CN115300494A - 羟基丙二酸类化合物及其药物组合物的应用 - Google Patents

羟基丙二酸类化合物及其药物组合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有式(I)结构的羟基丙二酸类化合物或其药学上可接受的盐以及它们形成的药物组合物在制备抗肾结石药物中的应用。应用该羟基丙二酸类化合物可有效抑制草酸钙结晶及肾脏沉积，降低体内血清肌酐及尿素氮水平，减轻肾损伤，改善肾脏肥大，具有显著的体内抗肾结石作用。同时应用的活性成分由天产物分离而得，安全有效，可制备为多种药物组合物剂型，应用广泛。
Figure DDA0003705343930000011

Description

羟基丙二酸类化合物及其药物组合物的应用
技术领域
本发明涉及一种羟基丙二酸类化合物及其药物组合物的应用，尤其涉及一种羟基丙二酸类化合物及其药物组合物在制备抗肾结石药物中的应用。
背景技术
肾结石是泌尿外科常见疾病，随着人们生活方式和饮食结构的改变，肾结石的发病率逐年上升。大多数肾结石为草酸钙(CaOx)结石，包括一水草酸钙(COM)和二水草酸钙(COD)结石。草酸钙肾结石是尿液中过饱和的钙离子(Ca2+)和草酸根(Ox2-)在肾小管、肾盏、肾盂等部位结晶所致，结石的形成是一个复杂的、多步骤的过程，包括晶体成核、生长，同时伴随着晶体的聚集和细胞黏附，其中晶体生长是肾结石形成的重要影响因素。
目前肾结石的治疗手段包括：对于较小的结石(直径小于0.6cm)，可通过大量饮水、排石药物和适当运动促进结石排出；而当结石直径较大时以碎石或手术取石方法治疗肾结石，但手术会增加肾脏损伤和感染发生率。目前尚无预防和治疗肾结石的特效药，使得肾结石依然是复发率较高的疾病。
发明内容
发明目的：针对现有抗肾结石药物存在的药效有限等不足，本发明旨在提供一种具有优异的抗草酸钙结晶的羟基丙二酸类化合物及其药物组合物在制备抗肾结石药物中的应用。
技术方案：作为本发明涉及的第一方面，具有式(I)结构的羟基丙二酸类化合物或其药学上可接受的盐应用于制备抗肾结石药物，
Figure BDA0003705343910000011
其中，R选自氢、氘、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、3～7元环烷基或3～7元环杂基；所述3～7元环杂基环系碳至少被一个氮、硫或氧取代。
羟基丙二酸(tartronic acid,TA)，又名丙醇二酸，黄瓜和冬瓜等食物中都含有这种化学物质，易溶于水，能够以原型形式从肾脏分泌。目前尚无关于羟基丙二酸用于肾结石治疗的相关报道。本发明通过筛选大量的小分子化合物获得羟基丙二酸类化合物对草酸钙结晶引发的肾结石具有有效抑制作用。
优选，上述药物为抗草酸钙肾结石的药物。
进一步优选，上述药物为抑制草酸钙结晶的药物。
进一步优选，上述药物为减轻肾损伤的药物。
进一步优选，上述药物为降低血清肌酐或尿素氮的药物。
作为药物的活性成分之二，上述药学上可接受的盐为羟基丙二酸类化合物与酸或碱形成的盐。
具体地，酸为无机酸或有机酸，其中无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸或氢溴酸；有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸或单宁酸。
碱为锂、钠、钾、钙或镁的碱、赖氨酸、三甲胺、三乙胺、二异丙胺、吡啶或N,N-二甲氨基吡啶。
作为本发明涉及的第二方面，上述含有式(I)结构的羟基丙二酸类化合物和/或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体形成的药物组合物应用于制备抗肾结石药物。
具体地，上述药学上可接受的载体选自淀粉、蔗糖、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠、季铵化合物、十六烷醇、高岭土、皂黏土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇、香精、甜味剂、矫味剂中的一种或多种。
其中，含有活性成分的重量比为0.1％～99.5％，最优选的重量比为0.5％～95％。药学上可接受的载体选自淀粉、蔗糖、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠、季铵化合物、十六烷醇、高岭土、皂黏土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇、香精、甜味剂、矫味剂中的一种或多种。上药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备得到。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
具体地，上述药物组合物的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。应用中可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种药物的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所适用疾病的类型及严重程度等作适应性调整，可以一次或多次施用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)应用该羟基丙二酸类化合物可有效抑制草酸钙结晶及肾脏沉积，降低体内血清肌酐及尿素氮水平，减轻肾损伤，改善肾脏肥大，具有显著的体内抗肾结石作用；
(2)应用的活性成分由天产物分离而得，安全有效，可制备为多种药物组合物剂型，应用广泛。
附图说明
图1为羟基丙二酸对一水草酸钙晶体生长的体外抑制作用；
图2为羟基丙二酸对一水草酸钙晶面生长的体外抑制作用；
图3为羟基丙二酸对肾结石患者尿液中草酸钙结晶的抑制作用；
图4为小鼠的体重变化；
图5为小鼠肾脏系数；
图6为羟基丙二酸对小鼠血清生化指标的影响，其中：A为尿素氮BUN含量的影响，B为肌酐Cr含量的影响；
图7为羟基丙二酸对小鼠草酸钙肾脏沉积量的影响，其中：A为肾组织Von kossa染色，B为草酸钙肾脏沉积面积比；
图8为羟基丙二酸对小鼠肾脏肾损伤标志物Opn、Ngal、Mcp-1和Kim-1mRNA表达的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：羟基丙二酸对一水草酸钙晶体生长的体外抑制作用
以生理盐水为背景，配制含有过饱和浓度的Ca2+和Ox2-的溶液，使用钙离子选择性电极测定添加晶种(单水草酸钙COM)后溶液中Ca2+浓度的变化，绘制Ca2+浓度随时间变化的曲线，选择其中线性部分，计算斜率，用单位时间内Ca2+的消耗量间接表示晶体生长的速率。
相对生长速率(relative growth rate)＝(RTA/R0)*100％。
RTA为TA存在条件下COM晶体的生长速率，R0为未添加TA条件下COM晶体的生长速率。
实验结果显示TA能够显著抑制COM晶体的宏观生长，并且具有剂量依赖性(图1)。
实施例2：羟基丙二酸对一水草酸钙晶面生长的体外抑制作用
使用微流控实验平台(包括微流控芯片、双通道注射泵和倒置显微镜)实时观测结晶过程，测定晶面生长速率。
(1)制备原位晶种：将2mM的CaCl2和Na2Ox通过双通道注射泵同时注入芯片，使其在芯片通道内混合发生反应结晶，生成COM晶体。
(2)晶体生长：当COM晶体生长到可观测尺寸，再更换1mM的CaCl2和Na2Ox溶液让晶体恒速生长，测定(010)晶面和(001)晶面延伸距离随时间的变化，绘制晶面延伸距离随时间变化的曲线，获得晶面的生长速率。
实验结果显示，TA能够显著抑制COM(001)晶面的生长，并且具有剂量依赖性(图2)。
实施例3：羟基丙二酸对肾结石患者尿液中草酸钙结晶的抑制作用
收集草酸钙肾结石患者的24小时尿液，使用钙离子和草酸根试剂盒测定尿样的Ca2+与Ox2-浓度。将尿样分为空白对照组、阳性对照组和TA组，阳性对照组加入2mM枸橼酸CA(目前治疗肾结石的常用药物)，TA组加入2mM的TA，在尿样中加入不同浓度的草酸钠溶液，测定尿样的浊度，用于判断结晶，测定能够引起草酸钙结晶时加入草酸钠的浓度。
实验结果显示TA能够抑制草酸钙肾结石患者尿样中草酸钙结晶，并且抑制效果优于治疗肾结石的常用药物枸橼酸(图3)。
实施例4：羟基丙二酸对小鼠草酸钙肾结石的治疗效果
将雄性C57BL/6小鼠适应性饲养1周后，随机分成3组，即空白组、草酸钙结石模型组(乙醛酸组)和给药组(乙醛酸+TA组)，每组5只。乙醛酸组和(乙醛酸+TA)组按照小鼠体重以50mg/kg的剂量腹腔注射乙醛酸溶液，每天一次，连续注射2周，空白组注射等量生理盐水。给药组在造模同时腹腔注射TA(187.5mg/kg)，空白组和乙醛酸组注射等量生理盐水。每日称量小鼠体重，2周后处死。
在体剥离肾脏组织，用0.9％NaCl溶液洗涤两次，滤纸干燥，称量并记录组织重量。一侧肾脏置于组织固定液中固定，用于石蜡切片进行Von kossa染色另一侧置冻存管于80℃保存，用于组织匀浆检测肾损伤标志物mRNA表达水平。
(1)小鼠血清生化指标检测
试验第14天，戊巴比妥麻醉小鼠，眼眶静脉丛取血法收集血液样本于未加入抗凝剂的EP管中，4℃冰箱过夜后，3000rpm，离心10min，小心收集上层血清，采用比色法测定血清中的肌酐Cr和尿素氮BUN浓度。
(2)小鼠肾脏结石观察
将肾脏标本进行包埋、切片、Von Kossa染色，使用切片扫描仪对Von Kossa染色切片进行扫描，观察各组小鼠肾组织病理改变及草酸钙结晶分布，使用ImageJ测量肾脏切片中草酸钙晶体的沉积面积，计算草酸钙晶体的沉积面积与肾脏切片面积的比率。
(3)小鼠肾损伤标志物检测
(3.1)引物设计
从NCBI基因库中查询Kim-1、Opn、Ngal、Mcp-1基因全序列，并使用NCBI中的Primerdesigning tool功能设计引物，BLAST比对后选择最优基因序列，基因序列如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0003705343910000051
(3.2)肾组织RNA提取
将另一半的肾脏放入研磨柱中，加入1mL Trizol进行研磨，直至无明显组织块，室温(15-30℃)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。2-8℃12000rpm离心10分钟，把水相转移到新管中，用0.5mL异丙醇沉淀水相中的RNA，室温放置20分钟。2-8℃12000rpm离心10分钟，移去上清。用1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀，2-8℃12000rpm离心5分钟，弃上清。室温放置干燥RNA沉淀，加入25-200μL无RNase的水，-70℃保存。
(3.3)反转录反应
对表1中的引物及cDNA模板进行qRT-PCR扩增，检测基因的表达水平。反应体系如表2所示，使用表3步骤进行扩增。扩增结束后，以Gapdh为内参，根据2-ΔΔCT法计算出的基因在肾组织中的相对表达量，并进行琼脂糖电泳验证。
表2 qRT-PCR反应体系
Figure BDA0003705343910000052
Figure BDA0003705343910000061
表3 qRT-PCR反应步骤
Figure BDA0003705343910000062
(4)统计学分析
利用GraphPad Prism 7.0软件分析实验数据并绘制统计图。两组间的统计学差异通过Students't检验比较。P<0.05被定义为组间差异具有统计学意义。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001；ns：无显著差异。
(5)实验结果
TA能够显著改善乙醛酸诱导肾结石导致的体重降低和肾脏肥大(图4～图5)，改善肾功能，降低血清肌酐和尿素氮水平(图6)，Von kossa染色结果显示与乙醛酸造模组相比，TA能够显著降低草酸钙晶体沉积(图7)，显著降低肾损伤标志物Kim-1、Ngal、Mcp-1mRNA的表达(图8)。

Claims (10)

1.一种具有式(I)结构的羟基丙二酸类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肾结石药物中的应用，
Figure FDA0003705343900000011
其中，R选自氢、氘、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、3～7元环烷基或3～7元环杂基；所述3～7元环杂基环系碳至少被一个氮、硫或氧取代。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为抗草酸钙肾结石的药物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制草酸钙结晶的药物。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为减轻肾损伤的药物。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为降低血清肌酐或尿素氮的药物。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为羟基丙二酸类化合物与酸或碱形成的盐。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酸为无机酸或有机酸，其中无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸或氢溴酸；有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸或单宁酸。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述碱为锂、钠、钾、钙或镁的碱、赖氨酸、三甲胺、三乙胺、二异丙胺、吡啶或N,N-二甲氨基吡啶。
9.一种含有式(I)结构的羟基丙二酸类化合物和/或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物在制备抗肾结石药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自淀粉、蔗糖、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠、季铵化合物、十六烷醇、高岭土、皂黏土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇、香精、甜味剂、矫味剂中的一种或多种。
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