CN115298190A - 离子液体、溶剂、制剂及经皮吸收剂 - Google Patents

离子液体、溶剂、制剂及经皮吸收剂 Download PDF

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Abstract

离子液体具有由下述通式(1)表示的结构。在通式(1)中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成烯基的至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代。X+表示具有阳离子基团的磷脂。通式(1)R‑COO‑X+。

Description

离子液体、溶剂、制剂及经皮吸收剂
技术领域
本发明涉及离子液体、溶剂、制剂及经皮吸收剂。
背景技术
近年来，作为仅由离子构成的液体的离子液体受到关注。离子液体是一种在宽温度范围内以液体形式存在的盐，由于具有低熔点、高溶解性、低挥发性、阻燃性，有望应用于电化学器件、分离萃取溶剂、反应溶剂、摩擦学及生物相关等各个领域。特别是，在生物相关领域中，正在对离子液体在酶促反应溶剂、药物递送及蛋白质重折叠等的使用积极开展研究。
作为这样的离子液体，专利文献1提出了使用鏻型阳离子的离子液体(鏻型离子液体)，专利文献2提出了使用有机胺化合物作为阳离子的离子液体。
(现有技术文献)
(专利文献)
专利文献1：日本特开2020-15688号公报
专利文献2：国际公开2009/066457号
发明内容
(要解决的技术问题)
在上述离子液体中，鏻型离子液体具有强刺激性，此外，使用有机胺化合物的离子液体具有高毒性。因此，均存在难以应用于生物相关领域的问题。因此，为了开发低毒性的离子液体，也正在研究使用氨基酸作为阳离子。然而，其不利之处在于，当使用氨基酸作为阳离子时，离子液体变为亲水性，从而对有机溶剂和疏水性药物的溶解度变低，应用受到很大限制。如上所述，实际情况是，现有离子液体的低毒性和溶解性不兼容，从而在生物相关领域中不能得到充分利用。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于，提供一种毒性低、生物相容性优异、且对亲水性物质和疏水性物质均表现出高溶解性的离子液体。
(解决问题的方案)
为了解决上述问题而进行深入研究的结果，本发明人们发现通过将脂肪酸和具有阳离子基团的磷脂组合构成离子液体，可以实现低毒性、且对亲水性物质和疏水性物质均表现出高溶解性的离子液体。
根据本发明第一观点的离子液体，具有由下述通式(1)表示的结构，
【化学式1】
通式(1)
R-COO-X+，
在通式(1)中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成所述烯基的至少一个亚乙基(ethylene group)可以被亚乙烯基(vinylene group)取代，X+表示具有阳离子基团的磷脂。
此时，所述通式(1)中的X+可以是具有阳离子基团的甘油磷脂。
此外，所述通式(1)中的X+可以具有由下述通式(2)表示的结构，
【化学式2】
通式(2)
Figure BDA0003854047520000021
在通式(2)中，R1表示被阳离子基团取代的烷基，R2表示氢原子或取代或未取代的烷基，R3表示取代或未取代的烷基。
此外，所述通式(2)中的R3可以是被烷基羰氧基取代的烷基。
此外，所述通式(2)中的R3可以是被两个以上的烷基羰氧基取代的烷基。
此外，所述通式(2)中的R2可以是取代或未取代的烷基。
此外，所述阳离子基团可以是季铵基。
此外，所述通式(1)中的X+可以是磷脂酰胆碱衍生物。
此外，所述通式(1)中的R的碳原子数可以是8～22。
此外，所述通式(1)中的R可以具有不饱和键。
此外，所述通式(1)中的R可以具有多烯结构。
此外，所述通式(1)中的R可以是仅由碳原子和氢原子构成的基团。
此外，根据上述本发明第一观点的离子液体可以是疏水性的。
此外，根据上述本发明第一观点的离子液体，具有由下式表示的结构，
【化学式3】
Figure BDA0003854047520000031
在式中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成所述烯基的至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代。
根据本发明第二观点的溶剂，包括根据上述本发明第一观点的离子液体。
根据本发明第三观点的制剂，包括根据上述本发明第一观点的离子液体。
根据本发明第四观点的经皮吸收剂，包括根据上述本发明第一观点的离子液体。
根据上述本发明第四观点的经皮吸收剂，还包括山梨糖醇酐脂肪酸酯。
此外，所述山梨糖醇酐脂肪酸酯可以是山梨糖醇单月桂酸酯。
此外，所述通式(1)中的R-COO-可以是从亚油酸的羧基解离氢离子而获得的羧酸根离子。
(发明的效果)
本发明的离子液体毒性低、生物相容性优异、且对亲水性物质和疏水性物质均表现出高溶解性。
附图说明
图1是示出在实施例中合成的离子液体1～3的NMR(核磁共振)光谱的图。
图2是示出通过动态光散射法(DLS)对混合离子液体1和肉豆蔻酸异丙酯(IPM)制备的液体样品测定的粒径分布的图。
图3是示出通过DLS对混合离子液体1和水制备的液体样品测定的粒径分布的图。
图4是示出用含有离子液体1～3的样品溶液或各种试剂处理的表皮组织的细胞生存率的图。
图5(A)是示出通过DLS测定的实施例1的粒径分布的图。(B)是示出通过透射电子显微镜法(TEM)拍摄的实施例1的图像的图。(C)是示出通过共聚焦激光扫描显微镜法(CLSM)拍摄的实施例1的图像的图。
图6(A)是示出通过DLS测定的实施例2的粒径分布的图。(B)是示出通过TEM拍摄的实施例2的图像的图。(C)是示出通过CLSM拍摄的实施例2的图像的图。
图7(A)是示出通过DLS测定的实施例3的粒径分布的图。(B)是示出通过TEM拍摄的实施例3的图像的图。(C)是示出通过CLSM拍摄的实施例3的图像的图。
图8是示出通过CLSM测定的实施例1～3的液滴的粒径分布的图。
图9(A)是示出通过DLS测定的实施例1在第90天的粒径分布的图。(B)是示出通过DLS测定的实施例2在90天的粒径分布。(C)是示出通过DLS测定的实施例3在90天的粒径分布的图。
图10(A)是示出通过高压液相色谱法(HPLC)测定的实施例1中包含的亮丙瑞林醋酸盐(LA)的量的图。(B)是示出通过HPLC测定的实施例2中包含的LA量的图。(C)是示出通过HPLC测定的实施例3中包含的LA量的图。
图11(A)是示出实施例1～3中LA的包封率的图。(B)是示出包含离子液体1、2或4的样品中LA的最大担载量的图。
图12是示出皮肤渗透试验中接收相的LA浓度随时间变化的图。
图13是示出皮肤渗透试验中36小时后经皮和局部的LA量的图。
图14是示出体内药代动力学试验中血浆中的LA浓度的图。
图15是示出用含有离子液体1的制剂处理的表皮组织的细胞生存率的图。
图16是示出经皮给药含有离子液体1的制剂的小鼠的体重随时间变化的图。
图17是示出经皮给药含有离子液体1的制剂的小鼠的角质层图像的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。以下记载的有关构成要素的说明，可以是基于代表性的实施方式和具体例进行，但本发明并不限于这样的实施方式。此外，在本说明书中，以“～”表示的数值范围是指将“～”前后记载的数值作为下限值和上限值包括在内的范围。此外，本发明中使用的化合物的分子内存在的氢原子的同位素种类没有特别限定，例如分子内的氢原子可以是全部为1H，也可以是一部分或全部为2H(氘D)。
<离子液体>
根据本实施方式的离子液体，具有由下述通式(1)表示的结构。
[化学式4]
通式(1)
R-COO-X+
在通式(1)中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成烯基的至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代。
R中的烷基可以是直链状、支链状及环状中的任一个。R中的烷基的碳原子数优选8～22，更优选12～22。例如，作为R中的烷基，可以列举十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、半二十烷基及二十二烷基等的直链状烷基，它们的支链状烷基、及它们的环状烷基等。作为可取代烷基的取代基，可以列举氨基、苄基及卤素原子(例如，氟原子)等。这些取代基可以进一步被取代基取代。当烷基被取代基取代时，烷基的碳原子数与取代基的碳原子数的合计优选8～22，更优选12～22。
R中的烯基可以是直链状及支链状中的任一个。R中的烯基碳原子数优选8～22，更优选12～22。例如，作为R中的烯基，可以列举十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、半二十碳烯基及二十二碳烯基等的直链状烯基，及它们的支链状烯基等。作为可取代烯基的取代基，可以列举氨基、苄基及卤素原子(例如，氟原子)等。这些取代基可以进一步被取代基取代。当烯基被取代基取代时，烯基的碳原子数与取代基的碳原子数的合计优选8～22，更优选12～22。此外，R中的烯基，其至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代而形成多烯结构。多烯结构的双键数优选2～6，更优选2～4。双键的位置没有特别限定，但优选至少隔着两个单键配置双键。
在这些中，R优选具有不饱和键的基团，更优选取代或未取代的烯基或具有取代或未取代的多烯结构的基团。此外，R中的烷基、烯基及具有多烯结构的基团可以被取代基取代，但即使在这种情况下，R优选仅由碳原子和氢原子构成。即，当烷基、烯基及多烯结构被取代基取代时，该取代基也优选仅由碳原子和氢原子构成。
对于R-COO-，例如可以使用从脂肪酸的羧基解离氢离子而获得的羧酸根离子或其衍生物。产生羧酸根离子的脂肪酸，可以是饱和脂肪酸，也可以是不饱和脂肪酸。作为饱和脂肪酸的示例，可以列举肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及月桂酸(C12:0)等，作为不饱和脂肪酸的示例，可以列举油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、α-亚麻酸(C18:3)、γ-亚麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)、二十碳五烯酸(C20:5)、二十二碳六烯酸(C22:6)及芥酸(C22:1)等。这里，括号内的数字是各脂肪酸的碳原子数和双键数。例如，亚油酸(C18:2)表示碳原子数为18，双键数为2。
在通式(1)中，X+表示具有阳离子基团的磷脂。这里，“磷脂”是指包含磷酸酯结构的脂质，“阳离子基团”是指带正电荷的取代基。X+优选具有阳离子基团的甘油磷脂，更优选磷脂酰胆碱衍生物。这里，磷脂酰胆碱衍生物是指具有甘油骨架、分别与甘油骨架的1位和2位键合的取代或未取代的烷酰基，与甘油骨架的3位键合的磷酸酯基(-P(O)(OH)O-)、与该磷酸酯基键合的胆碱残基的化合物。在该磷脂酰胆碱衍生物中，烷酰基的至少1个亚乙基可以被亚乙烯基取代，磷酸酯基的羟基的氢原子可以被取代或未取代的烷基取代。
此外，X+优选具有下述通式(2)表示的结构的磷脂，更优选具有下述通式(2)表示的结构的甘油磷脂。
[化学式5]
通式(2)
Figure BDA0003854047520000061
在通式(2)中，R1表示被阳离子基团取代的烷基，R2表示氢原子或取代或未取代的烷基，R3表示取代或未取代的烷基。
R1中的烷基可以是直链状、支链状及环状中的任一个。R1中的烷基的碳原子数优选1～20，更优选1～10，进一步优选1～6。例如，作为R1中的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基及异丙基等，R1中的烷基优选乙基。
R1中的阳离子基团优选下述通式(3)表示的铵基。
[化学式6]
通式(3)
*-NR4 3 +
在通式(3)中，R4表示氢原子或取代或未取代的烷基，*表示与烷基的键合位置。三个R4可以相同，也可以互不相同。3个R4中，取代或未取代的烷基的个数没有特别限制，R4可以全部是氢原子或取代或未取代的烷基，也可以是其中1个或2个为氢原子，其余为取代或未取代的烷基。
R4中的烷基可以是直链状、支链状及环状中的任一个。R4中的烷基的碳原子数优选1～20，更优选1～10，进一步优选1～6。例如，作为R4中的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基及异丙基等，R4中的烷基优选甲基。作为可取代烷基的取代基，可以列举苄基及卤素原子(例如，氟原子)等。这些取代基可以进一步被取代基取代。
R1中的阳离子基团优选季铵基，更优选由通式(5)表示的季铵基(R4的全部是取代或未取代的烷基的铵基)。此外，烷基中的阳离子基团的取代位置没有特别限制，优选与烷基末端的碳原子键合的氢原子被阳离子基团取代。
在通式(2)中，R2表示氢原子或取代或未取代的烷基。R2优选取代或未取代的烷基。R2中的烷基可以是直链状、支链状及环状中的任一个。R2中的烷基的碳原子数优选1～20，更优选1～10，进一步优选1～6。例如，作为R2中的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基及异丙基等，R2中的烷基优选乙基。作为可取代烷基的取代基，可以列举苄基及卤素原子(例如，氟原子)等。这些取代基可以进一步被取代基取代。
在通式(2)中，R3表示取代或未取代的烷基。R3中的烷基可以是直链状、支链状及环状中的任一个。R3中的烷基的碳原子数优选1～20，更优选1～10，进一步优选1～6。例如，作为R3中的烷基，可以列举甲基、乙基、正丙基及异丙基等，R3中的烷基优选正丙基。作为可取代烷基的取代基，可以列举烷基羰氧基、苄基及卤素原子(例如，氟原子)等。这些取代基可以进一步被取代基取代。
作为R3的优选例，可以列举被烷基羰氧基取代的烷基，更优选R3是被两个以上的烷基羰氧基取代的烷基。这里，两个以上烷基羰氧基可以彼此相同，也可以互不相同，但优选相同。
烷基中的烷基羰氧基的取代数优选2～8个，更优选2～4个，最优选2个。烷基中的烷基羰氧基的取代位置没有特别限制，但当作为R3的主链的烷基是正丙基时，与其末端的碳原子键合的氢原子和与相邻的碳原子键合的氢原子被烷基羰氧基取代的情况相当于甘油磷脂，特别优选磷脂。
对烷基羰氧基中的烷基的说明、优选范围及具体例，可以参照上述R中对烷基的说明、优选范围及具体例。
以下，列举具有由通式(1)表示的结构的离子液体的优选化合物例。然而，根据本实施方式的离子液体不应被解释为受具体例的限定。在下式中，R-COO-与通式(1)中的R-COO-具有相同的含义，作为其具体例，可以列举亚油酸、油酸、乙酸或硬脂酸的各羧酸根离子。
[化学式7]
Figure BDA0003854047520000081
[离子液体的特性]
接着，对根据本实施方式的离子液体的优选特性进行说明。
(疏水性)
根据本实施方式的离子液体优选疏水性的。这里，“疏水性”是指0.1重量％以上溶解于IPM。
根据本实施方式的离子液体优选0.1重量％以上溶解于IPM(具有疏水性)，更优选5重量％以上溶解于IPM，进一步优选20重量％以上溶解于IPM。这里，离子液体溶解于IPM除了指离子液体在IPM中形成均相体系并溶解之外，还包括形成反胶束并溶解。离子液体在IPM中形成反胶束，这一点可以通过观察由DLS测定的粒径分布中的峰来确认。
根据本实施方式的离子液体具有由通式(1)表示的结构，由于R和X+中包含烷基或烯基，因此容易成疏水性。由于疏水性离子液体相对于疏水性溶剂、油性基材及疏水性药物等示出高相容性，因此可以容易地与它们混合。此外，离子液体对角质层的渗透屏障具有高渗透性，易于经皮吸收。因此，疏水性离子液体特别可用于经皮吸收型药物递送系统(DDS)。
(形成胶束或脂质体的能力)
根据本实施方式的离子液体是疏水性的，例如当以最高20％的浓度与水混合，并通过DLS测定该液体混合液的粒径分布时，优选出现峰，且该峰优选出现在0.01～1μm的范围。出现在粒径分布的峰，表明离子液体在该液体混合物中形成具有该粒径的胶束或脂质体并溶解。这样的离子液体对疏水性溶剂表现出高相容性并溶解，并在亲水性溶剂中形成胶束或脂质体并均匀分散(胶束溶解)，因此无论是疏水性溶剂还是亲水性溶剂都可以获得良好的溶解性。此外，该胶束或脂质体可作为各种用途使用。例如，形成胶束或脂质体的离子液体，可以通过将各种分子包封在其内部而适合作为药物递送系统的载体使用。
(熔点)
根据本实施方式的离子液体的熔点优选100℃以下，更优选60℃以下，进一步优选40℃以下。这里，熔点是根据差示扫描量热法测定的熔点。由于熔点在上述范围内的离子液体在宽温度范围呈液体状态，因此可以适合作为溶剂使用。
<溶剂>
根据本实施方式的溶剂包括根据本实施方式的离子液体。根据本实施方式的溶剂中包含的离子液体，可以仅由通式(1)表示的化合物中的一种构成，也可以含有两种以上。此外，根据本实施方式的溶剂，可以仅由根据本实施方式的离子液体构成，也可以包含其他溶剂。其他溶剂没有特别限制，可以从公知溶剂中适当地选择。
根据本实施方式的离子液体具有由通式(1)表示的结构，由于R和X+中包含烷基或烯基，因此与疏水性物质的相容性高，此外，由于具有羧酸根离子和阳离子基团，因此对亲水性物质表现出类表面活性剂的行为。因此，根据本实施方式的离子液体可以与疏水性溶剂或亲水性溶剂组合而均匀混合，此外，疏水性溶质和亲水性溶质均可以溶解。例如，通常药理活性物质多为难溶解，但如果将根据本实施方式的离子液体用作溶剂，则溶解这些难溶性的药理活性物质成为可能。通过使用该离子液体，可以实现与组合的溶剂和溶质无关地表现出高溶解性的溶剂。此外，还可以实现生物相容性优异的制剂和经皮吸收剂。
<制剂>
根据本实施方式的制剂包含根据本实施方式的离子液体。根据本实施方式的制剂包含的离子液体可以是由通式(1)表示的化合物中的一种，也可以是两种以上。此外，除了根据本实施方式的离子液体之外，根据本实施方式的制剂还可以包含有效成分、添加剂、赋形剂及基剂等制剂中通常使用的成分。此外，根据本实施方式的制剂的形态没有特别限制，例如可以是内服药、外用药及注射剂等任意形态。
根据本实施方式的离子液体是组合将脂肪酸作为基本骨架的阴离子和将磷脂作为基本骨架的阳离子而构成，无论哪种基本骨架都是生物相关物质，因此具有低毒性、高生物相容性。此外，由于根据本实施方式的离子液体的R和X+中包含烷基或烯基，因此与疏水性物质的相溶性高，此外，由于具有羧酸根离子和阳离子基团，因此对亲水性物质表现出类表面活性剂的行为。因此，通过使用根据本实施方式的离子液体，可以容易地制备具有离子液体的优点且安全的制剂。
<经皮吸收剂>
根据本实施方式的经皮吸收剂包含根据本实施方式的离子液体。根据本实施方式的经皮吸收体剂中包含的离子液体可以是由通式(1)表示的化合物中的一种，也可以是两种以上。
根据本实施例的离子液体具有低毒性、高生物相容性的特点，且由于在分子内包含烷基或烯基、脂质结构，因此表现出疏水性，使其能够渗透皮肤的角质层。因此，根据本实施方式的离子液体具有离子液体的优点且安全，从而能够实现表现出良好经皮吸收性的经皮吸收剂。
经皮吸收剂的剂型没有特别限制，例如可以是液剂(洗剂和喷雾剂等)、软膏、乳膏、凝胶、乳液及贴剂等任意剂型。此外，除了根据本实施方式的离子液体之外，经皮吸收剂还可以含有有效成分和基剂。可以适当地从经皮吸收剂中通常使用的基材中选择并采用。此外，经皮吸收剂可以根据需要添加外用剂等医药品、用于医药部外品及化妆品等的稳定剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、助悬剂、pH调节剂及抗氧化剂等添加剂。
除了起到类表面活性剂作用的离子液体之外，经皮吸收剂还可以包含辅助表面活性剂。辅助表面活性剂是例如山梨糖醇酐脂肪酸酯。作为山梨糖醇酐脂肪酸酯，可以列举山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨聚糖三硬脂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇三油酸酯、山梨糖醇倍半油酸酯及山梨糖醇单棕榈酸酯等。山梨糖醇脂肪酸酯优选山梨糖醇单月桂酸酯(司盘-20)。
经皮吸收剂中的辅助表面活性剂的含量适当设定，例如1～10质量体积(w/v)％、2～8w/v％、3～7w/v％、4～6w/v％，优选5w/v％。经皮吸收剂中的离子液体的含量适当设定，例如1～10质量体积(w/v)％、2～8w/v％、3～7w/v％、4～6w/v％，优选5w/v％。经皮吸收剂中包含的离子液体与辅助表面活性剂的质量比，例如可以为1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1，优选1:1。
当离子液体包含在经皮吸收剂中时，优先地，上述通式(1)中的R-COO-是从亚油酸的羧基解离氢离子而获得的羧酸根离子。
实施例
以下，将举出实施例和比较例进一步具体地说明本发明的特征。以下实施例中所示的材料、用量、比例、处理内容及处理步骤等可以在不脱离本发明主旨的情况下适当变更。因此，本发明的范围不应被解释为受以下所示的具体例的限定。此外，使用示差热热重量同时测定装置(日立高新技术公司制造，TG/DTA7300)测定熔点，并使用Zetasizer(英国马尔文帕纳科公司制造，Malvern-UK.Nano系列)进行DLS测定。
[1]离子液体的合成
(合成例1)离子液体1的合成
[化学式8]
Figure BDA0003854047520000111
将1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)、三氟甲磺酸乙酯(ETFM)(1摩尔当量)及氯仿(超脱水)放入容器中，在氮气气氛下，于45℃搅拌一晚。通过将该反应液在避光的氮气气氛下干燥一晚而获得中间体1(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱(EDMPC)的三氟甲磺酸盐)。
[化学式9]
Figure BDA0003854047520000121
将中间体1溶解于氯仿中，然后加入0.2N盐酸进行相分离反应，获得含有中间体2(EDMPC氯化物)的下层和含有三氟甲磺酸的上层(水相)。其中，除去上层，用超纯水(MilliQ)洗涤下层以除去未反应的盐酸，然后通过蒸发器和冷冻干燥机除去氯仿和多余的水，获得中间体2。
[化学式10]
Figure BDA0003854047520000122
向中间体2中加入亚油酸(1摩尔当量)和氯仿(超脱水)，在避光的干燥氮气气氛下，于45℃搅拌一晚使其反应，从而获得所需的离子液体1。将获得的离子液体1的NMR光谱示于图1。
(合成例2、3)离子液体2、3及4的合成
除了用油酸、乙酸或硬脂酸代替亚油酸之外，与合成例1同样地，合成含有油酸的羧酸根离子的离子液体2、含有乙酸的羧酸根离子的离子液体3及含有硬脂酸的羧酸根离子的离子液体4。将获得的离子液体2、3的NMR光谱示于图1。
[2]评价
对合成的离子液体1～3进行熔点测定、DLS测定、溶解性及毒性评价。此外，以下，离子液体1标记为[EDMPC][Lin]、离子液体2标记为[EDMPC][Ole]、离子液体3标记为[EDMPC][Act]、离子液体4标记为[EDMPC][Ste]。
(熔点测定)
用差示扫描量热法测定熔点时，离子液体1为14.8℃，离子液体2为34.5℃，离子液体3为47.5℃，均示出不足50℃的低熔点。
(DLS测定)
将各离子液体以5重量％的浓度与IPM或水混合而制备两种液体样品，并分别通过DLS测定粒径分布。作为代表，将离子液体1在IPM中的粒径分布示于图2，在水中的粒径分布示于图3。如图2和3所示，在使用IPM作为溶剂的液体样品和使用水作为溶剂的液体样品中，都在特定粒径观察到峰。此外，对其他离子液体的液体样品也同样地测定具有峰的粒径分布。在水中的粒径分布中观察到峰，这一点表明离子液体1～3为疏水性，在水中示出类表面活性剂的行为并形成胶束，且均匀分散(胶束溶解)。此外，由于在IPM的粒径分布中也观察到峰，因此也对离子液体1～3在疏水性溶剂中形成反胶束的可能性给出了启示。
(溶解性评价)
在室温下评价离子液体对各种溶剂的溶解性。具体而言，将离子液体1～3与各溶剂一起分别放入玻璃管中，使用涡流混合器搅拌1～2分钟进行混合。此时，离子液体1～3与溶剂的比例，以重量比为50:50。目视观察获得的液体(液体样品)的溶解性和透明度，并根据以下标准进行评价。将其结果示于表1。
○：离子液体均匀溶解，液体样品的透明度高
△：离子液体均匀溶解，但液体样品混浊
×：离子液体与溶剂分离，离子液体不溶于溶剂
此外，作为比较，对中间体2([EDMPC][Cl])也进行相同的评价。
[表1]
Figure BDA0003854047520000141
如表1所示，将氯离子作为阴离子的中间体2溶解于IPM和异丙醇，但不溶于含有水的溶剂(水、磷酸盐缓冲盐水)和非极性溶剂(正己烷、环己烷、庚烷、甲苯)。另一方面，将脂肪酸的羧酸根离子用作阴离子的离子液体1～3均对各种溶剂表现出高溶解性。此外，将水和磷酸盐缓冲盐水用作溶剂的液体样品混浊的原因，认为是各离子液体在这些溶剂中形成胶束并溶解。因此可知，通过将具有阳离子基团的磷脂与脂肪酸的羧酸根离子进行组合，对水性溶剂和非极性溶剂的溶解性也得到改善，从而无论是在非极性溶剂还是在极性溶剂、疏水性溶剂及亲水溶剂都示出高溶解性。
(细胞毒性试验)
将人类人工表皮(日本组织工程公司制造：LabCyte EPI-MODEL 12细胞)作为对象，使用MTT细胞活力测定进行细胞毒性试验。MTT细胞活力测定是一种利用黄色MTT[3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑]被细胞内线粒体脱氢酶转化为蓝色甲臜来测定细胞生存率的方法。甲臜产生量越多(在570nm处的吸光度越高)表明细胞生存率越高。
具体而言，首先，将离子液体1～3溶解在IPM中来制备样品溶液。这里，各样品溶液中的离子液体的浓度为5重量％、10重量％、20重量％、50重量％或100重量％。
另一方面，准备注入测定培养基(500μL)的24孔板，在各孔内放置人类表皮细胞培养杯。将该24孔板在5％CO2的加湿气氛下，于37℃孵育24小时，然后将样品溶液(25μL)和作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS:25μL)注入各培养杯中，在5％CO2的加湿气氛下，于37℃孵育24小时。孵育后，从各培养杯中除去样品溶液，用杜氏磷酸盐缓冲盐水洗涤杯中的组织表面15次。接着，将0.5mg/mL的MTT测定培养基(500μL)注入各培养杯中，在5％CO2的加湿气氛下，于37℃孵育3小时。孵育后，从培养杯中取出表皮组织，转移到装有2-丙醇(300μL)的微管中，通过在室温黑暗条件下放置48小时，将表皮组织中着色的甲臜提取到2-丙醇中。将该组织提取液(100μL)和2-丙醇(空白)注入96孔ELISA板的各孔中，分别在650nm和570nm处测量吸光度，通过下式计算细胞生存率。
细胞生存率(％)＝[A(样品溶液)/A(PBS)]×100
在式中，A(样品溶液)表示用各样品溶液处理的组织提取液在570nm处的吸光度，A(PBS)表示用磷酸盐缓冲盐水处理的组织提取液在570nm处的吸光度。
如上所述，进行3次试验，将求得的其细胞生存率的平均值和标准偏差(SD)结果示于图4。在图4中，沿横轴记载的略称和离子液体表示用于表皮组织处理的试剂的种类或含在样品溶液中的离子液体。此外，[Choline][Ole]、emim Tf2SA、SDS分别是比较例，[Choline][Ole]表示胆碱和油酸的离子液体，emim Tf2SA表示市售的离子液体(1-乙基-3-甲基咪唑鎓双(三氟乙基磺酰基)酰胺)、SDS表示月桂基硫酸钠(阴离子表面活性剂)。
如图4所示，离子液体1～3即使以20重量％的浓度使用时也获得高细胞生存率，可知没有毒性问题。此外，对离子液体1和2还测定了在100％浓度下的细胞生存率，即使在这种情况下也获得了远高于20％SDS的细胞生存率。这些结果表明组合了具有阳离子基团的磷脂和脂肪酸的羧酸根离子的离子液体的毒性极低。
关于离子液体1、2及4，如下所示，研究对用于经由皮肤给药LA的经皮吸收剂的应用。此外，以下统计分析基于邓尼特(Dunnett)多重比较法和prism6(GraphPad软件公司制造)的双向方差分析和图基(Tukey)检验进行。统计学上显着的差异是，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001及*****p<0.00001。
(样品制备)
使用均质器(POLYTRON公司制造，高速均质器，PT2500E)将3.0mg/mL的LA水溶液2mL和12.5mg/mL的离子液体1、离子液体2或离子液体4的环己烷溶液4mL在26000rpm下均质化2分钟。将获得的溶液冷冻干燥以除去水和环己烷，获得粉末状的离子液体-肽复合体。将离子液体-肽复合体在包含5％司盘-20的1mL的IPM溶液中搅拌12小时，获得离子液体/油-纳米分散体系(IL/O-ND)。
(IL/O-ND的特性分析)
将实施例1、2或3作为样品，通过DLS评价粒径、多分散指数(PDI)和峰强度。将对各样品的10次测定值的平均作为粒径。通过TEM分析粒径和形状。对于TEM，将2μL样品置于碳-铜薄膜TEM网格上，孵育2分钟以使薄膜吸收样品。用环己烷洗涤IPM，进一步孵育2分钟。将沉积的复合体以2％乙酸双氧铀溶液染色。此外，使用TEM-2010(由日本电子公司制造)在120kV下观察样品的图像。通过使用LSM700(Carl Zeiss公司制造)的CLSM在明场中进行样品的液滴直径和形状的形态学分析。对于CLSM，以63oil×3的分辨率拍摄图像。
图5(A)、6(A)及7(A)分别示出实施例1、2及3的DLS结果。实施例1、2及3的液滴粒径分别为251nm、220nm及265nm。图5(B)、图6(B)及图7(B)分别示出通过TEM拍摄的实施例1、2及3的图像。在TEM图像中，实施例1～3的粒子观察到轻微变形。图5(C)、6(C)及7(C)分别示出通过CLSM拍摄的实施例1、2及3的图像。在CLSM图像中，实施例1～3形成均匀粒子，且粒子通过形成纳米粒子而自由扩散。将通过DLS测定的粒径、PDI及峰强度示于表2。图8示出通过CLSM测定的实施例1～3的液滴直径。通过CLSM测定的粒径分布在200～300nm处，且支持DLS结果。
[表2]
Figure BDA0003854047520000161
(IL/O-ND的稳定性评价)
对于在低温(-4℃)、室温(25℃)及高温(37℃)下储存的样品，通过DLS和HPLC进行为期90天的粒径测定和LA定量，从而评价LA在IL/O-ND中的物理化学稳定性。关于粒径，与上述同样地，通过DLS测定液滴大小。
在根据HPLC的评价中，考虑了使用0.01～0.1μg/mL浓度的稀释液(包含1％TFA的25％乙腈水溶液)获得的LA的线性相关曲线。将LA浓度为0.1μg/mL的稀释液以10000rpm离心30分钟来制备试验样品。HPLC测定使用HPLC系统(由日本分光公司制造)。将用HaOH/HCl调节至pH6.5的、以77:23体积比包含0.0087M磷酸一铵和乙腈的溶液作为流动相。使用惰性维持ODS柱(150×4.6mm，5μm，由GL Sciences公司制造)于30℃进行色谱分离。将注入的100μL试验样品在220nm以流动相流速1.0mL/min进行分离。
根据DLS结果，观察到实施例1、2及3的粒径在室温下至少保持恒定(200～300nm)90天，但在高温下有减小50～60nm左右的趋势，在低温下有增加700～1000nm的趋势。将实施例1、2及3在第90天的粒径分别示于图9(A)、(B)及(C)。
图10(A)、(B)及(C)分别示出通过HPLC测定的实施例1、2及3中包含的LA量。LA量在低温下有轻微减少的趋势，但变化并不显着，在所有温度下几乎都没有变化且稳定。
(LA在IL/O-ND中的包封量的评价)
将包封LA的IL/O-ND溶液以10000rpm离心30分钟而获得上清。通过用HPLC测定泄漏到上清的未包封LA浓度来评价包封在IL/O-ND中的LA量。基于根据LA标准溶液制作的校准曲线，测定泄漏到上清的未包封LA浓度，并计算LA在IL/O-ND中的包封率。此外，作为比较例1，使用含有3mg/mL的LA和5％司盘-20的IPM，作为比较例2，使用含有3mg/mL的LA和5％离子液体1的IPM。
(LA在IL/O-ND中的最大容量的评价)
为了评价LA在IL/O-NDs中的负载能力的最大值，将过量的LA加入到含有5％离子液体1、2或4和5％司盘-20的IPM中，并持续搅拌。使用离心处理除去未加载到IL/O-ND的LA。通过HPLC测定样品中的LA浓度。作为比较例3，使用含有5％司盘-20的IPM，作为比较例4，使用含有5％离子液体1的IPM。
图11(A)示出实施例1～3中的LA包封率。通过在IPM中加入离子液体1、2或4和辅助表面活性剂可以显着提高LA在纳米粒子中的包封率。图11(B)示出LA在包含离子液体1、2或4的样品中的最大担载量。离子液体1、2及4能够显着提高LA在纳米粒子中的担载量。
(皮肤渗透试验)
使用放置小鼠皮肤的Franz扩散池对表3所示的组合物进行皮肤渗透试验。此外，比较例5包含作为化学渗透促进剂的二甘醇单乙醚(DGME)作为表面活性剂。将小鼠皮肤(Hos-HR-1，星野试验动物饲养所制造)碎片(2x2cm2)放置于接收室充满5mL的HEPES缓冲液(以31M的浓度将HEPES盐溶解在MilliQ中并用NaOH和HCl溶液调节至pH7.4)的Franz扩散池中。在作为供体隔室的被剃毛的小鼠皮肤部分添加250μL的组合物，使用循环水浴将系统维持在32.5℃，并通过经由磁力的搅拌器的旋转搅拌接收相。
在1、3、6、9、24及36小时，将组合物(300μL)添加到供体隔室，同时吸出300μL介质以取代接收相。通过HPLC对经皮(通过皮肤)和局部(皮肤内)的LA进行定量。对于皮肤内LA定量，36小时后解除供体隔室的固定，并用20％乙醇溶液多次洗涤皮肤表面。将皮肤切成16片，在稀释液中搅拌12小时提取LA。将提取溶液稀释10～100倍，并通过HPLC测定LA浓度。
[表3]
Figure BDA0003854047520000181
如图12所示，接收相的LA浓度在24小时后达到最高，除了实施例1之外，逐渐下降。实施例1的LA浓度即使是在36小时后也增加。图13示出36小时后经皮和局部的LA量。通过实施例1，有最多的LA渗透皮肤并被经皮递送。
通过滞后时间和最小二乘法评价皮肤渗透动力学参数。基于Kp＝J/Cd求得经皮通量(J)和渗透系数(Kp)。Cd是供体制剂中的LA浓度(μg/mL)。滞后时间(tL)由X轴上的截距求得，扩散系数(D)由D＝I2/6tL求得。I是小鼠的皮肤厚度0.0041cm。皮肤分配系数(Kskin)由Kskin＝(JxI)/(DxCd)算出。将皮肤渗透动力学参数示于表4。
[表4]
Figure BDA0003854047520000191
(IL/O-ND对皮肤角质层的影响)
将冷冻猪(YMPC，星野试验动物饲养所制造)皮在室温下解冻，将干燥后的皮在60℃下加热60～120秒，从皮上剥离表皮层。使采集的表皮片在0.25％胰蛋白酶和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中以角质层侧朝上的方式在室温下漂浮24小时。将分离的角质层用水洗涤，进一步干燥24小时。将角质层切片在玻璃管中于室温下浸入试验样品(IPM、离子液体1、2、4、吐温-80、DGME或PBS)中30分钟。用20％乙醇洗涤角质层片并干燥1小时。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)光谱法分析角质层片。此外，作为对照使用未处理的角质层。
脂质基质的组织(层状结构的胆固醇、脂肪酸及神经酰胺)和角质层的角质蛋白结构是经皮DDS的主要障碍，并影响药剂扩散到皮肤深层的速度。角质层的FTIR光谱显示出指示在2825～2975cm-1处的脂质拉伸区域的吸收和在1475～1725cm-1处的蛋白质的酰胺结构的吸收。将IL/O-ND对皮肤层的影响示于表5。在光谱中，酰胺结构或角质蛋白的吸收显示出相对于酰胺-I；-C＝O的位移为1550cm-1和相对于酰胺-II；NH-C＝O的位移为1650cm-1，2845cm-1和2923cm-1属于根据CH2对称和CH2不对称的脂质的振动伸缩碳水化合物。角质层的分解与药剂通过皮肤的分子扩散直接相关。角质蛋白的α-螺旋胶体和β-折叠结构的变形能力得到促进，从而药剂的渗透提高。由于离子液体的脂溶性阳离子和脂肪酸的阴离子，这些位移在离子液体中得到促进。
离子液体1的亚油酸(C18:2)的不饱和双键的碳对促进角质层的氢键的变形有大影响。这些位移与表征角质层脂质组织的左旋式/反式结构有关，对脂质屏障功能降低给出了启示。离子液体1中的CH2对称和CH2不对称位移最大，这一点表明离子液体1有效地损坏屏障功能，适用于经皮DDS。
[表5]
Figure BDA0003854047520000201
(IL/O-ND对药代动力学的影响)
对以每组5只随机分为6组的BALB/C小鼠(雌性，6周龄，20±2g，九动公司制造)进行IL/O-ND的药代动力学试验。除去小鼠背部的毛，两天后使用1cm×1cm的贴片将表6所示的制剂(90μg的LA/小鼠)对每只小鼠的清洁皮肤给药300μL。将皮下注射了包含90μgLA的300μLPBS的小鼠作为阳性对照。经过预定时间后，从小鼠眼中采集约200μL的后眼窝血液。经过预定时间后，还从注射给药组采集血液。通过以10000rpm离心血液样本20分钟获得血清。如下所述，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆中的LA浓度。
将添加100μL的4％磷酸的100μL的血浆涡旋并适用到WCX-SPE柱。用200μL的5％氢氧化铵和20％乙腈相继洗涤WCX SPE柱，并用包含1％TFA的乙腈/水(75/25)溶液100μL洗脱LA。用微蒸发器蒸发洗脱的LA，将其在100μL水中洗脱，并基于LHRH(Leuprolide:亮丙瑞林)ELISA试剂盒(A18102，BMA生物医学，半岛实验室)协议通过ELISA进行评价。通过测定样品在450nm处的吸光度来确定血浆中的LA浓度。
图14示出血浆中的LA浓度随时间变化。表6示出药代动力学参数。LA的经皮给药优于注射。在注射给药中，给药30分钟后血浆中的LA浓度大幅度增加，4小时后降低。另一方面，经皮给药，特别是根据实施例1的给药，血浆中的LA浓度逐渐增加，直至36小时后。表明实施例1适用于使用贴剂的经皮DDS。
[表6]
Figure BDA0003854047520000211
(生物相容性评价)
对表7所示的制剂，如上所述，同样地进行MTT细胞活力测定。此外，表7中的e-TFSA表示1-十二烷基-3-甲基咪唑鎓双(三氟甲基磺酰基)亚胺，e-TF2N表示1-十二烷基-3-甲基咪唑鎓双(三氟乙基磺酰基)亚胺。
此外，使用雌性BALB/C小鼠(九动公司制造)评价各制剂在体内的生物相容性。将制剂以300μL/小鼠、以贴片形式通过皮肤以5天为间隔给药3剂。对于每次给药，贴片在皮肤上保留24小时。每隔一天测定一次体重，直到最后一天，在实验的最后，采集皮肤用于组织学分析。在组织学样品的制备和染色中，将皮肤暴露于水和50％的2-丙醇中，然后在4％甲醛溶液中于-30℃冷冻2～3小时。从皮肤获得约20μm厚度的切片并固定在载玻片上。用丙酮、乙醇及水洗涤切片，将去除不需要的残留物的切片用苏木精溶液染色6小时，并用水洗涤，进一步用伊红溶液染色20～30分钟。用水洗涤，并用乙醇脱水，然后用玻璃覆盖切片，并用彩色显微镜(BZ-9000，由基恩士公司制造)观察。
[表7]
Figure BDA0003854047520000221
图15示出细胞生存率。除了比较例6、8和9之外，实施例1中细胞的生存率接近100％。另一方面，比较例5、10、11及12分别为59％、53％、18％及6％。根据该结果，表明实施例1在体外的生物相容性。
图16示出每隔一天测定的小鼠体重。无论哪种情况，直到第15天体重都没有显着变化，但在比较例11中，小鼠在第一次给药后死亡，皮肤变黑并被破坏。图17示出用荧光显微镜放大20倍拍摄的角质层。未处理、实施例1、比较例6及9的角质层未见损伤。在比较例5和比较例10中，观察到轻微损伤，在比较例11和比较例12中，在两层皮肤都观察到损伤。根据以上，表明由于实施例1在生物体的生物相容性高且安全，因此对医药制剂，特别是经皮吸收剂有用。
在不脱离本发明的广义精神和范围的情况下，本发明能够进行各种实施方式和变形。此外，上述实施方式用于说明本发明，并不限定本发明的范围。即，本发明的范围不是由实施方式而是由权利要求的范围表示。此外，在权利要求的范围内及与其同等的发明意义范围内进行的各种变形都被视为在本发明的范围内。
本申请基于2020年3月26日申请的日本专利申请2020-056457号。将日本专利申请2020-056457号的整个说明书、权利要求书及附图作为参照引入本说明书中。
(产业上的利用可能性)
本发明的离子液体毒性低、生物相容性优异、且对亲水性物质和疏水性物质均表现出高溶解性，因此可以安全地用于包括生物相关领域在内的各种领域。因此，本发明的产业上的利用可能性高。

Claims (20)

1.一种离子液体，具有由下述通式(1)表示的结构，
【化学式1】
通式(1)
R-COO-X+
在通式(1)中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成所述烯基的至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代，X+表示具有阳离子基团的磷脂。
2.根据权利要求1所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的X+是具有阳离子基团的甘油磷脂。
3.根据权利要求2所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的X+具有由下述通式(2)表示的结构，
【化学式2】
迪式(2)
Figure FDA0003854047510000011
在通式(2)中，R1表示被阳离子基团取代的烷基，R2表示氢原子或取代或未取代的烷基，R3表示取代或未取代的烷基。
4.根据权利要求3所述的离子液体，其中，
所述通式(2)中的R3是被烷基羰氧基取代的烷基。
5.根据权利要求4所述的离子液体，其中，
所述通式(2)中的R3是被两个以上的烷基羰氧基取代的烷基。
6.根据权利要求3至5中的任一项所述的离子液体，其中，
所述通式(2)中的R2是取代或未取代的烷基。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的离子液体，其中，
所述阳离子基团是季铵基。
8.根据权利要求2所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的X+是磷脂酰胆碱衍生物。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的R的碳原子数是8～22。
10.根据权利要求1至9中的任一项所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的R具有不饱和键。
11.根据权利要求10所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的R具有多烯结构。
12.根据权利要求1至11中的任一项所述的离子液体，其中，
所述通式(1)中的R是仅由碳原子和氢原子构成的基团。
13.根据权利要求1至12中的任一项所述的离子液体，其中，
所述离子液体是疏水性的。
14.根据权利要求13所述的离子液体，其中，
所述离子液体具有由下式表示的结构，
【化学式3】
Figure FDA0003854047510000021
在式中，R表示取代或未取代的烷基、或取代或未取代的烯基，构成所述烯基的至少一个亚乙基可以被亚乙烯基取代。
15.一种溶剂，其中，
包括权利要求1至14中的任一项所述的离子液体。
16.一种制剂，其中，
包括权利要求1至14中的任一项所述的离子液体。
17.一种经皮吸收剂，其中，
包括权利要求1至14中的任一项所述的离子液体。
18.根据权利要求17所述的经皮吸收剂，其中，
还包括山梨糖醇酐脂肪酸酯。
19.根据权利要求18所述的经皮吸收剂，其中，
所述山梨糖醇酐脂肪酸酯是山梨糖醇单月桂酸酯。
20.根据权利要求17至19中的任一项所述的经皮吸收剂，其中，
所述通式(1)中的R-COO-是从亚油酸的羧基解离氢离子而获得的羧酸根离子。
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