CN115297885A - 包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含基于IL‑15/IL‑15Rα的异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子，及其作为治疗剂，特别是作为用于治疗癌症和自身免疫性疾病的药剂的用途。本发明进一步涉及包含基于IL‑15/IL‑15Rα的异二聚体蛋白质复合物和免疫调节抗体的免疫细胞因子，及其作为治疗剂，特别是作为用于治疗癌症和自身免疫性疾病的药剂的用途。

Description

包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物的免疫细 胞因子
技术领域
本发明涉及包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子，及其作为治疗剂，特别是作为用于治疗癌症和自身免疫性疾病的药剂的用途。本发明进一步涉及包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物和免疫调节抗体的免疫细胞因子，及其作为治疗剂，特别是作为用于治疗癌症和自身免疫性疾病的药剂的用途。
背景技术
细胞因子是一类信号传导蛋白和糖蛋白，如同激素和神经递质，其广泛用于细胞通讯中。虽然激素从特定器官分泌到血液中，并且神经递质与神经活动有关，但就起源和目的而言，细胞因子是一类更加多样化的化合物。它们通过广泛多样的造血细胞和非造血细胞产生，并且可以影响附近的细胞和整个生物两者，并且有时强烈依赖于其它化学物质的存在。细胞因子家族主要由小的水溶性蛋白质和糖蛋白组成，其质量范围为8至30 kDa。细胞因子对于先天性和适应性免疫应答两者的发展和功能是关键的。它们经常由已遇到病原体的免疫细胞分泌，从而激活且募集进一步的免疫细胞，以增加系统对病原体的应答。
在细胞因子中，白细胞介素15 (IL-15)是与IL-2具有结构相似性的细胞因子；前者在由病毒感染或者通过识别为“非自我”或削弱的细胞的间接刺激之后，由单核吞噬细胞(及其它一些细胞)分泌。这种细胞因子诱导天然杀伤细胞的细胞增殖；所述天然杀伤细胞是先天性免疫系统的细胞，其主要作用是杀死病毒感染的细胞。由这种基因编码的蛋白质是调控T细胞和天然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。
白细胞介素-15 (IL-15)是被两个团体同时鉴定为T细胞激活因子的14-15 kDa糖蛋白(Grabstein，K.H.等人，Science 1994，264，965；Burton，J.D.等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 1994，91，4935)。IL-15 mRNA在不同的细胞和组织中广泛表达，然而，由于其表达在翻译和细胞内运输水平上的强转录后控制，难以在这些细胞或细胞上清液中找到该蛋白质(Bamford RN.等人，J. Immunol. 1998，160: 4418-4426；Kurys G等人，J. Biol.Chem. 2000，275: 30653-30659)。此外，已显示了IL-15可以作为膜蛋白以活性形式存在(Musso等人，Blood 1999，第93卷，第10期(5月15日): 第3531-3539页)，并且最近注意到它可以充当配体或作为受体(Budalgian等人，JBC 2004，第279卷，第40期：第42192-42201页)，通过该途径诱导促炎细胞因子的分泌。可溶性蛋白的高表达水平已与自身免疫性疾病和炎性疾病的发病机制相关。IL-15已在几种疾病中检测到，所述疾病包括克罗恩氏病(Kirman I.，1996，Am. J. Gastroenterol. 91，1789)、牛皮癣(Ruckert R. 2000，165:2240-2250)、白血病(Yamada Y. 1999，Leukemia and Lymphoma，35 (1-2): 37-45)和类风湿性关节炎(RA) (Mclnnes I.B. 1998，Immunology Today，19，75-79)。配体与T细胞受体的结合诱导IL-15Rα的表达，以及几种激活抗原如CD69、CD25和TNFRII的表达。此外，IL-15是人血液T淋巴细胞的化学引诱剂(Wilkinson 1995，J. Exp. Med. 181，1255-1259)。所有这些数据都提示了，由抗原呈递细胞表达的IL-15对在炎症部位处的早期T细胞活化可能是重要的。
IL-15是四个小α螺旋束细胞因子家族的成员。IL-15的生物学效应通过其与细胞膜受体的结合来介导，所述细胞膜受体由三个亚基α、β和γ组成。IL-15Rα是对于这种细胞因子特异性的亚基，它以非常高的亲和力Kd 10−11与其结合，并且可以作为膜受体或以可溶性形式发现(Budagian V.等人，JBC 2004，279，39: 40368-40375；Mortier等人，TheJournal of Immunology，2004，173: 1681-1688)。IL-15Ra含有寿司(Sushi)结构域，其能够与IL-15结合，并且在结合后对于IL-15的生物学功能是必需的。
IL-15具有与低分子量、短体内半衰期、难以控制的重复剂量相关的局限性，并且很可能引起全身免疫副作用。迫切需要找到可以增加体内半衰期，并且促进或增强IL-15在体内的生物活性的方法。
最近，发现由IL-15及其受体IL-15Rα形成的复合物可以显著增强IL-15的生物活性。研究显示了，由IL-15和可溶性受体IL-15Rα形成的复合物在刺激记忆CD8+ T淋巴细胞和NT/NKT细胞的增殖方面显著优于单独的IL-15。IL-15/IL-15Rα复合物在刺激记忆CD8+ T细胞的增殖和维持其存活方面与单独的IL-15相比10倍有余，并且机制可能与顺式呈递相关。
国际申请WO2007046006、WO2016095642公开了预期用于刺激IL-15Rβ/γ信号传导途径以从而诱导和/或刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞如NK和/或T细胞的活化和/或增殖的融合蛋白及其在癌症治疗中的用途，其特征在于包含通过共价键间接连接至多肽的IL-15，所述多肽含有IL-15Rα的细胞外区域的寿司结构域。然而，WO2007046006仅提供了关于经由N和C末端氨基酸通过接头肽与IL-15Rα连接的IL-15的超级激动剂的实验数据和特性，而WO2016095642仅提供了关于通过嵌合S-S键连接的超级激动剂的实验数据和特性，所述嵌合S-S键通过IL-15配体和IL-15Rα本身中的Cys突变形成。两者均未提供关于IL15超级激动剂变体的活性和物理化学特性的任何证据，所述变体包含通过S-S键连接或不含S-S桥的融合蛋白结构域。
这些对象具有与低分子量、短体内半衰期有关的局限性。它们具有白细胞介素15的有限活性，并且其生产特别是在中国仓鼠卵巢细胞中是非常困难的，且与低产率相关。
国际申请WO 2015103928、WO2018071919公开了关于上述问题的解决方案的变体，特别是包含蛋白质(I)和蛋白质(II)的异二聚体IL-15激动剂蛋白质，其中所述蛋白质(I)通过与第一Fc变体融合的IL-15形成，第一Fc变体与IL-15的C末端连接，并且所述蛋白质(II)是第二Fc变体或者通过与第二Fc变体融合的IL-15Rα或其变体形成，第二Fc变体与IL-15Rα的C末端连接。蛋白质(I)和蛋白质(II)通过第一Fc变体和第二Fc变体之间的“旋钮入孔(knobs-into-holes)”相互作用形成稳定的异二聚体蛋白质。
基于IL-15的免疫细胞因子的生成对于将靶向肿瘤的肿瘤特异性抗体的有利性质与白细胞介素15的免疫调节效应组合是特别有利的。
国际申请WO2015018528、WO2018071918公开了免疫细胞因子，其包含缀合物以及通过共价键与所述缀合物直接或间接连接的免疫调节抗体或其片段，其中所述缀合物包括包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肽、以及IL-15Rα或其衍生物的寿司结构域的氨基酸序列。
国际申请WO 2012175222公开了用于治疗癌症的免疫细胞因子，其包含缀合物和抗体或其片段，所述抗体或其片段选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Facb、Fd和scFv，其中所述缀合物包括包含白细胞介素15的氨基酸序列的多肽、以及包含IL-15Rα的寿司结构域的氨基酸序列的多肽。缀合物和抗体或其片段使用提供蛋白质缀合的双功能偶联剂进行共价连接。
国际申请WO2019006472公开了双功能异二聚体蛋白质，其包含：
IL-15/IL-15Ra融合蛋白，其包含IL-15Ra蛋白、IL-15蛋白和第一Fc结构域；和
结合选自人CD8、人NKG2A和人NKG2D的抗原的抗原结合结构域单体，其包括包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体的重链、以及包含可变轻链(VL)和轻恒定结构域(CL)的轻链，其中VH是重链可变结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域，
其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域具有选自以下的一组氨基酸取代：
S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q；
S364K / E357Q: L368D / K370S；
L368D / K370S: S364K；
L368E / K370S: S364K；
T411T / K360E / Q362E: D401K；
L368D / K370S: S364K / E357L；和
K370S:S364K / E357Q。
尽管存在IL-15及其受体IL-15Rα的复合物的上述现有技术解决方案，仍然需要基于IL15的分子，其将具有高稳定性、延长的体内半衰期、增加的体内生物活性以及在哺乳动物细胞中增加的生产率。
由本发明人开发的包含基于IL-15和IL-15Rα的异二聚体分子的新的免疫细胞因子形式，显示出更高的稳定性、在哺乳动物细胞中增加的生产率、延长的体内半衰期和增加的体内生物活性。此外，它们是具有IL15活性性质的双特异性免疫细胞因子的通用形式。根据临床前研究的结果，由本发明人开发的新的免疫细胞因子形式具有减少的毒性。
发明内容
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包括包含以下的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自CK或CL的抗体轻链恒定结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的IL-15Rα、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15Rα变体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的IL-15、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15变体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含经由铰链连接的第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15或IL-15Rα，所述抗体重链恒定结构域按下述次序排列：CH1-铰链-CH2-CH3。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含属于IgG的Fc片段。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自以下的Fc片段：人IgG1、IgG2或IgG4。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含上述两种IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用作用于治疗癌症或自身免疫性疾病的治疗剂。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用作用于治疗癌症的治疗剂。
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物、以及特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段，
其中所述IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物包含：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自CK或CL的抗体轻链恒定结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的IL-15Rα、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15Rα变体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的IL-15、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15变体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含经由铰链连接的第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15或IL-15Rα，所述抗体重链恒定结构域按下述次序排列：CH1-铰链-CH2-CH3。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体或其抗原结合片段，其特异性抑制PD-1途径，并且是特异性结合PD-1的抗体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包含：
a)轻链，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
b)重链，其包含重链可变结构域和抗体重链恒定结构域，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含轻链可变结构域，其包含分别由SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含轻链可变结构域，其包含由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含重链可变结构域，其包含分别由SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含重链可变结构域，其包含由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
1)轻链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)；
2)重链可变结构域，其包含分别由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
1)轻链可变结构域，其包含由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列。
2)重链可变结构域，其包含由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段，其是特异性结合PD-L1的抗体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物，其包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子具有在抗体恒定结构域中的突变，其诱导两个不同部分的异二聚化，所述部分之一包含共价缔合或非共价缔合的与抗体恒定结构域连接的IL-15Rα以及与抗体恒定结构域连接的IL-15，而另一部分包含共价缔合或非共价缔合的抗体轻链和重链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
第一Fc单体和第二Fc单体，其选自下述：第一Fc单体是旋钮修饰的Fc，且第二Fc单体是孔修饰的Fc，或者当第二Fc单体是旋钮修饰的Fc时，第一Fc单体是孔修饰的Fc。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有氨基酸取代S354C/T366W的第一Fc单体、以及具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V的第二Fc单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407的第一Fc单体、以及具有氨基酸取代S354C/T366W的第二Fc单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含属于IgG的Fc片段。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段，其中所述Fc片段同种型选自：人IgG1、IgG2或IgG4。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用于治疗肿瘤疾病。
在一个方面，本发明涉及编码任何上述免疫细胞因子的分离的核酸。
在一些实施方案中，核酸是DNA。
在一个方面，本发明涉及包含上述核酸的表达载体。
在一个方面，本发明涉及用于产生上述免疫细胞因子的宿主细胞的生产方法，其包括用上述载体转化细胞。
在一个方面，本发明涉及用于产生上述免疫细胞因子的宿主细胞，其包含上述核酸。
在一个方面，本发明涉及用于产生包含上述免疫细胞因子的药物的方法，其包括在足以产生所述免疫细胞因子的条件下，在培养基中培养上述宿主细胞，需要时，随后为所得到的免疫细胞因子的分离和纯化。
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的治疗有效量的上述免疫细胞因子。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤疾病。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗选自以下的肿瘤疾病：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSICRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
在一个方面，本发明涉及用于治疗肿瘤疾病的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的所述免疫细胞因子或所述药物组合物。
在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
在一个方面，本发明涉及用于激活需要此类激活的受试者中的T细胞群体或NK细胞群体的生物活性的方法，其包括向受试者施用有效量的上述免疫细胞因子或上述药物组合物。
在一个方面，本发明涉及所述免疫细胞因子或所述药物组合物用于治疗需要肿瘤疾病的此类治疗的受试者的用途。
在一些用途中，肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
附图说明
图1. 包含IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子形式(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)。
图2. 包含IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子形式(CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA)。
图3. 包含IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物和特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体的免疫细胞因子形式(Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA)。
“旋钮”应理解为意指在CH3结构域中的第一Fc变体和第二Fc变体之间形成“旋钮入孔”结构的突变。
图4. 包含IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白质复合物和特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体的免疫细胞因子形式(Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1Fc旋钮LALA)。
“旋钮”应理解为意指在CH3结构域中的第一Fc变体和第二Fc变体之间形成“旋钮入孔”结构的突变。
图5. pEE-IL15Ra-CK载体。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是细菌中的pUC复制起点，
CMV-启动子是巨细胞病毒早期基因的启动子，
前导区是前导区序列，
IL15Ra是编码白细胞介素15受体α亚基的基因，
CK是编码轻链恒定结构域的基因，
Poly A是多聚腺苷酸化信号序列，用于增加mRNA稳定性，
OriP是细菌中的复制起点或细菌细胞中的高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点。
图6. pEE-IL15-CH1-Fc-LALA载体。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是细菌中的pUC复制起点，
CMV-启动子是巨细胞病毒早期基因的启动子，
前导区是前导区序列，
IL15是编码白细胞介素15的基因，
CH1是编码第一重链恒定结构域的基因，
Fc-LALA是编码携带LALA突变(Fc片段的CH2恒定结构域中的L234A和L235A突变)的Fc片段的基因，
Poly A是多聚腺苷酸化信号序列，用于增加mRNA稳定性，
OriP是细菌中的复制起点或细菌细胞中的高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点。
图7. pEE-BCD100-02-VL-CK载体。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是细菌中的pUC复制起点，
CMV-启动子是巨细胞病毒早期基因的启动子，
前导区是前导区序列，
aPD1-VL是编码抗体轻链的基因，所述抗体特异性结合PD1，
CK是编码轻链恒定结构域的基因，
Poly A是多聚腺苷酸化信号序列，用于增加mRNA稳定性，
OriP是细菌中的复制起点或细菌细胞中的高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点。
图8. pEE-BCD100-02-VH-CH1-Fc-孔-LALA载体。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是细菌中的pUC复制起点，
启动子是巨细胞病毒早期基因的启动子，
前导区是前导区序列，
aPD1-VH是编码抗体重链的可变结构域的基因，所述抗体特异性结合PD1，
CH1是编码第一重链恒定结构域的基因，
Fc-孔-LALA是编码Fc片段的基因，所述Fc片段携带形成“孔”的突变和LALA突变(Fc片段的CH2恒定结构域中的L234A和L235A突变)，
STOP是终止密码子，
OriP是细菌中的复制起点或细菌细胞中的高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点。
图9. pEE-IL15-CH1-Fc-旋钮-LALA载体。
AmpR是β-内酰胺酶基因，其提供对氨苄青霉素的抗性，
pUC起点是细菌中的pUC复制起点，
CMV-启动子是巨细胞病毒早期基因的启动子，
前导区是前导区序列，
IL15是编码白细胞介素15的基因，
CH1是编码第一重链恒定结构域的基因，
Fc-旋钮-LALA是编码Fc片段的基因，其携带形成“旋钮”的突变和LALA突变(Fc片段的CH2恒定结构域中的L234A和L235A突变)，
STOP是终止密码子，
OriP是细菌中的复制起点或细菌细胞中的高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点。
图10A. 含有β-巯基乙醇的SDS凝胶电泳
1. 对照抗体 5μl
2. Fermentas未染色标记物
3.–
4. 在纯化之前具有CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA的生长培养基 10 µl
5. 在纯化之后具有CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA的生长培养基 10 µl
6. 纯化的CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 10 µl
7.-
8. 在纯化之前具有CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA的生长培养基 10 µl
9. 在纯化之后具有CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA的生长培养基 10 µl
10. 纯化的CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 10 µl
图10B. 不含β-巯基乙醇的SDS凝胶电泳
1. 纯化的CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 10 µl
2. 纯化的CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 10 µl
3. Fermentas未染色标记物
4. 对照抗体 5µl
图11. 增殖活性的测量。NK-92细胞系用于测定中。测定在96孔培养板中进行。悬浮液包含NK-92细胞，以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有胎牛血清和谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后将Alamar Blue加入孔中。在温育之后，测量孔中的荧光强度。
图12. 增殖活性的测量。测定使用通过阴性选择从健康供体的PBMC中分离的天然杀伤细胞。测定在96孔培养板中进行。悬浮液包含天然杀伤细胞，以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有自体人血浆的培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后将Alamar Blue加入孔中。在温育之后，测量孔中的荧光强度。
图13. aPD1比活性的测量。对于测定，我们使用Jurkat NFAT-FLuc PD-1细胞系，其基于Jurkat细胞系生成，且在其表面上稳定表达PD-1，且含有处于NFAT启动子的控制下的萤火虫萤光素酶编码基因；并且Raji PDL1细胞系基于Raji细胞系生成，且在其表面上稳定表达PDL1。测定在96孔培养板中进行。每个孔中的悬浮液含有浓度为1 ng/ml的JurkatNFAT-FLuc PD-1细胞、Raji PDL1细胞、aCD3/aTAA1细胞以及以如图中所示的浓度的测试抗体。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育，然后使用发光测定试剂盒，测量孔中的萤光素酶强度。
图14. 在报告细胞系上的抗PDL1/IL15SA抗体比活性的确定。
图15. 天然杀伤细胞对ADCC的作用的确定。测定使用通过阴性选择从健康供体的PBMC中分离的天然杀伤细胞。测定在96孔培养板中进行。悬浮液含有天然杀伤细胞和Raji细胞、效应抗体利妥昔单抗以及以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有胎牛血清和谷氨酰胺的培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后收集培养液，并且使用LDH测定试剂盒，测量乳酸脱氢酶含量。
图16. 相对于利妥昔单抗针对TAA报告系的增强ADCC能力，免疫细胞因子的比活性的测定结果。
图17. 包含IL-15/IL-15Rα (IL15SA)异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子变体对NK细胞的细胞毒性的研究。
结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。
图18. IL15SA变体对B细胞的细胞毒性的研究。
结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。
图19. IL15SA变体对CD3+细胞的细胞毒性的研究。
结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。
图20. IL15SA变体对CD4+细胞的细胞毒性的研究。
结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。
图21. IL15SA变体对CD8+细胞的细胞毒性的研究。
结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。
图22. 层析图。该层析图证实了免疫细胞因子的高同质性(溶液中的聚集体含量不多于5%)，所述免疫细胞因子包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物(IL15超级激动剂)。
图23. 用于确定免疫细胞因子产物在鼠体内肿瘤模型中的抗肿瘤活性的实验方案，所述免疫细胞因子包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物(BCD-225)。
图24. 用于确定免疫细胞因子产物变体在鼠体内肿瘤模型中的抗肿瘤活性的实验结果，所述免疫细胞因子包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物(BCD-225)(曲线图)。
图25. 用于确定免疫细胞因子产物变体在鼠体内肿瘤模型中的抗肿瘤活性的实验结果，所述免疫细胞因子包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物(BCD-225)(图解)。
具体实施方式
一般定义和一般方法
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。通常，本文所述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学、以及蛋白质和核酸的杂交和化学的分类和方法是众所周知的，并且由本领域技术人员广泛使用。酶反应和纯化方法根据制造商的指南，如本领域中常见的或如本文所述的执行。
除非另有说明，否则关于本发明的多肽的术语“生物活性的”和“生物活性”和“生物特性”意指具有结合生物分子的能力。
术语“重组蛋白质”意指在包含编码所述蛋白质的核苷酸序列的细胞或细胞系中表达的蛋白质(多肽)，其中所述核苷酸序列与细胞并非天然关联的。
术语“双特异性抗体”指具有抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域能够与单一生物分子上的两个不同表位特异性结合、或能够与两种不同生物分子上的表位特异性结合。双特异性抗体在本文中也被称为具有“双重特异性”或是“双重特异性”抗体。
术语“单克隆抗体”或“mAb”指由分开的细胞克隆群体合成且分离的抗体。克隆群体可以是永生化细胞的克隆群体。在一些实施方案中，克隆群体中的永生化细胞是杂合细胞即杂交瘤，通常通过将来自免疫动物的个体B淋巴细胞与来自淋巴细胞瘤的个体细胞融合而产生。杂交瘤是一类构建细胞，并且在自然界中不存在。
如本文使用的，术语"Ka"指特定抗体-抗原相互作用的缔合(on)速率。
如本文使用的，术语"Kd"指特定抗体-抗原相互作用的解离(off)速率。
“结合亲和力”一般指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则“结合亲和力”指固有的(特性的、真实的)结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对于其结合配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。优选的Kd值是约200 nM、150 nM、100 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、8 nM、6 nM、4 nM、2 nM、1 nM或更小。亲和力可以通过包括本文所述的方法在内的本领域已知的常见方法来测量。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，所述方法中的任一种均可以用于本发明的目的。
如本文使用的，术语“肽接头”预期意指具有组合结构域的能力的任何肽，其长度取决于与之彼此结合的结构域，并且包含任何氨基酸序列。优选地，肽接头具有多于5个氨基酸的长度，并且由选自G、A、S、P、E、T、D、K的任何氨基酸的集合组成。
术语“体外”指在人工条件下机体外部的生物实体、生物过程或生物反应。例如，体外生长的细胞应理解为在机体外部的环境中，例如在试管、培养小瓶或微量滴定板中生长的细胞。
如本文使用的，词语“包含(comprise)”、“具有(have)”、“包括(include)”，或者变化例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”或“包括(including)”，以及其所有语法变化应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。
发明详述
免疫细胞因子
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包括包含以下的基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
上述免疫细胞因子的形式显示于图1和图2中。
术语“免疫细胞因子”意指包含抗体或其片段的分子，所述抗体或其片段通过共价键与细胞因子或其衍生物直接或间接连接。所述抗体和所述细胞因子可以通过接头肽进行连接。
本发明的免疫细胞因子考虑指分离的免疫细胞因子。
用于描述本说明书的各种免疫细胞因子的术语“分离的”，意指已从表达免疫细胞因子的细胞或细胞培养物中鉴定和分开和/或再生的免疫细胞因子。来自其天然环境的杂质(污染物组分)是将干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将免疫细胞因子纯化(1)到足以通过使用旋转杯测序仪(Edman sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)在非还原或还原条件下，使用考马斯亮蓝或优选地银染色，基于SDS-PAGE的同质性。分离的免疫细胞因子包括重组细胞内的原位免疫细胞因子，因为不存在多肽的天然环境的至少一种组分。分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文使用的，“异二聚体蛋白质复合物”指由IL-15和IL-15Rα的组合形成的蛋白质。
如本文使用的，“IL-15”或“IL-15肽”或“白细胞介素15”可以是任何IL-15 (白细胞介素15)或其突变体，例如人或非人哺乳动物IL-15或者非哺乳动物IL-15。示例性的非人哺乳动物包括哺乳动物，例如猪、兔、猴、黑猩猩、小鼠等等；并且非哺乳动物包括鸡等等。优选地，人白细胞介素-15成熟分子在数据库UniProtKB，登录号P40933，49-162aa中找到。术语“IL-15变体”指由于一个或多个氨基酸取代、添加或缺失，对其受体具有增加或降低的亲和力、或者在刺激T细胞或NK细胞中的活性增加或降低的变体分子。
“IL-15Rα”意指白细胞介素15受体亚基alpha (α)，并且根据本发明，可以是任何IL-15Rα化合物或其功能片段，例如人IL-15Rα或非人哺乳动物IL-15Rα或非哺乳动物IL-15Rα。示例性的非人哺乳动物包括哺乳动物，例如猪、兔、猴、黑猩猩、小鼠等等；并且非哺乳动物包括鸡等等。优选的IL-15Rα分子在数据库UniProtKB，登录号Q13261 (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261)中找到。
免疫球蛋白的片段可结晶区(“Fc区、Fc”)是与细胞表面Fc-受体以及补体系统的一些蛋白质相互作用的免疫球蛋白分子的“尾”区。这种性质允许抗体激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，所述蛋白质片段分别来自两条重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域；在IgM和IgE同种型中，Fc区含有每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
“Fc片段单体”应理解为意指来自两条重链中的任一条(对于IgG、IgA和IgD同种型)的第二恒定结构域和第三恒定结构域的Fc区；对于IgM和IgE同种型，Fc单体包含两条重链之一的三个恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自CK或CL的抗体轻链恒定结构域。
在哺乳动物中，已知只有由lambda (λ)和kappa (κ)表示的两种类型的轻链。λ轻链的恒定结构域指定为CL，且κ轻链的恒定结构域指定为CK。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASS(SEQ ID NO:9)表示的氨基酸序列的IL-15Rα、或具有相似生物活性的含有突变的任何已知的IL-15Rα变体。
突变型IL-15Rα、具有相似生物活性的IL-15Rα应理解为指本领域已知的任何IL-15Rα，其包含突变并且具有与“野生型” IL-15Rα相比相似的生物活性。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO:10)表示的氨基酸序列的IL-15、或具有相似生物活性的含有突变的任何已知的IL-15变体。
突变型IL-15、具有相似生物活性的IL-15意指本领域已知的任何IL-15，其包含突变并且具有与“野生型” IL-15相比相似的生物活性。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:1)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQID NO:19)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列通过在位置216处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:21)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列通过在位置233处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含经由铰链连接的第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15或IL-15Rα，所述抗体重链恒定结构域按下述次序排列：CH1-铰链-CH2-CH3。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:4)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:22)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列通过在位置212处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:2)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:20)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列通过在位置229处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1)或DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:19)表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:2)或DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:20)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1)表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:2)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:19)表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:20)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:4)或DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:22)表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3)或DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA(SEQ ID NO:21)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:4)表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:22)表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:21)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
Fc片段中的突变应理解为意指本文所述抗体的氨基酸序列的修饰。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸内或通过肽合成，来产生抗体的氨基酸序列的变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。制备缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特性。
使用氨基酸取代修饰抗体的氨基酸序列的变体是用另一个残基取代抗体分子中的至少一个氨基酸残基。
保守取代显示于表A中的“优选取代”下。
表A
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gin；Asn Lys
Asn(N) Gin；His；Asp，Lys；Arg Gin
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gin；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gin；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
术语抗体的“效应子功能”指可归于抗体的Fc区(天然Fc区序列或Fc区氨基酸变体)的生物活性，其随抗体同种型而变。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体，BCR)的下调和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的应答，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的裂解或吞噬作用。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达FcγRJII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet，Annu. Rev. Immunol 9：457-92 (1991)的第464页上的表3中进行概括。为了评价目的分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的那种。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内，例如在动物模型如Clynes等人PNAS(USA) 95：652-656 (1998)公开的那种中，评价目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源分离，例如从本公开中所述的血液或PBMC中分离。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指分子在补体的存在下裂解靶的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(C1q)与分子(例如抗体)的结合而开始，所述分子与同源抗原复合。为了评价补体激活，可以执行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol. Methods 202: 163 (1996)中所述的。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含属于IgG的Fc片段。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自以下的Fc片段：人IgG1、IgG2或IgG4。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含基于IL-15/IL-15Rα的上述两种异二聚体蛋白质复合物。
本发明的IL15超级激动剂(也称为BCD225或IL15SA或(IL15SA)2-Fc)应理解为指CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA和CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA。
名称CK、IL15Ra、IL15、CH1FcLALA的含义在本申请的正文自始至终给出。
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA是包含基于IL-15/IL-15Rα的两种异二聚体蛋白质复合物的上述免疫细胞因子，其包含与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15Ra、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含LALA突变。
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA是包含基于IL-15/IL-15Rα的两种异二聚体蛋白质复合物的上述免疫细胞因子，其包含与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15Ra，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含LALA突变。
上述免疫细胞因子可以以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式，以及以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域不具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式两者进行制备；在特定情况下，为此，两个半胱氨酸均由丙氨酸替换。
上述免疫细胞因子的实验研究证实上述免疫细胞因子的活性没有显著差异，所述免疫细胞因子呈其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式，以及以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域不具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式两者。
上述免疫细胞因子的形式显示于图1和图2中。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用作用于治疗癌症或自身免疫性疾病的治疗剂。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用作用于治疗癌症的治疗剂。
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物、以及特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段，
其中所述基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物包含：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
如本文使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”(Ig)包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。术语“抗体”指包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。已知的是由希腊字母表示的五种类型的哺乳动物Ig重链：α，δ，ε，γ和μ。存在的重链类型限定了抗体的种类；这些链分别在IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中发现。不同的重链在大小和组成方面不同；α和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε具有大约550个氨基酸。每条重链具有两个区域，恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中都是等同的，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由三个恒定结构域CH1、СН2和CH3(成一条线)组成的恒定区，以及用于增加柔性的铰链区(Woof J.，Burton D.，Nat RevImmunol 4，2004，cc.89-99)；重链μ和ε具有由四个恒定结构域CH1、СН2、CH3和CH4组成的恒定区。在哺乳动物中，已知的是由lambda(λ)和kappa(κ)表示的仅两种类型的轻链。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链的大约长度是211至217个氨基酸。优选地，轻链是kappa (κ)轻链，并且恒定结构域CL优选是C kappa (κ)。
根据本发明的“抗体”可以是任何种类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选IgG)、或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，优选IgG1)。
VL和VH区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布在称为构架区(FR)的更保守区域之间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简单地“抗体部分”或“抗体片段”)指抗体的一个或多个片段，其保留与抗原特异性结合的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH 1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab') 2片段，包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH/VHH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546)；以及(vi)提取的互补决定区(CDR)。另外，Fv片段的两个区域VL和VH由分开的基因编码，它们可以使用合成接头使用重组方法进行连接，所述合成接头致使其能够接受单条蛋白质链，在所述链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；以及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。假定此类单链分子也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段。
优选地，本发明抗体的抗原结合部分的CDR或整个抗原结合部分衍生自小鼠、美洲驼(lama)或人供体文库，或者是基本上人起源的，其中某些氨基酸残基被改变，例如，被不同的氨基酸残基取代，以便优化抗体的特异性性质，例如KD、koff、IC50、EC50、ED50。优选地，本发明的抗体的构架区是人起源的或基本上人起源的(至少80、85、90、95、96、97、98或99%人起源的)。
在其它实施方案中，本发明抗体的抗原结合部分可以衍生自其它非人物种，包括小鼠、美洲驼、兔、大鼠或仓鼠，但不限于此。可替代地，抗原结合区可以衍生自人物种。
术语“可变的”指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列方面极大不同的事实。V结构域介导抗原结合，并且决定每种特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性跨越可变结构域的110个氨基酸跨度并非均匀分布的。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的不变片段组成，所述不变片段由称为“高变区”或CDR的极度可变性的较短区域分开。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，在很大程度上采取β-折叠构型，由三个高变区连接，所述三个高变区形成连接β-折叠结构，并且在一些情况下构成β-折叠结构的部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起，促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定结构域并不直接涉及抗体与抗原的结合，而是显示出各种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与。
如本说明书中使用的，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含来自“互补决定区”或“ CDR”的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。
在某些情况下，可能还期望改变一个或多个CDR氨基酸残基，以便改善与靶表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”，并且可以任选地与人源化结合执行，例如在其中抗体的人源化导致减少的结合特异性或亲和力，并且不能通过单独的回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的，例如由Burks等人，Proc NatlAcad Sci USA，94:412–417 (1997)描述的体外扫描饱和诱变方法，以及由Wu等人，ProcNatl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)的逐步体外亲和力成熟方法。
“构架区” (FR)是除CDR残基外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR根据Kabat限定，则轻链FR残基在残基1-23(LCFR1)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)和98-107 (LCFR4)周围定位，而重链FR残基在重链中的残基1-30 (HCFR1)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)和103-113 (HCFR4)周围定位。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，则轻链FR残基在轻链中的残基1-25 (LCFR1)、33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)和97-107 (LCFR4)周围定位，而重链FR残基在重链残基中的残基1-25 (HCFR1)、33-52 (HCFR2)、56-95 (HCFR3)和102-113 (HCFR4)周围定位。在一些情况下，当CDR包含来自如由Kabat定义的CDR的氨基酸和高变环的氨基酸两者时，FR残基将相应地进行调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在位置1-25处，而FR2残基在位置36-49处。
“结合”靶抗原的本发明的抗体指能够以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得该抗体可以用作诊断剂和/或治疗剂，靶向表达所述抗原的蛋白质或细胞或组织，并且与其它蛋白质轻微地交叉反应。根据分析方法：荧光激活细胞分选(FACS)、放射性免疫测定(RIA)或ELISA，在此类实施方案中，抗体与非靶蛋白结合的程度小于抗体与特异性靶蛋白结合的10%。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽靶上的表位，意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含在异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含选自CK或CL的抗体轻链恒定结构域。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASS(SEQ ID NO:9)表示的氨基酸序列的IL-15Rα、或具有相似生物活性的含有突变的任何已知的IL-15Rα变体。
突变型IL-15Rα、具有相似生物活性的IL-15Rα应理解为指本领域已知的任何IL-15Rα，其包含突变并且具有与“野生型” IL-15Rα相比相似的生物活性。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (SEQ ID NO:10)表示的氨基酸序列的IL-15、或具有相似生物活性的含有突变的任何已知的IL-15变体。
突变型IL-15、具有相似生物活性的IL-15意指本领域已知的任何IL-15，其包含突变并且具有与“野生型” IL-15相比相似的生物活性。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQID NO:1)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQID NO:19)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列通过在位置216处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:21)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列通过在位置233处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含经由铰链连接的第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15或IL-15Rα，所述抗体重链恒定结构域按下述次序排列：CH1-铰链-CH2-CH3。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:6)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:24)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列通过在位置212处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:5)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:23)表示的氨基酸序列。
由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列通过在位置229处的半胱氨酸(C)到丙氨酸(A)的单个氨基酸取代，根据由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列进行修饰。这种取代使得能够产生包含在异二聚复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域的免疫细胞因子，其不具有通过天然S-S桥的共价缔合。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体或其抗原结合片段，其特异性抑制PD-1途径，并且是特异性结合PD-1的抗体。
特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量。例如，特异性结合可以通过与类似于靶的对照分子(例如过量的未标记靶)竞争来测定。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记靶竞争性抑制，则指示特异性结合。如本说明书中使用的，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽靶上的表位，可以通过对于靶具有以下Kd的分子进行描述：至少约200 nM、或至少约150nM、或至少约100 nM、或至少约60 nM、或至少约50 nM、或至少约40 nM、或至少约30 nM、或至少约20 nM、或至少约10 nM、或至少约8 nM、或至少约6 nM、或至少约4 nM、或至少约2nM、或至少约1 nM或更大。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中分子结合特定多肽上的特定多肽或表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包含：
a)轻链，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
b)重链，其包含重链可变结构域和抗体重链恒定结构域，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含轻链可变结构域，其包含分别由氨基酸序列GGNNIGSKNVH (SEQ ID NO:14)、RDSNRPS (SEQ ID NO:15)和CQVWDSSTAV (SEQ ID NO:16)表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含轻链可变结构域，其包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQ (SEQ ID NO:18)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含重链可变结构域，其包含分别由氨基酸序列FTFSSYWMY (SEQ ID NO:11)、AIDTGGGRTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)和CARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDA (SEQ ID NO:13)表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含重链可变结构域，其包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
1)轻链可变结构域，其包含分别由氨基酸序列GGNNIGSKNVH (SEQ ID NO:14)、RDSNRPS (SEQ ID NO:15)和CQVWDSSTAV (SEQ ID NO:16)表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)；
2)重链可变结构域，其包含分别由氨基酸序列FTFSSYWMY (SEQ ID NO:11)、AIDTGGGRTYYADSVKG (SEQ ID NO:12)和CARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDA (SEQ ID NO:13)表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
1)轻链可变结构域，其包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQ (SEQ ID NO:18)表示的氨基酸序列；
2)重链可变结构域，其包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:17)表示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ IDNO 7)表示的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体，其包括：
包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO 7)表示的氨基酸序列的重链；
包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含免疫调节抗体prolgolimab (BCD100，WO2018013017)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段，其是特异性结合PD-L1的抗体。
在一些实施方案中，特异性结合PD-L1的抗体是BCD135，其公开于RU2665790(WO2018194496)中。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物，其包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1)表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:5)表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO 7)表示的氨基酸序列的重链；
包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物，其包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:19)表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:23)表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO 7)表示的氨基酸序列的重链；
包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:6)表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:3)表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO 7)表示的氨基酸序列的重链；
包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
a)与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα，其具有由DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPСRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO:24)表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15，其具有由DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (SEQ ID NO:21)表示的氨基酸序列；
b)免疫调节抗体，其包括：
包含由QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO 7)表示的氨基酸序列的重链；
包含由QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO 8)表示的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子具有在抗体恒定结构域中的突变，其诱导两个不同部分的异二聚化，所述部分之一包含共价缔合或非共价缔合的与抗体恒定结构域连接的IL-15Rα以及与抗体恒定结构域连接的IL-15，而另一部分包含共价缔合或非共价缔合的抗体轻链和重链。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含：
第一Fc单体和第二Fc单体，其选自下述：第一Fc单体是旋钮修饰的Fc，且第二Fc单体是孔修饰的Fc，或者当第二Fc单体是旋钮修饰的Fc时，第一Fc单体是孔修饰的Fc。
“旋钮入孔”(“旋钮入孔”类型的相互作用)是使得能够避免与错配副产物相关的问题的方法。该方法旨在通过将突变引入CH3结构域内以修饰接触界面，来迫使两条不同抗体重链的配对。在一条链上，庞大的氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以产生“孔”。相反，将具有大侧链的氨基酸引入另一个CH3结构域内，以产生“旋钮”。通过共表达这两条重链，观察到异二聚体形成(“旋钮-孔”)相对于同二聚体形成(“孔-孔”或“旋钮-旋钮”)的高产率(Ridgway，J. B.，Presta L G，Carter P；以及WO 1996/027011)。通过使用噬菌体展示技术重塑两个CH3结构域的界面，并引入二硫桥以稳定异二聚体，可以进一步增加异二聚体的百分比(Merchant，A. M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell，S.，Ridgway，J.B.，Wells，J. A.，Carter，P.，J Mol Biol 270 (1997) 26-35)。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有氨基酸取代S354C/T366W的第一Fc单体、以及具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V的第二Fc单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407的第一Fc单体、以及具有氨基酸取代S354C/T366W的第二Fc单体。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含属于IgG的Fc片段。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段，其中所述Fc片段同种型选自：人IgG1、IgG2或IgG4。
在一些实施方案中，免疫细胞因子包含Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
进一步地，双特异性IL15超级激动剂或双特异性IL15免疫细胞因子或抗PD1/IL15SA免疫细胞因子(包含IL-15SA和抗PD-1 Fab片段的双特异性单克隆抗体)应理解为意指：
抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA，
抗PD-1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA。
进一步地，抗PD-L1/IL15SA免疫细胞因子应理解为意指：
抗PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA，
抗PD-L1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA。
名称抗PD-1 Fab、抗PD-L1 Fab、CK、IL15Ra、IL15、CH1Fc旋钮LALA的含义在本申请的正文自始至终给出。
抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA是上述免疫细胞因子，其包含抗PD1抗体的抗原结合Fab片段、与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15Ra、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含突变以形成异二聚化(例如旋钮)和LALA。
抗PD-1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA是上述免疫细胞因子，其包含抗PD1抗体的抗原结合Fab片段、与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15Ra，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含突变以形成异二聚化(例如旋钮)和LALA。
抗PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA是上述免疫细胞因子，其包含抗PD-L1抗体的抗原结合Fab片段、与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15Ra、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含突变以形成异二聚化(例如旋钮)和LALA。
抗PD-L1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA是上述免疫细胞因子，其包含抗PD-L1抗体的抗原结合Fab片段、与抗体轻链恒定结构域CK连接的IL15、以及与抗体重链恒定结构域连接的IL15Ra，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，其中所述Fc包含突变以形成异二聚化(例如旋钮)和LALA。
上述免疫细胞因子可以以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式，以及以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域不具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式两者进行制备；在特定情况下，为此，两个半胱氨酸均由丙氨酸替换。
上述免疫细胞因子的实验研究证实上述细胞因子的活性没有显著差异，所述免疫细胞因子呈其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式，以及以其中异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域不具有通过天然S-S桥的共价缔合的形式两者。
如上所述，“旋钮”应理解为意指在CH3结构域中的第一Fc变体和第二Fc变体之间形成“旋钮入孔”结构的突变。
上述免疫细胞因子的形式显示于图3和图4中。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，免疫细胞因子用于治疗肿瘤疾病。
核酸
在一个方面，本发明涉及编码任何上述免疫细胞因子的分离的核酸。
在本说明书中可互换使用的术语“核酸”、“核酸序列(nucleic sequence)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”，意指核苷酸的精确序列，修饰或未修饰，决定核酸的片段或区域，含有或不包含非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或所述DNA的转录产物。
此处还应该包括，本发明并不涉及处于其天然染色体环境中，即处于天然状态的核苷酸序列。本发明的序列已进行分离和/或纯化，即，它们例如通过拷贝直接或间接地进行取样，其环境已被至少部分地修饰。因此，此处还应该提到通过重组遗传学，借助于例如宿主细胞获得的分离的核酸，或通过化学合成获得的分离的核酸。
“分离的”核酸分子是从至少一个核酸分子-杂质中鉴定并且与之分开的核酸分子，前者在天然来源中与所述杂质结合。分离的核酸分子不同于其中它在天然条件下发现的形式或集合。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下存在于细胞中的核酸分子。分离的核酸分子包括位于其中正常表达免疫细胞因子的细胞中的核酸分子，例如，如果该核酸分子具有与其在天然条件下在细胞中的定位不同的染色体定位。
在一些实施方案中，核酸是DNA。
在一个实施方案中，本发明涉及包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24的氨基酸序列。核酸分子还可以包含上述核苷酸序列的任何组合。
如本领域技术人员将了解的，由于遗传密码的冗余，各种不同的DNA序列可以编码具有选自以下的氨基酸序列的肽：SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。产生编码相同氨基酸序列的这些替代DNA序列完全在本领域受过训练的人员的技能内。此类变体DNA序列在本发明的范围内。
表达载体
在一个方面，本发明涉及包含上述核酸的表达载体。
如本文使用的，术语“载体”指能够转运已与之连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA片。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。在一些实施方案中，载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起源位点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在进一步的实施方案中，载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞内之后，整合到宿主细胞的基因组内，并且从而连同宿主基因一起复制。此外，某些载体能够指导与之可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
本发明涉及包含上述核酸分子的载体，所述核酸分子编码如本文所述的上述免疫细胞因子或其结构部分的任何氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞因子通过在表达载体中插入如上所述产生的DNA进行表达，所述DNA部分或全部编码第一免疫细胞因子结构域和第二免疫细胞因子结构域(例如包含与抗体恒定结构域连接的IL15或IL15Rα的结构域、和/或抗体轻链和重链)的序列，使得基因可操作地连接至所需的表达控制序列，例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒，例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的附加体等等。可以将DNA分子连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其预期的调节DNA转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列可以选择为与所使用的表达宿主细胞相容。可以将部分或完全编码第一结合结构域和第二结合结构域的序列(例如，重链和轻链序列，其中结合结构域包含重链和轻链序列)的DNA分子引入各个载体内。在一个实施方案中，将所述DNA分子的任何组合引入相同的表达载体内。可以通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接，或者如果不存在限制性位点，则平端连接)，将DNA分子引入表达载体内。
合适的载体是编码功能完整的人CH或CL/CK免疫球蛋白序列的载体，具有改造的适当的限制性位点，使得如上所述的任何序列VH或VL或IL15或IL15Rα都可以容易地插入且表达。此类载体中编码HC和LC的基因可以含有内含子序列，导致通过稳定相应的mRNA导致增强的总抗体蛋白产率。内含子序列的侧翼为剪接供体和剪接受体位点，其决定了RNA剪接在何处发生。当使用多重内含子时，内含子序列的位置可以在抗体链的可变区或恒定区中、或者在可变区和恒定区两者中。聚腺苷酸化和转录终止可以在编码区下游的天然染色体位点处发生。重组表达载体还可以编码信号肽，其促进抗体链从宿主细胞中的分泌。可以将抗体链的基因或者包含IL15或IL15Rα的链的基因以这样的方式克隆到载体内，使得信号肽与免疫球蛋白链的氨基末端的读码框连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链的基因或者包含IL15或IL15Rα的链的基因之外，本发明的载体的重组表达可以包含调控序列，其控制基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等等。用于在哺乳动物中表达宿主细胞的优选控制序列包括确保在哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自以下的启动子和/或增强子：逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV) (例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40 (SV40) (例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如主要晚期启动子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒和强哺乳动物启动子，例如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。关于病毒控制元件及其序列的进一步描述，参见例如，美国专利号5,168,062、4,510,245和4,968,615。用于在细菌细胞或真菌细胞，例如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域众所周知的。
除上述基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择性标记物基因。选择性标记物基因促进载体已引入其内的宿主细胞的选择(参见例如，美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记物基因对载体已引入其内的宿主细胞通常赋予针对医学药剂，例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。例如，选择性标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在氨甲蝶呤选择/扩增期间在dhfr宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
如本说明书中使用的，术语“表达控制序列”指这样的多核苷酸序列，其是影响与之连接的编码序列的表达和加工所必需的。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，通常，此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期至少包括其存在对于表达和加工是必要的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
术语“控制序列”指在特定宿主生物中，对于表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸置于与另一种核酸序列的功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；如果核糖体结合位点的定位使得促进翻译，则它与编码序列可操作地连接。一般地，“可操作地连接”意指待连接的DNA序列是邻接的，并且在分泌前导区的情况下，是邻接的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是邻接的。
宿主细胞及其生产方法
在一个方面，本发明涉及用于产生上述免疫细胞因子的宿主细胞的生产方法，其包括用上述载体转化细胞。
编码本发明的免疫细胞因子的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可以用于转染合适的哺乳动物或其细胞，植物或其细胞，细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知技术。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，包括右旋糖酐介导的转染、阳离子聚合物-核酸复合物转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、多核苷酸包封在脂质体中、以及DNA直接显微注射到核内。另外，可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞内。用于转染细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如，美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。用于转化植物细胞的方法是本领域众所周知的，包括例如农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、生物弹道转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。用于转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。
在一个方面，本发明涉及用于产生上述免疫细胞因子的宿主细胞，其包含上述核酸。
在一个方面，本发明涉及用于产生包含上述免疫细胞因子的药物的方法，其包括在足以产生所述免疫细胞因子的条件下，在培养基中培养上述宿主细胞，需要时，随后为所得到的免疫细胞因子的分离和纯化。
如本文使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)指重组表达载体已引入其内的细胞。本发明涉及宿主细胞，其可以包括例如上文描述的根据本发明的载体。本发明进一步涉及包含例如核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列编码本发明的免疫细胞因子或其上述部分。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代。因为修饰可以由于突变或环境影响而在后续代中发生，因此，事实上，此类后代可能并不等同于亲代细胞，然而，此类细胞仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。
用作用于转化的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并且包括多个可用的永生化细胞系。这些包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞和许多其它细胞系。通过测定哪些细胞系具有高表达水平，并且提供产生的蛋白质的必需特性来选择细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。当将编码本发明的免疫细胞因子或其一部分的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养一段时间来产生免疫细胞因子，所述时间段足以在宿主细胞中表达本发明的免疫细胞因子或其一部分，或更优选地，将免疫细胞因子分泌到宿主细胞在其中培养的培养基内。可以使用标准蛋白质纯化技术，从培养基中分离免疫细胞因子。植物宿主细胞包括例如烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
此外，可以使用多种已知技术来增强来自生产细胞系的本发明的免疫细胞因子的生产水平。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下用于增强表达的常见方法。GS系统整体或部分与ЕР号0216846、0256055、0323997和0338841结合进行讨论。
在不同细胞系或宿主细胞中的本发明的免疫细胞因子或其一部分很可能具有彼此不同的糖基化模式。然而，如本文公开的免疫细胞因子或其包含本文提供的氨基酸序列的一部分(结构域)是本发明的部分，而与结合分子的糖基化无关，并且一般而言，与翻译后修饰的存在或不存在无关。
药物组合物
在一个方面，本发明涉及用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的治疗有效量的上述免疫细胞因子。
“药物组合物”意指组合物，其包含本发明的免疫细胞因子以及选自药学上可接受的和药学上相容的赋形剂的至少一种组分，例如填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂、递送剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、延递送控制剂，其选择和比例取决于施用的类型和途径以及剂量。本发明的药物组合物及其制备方法对于本领域技术人员无疑是显而易见的。药物组合物应该优选遵照GMP (良好生产规范)要求进行制造。该组合物可以包含缓冲剂组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。组合物的延长作用可以通过减慢活性药物成分的吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括水、乙醇、多元醇及其混合物、油和用于注射的有机酯。
“治疗有效量”指待施用的治疗剂的量，所述量在一定程度上减轻待治疗病症的一种或多种症状。
“药剂(药物)” 是以片剂、胶囊、粉末、冻干制剂、注射剂、输液剂、软膏和其它现成形式，作为药物组合物的化合物或化合物的混合物，其预期用于恢复、改善或改变人和动物的生理功能，以及用于疾病的治疗和预防，用于诊断、麻醉、避孕、美容等。本领域公认的用于施用肽、蛋白质或抗体的任何方法都可以适当地用于本发明的免疫细胞因子。
术语“药学上可接受的”指适合于在哺乳动物，优选人中施用的一种或多种相容的液体或固体组分。
术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的上述成分外的任何成分。这些是无机或有机性质的物质，其用于药物制造中，以便给予药物产品必要的物理化学性质。
术语“缓冲液”、“缓冲液组合物”，“缓冲剂”指这样的溶液，其能够通过其酸碱共轭组分的作用而抵抗pH的变化，并且允许本发明的免疫细胞因子产物抵抗pH的变化。一般地，药物组合物优选具有在4.0至8.0范围内的pH。所使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。
如本文使用的，术语“张度剂(tonic agent)”、“渗透质”或“渗透剂”指可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗”药物是具有与人血相当的渗透压的药物。等渗药物通常具有约250至350 mOsm/kg的渗透压。使用的等渗剂包括但不限于多元醇、糖和蔗糖、氨基酸、金属盐例如氯化钠等。
“稳定剂”指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂、或者两种或更多种赋形剂的混合物。稳定剂包括氨基酸，例如但不限于精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如但不限于聚山梨醇酯20 (商品名称：Tween 20)、聚山梨醇酯80 (商品名称：Tween 80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商品名称：泊洛沙姆、Pluronic、十二烷基硫酸钠(SDS)；抗氧化剂，例如但不限于甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、单硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。
如果在指定的贮存温度例如2–8°C下，在指定的贮存期限过程中，活性剂保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保留物理和化学稳定性两者、以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性测试结果，来调整贮存期限。
本发明的药物组合物可以以现成制剂形式的单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式制造、包装或广泛销售。如本文使用的，术语“单一单位剂量”指离散数量的含有预定数量的活性成分的药物组合物。活性成分的数量通常等于受试者中待施用的活性成分的剂量，或此类剂量的方便部分，例如此类剂量的一半或三分之一。
根据本发明的药物组合物通常适合于作为无菌制剂肠胃外施用，其预期借助于注射、输注和植入绕过胃肠道，通过皮肤和粘膜屏障中的缺口而在人体中施用。例如，肠胃外施用尤其预期包括皮下、腹膜内、肌内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内、经皮注射或输注；和肾透析输液技术。还可以采用肿瘤内递送，例如肿瘤内注射。还提供了区域灌注。优选的实施方案包括静脉内和皮下途径。本领域公认的用于施用肽或蛋白质的任何方法都可以适当地用于本发明的免疫细胞因子。
可注射制剂可以以单位剂型，例如在安瓿瓶、小瓶、塑料容器、预填充注射器、自动注射装置中进行制备、包装或销售，而无限制。用于肠胃外施用的制剂尤其包括悬浮液、溶液、在油性或水性基质中的乳剂、糊剂等等。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，其包含以干燥(即粉末或颗粒)形式提供的药物组合物，用于在施用前由合适的基质(例如灭菌无热原水)重构。此类制剂可以通过例如冻干过程进行制备，所述冻干过程在本领域中称为冷冻干燥，并且涉及将产物冷冻，随后为从冷冻材料中去除溶剂。
本发明的免疫细胞因子还可以单独或作为具有合适的药学上可接受的赋形剂的混合物，鼻内施用或通过从吸入器(例如加压气溶胶容器、泵、喷射器、喷雾器或雾化器)吸入施用，其中使用或不使用合适的推进剂，或者作为滴鼻剂或喷雾剂施用。
用于肠胃外施用的剂型可以配制为立即释放或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和按程序释放。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗自身免疫性疾病。
如本说明书中使用的，术语“自身免疫性疾病”指起于且针对个体的自身(自体)抗原和/或组织的非恶性疾病或病症。
“自身免疫性疾病”的定义涵盖但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、化脓性关节炎、莱姆骨关节炎、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、牛皮癣、特应性皮炎、硬皮病、“移植物抗宿主”反应、器官移植排斥、与移植相关的急性或慢性免疫疾病、结节病、川崎病、格雷夫斯病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、显微镜下肾血管炎、慢性活动性肝炎、uvenita、败血性休克、中毒性休克综合征、脓毒症综合征、恶病质、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、成人(急性)呼吸窘迫综合征、脱发、斑秃、血清阴性性关节病、关节病、莱特氏病、与溃疡性结肠炎关节病相关的牛皮癣关节病、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常型天疱疮、片状天疱疮、类天疱疮疾病、线性IgA、自身免疫性溶血性贫血、库姆斯阳性溶血性贫血、恶性贫血、幼年性恶性贫血、关节炎、原发性硬化性甲型肝炎、隐源性自身免疫性肝炎、纤维化肺病、隐源性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、I型自身免疫性肝炎(经典的自身免疫性肝炎或狼疮样)、II型自身免疫性肝炎、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、I型牛皮癣、II型牛皮癣、特发性白细胞减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、肾NOS病、肾小球肾炎、显微镜下肾血管炎、盘状红斑狼疮、特发性或NOS男性不育、对精子的自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发性肺动脉高压、古德帕斯丘综合征、结节性多关节炎的肺部表现、急性风湿热、类风湿性脊柱炎、强直性脊柱炎、斯蒂尔氏病、系统性硬化、干燥综合征、高安氏病、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺功能亢进、桥本氏病、自身免疫性萎缩性甲状腺功能低下、原发性粘液水肿、晶状体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、变态反应、哮喘、精神病症(包括抑郁症和精神分裂症)、Th2型/Th1型介导的疾病、结膜炎、变应性接触性皮炎、变应性鼻炎、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎缩侧索硬化、贫血、囊性纤维化、与细胞因子疗法相关的病症、脱髓鞘疾病、皮炎、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血再灌注损伤、缺血性中风、幼年型类风湿性关节炎、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢早衰和睑缘炎。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗肿瘤疾病。
术语“肿瘤疾病”、“癌症”和“癌性”指生理状况或描述哺乳动物中的生理状况，其特征通常在于不受调控的细胞生长/增殖。肿瘤疾病的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌性疾病的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤和各种头颈癌。
在一些实施方案中，药物组合物用于治疗选自以下的肿瘤疾病：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSICRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
术语“抗增殖活性”预期指停止或抑制细胞如癌细胞的生长。
术语"IC50" (抑制浓度50%)指可测量的活性或应答，例如细胞例如肿瘤细胞的生长/增殖被抑制50%的药物浓度。IC50值可以使用适当的剂量应答曲线，使用用于曲线拟合的专门统计软件进行计算。
术语GI50 (50%生长抑制)指细胞例如肿瘤细胞的增殖被抑制50%的药物浓度。
术语"ED50" (EC50) (50%有效剂量/浓度)指产生50%生物效应(其可以包括细胞毒性)的药物浓度。
治疗方法/治疗用途
在一个方面，本发明涉及用于治疗肿瘤疾病的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的所述免疫细胞因子或所述药物组合物。
“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“疗法”指减轻或消除生物学病症和/或其伴随症状中的至少一种的方法。如本文使用的，“减轻”疾病、病症或状况意指减少疾病、病症或状况的症状的严重性和/或发生频率。进一步地，本文对“治疗”的提及包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。
在一个方面，治疗的受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。受试者可以是任何年龄的男性或女性。
术语“疾病”意指将受益于根据本发明的治疗的任何状况。该术语的定义包括慢性和急性病症或疾病。
在治疗方法的一些实施方案中，肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
在一个方面，本发明涉及用于激活需要此类激活的受试者中的T细胞群体或NK细胞群体的生物活性的方法，其包括向受试者施用有效量的上述免疫细胞因子或上述药物组合物。
在一个方面，本发明涉及所述免疫细胞因子或所述药物组合物用于治疗需要肿瘤疾病的此类治疗的受试者的用途。
在一些用途中，肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
在肿瘤(例如癌症)的情况下，治疗有效量的本发明的免疫细胞因子可以减少癌细胞的数目；减少初始肿瘤的大小；抑制(即，在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞浸润到周围器官内；抑制(即，在一定程度上减慢并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状。本发明的免疫细胞因子可以在一定程度上阻止生长和/或杀死现有的癌细胞，它可以为细胞生长抑制性的和/或细胞毒性的。在癌症治疗中，例如，可以通过评价存活、肿瘤进展时间(TTP)、对治疗的肿瘤应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量体内功效。
本发明的免疫细胞因子可以无需进一步治疗性处理，即作为独立疗法进行施用。此外，通过本发明的免疫细胞因子的治疗可以包含至少一种另外的治疗性处理(组合疗法)。在一些实施方案中，免疫细胞因子可以与用于治疗癌症的另一种药剂/制剂联合进行施用或配制。
如本文使用的，提及本发明的免疫细胞因子和一种或多种其它治疗剂的术语“共施用”、“共施用的”和“与……组合”，考虑意指下述、提及下述或包括下述：
1)本发明的免疫细胞因子和治疗剂的此类组合同时施用于需要治疗的患者，此时此类组分一起配制成单一剂型，所述单一剂型在基本上相同的时间将所述组分释放给所述患者，
2)本发明的免疫细胞因子和治疗剂的此类组合同时施用于需要治疗的患者，此时此类组分彼此分开配制成分开的剂型，所述分开的剂型在基本上相同的时间由所述患者服用，随即所述组分在基本上相同的时间释放给所述患者，
3)本发明的免疫细胞因子和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者，此时此类组分彼此分开配制成分开的剂型，所述分开的剂型在连续的时间由所述患者服用，其中在每次施用之间具有显著的时间间隔，随即所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者；和
4)本发明的免疫细胞因子和治疗剂的此类组合序贯施用于需要治疗的患者，此时此类组分一起配制成单一剂型，所述单个剂型以受控方式释放所述组分，随后它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠地释放给所述患者，其中每个部分可以通过相同或不同途径施用。
本发明的免疫细胞因子可以与选自以下的治疗剂组合：细胞毒性剂、化学治疗剂、抗激素剂或另一种治疗性抗体。
如本说明书中使用的，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语预期包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化学治疗剂和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化学治疗剂”是可用于癌症治疗中的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXAN®)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；乙酸原化合物(acetogenin) (例如，布拉他辛和布拉他辛酮)；δ-9- 四氢大麻酚(屈大麻酚，MARINOL®)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊立替康、CAMPTOSAR®)、乙酰喜树碱、东茛菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065 (包括其合成类似物阿多来新、卡折来新和比折来新)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素(例如念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫斯汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，例如加利车霉素γII和加利车霉素ω II (参见例如，Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl.，33: 183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；埃波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素D、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN®吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂(DOXOL®)、多柔比星脂质体TLC D-99 (MYOCETCA®)和聚乙二醇化多柔比星脂质体(CAELYX®)和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤、吉西他滨(GEMZAR®)、替加氟(UFTORAL®)、卡培他滨(XELODA®)、埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟鸟苷、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinicacid)；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK®多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(例如T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；尿烷；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；噻替哌；类紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL®)、白蛋白改造的紫杉醇纳米制剂(ABRAXANETM)和多西他赛(TAXOTERE®)；苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂药剂，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花素，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(VELBAN®)、长春新碱(ONCOVIN®)、长春地辛(ELDISINE®)、FILDESIN®)和长春瑞滨(NAVELBINE®)；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；诺肖林；依达曲沙；道诺霉素；氨甲蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，例如视黄酸，包括贝沙罗汀(TARGRETIN®)；双膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸盐(DIDROCAL®)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(ZOMETA®)、阿仑膦酸盐(FOSAMAJX®)、帕米膦酸盐(AREDIA®)、替鲁膦酸盐(SKELID®)或利塞膦酸盐(ACTONEL®)；曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，例如抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE®疫苗和基因治疗疫苗，例如ALLOVECTIN®、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN®)；rmRH(例如ABARELIX®)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248 (Pfizer)；哌立福新、COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托昔布)、蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米(VELCADE®)；CCI-779；替匹法尼(811577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠(GENASENSE®)；匹克生琼；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP (环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)以及FOLFOX (用与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATINTM)的治疗方案的缩写)。
这个定义中还包括的是抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，例如具有混合的激动剂/拮抗剂概况的抗雌激素，包括他莫昔芬(NOLVADEX®)、4-羟基他莫昔芬、曲昔芬、托瑞米芬(FARESTON®)、艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬(EVTSTA®)、曲沃昔芬、雷洛昔芬和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如SERM3；没有激动剂性质的纯抗雌激素，例如氟维司群(FASLODEX®)和EM800 (此类药剂可以阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，增加ER转换率，和/或压制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂，例如福美坦和依西美坦(AROMASIN®)，以及非甾体芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑(AREVIIDEX®)、来曲唑(FEMARA®)和氨鲁米特)，以及其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑(RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(MEGASE®)、法曲唑、咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(LUPRON®和ELIGARD®)、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林；性类固醇，包括孕激素，例如乙酸甲地孕酮和乙酸甲羟孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和普力马；以及雄激素/类维A酸，例如氟甲睾酮；全反式视黄酸和芬维A胺；奥那斯酮；抗孕激素；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；睾内酯；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。
可以与本发明的免疫细胞因子组合使用的其它治疗剂可以是选自以下的治疗性抗体：针对PD1的抗体(例如prolgolimab、帕博利珠单抗或纳武单抗)、针对PD-L1的抗体、针对CTLA4的抗体、针对4-1BB的抗体、针对OX40的抗体、针对GITR的抗体、针对CD20的抗体(例如利妥昔单抗)、针对HER2的抗体(例如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)、针对VEGF的抗体(例如贝伐珠单抗)或其组合。
可以与根据本发明的免疫细胞因子组合使用的其它治疗剂可以是选自先天性免疫或适应性免疫的激活剂的治疗活性抗肿瘤化合物。
应理解，本发明的免疫细胞因子可以用于如上所述的治疗方法、如上所述的治疗和/或用于上述治疗应用的药剂的制造中。
剂量和施用途径
本发明的免疫细胞因子将以有效治疗所讨论的状况的量施用，即以达到所需结果所需要的剂量和在达到所需结果所需要的时间段期间。治疗有效量可以根据因素而变，所述因素例如待治疗的具体状况，患者的年龄、性别和重量，以及免疫细胞因子是单独施用、还是与一种或多种另外的药物或治疗技术组合施用。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答。例如，可以施用单次推注，可以随着时间过去施用几个分份剂量，或者可以如由治疗情况的紧急程度指示的，按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以单位剂型配制肠胃外组合物，用于施用的容易性和剂量的均匀性。如本文使用的，单位剂型指适于作为用于待治疗的患者/受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定数量的活性化合物，所述预定数量计算为与所需药物载体结合产生所需疗效。关于本发明的单位剂型的规格通常由以下因素决定，并直接取决于以下：(a)化学治疗剂的独特特性和待实现的特定治疗或预防效应，以及(b)配制用于治疗受试者中的敏感性的此类活性化合物的领域中固有的局限性。
因此，基于本文提供的公开内容，技术人员将了解，根据治疗领域中众所周知的方法来调整剂量和剂量方案。即，可以容易地测定最大可耐受剂量，并且还可以测定向患者提供可检测的疗效的有效量，以及可以施用每种药剂以向患者提供可检测的疗效的时间要求。因此，虽然本文例示了某些剂量和施用方案，但这些实例决不限制在实践本发明的实施方案中可以提供给患者的剂量和施用方案。
应注意，剂量值可以随着待缓解的状况的类型和严重性而变，并且可以包括单一剂量或多重剂量。此外，应理解，对于任何特定受试者，应该根据个体需要和施用或监督组合物施用的医学专业人员的判断，随着时间过去调整具体的剂量方案，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不预期限制请求保护的组合物的范围或实践。此外，关于本发明组合物的施用方案可以基于各种因素，包括疾病的类型，患者的年龄、重量、性别、医学状况，状况的严重性，施用途径，以及所采用的本发明的特定免疫细胞因子。因此，剂量方案可以广泛改变，但可以使用标准方法照常规测定。例如，可以基于药代动力学或药效学参数来调整剂量，所述药代动力学或药效学参数可以包括临床效应，例如毒性效应和/或实验室值。因此，本发明涵盖由本领域技术人员测定的患者内剂量递增。用于测定适当剂量和方案的方法是本领域众所周知的，并且一旦提供了本文公开的构想，本领域技术人员就会理解。
上文提供了合适的施用方法的实例。
考虑根据本发明的免疫细胞因子的合适剂量将在0.1-200 mg/kg的范围内，优选0.1-100 mg/kg，包括约0.5-50 mg/kg，例如约1-20 mg/kg。免疫细胞因子可以例如以至少0.25 mg/kg的剂量施用，例如至少0.5mg/kg，包括至少1 mg/kg，例如至少1.5 mg/kg，例如至少2 mg/kg，例如至少3 mg/kg，包括至少4 mg/kg，例如至少5 mg/kg；以及例如直到多达50 mg/kg，包括直到多达30 mg/kg，例如直到多达多20 mg/kg，包括直到多达15 mg/kg。通常以适当的时间间隔重复施用，例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次，以及与由负责的医生认为适当的一样久，在一些情况下，医生可以在必要时增加或减少剂量。
实施例
提供下述实施例用于更好地理解本发明。这些实施例仅出于说明目的，而不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文。尽管本发明已通过说明和实例的方式略微详细地进行描述用于清楚理解的目的，但按照本发明的教导，对于本领域的普通技术人员显而易见的是，可以对其进行某些改变和修改，而不背离所附实施方案的精神或范围。
材料和一般方法
重组DNA技术
通过如由Sambrook J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989描述的标准技术来进行DNA操纵。分子生物学试剂根据制造商方案使用。
基因合成
从通过化学合成制备的寡核苷酸制备所需的基因区段。侧翼为单个限制性位点的300-4000 bp长的基因区段，通过寡核苷酸的退火和连接(包括PCR扩增)进行组装，并且随后经由指定的限制性位点进行克隆。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。
DNA序列确定
DNA序列通过桑格测序进行确定。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
Infomax的Vector NTI Advance套件版本8.0和SnapGene Viewer用于序列创建、映射、分析、注释和说明。
实施例1
在哺乳动物细胞的悬浮培养中生产重组蛋白质
为了产生图1、图2、图3和图4中示意性显示的重组IL15超级激动剂蛋白，我们合成了包含人IL15配体 (https://www.uniprot.org/uniprot/P40933)和IL15Rα (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261)的序列片段的构建体。使用PCR从寡核苷酸合成两种基因的序列。
为了产生如通过图1中的CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA和图2中的CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA表示的IL15超级激动剂变体(以下称为IL15SA或BCD225)，将所述基因作为N末端融合物(融合蛋白)克隆到质粒内，所述N末端融合物具有在SalI/BsiWI限制性位点处在载体pEE-IL15Ra-CK (或pEE-IL15-CK)内的抗体κ轻链的第一恒定结构域(图5)，并且具有在SalI/NheI限制性位点处在载体pEE-IL15-CH1-Fc-LALA (或pEE-IL15Ra-CH1-Fc-LALA) IgG1内的抗体重链的第一恒定结构域(图6)，并且两种载体在转染步骤进行组合。
为了产生如通过图4中的Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1Fc旋钮LALA (以下称为IL15SA/PD1或抗PD1/IL15SA或IL15SA/PDL1或抗PDL1/IL15SA)和图3中的Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1Fc旋钮LALA表示的双特异性IL15超级激动剂变体，将IL15配体和受体基因作为N末端融合物克隆到质粒内，所述N末端融合物具有在SalI/BsiWI限制性位点处在载体pEE-IL15Ra-CK (或pEE-IL15-CK)内的抗体κ轻链的第一恒定结构域(图5)，并且具有在SalI/NheI限制性位点处在载体pEE-IL15-CH1-Fc-旋钮-LALA (或pEE-IL15Ra-CH1-Fc-旋钮-LALA) IgG1内的抗体重链的第一恒定结构域(图9)。此外，为了形成如图3和图4中所示的不对称抗体的Fab部分，将抗PD1 (prolgolimab) (以下称为IL15SA/PD1或抗PD1/IL15SA)或抗PDL1 (BCD-135)抗体(以下简称IL15SA/PDL1或抗PDL1/IL15SA)的可变结构域的基因作为N末端融合物克隆到质粒内，所述N末端融合物具有在SalI/BsiWI限制性位点处在载体pEE-BCD100-02-VL-CK内的抗体κ轻链的第一恒定结构域(图7)，并且具有在SalI/NheI限制性位点处在载体pEE-BCD100-02-VH-CH1-Fc-孔-LALA IgG1内的抗体重链的第一恒定结构域(图8)。结果，上述四种载体在转染步骤进行组合，以在一种细胞中合成4种不同的多肽，且形成双特异性免疫细胞因子。
所需数量的所有上述质粒都在大肠杆菌细胞中产生，并且使用Maxiprep Qiagen试剂盒进行纯化。
包含IL15SA的重组蛋白质在中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-K1)中进行瞬时培养，所述细胞系根据公开的方案[Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20；91 (6):670-677，LiaoMetal.，2004；Biotechnol Lett. 2006 Jun；28 (11):843-848；Biotechnol Bioeng. 2003Nov 5；84 (3):332-342]产生。使用组成型表达EBNA1 (EB病毒核抗原1)蛋白基因的细胞。使用来自Life Technologies Corporation的无血清培养基，并且按照制造商的说明书，在定轨振荡器上的烧瓶中进行悬浮培养。对于瞬时表达，借助于线性聚乙烯亚胺(PEI MAX，Polysciences)来转染浓度为2*106/ml的细胞。DNA/PEI比率为1:3-1:10。在转染后5-7天内，将细胞培养物以2000 g离心20分钟，并通过0.22 µm过滤器过滤。通过亲和(affine)HPLC，从培养液中分离靶蛋白。
使用蛋白A亲和层析柱，从培养液中分离且纯化重组蛋白质。使澄清的培养液通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)平衡的5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF柱(GEHealthcare)。然后用5柱体积的PBS洗涤柱，以去除非特异性结合的组分。使用0.1 M甘氨酸缓冲液(pH 3)洗脱结合的抗原。收集主要的蛋白质洗脱峰，并且用1 M Tris缓冲液(pH 8)调整至中性pH。所有阶段都在110 cm/h流速下进行。然后使用SnakeSkin Dialysis Tubing技术，将蛋白质透析到PBS (pH 7.4)内，过滤(0.22 µm)，转移到管内并贮存于-70°С下。
通过SDS凝胶电泳评估所得到的蛋白质溶液的纯度(参见图10中的实例)。
实施例2
(IL15SA)2-Fc和人IL2βγ受体相互作用的动力学测定
根据ForteBio说明书，使用OctetRedBio仪器获得(IL15SA)2-Fc (下文称为图1中的CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA和图2中的CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA)和人IL2βγ结合的亲和常数。使AR2G生物传感器在mQ中预先再水合一小时。在生物传感器激活后，将在乙酸盐缓冲液pH 4中浓度为25 µg/ml的(IL15SA)2-Fc产物非特异性地(通过NH2基团)固定到生物传感器上。然后在30°C下，在补充有0.1% Tween-20和0.1% BSA的PBS缓冲液中，将传感器浸入含有人CD122/IL-2RB蛋白(Fc标签)溶液(1和0.5 μg/ml)的孔内。IL15SA/IL2βγ复合物在该溶液中结合。然后将传感器浸入缓冲溶液中，用于随后的解离步骤。测定在30°C下使用补充有Tween-20和0.1% BSA的PBS作为工作缓冲液进行。
在表1中给出了CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA和CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA所得到的传感图，所述传感图按照标准程序并使用1:1相互作用模型，使用Octet DataAnalysis软件(版本8.0)减去参考信号后进行分析。所得到的亲和常数显示于表1中。所研究的两种变体均显示对于人IL2βγ的高亲和力和特异性。
表1. 与人IL2βγ-Fc相互作用的(IL15SA)2-Fc免疫细胞因子的亲和常数
装载样品ID 浓度(nM) 应答 KD (M) Kon (1/Ms) Kdis (1/s)
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 19.4 0.3774 2.47E-10 3.69E+05 9.11E-05
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 9.69 0.3301 3.80E-10 3.02E+05 1.15E-04
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 19.4 0.325 2.13E-10 3.58E+05 7.63E-05
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 9.69 0.2832 2.12E-10 3.57E+05 7.55E-05
实施例3
双特异性IL15超级激动剂与人IL2βγ受体和免疫细胞的其它细胞受体之间的相互作用的动力学测定
根据ForteBio说明书，使用OctetRed 96测量IL15SA双特异性免疫细胞因子(以下称为抗PD1-Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1Fc旋钮LALA和抗PD-L1-Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1Fc旋钮LALA)与IL2βγ和人PD-1/PD-L1受体结合的亲和常数。AR2G生物传感器在mQ中预先再水合一小时。在生物传感器激活后，将在乙酸盐缓冲液pH 4中浓度为25 µg/ml的双特异性免疫细胞因子非特异性地(通过NH2基团)固定到生物传感器上。然后在补充有0.1% Tween-20和0.1% BSA的PBS缓冲液中，将传感器浸入含有人CD122/IL-2RB蛋白(Fc标签)或PD-1-Fc受体或PD-L1-Fc受体(1和0.5 μg/ml)的孔内，以使双特异性超级激动剂与测试受体结合。然后将传感器浸入缓冲溶液中，用于随后的解离步骤。
按照标准程序并使用1:1相互作用模型，使用Octet Data Analysis软件(版本8.0)，来分析减去参考信号后的仪器数据。
所得到的亲和常数显示于表2中。所研究的两种变体均显示对于人IL2βγ和配对受体两者的高亲和力和特异性，并且缺乏对其它受体的非特异性活性。
表2. 与人IL2βγ-Fc和第二受体相互作用的双特异性IL15超级激动剂抗体的亲和常数
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实施例4
用于确定IL15超级激动剂对NK92系的增殖活性的细胞测定
NK-92细胞系用于测定中。测定在96孔培养板中进行。悬浮液包含NK-92细胞，以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有胎牛血清和谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后将AlamarBlue加入孔中。在温育之后，测量孔中的荧光强度。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、IL15SA/PD1 (抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcLALA)和IL15SA/PDL1 (抗PDL-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcLALA)。
上述免疫细胞因子的比活性的测定结果显示了相对于NK92系的高增殖活性。所有候选物的估计EC50是等同的，并且如通过上平台确定的激活水平也是完全相同的(图11)。应该注意的是，IL15SA部分的效价，以及相应地，不同的亲合力，并未显著影响这一活性。
实施例5
用于确定IL15超级激动剂对天然杀伤系的增殖活性的细胞测定
测定使用通过阴性选择从健康供体的PBMC中分离的天然杀伤细胞。测定在96孔培养板中进行。悬浮液包含天然杀伤细胞，以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有自体人血浆的培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后将Alamar Blue加入孔中。在温育之后，测量孔中的荧光强度。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、IL15SA/PD1 (抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA)和人白细胞介素2 (IL2) (Ronleukin，PCI Biotech)对天然杀伤细胞的增殖能力的作用。
上述免疫细胞因子的比活性的测定结果显示了相对于天然杀伤细胞的高增殖活性(图12)。所有候选物的估计EC50在误差范围内是相同的，并且略低于IL2细胞因子。此外，如通过上平台限定的激活水平也是完全相同的。应该注意的是，IL15SA部分的效价，以及相应地，不同的亲合力，并未显著影响这一活性。
实施例6
用于确定IL15超级激动剂对报告系的抗PD1拮抗活性的细胞测定
对于测定，我们使用Jurkat NFAT-FLuc PD-1细胞系，其基于Jurkat细胞系生成，且在其表面上稳定表达PD-1，且含有处于NFAT启动子的控制下的萤火虫萤光素酶编码基因；并且Raji PDL1细胞系基于Raji细胞系生成，且在其表面上稳定表达PDL1。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、抗PD1/IL15SA (抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1Fc旋钮LALA)和抗PD1拮抗剂(prolgolimab)对报告细胞系统中的活化能力的作用。
测定在96孔培养板中进行。每个孔中的悬浮液含有浓度为1 ng/ml的JurkatNFAT-FLuc PD-1细胞、Raji PDL1细胞、aCD3/aTAA1细胞以及以如图中所示的浓度的测试抗体。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育，然后使用发光测定试剂盒，测量孔中的萤光素酶强度。
与治疗有效的抗PD1单克隆抗体prolgolimab相比，上述免疫细胞因子的比活性的测定结果显示了抗PD1/IL15SA的比活性EC50值低一个数量级(图13)。另外，最大活性水平(上平台)降低了30%。与prolgolimab相比，抗PD1/IL15SA的较低比活性只能通过与经典抗体相比抗PD1/IL15SA分子内的单价Fab结合PD1来解释。根据实施例3中的数据(表2)以及如对于prolgolimab指定的值，关于PD-1受体的亲和力几乎一个数量级的差异也支持了这一点。应该注意的是，IL15SA的拮抗活性作为背景观察到，即它是基本上不存在的。
实施例7
用于确定IL15超级激动剂对报告系的抗PDL1拮抗活性的细胞测定
对于测定，我们使用Jurkat NFAT-FLuc PD-1细胞系，其基于Jurkat细胞系生成，且在其表面上稳定表达PD-1，且含有处于NFAT启动子的控制下的萤火虫萤光素酶编码基因；并且Raji PDL1细胞系基于Raji细胞系生成，且在其表面上稳定表达PDL1。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、抗PDL1/IL15SA (抗PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA)和抗PDL1拮抗剂(阿替利珠单抗)对报告细胞系统中的活化能力的作用。
测定在96孔培养板中进行。每个孔中的悬浮液含有浓度为1 ng/ml的JurkatNFAT-FLuc PD-1细胞、Raji PDL1细胞、aCD3/aTAA1细胞以及以如图中所示的浓度的测试抗体。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育，然后使用发光测定试剂盒，测量孔中的萤光素酶强度。
与治疗有效的抗PDL1单克隆抗体阿替利珠单抗相比，上述免疫细胞因子的比活性的测定结果显示了抗PDL1/IL15SA的比活性EC50值低至1/30 (图14)。然而，最大活性水平(上平台)仅降低了10%。与阿替利珠单抗相比，抗PDL1/IL15SA的较低比活性只能通过与经典抗体相比抗PDL1/IL15SA分子内的单价Fab结合PD-L1来解释。因而，没有观察到IL15SA的显著拮抗活性。
实施例8
用于确定在对于肿瘤相关抗原(TAA)特异性的抗体的存在下，IL15超级激动剂对天然杀伤细胞针对TAA报告系的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的作用的细胞测定
测定使用通过阴性选择从健康供体的PBMC中分离的天然杀伤细胞。测定在96孔培养板中进行。悬浮液含有天然杀伤细胞和Raji细胞、效应抗体利妥昔单抗以及以如图中所示的浓度的测试抗体。所有悬浮液组分都在补充有胎牛血清和谷氨酰胺的培养基中进行制备。在添加所有组分后，使板在37°C、5% CO2下温育。然后收集培养液，并且使用LDH测定试剂盒，测量乳酸脱氢酶含量。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、抗PD1/IL15SA (抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA)对利妥昔单抗在报告细胞系统中的ADCC能力的作用。
上述免疫细胞因子的比活性的测定结果显示了相对于利妥昔单抗针对TAA报告系的增强ADCC能力的高活性(图15和图16)。如通过在其表面上具有过表达的CD20受体的裂解Raji细胞的百分比测量的，与单独的利妥昔单抗相比，利妥昔单抗依赖性ADCC的功效在所研究的每种候选物的存在下增加了30%。根据实施例4和5中给出的结果，这种效应看起来通过在测定中的IL15SA和抗PD1/IL15SA影响下活性天然杀伤细胞的增殖来解释。所有候选物的估计EC50在误差范围内是相同的。应该注意的是，IL15SA部分的效价，以及相应地，不同的亲合力，并未显著影响这一活性，所述事实得到实施例4和5的进一步支持。
实施例9
用于确定IL15超级激动剂对来自健康供体全血的PBMC的细胞毒性的细胞测定
通过Ficoll密度梯度离心，从来自健康供体的全血中分离PBMC。
测定在96孔培养板中进行。悬浮液含有(每孔)新鲜分离的PBMC以及如图中所示的浓度为0.1 μg/ml的抗体。在将PBMC和抗体混合后，使板在37°C、5% CO2下温育16小时。然后通过用针对相应CD的荧光标记抗体直接染色悬浮液，并且使用流式细胞荧光计进一步分析细胞，来测量悬浮液中的PBMC的CD56+、CD19+、CD3+、CD4+和CD8+亚群比例。对于CD56+、CD19+、CD3+细胞，图显示了其相对于测试悬浮液的所有细胞的比例，而对于CD4+、CD8+细胞，图显示了其相对于CD3+细胞的比例。对比研究了IL15SA产物(CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA)、抗PD1/IL15SA (抗PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1Fc旋钮LALA)、抗PD1 (prolgolimab)、抗PD1 (prolgolimab) + IL15SA的混合物、抗CD20 GA101抗体对人PBMC的细胞毒性作用。
如图17-21中给出的结果证实了候选物没有显著的细胞毒性效应，即与AB阴性对照(即不存在任何外源抗体)相比，免疫反应细胞的数目不多于10%的降低。因而，对照抗CD20抗体显示CD20+ B细胞群体的一致完全耗尽。因此，所讨论的所有候选物并未显示出针对人血细胞的任何显著的非特异性体外细胞毒性。
实施例10
在热应激条件下IL15超级激动剂的聚集稳定性的确定
将PBS缓冲液中浓度为9 mg/ml的IL15超级激动剂产物在50°C的温度下加热12小时。通过高效凝胶过滤层析确定在热应激后的聚集。层析在HPLC系统(Agilent)上的TosohTSK-Gel G3000SWXL柱，7.8 mm x 30 cm，订货号08541上执行，所述柱具有Tosoh TSKgelGuard SWXL预柱，6.0 mm x 4.0 cm，具有7 μm的粒径，订货号08543。以等度模式，流动相：50 mM NaFb，0.3 M NaCl，pH 7.0，以0.5 ml/分钟的流速执行洗脱。在214和280 nm的波长下执行检测。用PBS缓冲液pH 7.5将抗体样品稀释至约1 mg/ml的浓度。注射体积为10微升。凝胶过滤标准校准混合物(Bio-Rad)，订货号151-1901，进行预层析。图22显示了层析图，其中IL15超级激动剂证实了高同质性(溶液中的聚集体含量不多于5%)。
实施例11
IL15超级激动剂产物在同基因B16F10黑色素瘤模型中的抗肿瘤活性评价
功效使用接种了B16F10肿瘤系的免疫活性C57BL/6小鼠进行评价。将1,5×105个肿瘤细胞皮下注射到组中的每只动物的右胁腹内。在细胞接种后第7天(实验的第1天)时，如表3中所示将动物分组。使用一个剂量的下述产物来评估功效：BCD-225、IL15SA/а-mPD-1(包含IL-15SA以及针对小鼠PD-1的Fab片段的双特异性单克隆抗体，小鼠RMP1-14抗体的衍生物)。RMP1-14抗体的可变结构域的序列由Hideo Yagita，PhD，Juntendo UniversitySchool of Medicine友情提供。根据实施例1合成了基因和RMP1-14抗体产物可变结构域。此外，我们合成了参考产物ALT-803 [Han KP等人，Cytokine. 2011 Dec；56(3):804-10.](阳性对照)和安慰剂(阴性对照)。还评价了产物与抗小鼠PD-1抗体(a-mPD-1)组合的抗肿瘤活性。
表3. IL15超级激动剂的抗肿瘤活性研究中的动物组
组 动物数量 剂量
BCD-225 (IL15SA) 9 0.2 mg/kg
IL15SA/a-mPD-l 9 0.2 mg/kg
ALT-803 9 0.2 mg/kg
抗mPD-1 10 10 mg/kg
BCD-225 (IL15SA)+抗mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
IL15SA/a-mPD-l+抗mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
ALT-803 + 抗mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
阴性对照 10 -
在实验的第1、4、8和11天时，BCD-225 (IL15SA)、IL15SA/a-mPD-1和ALT-803产物以0.2 ml的体积进行腹膜内注射。在实验的第2、5、9和12天时，抗mPD-1产物以0.2 ml的体积进行腹膜内注射。在实验的第1、2、4、5、8、9、11和12天时，阴性对照组用乙酸钠缓冲液以0.2 ml的体积进行注射(图23)。
实验自始至终测量小鼠体重和肿瘤线性尺寸。使用下式计算肿瘤体积：V=L×W×W×π/6。测试产物的功效通过肿瘤生长抑制指数(TGI)进行评价，所述指数考虑到阴性对照组(Vc)和产物组(Vt)中的中值肿瘤体积，使用下式进行计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实验结果显示于图24和25中。提供的是截至实验的第11天的数据，因为几乎所有实验组中的动物都死于肿瘤负荷，使得无法在第15天时可靠地评价产物的抗肿瘤活性。
根据研究结果，BCD-225产物和参考ALT-803产物显示了可比较的抗肿瘤活性，其中TGI在BCD-225组中为52%，且在ALT-803组中为53%。与BCD-225和ALT-803组中的TGI值相比，我们观察到IL15SA/抗mPD-1双特异性抗体组中的TGI值的增加趋势。在实验的第11天时，IL15SA/抗mPD-1组中的TGI为58%。
产物组合BCD-225 + 抗mPD-1和ALT-803 + 抗mPD-1组的TGI值在实验的第11天时为72%，并且对于产物组合IL15SA/a-mPD-1和抗mPD-1组，TGI值为69%。与这些产物在单一疗法中的活性相比，所得到的TGI值指示了测试产物和抗mPD-1的组合的更显著的抗肿瘤活性。
实施例12
在同基因B16F10黑色素瘤模型中，使用IL15超级激动剂和ALT803产物的小鼠中的比较死亡率的评价和分析
使用如实施例11中所述的模型和动物，来执行在IL15超级激动剂产物使用之后的小鼠中的死亡率的比较评价。通过计数处于痛苦状态的死亡或安乐死动物来评价存活。
结果显示于表4中。如根据所得到的数据得出的，与IL15SA (BCD225)、IL15SA +抗mPD-1、ALT-803、ALT-803 + 抗mPD-1相比，就小鼠数目和存活时间而言，IL15SA/a-mPD-1和IL15SA/a-mPD-1 + 抗mPD-1产物组中的死亡率平均起来更低。与单特异性二价IL15SA和ALT-803相比，所得到的死亡率值显示了IL15SA/a-mPD-1双特异性免疫细胞因子可能不太明显的毒性。抗PD1抗体的存在或不存在对死亡率没有统计学显著的作用。此外，来自IL15SA和ALT-803分批的死亡小鼠的器官检查揭示了肝脏中存在水肿性营养不良伴肝细胞坏死，血窦受压；实质中的淋巴组织细胞浸润和血窦中的淋巴细胞聚集。这些发现与先前报道的关于基于IL15的超级激动剂在小鼠中引起肝损伤的能力的文献数据一致。
表4. 在IL15超级激动剂和ALT803超级激动剂产物及其与抗PD1抗体的组合之后的死亡率研究中的动物组
Figure DEST_PATH_IMAGE006
<110> JOINT STOCK COMPANY "BIOCAD"
<120> 包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物的免疫细胞因子
<150> RU2019129569
<151> 2019-09-19
<160> 24
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CK人工序列
<400> 1
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CH1CH2CH3人工序列
<400> 2
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450
<210> 3
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CK人工序列
<400> 3
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 4
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CH1CH2CH3人工序列
<400> 4
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro
435
<210> 5
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CH1CH2CH3旋钮-Fc人工序列
<400> 5
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro
450
<210> 6
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CH1CH2CH3旋钮-Fc人工序列
<400> 6
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro
435
<210> 7
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD1 VH-CH1CH2CH3孔-Fc人工序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp Trp
100 105 110
Pro Tyr Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
130 135 140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
165 170 175
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
195 200 205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
210 215 220
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD1 VK-CK人工序列
<400> 8
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα人工序列
<400> 9
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser
100
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 天然序列
<220>
<223> IL15天然序列
<400> 10
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser
115
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR1 prolgolimab人工序列
<400> 11
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Tyr
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR2 prolgolimab人工序列
<400> 12
Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HCDR3 prolgolimab人工序列
<400> 13
Cys Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp
1 5 10 15
Trp Pro Tyr Gly Leu Asp Ala
20
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR1 prolgolimab人工序列
<400> 14
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR2 prolgolimab人工序列
<400> 15
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCDR3 prolgolimab人工序列
<400> 16
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
1 5 10
<210> 17
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH prolgolimab人工序列
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Thr Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Val Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Gly Gly Gly Thr Gly Trp Gly Val Leu Lys Asp Trp
100 105 110
Pro Tyr Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL prolgolimab人工序列
<400> 18
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gln
100 105
<210> 19
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CK-CiA人工序列
<400> 19
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210 215
<210> 20
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CH1CH2CH3- CiA人工序列
<400> 20
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450
<210> 21
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CK- CiA人工序列
<400> 21
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala
225 230
<210> 22
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CH1CH2CH3- CiA人工序列
<400> 22
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro
435
<210> 23
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15-CH1CH2CH3旋钮-Fc人工序列
<400> 23
Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu
1 5 10 15
Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val
20 25 30
His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val
50 55 60
Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn
65 70 75 80
Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn
85 90 95
Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile
100 105 110
Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro
450
<210> 24
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15Rα-CH1CH2CH3旋钮-Fc人工序列
<400> 24
Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
340 345 350
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
355 360 365
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
370 375 380
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
385 390 395 400
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
405 410 415
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
420 425 430
Ser Leu Ser Pro
435

Claims (70)

1. 一种用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包括包含以下的基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
2.权利要求1的免疫细胞因子，其中所述抗体轻链恒定结构域选自CK或CL。
3. 权利要求1的免疫细胞因子，其中IL-15Rα具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15Rα变体。
4. 权利要求1的免疫细胞因子，其中IL-15具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15变体。
5.权利要求1的免疫细胞因子，其中IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接。
6. 权利要求5的免疫细胞因子，其中与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
7.权利要求1的免疫细胞因子，其中IL-15与抗体轻链恒定结构域连接。
8. 权利要求7的免疫细胞因子，其中与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
9.权利要求1的免疫细胞因子，其中第一(CH1)重链恒定结构域以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体经由铰链进行连接。
10.权利要求1的免疫细胞因子，其中IL-15或IL-15Rα连接至按下述次序排列的抗体重链恒定结构域：CH1-铰链-CH2-CH3。
11.权利要求10的免疫细胞因子，其中IL-15Rα与抗体重链恒定结构域连接。
12. 权利要求11的免疫细胞因子，其中与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列。
13.权利要求10的免疫细胞因子，其中IL-15与抗体重链恒定结构域连接。
14. 权利要求13的免疫细胞因子，其中与抗体重链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQID NO:2或SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
15. 权利要求1的免疫细胞因子，其中
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列。
16. 权利要求1的免疫细胞因子，其中
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:22表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
17.权利要求1的免疫细胞因子，其包含Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
18.权利要求1的免疫细胞因子，其中Fc片段属于IgG。
19.权利要求18的免疫细胞因子，其中Fc片段同种型选自：人IgG1、IgG2或IgG4。
20.权利要求1-19中任一项的免疫细胞因子，其包含上述两种基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物。
21.权利要求20的免疫细胞因子，其用作用于治疗癌症或自身免疫性疾病的治疗剂。
22.一种用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的免疫细胞因子，其包含基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物、以及特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段，
其中所述基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物包含：
1) IL-15Rα，其与以下连接
a)抗体轻链恒定结构域，或
b)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体；
2) IL-15，其与以下连接
a)抗体重链恒定结构域，其包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体，或
b)抗体轻链恒定结构域；
其中所述异二聚体复合物内的第一抗体重链恒定结构域和抗体轻链恒定结构域具有或不具有通过天然S-S桥的共价缔合，和
其中如果IL-15或IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接，则异二聚体蛋白质复合物的选自IL-15Rα或IL-15的另一部分与抗体重链恒定结构域连接。
23.权利要求的免疫细胞因子，其中所述抗体轻链恒定结构域选自CK或CL。
24. 权利要求22的免疫细胞因子，其中IL-15Rα具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15Rα变体。
25. 权利要求22的免疫细胞因子，其中IL-15具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列、或具有相似生物活性的任何已知的突变型IL-15变体。
26.权利要求22的免疫细胞因子，其中IL-15Rα与抗体轻链恒定结构域连接。
27. 权利要求26的免疫细胞因子，其中与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。
28.权利要求22的免疫细胞因子，其中IL-15与抗体轻链恒定结构域连接。
29. 权利要求28的免疫细胞因子，其中与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列。
30.权利要求22的免疫细胞因子，其中第一(CH1)重链恒定结构域以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体经由铰链进行连接。
31.权利要求22的免疫细胞因子，其中IL-15或IL-15Rα连接至按下述次序排列的抗体重链恒定结构域：CH1-铰链-CH2-CH3。
32.权利要求31的免疫细胞因子，其中IL-15Rα与抗体重链恒定结构域连接。
33. 权利要求32的免疫细胞因子，其中与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列。
34.权利要求31的免疫细胞因子，其中IL-15与抗体重链恒定结构域连接。
35. 权利要求34的免疫细胞因子，其中与抗体重链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQID NO:5或SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
36.权利要求22的免疫细胞因子，其中特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段是特异性结合PD-1的抗体。
37.权利要求22的免疫细胞因子，其中所述免疫调节抗体包含：
a)轻链，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
b)重链，其包含重链可变结构域和抗体重链恒定结构域，所述抗体重链恒定结构域包含第一(CH1)重链恒定结构域、以及包含第二(CH2)重链恒定结构域和第三(CH3)重链恒定结构域的Fc片段单体。
38. 权利要求37的免疫细胞因子，其中所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
39. 权利要求38的免疫细胞因子，其中所述轻链可变结构域包含由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列。
40. 权利要求37的免疫细胞因子，其中所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
41. 权利要求40的免疫细胞因子，其中所述重链可变结构域包含由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
42.权利要求37的免疫细胞因子，其中
1)所述轻链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列表示的LCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)；
2)所述重链可变结构域包含分别由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列表示的HCDR 1、2和3 (高变区1、2和3)。
43.权利要求42的免疫细胞因子，其中
1)所述轻链可变结构域包含由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列；
2)所述重链可变结构域包含由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。
44. 权利要求37的免疫细胞因子，其中所述免疫调节抗体包括包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
45. 权利要求37的免疫细胞因子，其中所述免疫调节抗体包括包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链。
46.权利要求37的免疫细胞因子，其中所述免疫调节抗体包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
47. 权利要求22的免疫细胞因子，其中特异性抑制PD-1途径的免疫调节抗体或其抗原结合片段是特异性结合PD-L1的抗体。
48.权利要求22的免疫细胞因子，其中
a)所述基于IL-15/IL-15Rα的异二聚体蛋白质复合物包含：
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列，和
与抗体重链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列；
b)所述免疫调节抗体包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
49. 权利要求22的免疫细胞因子，其中
a)与抗体重链恒定结构域连接的IL-15Rα具有由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:24表示的氨基酸序列，和
与抗体轻链恒定结构域连接的IL-15具有由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21表示的氨基酸序列；
b)所述免疫调节抗体包括：
包含由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链；
包含由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的轻链。
50.权利要求22或37中任一项的免疫细胞因子，其具有在抗体恒定结构域中的突变，所述突变诱导两个不同部分的异二聚化，所述部分之一包含共价缔合或非共价缔合的与抗体恒定结构域连接的IL-15Rα以及与抗体恒定结构域连接的IL-15，而另一部分包含共价缔合或非共价缔合的抗体轻链和重链。
51. 权利要求22或37中任一项的免疫细胞因子，其中第一Fc单体和第二Fc单体选自下述：第一Fc单体是旋钮修饰的Fc，且第二Fc单体是孔修饰的Fc，或者当第二Fc单体是旋钮修饰的Fc时，第一Fc单体是孔修饰的Fc。
52.权利要求51的免疫细胞因子，其中
a)第一Fc单体具有氨基酸取代S354C/T366W，且第二Fc单体具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V，
b)第一Fc单体具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407，且第二Fc单体具有氨基酸取代S354C/T366W。
53.权利要求22或37中任一项的免疫细胞因子，其中Fc片段属于IgG。
54.权利要求53的免疫细胞因子，其中Fc片段同种型选自：人IgG1、IgG2或IgG4。
55.权利要求22或37中任一项的免疫细胞因子，其具有在Fc片段单体中的突变，其引起所述免疫细胞因子中的ADCC、CDC和/或ADCP性质的缺陷。
56.权利要求22-55中任一项的免疫细胞因子，其用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
57.一种分离的核酸，其编码权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子。
58.权利要求57的核酸，其中所述核酸是DNA。
59.一种表达载体，其包含权利要求57-58中任一项的核酸。
60.一种用于产生权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子的宿主细胞的生产方法，其包括用权利要求59的载体转化细胞。
61.一种用于产生权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子的宿主细胞，其包含权利要求57-58中任一项的核酸。
62.一种用于产生包含权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子的产物的方法，其包括在足以产生所述免疫细胞因子的条件下，在培养基中培养权利要求61的宿主细胞，需要时，随后为所产生的免疫细胞因子的分离和纯化。
63.一种用于刺激IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的治疗有效量的权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子。
64.权利要求63的药物组合物，其用于治疗肿瘤疾病或自身免疫性疾病。
65. 权利要求64的药物组合物，其中所述肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
66.一种肿瘤疾病的治疗方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子、或权利要求63的药物组合物。
67. 权利要求55的治疗方法，其中所述肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
68.一种用于激活需要此类激活的受试者中的T细胞群体或NK细胞群体的生物活性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子、或权利要求63的药物组合物。
69.权利要求1-20或22-55中任一项的免疫细胞因子或权利要求63的药物组合物用于治疗需要肿瘤疾病的此类治疗的受试者的用途。
70. 权利要求69的用途，其中所述肿瘤疾病选自：HNSCC (头颈部鳞状细胞癌)、子宫颈癌、原发灶不明癌、胶质母细胞瘤、食道癌、膀胱癌、TNBC (三阴性乳腺癌)、CRC (结肠直肠癌)、肝细胞癌、黑色素瘤、NSCLC (非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、MSI CRC (具有微卫星不稳定性的结肠直肠癌)、白血病(急性白血病或成髓细胞性白血病)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肉瘤、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞和B细胞急性成淋巴细胞性白血病、小细胞肺癌、急性成髓细胞性白血病、难治性非霍奇金氏B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、急性成髓细胞性白血病和高危骨髓增生异常综合征。
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