KR20220145323A - Il-15/il-15ra에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인, 및 치료학적 물질로서, 특히 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 물질로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체와 면역조절 항체를 포함하는 면역사이토카인, 및 치료학적 물질로서, 특히 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 물질로서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

IL-15/IL-15RA에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인
본 발명은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인, 및 치료학적 물질로서, 특히 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 물질로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체와 면역조절 항체를 포함하는 면역사이토카인, 및 치료학적 물질로서, 특히 암 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 물질로서의 이의 용도에 관한 것이다.
사이토카인은 호르몬 및 신경전달물질과 같이 세포 교류에 광범위하게 이용되는 신호전달 단백질 및 당단백질 범주에 속한다. 호르몬이 특정 장기에서 혈액으로 방출되고, 신경전달물질이 신경 활성과 관련 있는데 반해, 사이토카인은 기원 및 목적 측면에서 좀더 다양한 계열의 화합물이다. 이는 매우 다양한 조혈 및 비-조혈 세포에서 생산되어, 주변 세포 및 유기체 전체에 영향을 미칠 수 있으며, 때때로 다른 화합물의 존재에 크게 좌우된다. 사이토카인 계열은 주로 분자량 8-30 kDa의 작은 수용성 단백질 및 당단백질로 구성된다. 사이토카인은 선천 및 적응 면역 반응 둘다의 발현 및 기능에 중요하다. 이는 종종 병원체에 노출된 면역 세포에 의해 분비되어, 추가적인 면역 세포를 활성화 및 동원함으로써 병원체에 대한 시스템의 반응성을 높인다.
사이토카인 중에서도 인터루킨 15 (IL-15)는 구조적으로 IL-2와 유사한 사이토카인으로서, 바이러스(들) 감염 후 또는 "비-자가"로 인지되거나 또는 약화된 세포에 의해 간접적으로 자극된 후 단핵 식세포 (및 일부 다른 세포)에 의해 분비된다. 이 사이토카인은 자연 살상 세포의 세포 증식을 유도하는데 자연 살상 세포는 주된 역할이 바이러스 감염된 세포를 사멸시키는 것인 선천 면역 시스템 세포이다. 이 유전자에 의해 코딩된 단백질이 T 세포 및 자연 살상 세포의 활성화 및 증식을 조절하는 사이토카인이다.
인터루킨-15 (IL-15)는 T 세포-활성화 인자로서 2개의 군으로 동시에 동정된 14-15 kDa 당단백질이다 (Grabstein, K.H. et al., Science 1994, 264, 965; Burton, J.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 4935). IL-15 mRNA는 여러가지 세포와 조직들에서 광범위하게 발현되지만, 번역 및 세포내 이동 측면에서 이의 발현에 대한 강력한 번역 후 제어로 인해 이들 세포 또는 세포 상층물에서 이들 단백질을 찾기 어렵다 (Bamford RN. et al., J. Immunol. 1998, 160: 4418-4426; Kurys G, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275: 30653-30659). 아울러, IL-15는 막 단백질로서 활성 형태로 존재할 수 있는 것으로 밝혀져 있으며 (Musso et al., Blood 1999, Vol. 93, No 10 (May 15): pp 3531-3539), 최근에는 전-염증성 사이토카인의 방출 경로를 통해 유도되는 리간드 또는 수용체로서 기능할 수 있는 것으로 언급된 바 있다 (Budalgian et al., JBC 2004, vol 279, No 40: pp 42192-42201). 용해성 단백질의 높은 발현 수준은 자가면역 및 염증성 질환 (Kirman I., 1996, Am. J. Gastroenterol. 91, 1789), 건선 (Ruckert R. 2000, 165: 2240-2250), 백혈병 (Yamada Y. 1999, Leukemia and Lymphoma, 35(1-2): 37-45) 및 류마티스 관절염 (RA), (Mclnnes I.B. 1998, Immunology Today, 19, 75-79)의 병인과 관련되어 있다. 리간드가 T 세포 수용체에 결합하면 IL-15Rα의 발현과, CD69, CD25 및 TNFRII와 같은 수종의 활성화 항원의 발현을 유도한다. 아울러, IL-15는 인간 혈액 T 림프구에 대한 화학주성인자이다 (Wilkinson 1995, J. Exp. Med. 181, 1255-1259). 이들 데이터 모두 항원 제시 세포에 의해 발현된 IL-15가 염증 부위에서 초기 T 세포 활성화에 중요할 수 있음을 시사해준다.
IL-15는 사이토카인의 작은 4 알파-나선 번들 계열의 구성원이다. IL-15의 생물학적 효과는 3종의 서브유닛, α, β 및 γ로 구성된 세포 막 수용체에 결합함으로써 매개된다. IL-15Rα는 Kd 10-11의 매우 높은 친화성으로 이에 결합하는 사이토카인에 대해 특이성을 가진 서브유닛으로서, 막 수용체 또는 용해성 형태로 발견할 수 있다 (Budagian V. et al., JBC 2004, 279, 39: 40368-40375; Mortier et al., The Journal of Immunology, 2004, 173: 1681-1688). IL-15Rα는 IL-15에 결합할 수 있으며 결합 후 IL-15의 생물학적 기능에 기본적인, Sushi 도메인을 가지고 있다.
IL-15는 저 분자량, 짧은 생체내 반감기, 제어된 반복 투여 곤란성과 관련하여 제한적인 문제가 있으며, 전신 면역 부작용을 유발할 가능성도 있다. 생체내 반감기를 연장하고, IL-15의 생체내 생물학적 활성을 촉진 또는 강화하는 방식을 탐구하는 것이 시급하게 요구되고 있다.
최근, IL-15와 이의 수용체 IL-15Rα에 의해 형성된 복합체가 IL-15의 생물학적 활성을 현저하게 강화할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 연구를 통해, IL-15와 용해성 수용체 IL-15Rα에 의해 형성된 복합체는 기억 CD8+ T 림프구 및 NT/NKT 세포의 증식을 자극하는데 있어 IL-15 단독보다 현저하게 우수한 것으로 확인되었다. IL-15/IL-15Rα 복합체는 기억 CD8+ T 세포의 증식을 자극하고, 이의 생존을 유지하는데 IL-15 단독보다 10배 이상 우수하며, 그 기전은 cis 제시와 관련 있을 수 있다.
국제 출원 WO2007046006, WO2016095642는 IL-15Rα의 세포외 영역의 sushi 도메인을 가진 폴리펩타이드에 IL-15가 간접적으로 연결된 것을 특징으로 하는, IL-15Rβ/γ 신호전달 경로를 자극하여 NK 및/또는 T 세포와 같은 IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 유도 및/또는 자극하기 위해 고안된 융합 단백질과, 암 치료에서의 이의 용도를 개시하였다. 그러나, WO2007046006은 IL-15Rα에 N- 및 C-말단 아미노산을 통해 링커 펩타이드에 연결된 IL-15에 대해서만 슈퍼-작용제라는 실험 데이터 및 특징을 제공하고, WO2016095642는 IL-15 리간드 및 IL-15Rα 자체에서 Cys 돌연변이에 의해 형성된 키메라 S-S 결합에 의해 연결된 것에 대해서만 슈퍼-작용제라는 실험 데이터 및 특징을 제공한다. 이들 문헌 둘다 S-S 결합(들)에 의해, 그리고 S-S 브릿지 없이 연결된 융합 단백질 도메인들을 포함하는 IL15 슈퍼-작용제 변이체의 활성 및 물리화학적 특성에 대해서는 어떠한 증거도 제시되어 있지 않다.
이들 대상은 저 분자량, ?F은 생체내 반감기와 관련한 한계를 가지고 있다. 이는 인터루킨 15 활성이 제한적이며, 이를 특히 중국 햄스터 난소 세포에서 생산하기 매우 어렵고, 낮은 수율과 연관되어 있다.
국제 출원 WO 2015103928, WO2018071919는 상기한 문제들을 해결하기 위한 변이체, 특히 단백질 (I) 및 단백질 (II)를 포함하는 이형이량체 IL-15 작용제 단백질을 개시하고 있으며, 단백질 (I)은 제1 Fc 변이체와 융합된 IL-15에 의해 형성되되 제1 Fc 변이체는 IL-15의 C-말단에 연결되고, 단백질 (II)는 제2 Fc 변이체이거나 또는 제2 Fc 변이체와 융합된 IL-15Rα 또는 이의 변이체에 의해 형성되되 제2 Fc 변이체는 IL -15Rα의 C-말단에 연결된다. 단백질 (I)과 단백질 (II)는 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 간의 "knobs-into-holes" 상호작용을 통해 안정적인 이형이량체 단백질을 형성한다.
IL-15 기반의 면역사이토카인이 구축은 종양을 표적화하는 종양-특이적인 항체의 유익한 특성을 인터루킨 15의 면역조절 효과와 결합시킨다는 점에 특히 흥미롭다.
국제 출원 WO2015018528, WO2018071918은 접합체 및 이 접합체에 공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 연결된 면역조절 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역사이토카인을 개시하고 있으며, 접합체는 인터루킨-15 또는 이의 유도체의 아미노산 서열과, IL-15Rα 또는 이의 유도체의 sushi 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
국제 출원 WO 2012175222는 접합체와, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Facb, Fd 및 scFv를 포함하는 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 접합체가 인터루킨 15의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 IL-15Rα의 sushi 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 암 치료용 면역사이토카인을 개시하고 있다. 이러한 접합체 및 항체 또는 이의 단편은 단백질 접합을 제공하는 2관능성 커플링제를 이용해 공유 연결된다.
국제 출원 WO2019006472는 하기를 포함하는 2관능성 이형이량체 단백질을 개시하였다:
IL-15Ra 단백질, IL-15 단백질 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 IL-15/IL-15Ra 융합 단백질; 및
VH-CHl-힌지-CH2-CH3 모노머 (VH는 중쇄 가변성 도메인이고, CH2-CH3는 제2 Fc 도메인임)를 포함하는 중쇄와 가변성 경쇄 (VL) 및 경쇄 불변 도메인 (CL)을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 CD8, 인간 NKG2A 및 인간 NKG2D로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원에 결합하는, 항원 결합성 도메인 모노머,
상기한 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 세트를 가진다:
S267K / L368D / K370S: S267K / S364K / E357Q;
S364K / E357Q: L368D / K370S;
L368D / K370S: S364K;
L368E / K370S: S364K;
T411T / K360E / Q362E: D401K;
L368D / K370S: S364K / E357L; 및
K370S:S364K / E357Q.
IL-15와 이의 수용체 IL-15Rα 간의 복합체에 대한 상기한 기존 해법들에도 불구하고, 높은 안정성, 연장된 생체내 반감기, 증가된 생체내 생물학적 활성 및 포유류 세포에서 증가된 생산성을 가진 IL15 기반의 분자가 여전히 요구되고 있다.
본 발명자들은, IL-15와 IL-15Rα-기반의 이형이량체 분자를 포함하며, 높은 안정성, 포유류 세포에서의 증가된 생산성, 연장된 생체내 반감기 및 증가된 생체내 생물학적 활성을 보이는, 새로운 면역사이토카인 형태를 개발하게 되었다. 아울러, 이것은 IL15 활성 특징을 가진 이중 특이성 면역사이토카인에 대한 보편적인 형태이다. 본 발명자들이 개발한 새로운 면역사이토카인 형태는 전임상 실험 결과에 따르면 낮은 독성을 가진다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인에 관한 것으로서, IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체는
1) a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15Rα;
2) a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
b) 항체 경쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15를 포함하고,
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 또는 결합되지 않으며,
IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 결쇄 불변 도메인에 연결되면, 이형이량체 단백질 복합체의 IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 다른 하나는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 CK 또는 CL로부터 선택되는 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15Rα, 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15Rα 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15, 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항쇄 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인, 및 이것과 힌지를 통해 연결된 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인과 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 다음과 같은 순서로 정렬된 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15 또는 IL-15Rα를 포함한다: CH1-힌지-CH2-CH3.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 4 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 2 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은
서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
서열번호 2 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은
서열번호 4 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 면역사이토카인의 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 초래하는 돌연변이를 Fc 단편 모노머에 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 IgG에 속하는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 상기한 IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체 2종을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료학적 물질로서 사용된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 암을 치료하기 위한 치료학적 물질로서 사용된다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체 및 PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인에 관한 것으로서,
IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체는
1) a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15Rα;
2) a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
b) 항체 경쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15를 포함하고,
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 또는 결합되지 않으며,
IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된다면, 이형이량체 단백질 복합체의 IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 다른 하나는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 CK 또는 CL로부터 선택되는 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15Rα, 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15Rα 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15, 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인, 및 이것에 힌지를 통해 연결된, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인과 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기 순서로 정렬된 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15 또는 IL-15Rα를 포함한다: CH1-힌지-CH2-CH3.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 6 또는 24로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 5 또는 23으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은, PD-1 경로를 특이적으로 저해하며 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다:
a) 경쇄 가변성 도메인과 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
b) 중쇄 가변성 도메인, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
1) 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는, LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
2) 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는 중쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
1) 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인.
2) 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다:
서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
일부 구현예에서, 면역사이토카인은, PD-1 경로를 특이적으로 저해하며, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
서열번호 5 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) 서열번호 6 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα, 및
서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은, 하나는 공유 또는 비-공유 결합된 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα와 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함하는 하나와, 공유 또는 비-공유 결합된 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 다른 하나인, 서로 다른 2종이 이형이량체를 형성하도록 유도하는, 돌연변이를 항체 불변 도메인에 가진다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
다음의 군으로부터 선택되는 제1 Fc 모노머 및 제2 Fc 모노머로서, 제1 Fc 모노머는 Knob 변형된 Fc이고 제2 Fc 모노머는 Hole 변형된 Fc이거나, 또는 제2 Fc 모노머은 Knob 변형된 Fc이고 제1 Fc 모노머은 Hole 변형된 Fc임.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 치환 S354C/T366W를 가진 제1 Fc 모노머와 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407V를 가진 제2 Fc 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407을 가진 제1 Fc 모노머와 아미노산 치환 S354C/T366W를 가진 제2 Fc 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 IgG에 속하는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 Fc 단편을 포함하며, Fc 단편 이소형은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 면역사이토카인에 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 유발하는 돌연변이를 Fc 단편 모노머에 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 면역사이토카인들 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 벡터를 세포에 형질전환하는 것을 포함하는 상기한 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 상기한 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 숙주 세포를 면역사이토카인을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라, 수득되는 면역사이토카인을 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 상기한 면역사이토카인을 포함하는 약물의 제조 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 면역사이토카인을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에 면역사이토카인 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 종양 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
치료 방법에 대한 일부 구현예에서, 종양 질환은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에 상기한 면역사이토카인 또는 상기한 약학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 활성화가 필요한 개체에서 T 세포 집단 또는 NK 세포 집단의 생물학적 활성을 활성화하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에서 종양 질환을 치료하기 위한 면역사이토카인 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 용도에서, 종양 질환은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택된다.
도 1. IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인 형태 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA).
도 2. IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인 형태 (CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA).
도 3. IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체 및 PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 면역조절 항체를 포함하는 면역사이토카인 형태 (Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA).
"Knob"는 CH3 도메인에서 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 간에 "knob-into-hole: 구조를 형성하는 돌연변이를 의미하는 것으로 이해된다.
도 4. IL-15/IL-15Rα 이형이량체 단백질 복합체 및 PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 면역조절 항체를 포함하는 면역사이토카인 형태 (Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA).
"Knob"는 CH3 도메인에서 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 간에 "knob-into-hole: 구조를 형성하는 돌연변이를 의미하는 것으로 이해된다.
도 5. pEE-IL15Ra-CK 벡터.
AmpR은 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자이고,
pUC 오리진은 박테리아의 pUC 복제 오리진이고,
CMV-promoter는 사이토메갈로바이러스 초기 유전자의 프로모터이고,
leader는 리더 서열이고,
IL15Ra는 인터루킨 15 수용체 서브유닛 α를 코딩하는 유전자이고,
CK는 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 유전자이고,
Poly A는 mRNA 안정성을 높이기 위한 폴리아데닐화 신호 서열이고,
OriP는 박테리아 복제 오리진, 또는 박테리아 세포에서 고-카피수 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 오리진이다.
도 6. pEE-IL15-CH1-Fc-LALA 벡터.
AmpR은 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자이고,
pUC 오리진은 박테리아의 pUC 복제 오리진이고,
CMV-promoter는 사이토메갈로바이러스 초기 유전자의 프로모터이고,
leader는 리더 서열이고,
IL15는 인터루킨 15를 코딩하는 유전자이고,
CH1은 제1 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 유전자이고,
Fc-LALA는 LALA 돌연변이 (Fc 단편의 CH2 불변 도메인에서 L234A 및 L235A 돌연변이)를 가진 Fc 단편을 코딩하는 유전자이고,
Poly A는 mRNA 안정성을 높이기 위한 폴리아데닐화 신호 서열이고,
OriP는 박테리아 복제 오리진이거나, 또는 박테리아 세포에서 고-카피수 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 오리진이다.
도 7. pEE-BCD100-02-VL-CK 벡터.
AmpR은 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자이고,
pUC 오리진은 박테리아의 pUC 복제 오리진이고,
CMV-promoter는 사이토메갈로바이러스 초기 유전자의 프로모터이고,
leader는 리더 서열이고,
aPD1-VL은 PD1에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자이고,
CK는 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 유전자이고,
Poly A는 mRNA 안정성을 높이기 위한 폴리아데닐화 신호 서열이고,
OriP는 박테리아 복제 오리진이거나, 또는 박테리아 세포에서 고-카피수 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 오리진이다.
도 8. pEE-BCD100-02-VH-CH1-Fc-hole-LALA 벡터.
AmpR은 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자이고,
pUC 오리진은 박테리아의 pUC 복제 오리진이고,
promoter는 사이토메갈로바이러스 초기 유전자들의 프로모터이고,
leader는 리더 서열이고,
aPD1-VH는 PD1에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄의 가변성 도메인을 코딩하는 유전자이고,
CH1은 제1 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 유전자이고,
Fc-hole-LALA는 "hole"을 형성하기 위한 돌연변이와 LALA 돌연변이 (Fc 단편의 CH2 불변 도메인에서 L234A 및 L235A 돌연변이)를 가진 Fc 단편을 코딩하는 유전자이고,
STOP는 정지 코돈이고,
OriP는 박테리아 복제 오리진이거나, 또는 박테리아 세포에서 고-카피수 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 오리진이다.
도 9. pEE-IL15-CH1-Fc-knob-LALA 벡터.
AmpR은 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자이고,
pUC 오리진은 박테리아의 pUC 복제 오리진이고,
CMV-promoter는 사이토메갈로바이러스 초기 유전자의 프로모터이고,
leader는 리더 서열이고,
IL15는 인터루킨 15를 코딩하는 유전자이고,
CH1은 제1 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 유전자이고,
Fc-knob-LALA는 "knob"를 형성하기 위한 돌연변이와 LALA 돌연변이 (Fc 단편의 CH2 불변 도메인에서 L234A 및 L235A 돌연변이)를 가진 Fc 단편을 코딩하는 유전자이고,
STOP는 정지 코돈이고,
OriP는 박테리아 복제 오리진이거나, 또는 박테리아 세포에서 고-카피수 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 오리진이다.
도 10 A. β-머캅토에탄올을 이용한 SDS 겔 전기영동
1. 대조군 항체 5 ㎕
2. Fermentas 비-염색 마커
3. -
4. CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA의 정제 전 배양물 10 ㎕
5. CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA의 정제 후 배양물 10 ㎕
6. CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA의 정제물 10 ㎕
7. -
8. CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA의 정제 전 배양물 10 ㎕
9. CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA의 정제 후 배양물 10 ㎕
10. CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA의 정제물 10 ㎕
도 10 B. β-머캅토에탄올 비-사용 SDS 겔 전기영동
1. CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA의 정제물 10 ㎕
2. CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA의 정제물 10 ㎕
3. Fermentas 비-염색 마커
4. 대조군 항체 5 ㎕
도 11. 증식 활성 측정. NK-92 세포주를 분석에서 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 NK-92 세포, 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성된다. 모든 현탁물 성분들은 소 태아 혈청과 글루타민이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후, Alamar Blue를 웰에 첨가하였다. 인큐베이션한 후, 웰에서 형광 강도를 측정하였다.
도 12. 증폭 활성 측정. 분석에서는 건강한 공여자의 PBMC로부터 음성 선별에 의해 분리한 단리된 자연 살상 세포를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 자연 살상 세포, 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성된다. 모든 현탁물 성분들은 자가 인간 혈장이 첨가된 배양 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후, Alamar Blue를 웰에 첨가하였다. 인큐베이션한 후, 웰에서 형광 강도를 측정하였다.
도 13. aPD1 비활성 측정. 분석에서는 Jurkat 세포주를 기반으로 구축되며 표면에 PD-1을 안정적으로 발현하며 NFAT 프로모터의 통제 하에 반딧불이 루시퍼라제 코딩 유전자를 가진 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포주; 및 Raji 세포주에 기반하여 구축되며 표면에 PDL1을 안정적으로 발현하는 Raji PDL1 세포주를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰의 현탁물은 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포, Raji PDL1 세포, 1 ng/ml 농도의 aCD3/aTAA1 세포, 및 도표에 표시된 농도의 검사 항체를 함유한다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 웰에서 루시퍼라제 강도를 발광 분석 키트를 사용해 측정하였다.
도 14. 리포터 세포주 상에서 항-PDL1/IL15SA 항체의 비활성 결정.
도 15. 자연 살상 세포의 ADCC에 대한 효과 결정. 분석에서는 건강한 공여자의 PBMC로부터 음성 선별에 의해 단리한 자연 살상 세포를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 자연 살상 세포 및 Raji 세포, 작동자 항체 리툭시맵 (rituximab) 및 도표에 표시된 농도의 검사 항체를 함유한다. 모든 현탁물 성분들은 소 태아 혈청과 글루타민이 첨가된 배양 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이후, 배양액을 수집한 다음, 락테이트 데하이드로게나제 함량을 LDH 분석 키트를 사용해 측정하였다.
도 16. TAA-리포터 세포주에 대한 리툭시맵의 ADCC 활성 강화에 대한 면역사이토카인의 비활성 측정 결과.
도 17. NK 세포 상에서 IL-15/IL-15Rα (IL15SA) 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인 변이체에 대한 세포독성 실험.
결과는 후보물질의 세포독성 효과가 유의하지 않다는 것을 보여주며, 즉 AB 음성 대조군 (임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을 보여준다.
도 18. B 세포 상에서 IL15SA 변이체에 대한 세포독성 실험.
결과는 후보물질의 세포독성 효과가 유의하지 않다는 것을 보여주며, 즉 AB 음성 대조군 (임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을 보여준다.
도 19. CD3+ 세포 상에서 IL15SA 변이체에 대한 세포독성 실험.
결과는 후보물질의 세포독성 효과가 유의하지 않다는 것을 보여주며, 즉 AB 음성 대조군 (임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을 보여준다.
도 20. CD4+ 세포 상에서 IL15SA 변이체에 대한 세포독성 실험.
결과는 후보물질의 세포독성 효과가 유의하지 않다는 것을 보여주며, 즉 AB 음성 대조군 (임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을 보여준다.
도 21. CD8+ 세포 상에서 IL15SA 변이체에 대한 세포독성 실험.
결과는 후보물질의 세포독성 효과가 유의하지 않다는 것을 보여주며, 즉 AB 음성 대조군 (임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을 보여준다.
도 22. 크로마토그램. 크로마토그램은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 면역사이토카인 (IL15 슈퍼-작용제)의 높은 동질성 (homogeneity)(용액내 응집물의 함량이 5% 이하임)을 입증해준다.
도 23. 뮤라인 생체내 종양 모델에서 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체 (BCD-225)를 포함하는 면역사이토카인 산물의 항-종양 활성을 확인하기 위한 실험 계획.
도 24. 뮤라인 생체내 종양 모델에서 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체 (BCD-225)를 포함하는 면역사이토카인 산물 변이체의 항-종양 활성을 확인하기 위한 실험의 결과.
도 25. 뮤라인 생체내 종양 모델에서 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체 (BCD-225)를 포함하는 면역사이토카인 산물 변이체의 항-종양 활성을 확인하기 위한 실험의 결과 (도표).
일반 정의 및 일반적인 방법
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
나아가, 문맥상 달리 요구되지 않은 한, 단수형 용어는 복수 형태를 포함할 것이며, 복수 용어는 단수 형태를 포함할 것이다. 전형적으로, 세포 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전자학, 분석 화학, 유기 합성 화학, 의학 및 약학 화학 뿐 아니라 본원에 기술된 단백질 및 핵산의 혼성화 및 화학에 대한 분류 및 방법이 널리 공지되어 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 광범위하게 이용된다. 효소 반응 및 정제 방법은 당해 기술 분야에서 통상적이거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 제조사의 가이드라인에 따라 수행된다.
달리 명시되지 않은 한, 본 발명의 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "생물학적으로 활성인" 및 "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 생물학적 분자에 결합하는 능력을 가지고 있다는 것을 의미한다.
용어 "재조합 단백질"은 단백질 코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 세포 또는 세포주에서 발현되는 단백질 (폴리펩타이드)를 의미하며, 여기서 뉴클레오티드 서열(들)은 본래 그 세포와 관련없는 것이다.
용어 "이중 특이성 항체"는 2종의 구분되는 생물학적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 단일 생물학적 분자의 구분되는 에피토프 2종에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(들)을 가진 항체를 지칭한다. 이중 특이성 항체는 또한 "듀얼 특이성"을 가진 것으로 또는 "듀얼 특이성" 항체인 것으로도 언급된다.
용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 세포의 분리된 클론 집단에 의해 합성 및 단리되는 항체를 지칭한다. 클론 집단은 불멸화 세포의 클론 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 클론 집단에서 불멸화 세포는 전형적으로 면역화된 동물 유래 개별 B 림프구를 림프성 종양 유래의 개별 세포와 융합하여 제조되는 하이브리드 세포, 즉 하이브리도마이다. 하이브리도마는 구축되는 세포의 한가지 유형이며, 자연계에는 존재하지 않는 것이다.
본원에서, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 (on) 속도를 의미한다.
본원에서, 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 (off) 속도를 의미한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예, 항체)의 단일 결합부와 이의 결합 파트너 (예, 항원) 간의 비-공유적인 상호작용들 전체 세기를 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 나타내는 고유한 (특징적인, 참된) 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 바람직한 Kd 값은 약 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM 또는 그 미만이다. 친화성은 본원에 기술된 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 일반적인 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 결합된 상태로 더 길게 머무르는 경향을 보인다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이중 임의의 방법을 본 발명의 목적에 따라 이용할 수 있다.
본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 도메인들을 조합할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 서로 연결하는 도메인에 따라 소정의 길이를 가지며, 임의의 아미노산 서열을 포함하는, 임의의 펩타이드를 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 5개 이상의 아미노산 길이를 가지며, G, A, S, P, E, T, D, K로부터 선택되는 임의의 아미노산 세트로 구성된다.
용어 "시험관내"는 인공적인 조건에서 신체 외부에서의 생물학적 대상, 생물학적 공정 또는 생물학적 반응을 지칭한다. 예를 들어, 시험관내 배양된 세포는 신체 외부 환경, 예를 들어 시험관, 배양 바이얼 또는 마이크로타이터 플레이트에서 배양된 세포로서 이해된다.
본원에서, 용어 "들을 포함한다", "들을 가진다, "들을 함유한다" 또는 "을 포함한다", "포함하는", "을 가진다", "가지는", "을 함유한다" 또는 "포함하여"와 같은 변형어, 그리고 이의 모든 문법 상의 변형어들은, 언급된 정수 (integer) 또는 정수 군을 포함하는 의미로 이해될 뿐만 아니라, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 대한 상세한 설명
면역사이토카인
일 측면에서, 본 발명은 IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인에 관한 것으로, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체는
1) a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα;
2) a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
b) 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15
를 포함하며,
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 결합되지 않으며,
IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된다면, 이형이량체 단백질 복합체의 IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 다른 하나가 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된다.
이러한 면역사이토카인의 형태는 도 1 및 2에 도시된다.
용어 "면역사이토카인"은 사이토카인 또는 이의 유도체에 항체 또는 이의 단편이 공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 연결된 분자를 의미한다. 이러한 항체 및 사이토카인은 링커 펩타이드에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 면역사이토카인은 단리된 면역사이토카인을 지칭하는 것으로 고려된다.
본원의 다양한 면역사이토카인을 기술하는데 사용되는 용어 "단리된"은 면역사이토카인이 발현되는 세포 또는 세포 배양물로부터 동정 및 분리 및/또는 재생된 면역사이토카인을 의미한다. 천연 환경으로부터의 불순물 (오염 물질)은 폴리펩타이드의 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질로서, 이는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 면역사이토카인은, (1) 스피닝 컵 서열 분석 장치 (spinning cup sequenator)(Edman sequenator)의 사용시 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (2) 코마시 브릴리언트 블루 또는 바람직하게는 은 염료를 이용한 환원성 또는 비-환원성 조건 하 SDS-PAGE에서 동질성을 나타내는 수준으로 정제된다. 단리된 면역사이토카인은, 폴리펩타이드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않으므로, 재조합 세포 내부의 인 시추 항체를 포함한다. 전형적으로, 단리된 폴리펩타이드는 전형적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 준비된다.
본원에서, "이형이량체 단백질 복합체"는 IL-15과 IL-15Rα의 조합으로 형성된 단백질을 의미한다.
본원에서, "IL-15" 또는 "IL-15 펩타이드" 또는 "인터루킨-15"는 인간 또는 비-인간 포유류 IL-15 또는 비-포유류 IL-15와 같은 임의의 IL-15 (인터루킨-15) 또는 이의 돌연변이일 수 있다. 예시적인 비-인간 포유류로는 돼지, 토끼, 원숭이, 침팬치, 마우스 등과 같은 포유류를 포함하며; 비-포유류로는 닭 등을 포함한다. 바람직하게는, 인간 인터루킨-15 성숙 분자는 데이터베이스 UniProtKB, 등재 번호 P40933, 49-162aa에서 확인된다. 용어 "IL-15 변이체"는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결손으로 인해, 이의 수용체에 대한 친화성이 증가 또는 감소된, 또는 T 세포 또는 NK 세포를 자극하는 활성이 증가 또는 감소된, 변이체 분자를 지칭한다.
"IL-15Rα"는 인터루킨 15 수용체 서브유닛 알파 (α)를 의미하며, 본 발명에 따르면, 임의의 IL-15Rα 화합물 또는 이의 기능성 단편, 예를 들어 인간 IL-15Rα 또는 비-인간 포유류 IL-15Rα 또는 비-포유류 IL-15Rα일 수 있다. 예시적인 비-인간 포유류로는 돼지, 토끼, 원숭이, 침팬치, 마우스 등의 포유류를 포함하며, 비-포유류로는 닭 등을 포함한다. 바람직한 IL-15Rα 분자는 데이터베이스 UniProtKB, 등재 번호 Q13261 (https ://www.uniprot.org/uniprot/Q13261)에서 확인된다.
면역글로불린의 단편 결정화가능한 영역 (fragment crystallizable region)("Fc 영역, Fc")은 세포 표면 Fc-수용체와 상호작용하는 면역글로불린 분자뿐 아니라 보체 시스템의 일부 단백질의 "꼬리" 영역이다. 이런 특성이 항체가 면역 시스템을 활성화하게 만든다. IgG, IgA 및 IgD 이소형의 경우, Fc 영역은 중쇄 2개의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 각각 유래한 동일한 단백질 단편 2개로 구성되고; IgM 및 IgE 이소형의 경우, Fc 영역은 각 폴리펩타이드 쇄에 중쇄 불변 도메인 3개 (CH2, CH3 및 CH4 도메인)를 포함한다.
"Fc 단편 모노머"는 (IgG, IgA 및 IgD 이소형의 경우) 중쇄 2개 중 어느 하나의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래한 Fc 영역을 의미하는 것으로 이해되며, IgM 및 IgE 이소형의 경우, Fc 모노머는 중쇄 2개 중 하나의 불변 도메인 3개 (CH2, CH3 및 CH4 도메인)를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 CK 또는 CL로부터 선택되는 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
포유류에서는 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 표시되는 2가지 유형의 경쇄만 알려져 있다. 람다 경쇄의 불변 도메인은 CL로 명명되고, 카파 경쇄의 불변 도메인은 CK로 명명된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASS (서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15Rα, 또는 생물학적 활성이 유사한 돌연변이를 함유한 임의의 공지된 IL-15Rα 변이체를 포함한다.
돌연변이 IL-15Rα, 생물학적 활성이 유사한 IL-15Rα는 "야생형" IL-15Rα와 비교해 생물학적 활성이 유사하고 돌연변이를 가진, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 IL-15Rα를 지칭하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 서열 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 10)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15, 또는 생물학적 활성이 유사한 돌연변이를 함유한 임의의 공지된 IL-15 변이체를 포함한다.
돌연변이 IL-15, 생물학적 활성이 유사한 IL-15는 "야생형" IL-15와 비교해 생물학적 활성이 유사하고 돌연변이를 가진, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 IL-15를 지칭하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1)을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 19)을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로부터 216번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3)을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다:.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 21)을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로부터 233번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인, 및 이에 힌지를 통해 연결된, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인과 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 다음과 같은 순서로 정렬된, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15 또는 IL-15Rα를 포함한다: CH1-힌지-CH2-CH3.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 4)을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 22)을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로부터 212번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 2)을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 서열 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 20)을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로부터 229번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1) 또는 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 19)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 2) 또는 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 20)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 2)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 19)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 20)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 4) 또는 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 22)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3) 또는 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 21)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 4)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 22)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα; 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 21)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 면역사이토카인에 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 유발하는 돌연변이를 Fc 단편 모노머에 포함한다.
Fc 단편에서 돌연변이는 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열의 변형(들)을 의미하는 것으로 이해된다. 항체의 아미노산 서열의 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형으로는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결손, 및/또는 삽입, 및/또는 치환 등이 있다. 최종 구조체가 바람직한 특징을 가지는 한, 최종 구조체에 도달하기 위해 결손, 삽입 및 치환의 임의 조합이 행해진다.
아미노산 치환을 이용한 항체 아미노산 서열의 변형 변이체는 항체 분자내 하나 이상의 아미노산 잔기를 다른 잔기로 치환한 것이다.
보존적인 치환은 표 A에서 "바람직한 치환"에 표시된다.
표 A
원 잔기 치환 예 바람직한 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gin; Asn Lys
Asn(N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp(D) Glu; Asn Glu
Cys(C) Ser; Ala Ser
Gln(Q) Asn; Glu Asn
Glu(E) Asp; Gin Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르루신 Leu
Leu(L) 노르루신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gin; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val; Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르루신 Leu
항체의 용어 "작동자 기능"은 항체 이소형에 따라 다양한, 항체의 Fc-영역 (네이티브 Fc-영역 서열 또는 Fc-영역 아미노산 변이체)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 작동자 기능의 예로는 Clq 결합성 및 보체 의존적인 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절 (예, B 세포 수용체, BCR), 및 B 세포 활성화 등이 있다.
"항체-의존적인 세포성 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적인 세포독성 세포 (예, 자연 살상 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지한 후 표적 세포의 세포용해 또는 식세포작용을 유발하는, 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 일차 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만 발현하지만, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)의 464쪽 표 3에 요약 기술되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 이용가능한 작동자 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살상 (NK) 세포를 포함한다. 다른 예로 또는 부가적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)에 기술된 바와 같이 동물 모델에서 분석할 수 있다.
"인간 작동자 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하며 작동자 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하며, ADCC 작동자 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 자연 살상 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있으며; PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 작동자 세포는 이의 천연 소스로부터, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 혈액 또는 PBMC로부터 단리할 수 있다.
"보체-의존적인 세포독성" 및 "CDC"는 분자가 보체의 존재시 표적을 세포용해시킬 수 있는 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예, 항체)에 결합함으로써, 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)에 기술된 바와 같이, CDC 분석을 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 IgG에 속하는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 상기한 2종의 이형이량체 단백질 복합체를 포함한다.
본 발명의 IL15 슈퍼-작용제 (BCD225 또는 IL15SA 또는 (IL15SA)2-Fc로도 지칭됨)는 CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 및 CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA를 지칭하는 것으로 이해된다.
명칭 CK, IL15Ra, IL15, CH1FcLALA의 의미는 본 출원 전문에 제시된다.
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA는, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15Ra, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15를 포함하되 Fc가 LALA 돌연변이를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 2개의 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 전술한 면역사이토카인이다.
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA는, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15Ra를 포함하되 Fc가 LALA 돌연변이를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 2개의 이형이량체 단백질 복합체를 포함하는 전술한 면역사이토카인이다.
상기한 면역사이토카인은, 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 형태, 그리고 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 형태 2가지로 제조할 수 있으며, 특정한 경우에, 이를 위해, 양쪽 시스테인이 알라닌으로 치환된다.
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 형태와, 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 형태인, 2종의 면역사이토카인에 대한 실험 연구에서, 이들 면역사이토카인은 활성에 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다.
상기한 면역사이토카인의 형태는 도 1과 도 2에 도시된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료학적 물질로서 사용된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 암을 치료하기 위한 치료학적 물질로서 사용된다.
일 측면에서, 본 발명은 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체, 및 PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인에 관한 것으로서,
IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체는
1) a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15Rα; 및
2) a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
b) 항체 경쇄 불변 도메인
에 연결된, IL-15를 포함하고,
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 또는 결합되지 않으며,
IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된다면, 이형이량체 단백질 복합체의 IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 다른 하나는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된다.
본원에서, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린" (Ig)은 항체 전체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 영역") 또는 이의 단쇄를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원-결합 영역을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변부를 포함한다. 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 타입의 포유류 Ig 중쇄들이 공지되어 있다. 존재하는 중쇄의 타입이 항체의 클래스를 규정하며; 이들 쇄들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체 각각에서 발견된다. 구분되는 중쇄들은 크기 및 구성 측면에서 다양하며; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 포함하지만, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 포함한다. 각각의 중쇄는 2개의 영역, 즉 불변부 및 가변부를 포함한다. 불변부는 동일한 이소형의 항체들 모두에서 동일하지만, 서로 다른 이소형 항체들에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 불변 도메인 3종 CH1, CH2 및 CH3 (일렬로)로 구성된 불변부와, 유연성 (flexibility) 부가를 위한 힌지부를 포함하며 (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); 중쇄 μ와 ε는 불변 도메인 4종 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 불변부를 가진다. 포유류에서는, 람다 (λ) 및 카파 (κ)로 언급되는 오직 2가지 타입의 경쇄만 공지되어 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄의 대략적인 길이는 아미노산 211개 내지 217개이다. 바람직하게는, 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL은 바람직하게는 C 카파 (κ)이다.
본 발명에서 "항체"는 임의 클래스 (예, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 바람직하게는 IgG) 또는 서브클래스 (예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1)에 속하는 것일 수 있다.
VL 영역 및 VH 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보존성이 높은 영역들과 그 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과-가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 정렬된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 가변부와 경쇄 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등의, 숙주 조직 또는 인자에의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서, 항체의 "항원-결합 영역" 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단히 "항체 영역" 또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 가진, 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 2개의 Fab 단편들이 연결된 2가 단편인, F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd-단편; (iv) 항체의 싱글 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv-단편, (v) VH/VHH 도메인으로 구성된 dAb-단편 (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR) 등이 있다. 또한, Fv 단편의 2개의 영역, 즉 VL와 VH는 개별 유전자들에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역들이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 싱글 단백질 쇄를 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방식으로 연결될 수도 있다 (단쇄 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조함). 이러한 단일-가닥 분자는 또한 항체의 "항원-결합 영역"이라는 용어에 포함되는 것으로 추정된다. 이러한 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 이용해 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체 (intact antibody)와 동일한 방식으로 스크리닝된다.
바람직하게는, 본 발명의 항원-결합 영역의 CDR 또는 항체의 전체 항원 결합 영역은 마우스, 라마 또는 인간 도너 라이브러리로부터 유래하거나, 또는 일부 아미노산 잔기가 변형된, 예를 들어 특정 항체 특성, 예를 들어, KD, koff, IC50, EC50, ED50을 최적화하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된, 실질적으로 인간 기원의 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 프래임워크 영역은 인간 기원의 것이거나 또는 실질적으로 인간 기원의 것이다 (인간 기원의 비율이 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%임).
다른 구현예들에서, 본 발명의 항체의 항원 결합 영역은, 비-제한적인 예로, 마우스, 라마, 토끼, 랫 또는 햄스터 등의, 인간을 제외한 다른 종으로부터 유래할 수 있다. 다른 예로, 항원-결합 영역은 인간 종으로부터 유래할 수 있다.
용어 "가변성"은 가변성 도메인의 일정 부분이 항체들에서 서열상 상당히 상이하다는 것을 의미한다. V 도메인은 각 특정 항체의 이의 특정 항원에 대한 항원 결합을 매개하고 특이성을 결정한다. 그러나, 가변성이 가변성 도메인의 110개의 아미노산 전체에 균등하게 분산된 것은 아니다. 대신, V 영역은 "과가변부" 또는 CDR로 지칭되는 극도의 가변성을 가진 더 짧은 가닥에 의해 이격된 아미노산 15-30개로 된 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 불변성 단편들로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인은 FR 4개를 포함하며, 연결성 루프, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는, 과가변부 3개에 의해 연결된, β-시트 배열을 주로 취한다. 각 체인에서 과가변부들은 FR에 의해 서로 인접하게 유지되며, 다른 체인으로부터 유래한 과가변부와 함께 항체의 항원-결합부를 형성하는데 기여한다. 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 참여하진 않지만, 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 항체 참여 등의 여러가지 작동자 기능을 발휘한다.
본 설명에서, 용어 "과가변부"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 통상적으로, 과가변부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래한 아미노산 잔기 및/또는 "과가변성 루프"로부터 유래한 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 경우에, 타겟 에피토프에 대한 결합 친화성을 높이기 위해 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 "친화성 성숙화"라고 하며, 선택적으로, 예를 들어, 항체의 인간화에 의해 결합 특이성 또는 친화성의 저하가 발생하고 역 돌연변이 (inverse mutation) 단독에 의해 결합 특이성 또는 친화성을 충분히 개선하는 것이 가능하지 않을 경우, 인간화와 더불어 수행할 수 있다. 다양한 친화성 돌연변이 방법들, 예를 들어, Burks et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997)에 언급된 시험관내 스캐닝 포화 돌연변이 유발 방법 및 Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998)에 제시된 단계별 시험관내 친화성 성숙화 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"프래임워크 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 각각의 가변성 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 FR 4개를 가지고 있다. CDR이 Kabat에 따라 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기들은 대략적으로 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) 및 98-107 (LCFR4)번 위치에 위치하고, 중쇄 FR 잔기들은 대략적으로 중쇄에서 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)번 위치에 위치한다. CDR이 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 대략적으로 경쇄에서 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) 및 97-107 (LCFR4)번 위치에 존재하며, 중쇄 FR 잔기는 대략적으로 중쇄 잔기에서 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)번 위치에 존재한다. CDR이 Kabat에 의해 정의되는 양쪽 CDR 및 과가변성 루프로부터 유래된 아미노산을 포함하는 일부 경우에, FR 잔기들은 그에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 경우, 중쇄 FR1 잔기는 1-25번 위치에 위치하고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 위치한다.
표적 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직 또는 단백질을 표적화하는 치료학적 물질 및/또는 진단 물질로서 사용될 수 있도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하며, 다른 단백질과는 일부 교차 반응하는 항체를 지칭한다. 분석 방법에 따라: 형광-활성화된 세포 분류 (FACS), 방사성면역분석 (RIA) 또는 ELISA, 이러한 구현예에서, 비-표적 단백질에 항체가 결합하는 수준은 특이적인 표적 단백질에 결합하는 항체의 10% 미만이다. 항체가 표적 분자에 결합하는 것과 관련하여, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 대해 특이적"이라는 용어는, 비-특이적인 상호작용과는 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 CK 또는 CL로부터 선택되는 항체 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASS (서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15Rα, 또는 생물학적 활성이 유사한 돌연변이를 함유한 임의의 공지된 IL-15Rα 변이체를 포함한다.
돌연변이 IL-15Rα, 생물학적 활성이 유사한 IL-15Rα는 "야생형" IL-15Rα와 비교해 생물학적 활성이 유사하고 돌연변이를 가진, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 IL-15Rα를 지칭하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 10)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 IL-15, 또는 생물학적 활성이 유사한 돌연변이를 함유한 임의의 공지된 IL-15 변이체를 포함한다.
돌연변이 IL-15, 생물학적 활성이 유사한 IL-15는 "야생형" IL-15와 비교해 생물학적 활성이 유사하고 돌연변이를 가진, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 IL-15를 의미한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 19)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로부터 216번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 21)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로부터 233번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인, 및 이에 힌지를 통해 연결된, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인과 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 다음과 같은 순서로 정렬된, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15 또는 IL-15Rα를 포함한다: CH1-힌지-CH2-CH3.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 6)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 24)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα를 포함한다.
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로부터 212번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 5)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 23)로 표시되는 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함한다.
서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로부터 229번 위치에서 시스테인 (C)에서 알라닌 (A)으로의 아미노산 치환 하나에 의해 변형된다. 이러한 치환으로 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 이형이량체 복합체 형태로 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인을 포함하는 면역사이토카인이 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 PD-1 경로를 특이적으로 저해하며 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체인 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특이적인 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적인 결합은 표적과 비슷한 다른 분자, 예를 들어 과량의 비-표지 표적을 이용한 경쟁적인 반응에 의해 결정할 수 있다. 이 경우, 표지된 표적과 프로브의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해된다면, 이는 특이적인 결합이다. 본원에서, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 타겟 상의 에피토프에 "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"이다라는 표현은, 표적에 대한 Kd가 적어도 약 200 nM 또는 적어도 약 150 nM 또는 적어도 약 100 nM 또는 적어도 약 60 nM 또는 적어도 약 50 nM 또는 적어도 약 40 nM 또는 적어도 약 30 nM 또는 적어도 약 20 nM 또는 적어도 약 10 nM 또는 적어도 약 8 nM 또는 적어도 약 6 nM 또는 적어도 약 4 nM 또는 적어도 약 2 nM 또는 적어도 약 1 nM 또는 그 이상인 분자로 설명될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "특이적인 결합"은 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에만 결합하고 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 상의 에피토프에는 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다:
a) 경쇄 가변성 도메인과 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
b) 중쇄 가변성 도메인; 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 각각 아미노산 서열 GGNNIGSKNVH (서열번호 14), RDSNRPS (서열번호 15) 및 CQVWDSSTAV (서열번호 16)로 표시되는 LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQ (서열번호 18)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 각각 아미노산 서열 FTFSSYWMY (서열번호 11), AIDTGGGRTYYADSVKG (서열번호 12) 및 CARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDA (서열번호 13)로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSS (서열번호 17)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
1) 각각 아미노산 서열 GGNNIGSKNVH (서열번호 14), RDSNRPS (서열번호 15) 및 CQVWDSSTAV (서열번호 16)로 표시되는 LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는 경쇄 가변성 도메인;
2) 각각 아미노산 서열 FTFSSYWMY (서열번호 11), AIDTGGGRTYYADSVKG (서열번호 12) 및 CARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDA (서열번호 13)로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는 중쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
1) QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQ (서열번호 18)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변성 도메인;
2) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSS (서열번호 17)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변성 도메인.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함하는 면역조절 항체를 포함한다:
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 면역조절 항체 프롤고리맵 (prolgolimab)(BCD100, WO2018013017)을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 PD-1 경로를 특이적으로 저해하며, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체는 RU2665790 (WO2018194496)에 개시된 BCD135이다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 1)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 5)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산을 포함하는 중쇄;
QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산을 포함하는 경쇄.
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 19)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 23)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산을 포함하는 중쇄;
QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 6)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 3)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 하기를 포함한다:
a) DTCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSGAEGGGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 24)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα, 및
DNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSAGGKPGGSAGGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEA (서열번호 21)로 표시된 아미노산 서열을 가진 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15
를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체;
b) QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQVPGKGLEWVSAIDTGGGRTYYADSVKGRFAISRVNAKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARDEGGGTGWGVLKDWPYGLDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (서열번호 7)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
QPVLTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSTAVFGTGTKLTVLQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 8)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
를 포함하는, 면역조절 항체.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 공유 또는 비-공유 결합된 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα와 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함하는 하나와, 공유 또는 비-공유 결합된 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 다른 하나로 이루어진 서로 다른 2종 간의 이형이량체 형성을 유도하는, 돌연변이를 항체 불변 도메인을 가진다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은, 제1 Fc 모노머가 Knob 변형된 Fc이고 제2 Fc 모노머가 Hole 변형된 Fc이거나, 또는 제2 Fc 모노머가 Knob 변형된 Fc이면 제1 Fc 모노머가 Hole 변형된 Fc인 군으로부터 선택되는, 제1 Fc 모노머 및 제2 Fc 모노머를 포함한다.
"Knobs-into-holes" ("knobs-into-holes" 유형의 상호작용)은 미스-페어링된 부산물 (mispaired byproducts)과 관련한 문제를 해결할 수 있는 접근법이다. 이 접근법은 접촉 계면을 변형시키기 위해 CH3 도메인에 돌연변이를 도입함으로써 서로 다른 2종의 항체 중쇄가 쌍을 형성하도록 강제하는 것을 목표로 한다. 하나의 쇄에는 큰 아미노산을 짧은 측쇄를 가진 아미노산으로 치환해 구멍을 형성시킨다. 반대로, 다른 CH3 도메인에는 큰 측쇄를 가진 아미노산을 도입하여 "손잡이"를 형성시킨다. 이들 2종의 중쇄를 공동-발현시킴으로써, 동형이량체 형성 ("hole-hole" 또는 "knob-knob") 대비 이형이량체의 형성("knob-hole")이 고 높은 수율로 달성되는 것으로 관찰되었다 (Ridgway, J. B., Presta L G, Carter P; 및 WO 1996/027011). 이형이량체의 %는 파지 디스플레이 기법을 이용해 CH3 도메인 2종의 계면을 리모델링하고, 이황화 결합을 도입함으로써 이형이량체를 안정화시킴으로써, 추가로 높일 수 있다 (Merchant, A. M., et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., Ridgway, J. B., Wells, J. A., Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35).
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 치환 S354C/T366W를 가진 제1 Fc 모노머와 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407V를 가진 제2 Fc 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407을 가진 제1 Fc 모노머와 아미노산 치환 S354C/T366W를 가진 제2 Fc 모노머를 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 IgG에 속하는 Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 Fc 단편 이소형이 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는, Fc 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 면역사이토카인에 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 유발하는 돌연변이를 Fc 단편 모노머에 포함한다.
나아가, 2중 특이성 IL15 슈퍼-작용제 또는 2중 특이성 IL15 면역사이토카인 또는 항-PD1/IL15SA 면역사이토카인 (IL-15SA와 항-PD-1 Fab 단편을 포함하는 2중 특이성 단일클론 항체)은 하기를 의미하는 것으로 이해된다:
항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA,
항-PD-1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA.
나아가, 항-PD-L1/IL15SA 면역사이토카인은 하기를 의미하는 것으로 이해된다:
항-PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA,
항-PD-L1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA.
명명 항-PD-1 Fab, 항-PD-L1 Fab, CK, IL15Ra, IL15, CH1FcknobLALA의 의미는 본 출원 전문에서 제시된다.
항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA는, 항-PD1 항체의 항원 결합성 Fab 단편, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15Ra, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15를 포함하되, Fc가 이형이량체 형성을 위한 돌연변이 (예, knob) 및 LALA를 포함하는, 상기한 면역사이토카인이다.
항-PD-1 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA는, 항-PD1 항체의 항원 결합성 Fab 단편, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15Ra를 포함하되, Fc가 이형이량체 형성을 위한 돌연변이 (예, knob) 및 LALA를 포함하는, 상기한 면역사이토카인이다.
항-PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA는, 항-PD-L1 항체의 항원 결합성 Fab 단편, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15Ra, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15를 포함하되, Fc가 이형이량체 형성을 위한 돌연변이 (예, knob) 및 LALA를 포함하는, 상기한 면역사이토카인이다.
항-PD-L1 Fab-CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA는, 항-PD-L1 항체의 항원 결합성 Fab 단편, 항체 경쇄 불변 도메인 CK에 연결된 IL15, 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL15Ra를 포함하되, Fc가 이형이량체 형성을 위한 돌연변이 (예, knob) 및 LALA를 포함하는, 상기한 면역사이토카인이다.
이러한 면역사이토카인은 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 형태로, 그리고 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 형태 2가지로 제조할 수 있으며, 특정 경우에, 이를 위해 양쪽 시스테인이 알라닌으로 치환된다.
이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합된 형태와 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인이 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되지 않은 형태 2가지의 상기한 면역사이토카인에 대한 실험 연구를 통해, 이들 사이토카인에는 유의한 활성 차이가 없는 것으로 확인되었다.
전술한 바와 같은 "Knob"는 CH3 도메인에서 제1 Fc 변이체와 제2 Fc 변이체 간에 "knob-into-hole: 구조를 형성하는 돌연변이를 의미하는 것으로 이해된다.
상기한 면역사이토카인의 형태는 도 3 및 4에 도시된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 면역사이토카인은 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
핵산
일 측면에서, 본 발명은 상기한 임의의 면역사이토카인을 코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
용어 "핵산", "뉴클레익 서열", "핵산 서열", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 핵산의 단편 또는 영역을 결정하고, 비-천연 뉴클레오티드를 함유하거나 또는 비-함유하며, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 또는 이들 DNA의 전사 산물인, 변형된 또는 비-변형된 정확한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 발명이 천연 염색체 환경, 즉 천연 상태의 뉴클레오티드 서열에 대한 것이 아닌 것 역시 본원에 포함되어야 한다. 본 발명의 서열은 단리 및/또는 정제된 것이며, 즉, 예를 들어, 복사 (copy)에 의해 직접 또는 간접적으로 수집된 것이며, 이의 환경은 적어도 부분적으로 변형된다. 이에, 예를 들어, 숙주 세포의 재조합 유전학에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 수득된 단리된 핵산 역시 본 발명에서 언급되어야 한다.
"단리된" 핵산 분자는 천연 소스에서 일반적으로 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 분자-불순물로부터 동정 및 분리된 것이다. 단리된 핵산 분자는, 천연 환경에서 발견되는 형태 또는 세트와 구분된다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 환경에서 세포내 존재하는 핵산 분자와 구분된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 환경에서 세포내 위치화가 아닌 염색체 위치에 존재한다면, 면역사이토카인이 정상적으로 발현되는 세포내 위치된 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 또한, 핵산 분자는 상기한 뉴클레오티드 서열들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 유전자 코드의 중복성 (redundancy)으로 인해, 다양한 여러가지 DNA 서열들이 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 코딩할 수 있다. 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 대안적인 DNA 서열을 생성하는 것은 당해 기술 분야의 당업자의 능력내에서 충분하다. 이러한 변이체 DNA 서열은 본 발명의 범위에 속한다.
발현 벡터
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이며, 즉 부가적인 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 조각이다. 일부 구현예에서, 벡터는 부가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 이것이 도입된 숙주 세포에서 자율적인 복제 (autonomous replication)를 수행할 수 있다 (예, 박테리아의 복제 오리진을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 추가적인 구현예들에서, 벡터 (예, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포 게놈에 병합될 수 있으며, 그래서 숙주 유전자와 함께 복제된다. 또한, 일부 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 상기한 면역사이토카인 또는 이의 구조 영역의 임의의 아미노산 서열을 코딩하는 상기한 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 면역사이토카인은, 유전자들이 전사 조절 서열 및 번역 조절 서열과 같은 요망되는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 발현 벡터에서, 전술한 바와 같이 생산되는, 제1 및 제2 면역사이토카인 도메인 (예, 항체 불변 도메인(들) 및/또는 항체 경쇄 및 중쇄에 연결된 IL15 또는 IL15Rα를 포함하는 도메인)의 서열 전체 또는 일부를 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 발현된다. 발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 (AAV), 식물 바이러스, 예를 들어 콜리플라워 모자익 바이러스, 토바코 모자익 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. DNA 분자는 벡터내 전사 및 번역 조절 서열이 DNA의 전사 및 번역을 조절하는 의도한 기능을 제공하도록, 벡터에 라이게이션될 수 있다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포에 적합하게 선택될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인의 서열 (예, 결합 도메인이 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 경우 중쇄 및 경쇄 서열)을 일부 또는 전체 코딩하는 DNA 서열이 각 벡터에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 DNA 분자들의 임의 조합이 동일한 발현 벡터에 도입된다. DNA 분자는 표준 방법 (예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적인 제한효소 부위의 라이게이션, 또는 제한효소 부위가 존재하지 않는다면 블런트 엔드 라이게이션)에 의해 발현 벡터에 도입될 수 있다.
적절한 벡터는, 임의의 서열 VH 또는 VL 서열 또는 IL15 또는 IL15Rα가 전술한 바와 같이 용이하게 삽입 및 발현될 수 있도록 적절한 제한효소 부위 조작을 가진, 기능적으로 완전한 (complete) 인간 CH 또는 CL/CK 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 이러한 벡터에서 HC- 및 LC-코딩 유전자는, 대응되는 mRNA를 안정화함으로써 항체 단백질의 전체 수율을 높이게 되는, 인트론 서열을 함유할 수 있다. 인트론 서열의 측면에는, RNA 스플라이싱이 발생할 위치를 결정하는 스플라이스 도너 부위와 스플라이스 어셉터 부위가 배치된다. 인트론 서열의 위치는 항체 쇄의 가변부 또는 불변부 중 어느 하나이거나, 또는 복수의 인트론이 사용되는 경우에는 가변부 및 불변부 양쪽일 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류 천연 염색체 부위에서 이루어질 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄에 대한 유전자 또는 IL15 또는 IL15Rα를 포함하는 쇄에 대한 유전자는, 신호 펩타이드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프래임으로 연결되는 방식으로 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종의 (heterologous) 신호 펩타이드 (즉, 비-면역글로불린 단백질 유래 신호 펩타이드)일 수 있다.
항체 쇄에 대한 유전자 또는 IL15 또는 IL15Rα를 포함하는 쇄에 대한 유전자 외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 숙주 세포에서 유전자들의 발현을 조절하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 조절 서열의 선택 등의 발현 벡터의 설계가 형질전환할 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 포유류에서 발현 숙주 세포에 대해 바람직한 조절 서열로는, 레트로바이러스 LTR, 사이토메갈로바이러스 (CMV) (예, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40 (SV40)(예, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예, 주요 후기 프로모터 아데노바이러스 (AdMLP)), 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서 및 천연 면역글로불린 프로모터 또는 액틴 프로모터와 같은 강한 포유류 프로모터 등의, 포유류 세포에서 단백질의 높은 수준의 발현을 보장하는 바이러스 인자 등이 있다. 바이러스 조절 인자 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어 미국 특허 5,168,062, 4,510,245 및 4,968,615를 참조한다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들어 효모 세포에서 폴리펩타이드를 발현하는 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 상기한 유전자 및 조절 서열 외에도, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 제어하는 서열 (예, 복제 오리진) 및 선별가능한 마커 유전자 등의, 부가적인 서열을 운반할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 해준다 (예, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약제 물질에 대해 내성을 부여한다. 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자로는 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭시 dhfr-숙주 세포를 사용하는 경우), neo 유전자 (G418 선별하는 경우), 및 글루타메이트 신테타제 유전자 등이 있다.
본 발명의 설명에서 사용되는 바와 같이 용어 "발현 조절 서열"은 이것이 라이게이션된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 작용하는데 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 발현 조절 서열로는 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 등의 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA 안정화 서열; 번역 효율을 강화하는 서열 (즉, Kozak 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 강화하는 서열; 및 적절한 경우, 단백질 분비를 강화하는 서열 등이 있다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르며; 원핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 일반적으로 리보솜 결합부의 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하며; 진핵생물의 경우, 이러한 조절 서열은 전형적으로 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 발현 및 프로세싱에 필수적인 모든 구성 성분들을 적어도 포함하며, 존재할 경우 유익한 부가적인 구성성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합부 등이 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은, 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치되었을 때, "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프리-서열 (pre-sequence) 또는 분비형 리더 서열의 DNA는, 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현된다면, 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미친다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 리보솜 결합부가 번역을 용이하게 하도록 배치된다면 이는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은, 연결된 DNA 서열들이 인접해 있으며, 분비형 리더의 경우에는 인접해 있으며, 리딩 페이스 (in reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 인접하게 위치되어야 하는 것은 아니다.
숙주 세포 및 이의 제조 방법
일 측면에서, 본 발명은 세포에 상기한 벡터를 형질전환하는 것을 포함하는, 상기한 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 면역사이토카인을 코딩하는 핵산 분자와 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적절한 포유류 또는 이의 세포, 식물 또는 이의 세포, 박테리아 또는 효모 숙주 세포를 형질전환하기 위해 이용할 수 있다. 형질전환은 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 임의의 공지된 기법일 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포에 도입하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-핵산 복합체 형질감염, 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 프로토플라스트 융합, 리포좀내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 DNA의 핵내 직접 미세주입법 등이 있다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류에 도입할 수 있다. 세포의 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 식물 세포의 형질전환 방법도 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation), 바이올리스틱 형질전환 (biolistic transformation), 직접 주입 (direct injection), 전기천공 (electroporation) 및 바이러스 형질전환 등이 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법들 역시 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 핵산을 포함하는 상기한 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기한 숙주 세포를 면역사이토카인을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 배양하고, 필요에 따라, 수득되는 면역사이토카인을 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 상기한 면역사이토카인을 포함하는 약물의 제조 방법에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 본 발명은 전술한 본 발명에 따른 벡터를 함유할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 본 발명의 면역사이토카인 또는 이의 상기한 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 숙주 세포에 관한 것이다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐 아니라 물론 이 세포의 자손을 지칭하는 것으로 이해하여야 한다. 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 연속 세대들에서 발생할 수 있으므로, 이들 자손은 실제 모 세포와 동일하지 않을 순 있지만, 이들 세포는 여전히 본 발명에서 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다.
형질전환에서 숙주로 이용되는 포유류 세포주는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이용가능한 복수의 불멸화 세포주들을 포함한다. 이러한 것으로는, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, FreeStyle 293 세포 (Invitrogen), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포암 세포 (예, Hep G2), A549 세포, 및 복수의 기타 세포주 등이 있다. 발현 수준이 높고 생산되는 단백질의 필수적인 특징을 제공하는 세포주를 확인함으로써, 세포주를 선정한다. 사용될 수 있는 기타 세포주는 Sf9 또는 Sf21 세포 등의 곤충 세포주이다. 본 발명의 면역사이토카인 또는 이의 영역을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 본 발명의 면역사이토카인 또는 이의 일부의 발현을 또는 더 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배양 배지로의 면역사이토카인의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체를 생산한다. 면역사이토카인은 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 배양 배지로부터 단리할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등이 있다. 박테리아 숙주 세포로는 E. coli 및 스트렙토마이세스 종 등이 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 있다.
아울러, 생산 세포주로부터 본 발명에 따른 면역사이토카인의 생산 수준은 다수의 공지된 기법을 이용해 강화할 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건에서 발현을 강화하기 위한 일반적인 방법이다. GS 시스템은 EP 0216846, 0256055, 0323997 및 0338841과 연계하여 전체 또는 일부 논의되어 있다.
여러가지 세포주 또는 숙주 세포에서 본 발명에 따른 면역사이토카인 또는 이의 일부가 서로 다른 당화 프로파일을 가질 가능성이 높다. 그러나, 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 면역사이토카인 또는 이의 일부 (도메인)는, 결합 분자의 당화와는 무관하게, 일반적으로, 번역 후 수정 여부와 무관하게, 본 발명의 일부이다.
약학적 조성물
일 측면에서, 본 발명은 상기한 면역사이토카인을 치료학적 유효량으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
"약학적 조성물"은 본 발명에 따른 면역사이토카인, 및 충전제, 용매, 희석제, 담체, 보조제, 분배제, 전달제, 보존제, 안정화제, 유화제, 현탁화제, 증점제, 장기 전달 조절제와 같은, 약제학적으로 허용가능하며 약리학적으로 적절한 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물을 의미하며, 이들 물질의 선택과 비율은 투여 타입과 경로 및 투여량에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물 및 이의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 의심의 여지없이 자명할 것이다. 약학적 조성물은 바람직하게는 GMP (우수 의약품 제조 관리 기준) 요건을 준수하여 제조하여야 한다. 조성물은 완충제 조성물, 긴장성 물질 (tonicity agent), 안정화제 및 용해제를 포함할 수 있다. 조성물의 장기 작용은 약학적 활성 성분의 흡수를 서행시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴에 의해 달성될 수 있다. 적절한 담체, 용매, 희석제 및 전달제에 대한 예로는 물, 에탄올, 폴리알코올 및 이들의 혼합물, 오일, 및 주사용 유기 에스테르 등이 있다.
"치료학적 유효량"은 치료 중인 장애의 한가지 이상의 증상을 어느 정도 완화하는 투여 중인 치료학적 물질의 양을 지칭한다.
"약제 (약물)"는, 인간 및 동물에서 생리학적 기능을 복구, 개선 또는 수정하고 질환을 치료 및 예방하고, 진단, 마취, 피임, 미용 (cosmetology) 및 기타 용도로 의도된, 정제, 캡슐제, 산제, 동결건조제, 주사제, 주입제, 연고 및 기타 레디 형태 (ready form)의 물질 또는 약학적 조성물로서 물질들의 혼합물이다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의 방법을 본 발명의 면역사이토카인에 대해서 적절하게 적용할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 포유류, 바람직하게는 인간에 투여하기 적합한 하나 이상의 혼용가능한 (compatible) 액체 또는 고체 성분을 지칭한다.
본원에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 전술한 성분 이외의 임의 성분을 나타내기 위해 사용된다. 이러한 성분은 약물 제품에 필요한 물리화학적 특성을 부여하기 위해 약제 제조에 사용되는 무기 또는 유기 성질의 물질이다.
용어 "완충제", "완충제 조성물", "완충화제 (buffering agent)"는 산-염기 공액 구성성분들의 작용에 의해 pH 변화를 견딜 수 있으며, 본 발명의 면역사이토카인 산물이 pH 변화를 견딜 수 있게 하는, 용액을 지칭한다. 일반적으로, 약학적 조성물은 바람직하게는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가진다. 사용되는 완충제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 아세테이트, 포스페이트, 사이트레이트, 히스티딘, 숙시네이트 등 완충제 용액이 있다.
본원에서, 용어 "긴장성 물질", "삼투용질 (osmolyte)" 또는 "삼투압제 (osmotic agent)"는 액체 항체 제형의 삼투압을 높일 수 있는 부형제를 지칭한다. "등장성" 약물은 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가진 약물이다. 등장성 약물은 전형적으로 약 250 내지 350 mOsm/kg의 삼투압을 가진다. 사용되는 등장제 (isotonic agent)로는, 비-제한적으로, 폴리올, 사카라이드 및 슈크로스, 아미노산, 금속염, 예를 들어, 염화나트륨 등이 있다.
"안정화제"는 활성 물질의 물리적 및/또는 화학적 안정성을 제공하는 부형제 또는 2 이상의 부형제들의 혼합물을 의미한다. 안정화제로는, 아미노산, 비-제한적인 예로, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 라이신, 글루타민, 프롤린; 계면활성제, 비-제한적인 예로, 폴리소르베이트 20 (상품명 Tween 20), 폴리소르베이트 80 (상품명 Tween 80), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 및 이의 코폴리머 (상품명 Poloxamer), Pluronic, 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 항산화제, 비-제한적인 예로, 메티오닌, 아세틸시스테인, 아스코르브산, 모노티오글리세롤, 아황산 염 등; 킬레이트제, 비-제한적인 예로, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 다이에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 소듐 사이트레이트 등이 있다.
약학적 조성물은, 활성 물질이 보관 온도, 예를 들어 2-8℃의 보관 온도에서 지정된 유통 기한 (shelf life) 동안 물리적인 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 유지한다면, "안정적"이다. 바람직하게는, 활성 물질은 물리적 및 화학적 안정성뿐 아니라 생물학적 활성을 유지한다. 보관 기간은 가속 또는 자연 노화 조건에서의 안정성 검사 결과를 토대로 조율된다.
본 발명의 약학적 조성물은 레디 제형 (ready formulation) 형태의 단일 단위 용량 (single unit dose) 또는 복수개의 단일 단위 용량들로 제조, 포장 또는 널리 시판할 수 있다. 본원에서, 용어 "단일 단위 용량"은 활성 물질을 미리 정해진 양으로 함유한 약학적 조성물의 개별 양을 의미한다. 이러한 활성 물질의 양은 전형적으로 개체에 투여할 활성 물질의 투여량 또는 투여량의 편리한 일부 (convenient part), 예를 들어 그 투여량의 절반 또는 1/3에 해당한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 전형적으로, 주사, 주입 및 이식 (implantation)에 의해 위장관을 우회하여, 피부 또는 점막 장벽에서의 브리치 (breach)를 통해 인체에 투여하기 위한 것으로 의도된 무균성 (sterile) 제형으로서 비경구 투여에 적합하다. 예를 들어, 비경구 투여는, 특히 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척추강내, 실내 (intraventricular), 요도내, 두개강내, 활액내, 경피 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기법을 포함하는 것으로 의도된다. 종양내 전달, 예를 들어 종양내 주사도 이용할 수 있다. 또한, 국소 관류 (regional perfusion)도 제공된다. 바람직한 구현예는 정맥내 경로 및 피하 경로를 포함한다. 당해 기술 분야에서 허용되는 펩타이드 또는 단백질의 임의 투여 방법은 본 발명에 따른 면역사이토카인에도 적절히 적용할 수 있다.
주사가능한 제형은, 비-제한적으로, 단위 투약 형태, 예를 들어, 앰플, 바이얼, 플라스틱 용기, 사전 충진된 주사기, 자동주사 기구 형태로 제조, 포장 또는 시판될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 특히 현탁제, 용액제, 오일성 또는 수성 베이스 중의 에멀젼, 파스타제 (pastes) 등을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 투여하기 전에 적절한 베이스 (예, 무균성 발열원 제거 수)를 사용해 재구성하기 위한 건조된 형태 (즉, 분말 또는 과립)로 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 이러한 제형은, 예를 들어, 냉동 건조로서 당해 기술 분야에 공지되어 있으며 산물을 냉동한 다음 냉동된 물질로부터 용매를 제거하는 것을 수반하는, 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 면역사이토카인은 또한 적절한 추진제가 사용되거나 또는 사용되지 않는, 가압 에어로졸 용기 (aerosol pressurized container), 펌프, 스프레이, 분무기 (atomizer) 또는 네불라이저와 같은 흡입기로부터 단독으로 또는 적절한 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로서 흡입에 의해 또는 비강내로, 또는 점비제로서 또는 코 스프레이제로서 투여할 수 있다.
비경구 투여를 위한 투여 형태는 즉시 방출형으로 및/또는 변형된 방출형으로 제형화할 수 있다. 변형된 방출형 제형은 지연성, 지속성, 펄스형, 조절된, 표적화된 및 프로그래밍된 방출을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자가면역 질환"은 개체 자신 (자기) 항원 및/또는 조직으로부터 기인하며 이를 겨냥하는 비-악성 질환 또는 장애를 지칭한다.
"자가면역 질환"의 정의는, 비-제한적으로, 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 만성 관절염, 화농성 관절염, 라임 골관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 루푸스, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 아토피성 피부염, 경피증, "이식 편대 숙주" 반응, 장기 이식 거부 반응, 이식 관련 급성 또는 만성 면역 질환, 사르코이드증, 가와사키 질환, 그레이브 질환, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노호-쉔라인 자반증, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 만성 활동성 간염, 포도막염, 패혈증 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모, 원형 탈모, 혈청반응음성의 관절병증 (seronegative arthropathy), 관절병증, 라이터 질환, 궤양성 대장염 관절병증과 관련된 건선성 관절병증 (psoriatic arthropathy associated with ulcerative colitis arthropathy), 아토피성 알레르기, 자가면역성 수포 질환 (autoimmune bullous disease), 심상성 천포창, 시트형 천포창 (sheet-like pemphigus), 유천포창 질환, 선상 IgA, 자가면역 용혈성 빈혈, 콤스-양성의 용혈성 빈혈 (Coombs-positive hemolytic anemia), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 소아 악성 빈혈, 관절염, 원발성 경화성 A형 간염 (primary sclerosing hepatitis A), 원인불명의 자가면역 간염, 섬유증 폐 질환, 원인불명의 섬유증 폐포염, 염증 후 간질성 폐 질환 (post-inflammatory interstitial lung disease), 만성 호산성 폐렴, 감염 후 간질성 폐 질환 (post-infectious interstitial lung disease), 통풍성 관절염, 자가면역 간염, I형 자가면역 간염 (고전적인 자가면역 간염 또는 루포이드), II형 자가면역 간염, 골관절염, 원발성 경화성 담관염, 타입 I 건선, 타입 II 건선, 특발성 백혈구 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장 NOS-질환, 사구체신염, 현미경적 신장 혈관염 (microscopic renal vasculitis), 원판형 홍반성 루푸스, 특발성 또는 NOS-남성 불임, 정자에 대한 자가면역 (autoimmunity to sperm), 다발성 경화증 (모든 서브타입), 교감성 안염 (sympathetic ophthalmia), 결합 조직 질환으로 인한 폐 고혈압 (pulmonary hypertension secondary to connective tissue disease), 굿파스처 증후군, 결절성 다발관절염의 폐 증상 (pulmonary manifestations of polyarthritis nodosa), 급성 류마티스성 열, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 스틸 질환, 전신 경피증, 쇼그렌 증후군, 타카야수 질환, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 하시모토 질환, 자가면역 위축성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염 (phacogenic uveitis), 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알레르기, 천식, 정신 질환 (psychiatric disorder) (우울증 및 정신분열증 등), 타입 Th2/타입 Th1-매개 질환, 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 알파-1-항트립신 결핍증 (deficiency of alpha-1-antitrypsin), 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 낭포성 섬유증, 사이토카인 테라피 관련 장애 (disorders associated with cytokine therapy), 탈수초 질환, 피부염, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈증-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 자가면역성 장병증, 자가면역성 난청 (autoimmune hearing loss), 자가면역성 림프증식성 증후군, 자가면역성 심근염, 자가면역 조기 난소 부전 및 안검염을 망라한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
용어 "종양 질환", "암" 및 "암성"은, 전형적으로 세포의 규제되지 않은 성장/증식을 특징으로 하는, 생리학적 병태를 지칭하거나 또는 포유류에서 생리학적 병태를 기술한다. 종양 질환에 대한 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 이러한 암성 질환에 대한 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소 세포성 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 상피암 (squamous carcinoma), 복막암, 간세포성 암, 위장암 등의 위암, 췌장암, 교모세포종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 대장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 (kidney cancer 또는 renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종 및 다양한 두경부암 등이 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는 종양 질환을 치료하기 위해 사용된다.
용어 "항-증식 활성"은 암 세포와 같은 세포의 증식을 정지 또는 저해하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서, 용어 "IC50" (50% 저해 농도)은 측정가능한 활성 또는 반응, 예를 들어 종양 세포와 같은 세포의 성장/증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다. IC50 값은 곡선 피팅을 위한 특수 통계 소프트웨어를 사용해 적절한 농도-반응 곡선으로 계산할 수 있다.
용어 GI50 (50% 성장 저해)은 종양 세포와 같은 세포의 증식을 50%까지 저해하는 약물의 농도를 의미한다.
용어 "ED50" (EC50)(50% 유효 용량/농도)은 50%의 (세포독성을 포함할 수 있는) 생물학적 효과를 발휘하는 약물의 농도를 지칭한다.
치료 방법/치료 용도
일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에 면역사이토카인 또는 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 종양 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
"치료한다", "치료" 및 "요법 (therapy)"은 생물학적 장애 및/또는 하나 이상의 이와 관련된 증상을 완화 또는 무효화하는 방법을 의미한다. 본원에서, 질환, 장애 또는 병태를 "완화한다"는 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상의 중증도 및/또는 발병 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"는 근치적 (curative), 고식적 (palliative) 및 예방적 치료를 포괄한다.
일 측면에서, 치료 대상 또는 환자는 포유류이며, 바람직하게는 인간 개체이다. 개체는 임의 연령의 남성 또는 여성일 수 있다.
용어 "질환"은 본 발명에 따른 치료가 유익한 임의 병태를 의미한다. 이 용어에 대한 정의는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포괄한다.
치료 방법에 대한 일부 구현예에서, 종양 질환은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에 상기한 면역사이토카인 또는 상기한 약학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 활성화가 필요한 개체에서 T 세포 집단 또는 NK 세포 집단의 생물학적 활성을 활성화하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 치료가 필요한 개체에서 종양 질환을 치료하기 위한 상기한 면역사이토카인 또는 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
일부 용도에서, 종양 질환은 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택된다.
종양 (예, 암)의 경우에, 본 발명의 면역사이토카인의 치료학적 유효량은 암 세포의 수를 감소시키거나; 처음 종양 크기를 줄이거나; 암 세포의 말초 장기로의 침윤을 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 전이를 저해 (즉, 어느 정도 서행, 바람직하게는 정지)하거나; 종양 증식을 어느 정도 저해하거나; 및/또는 장애와 관련있는 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화할 수 있다. 본 발명의 면역사이토카인은 암 세포의 생장을 어느 정도 방지할 수 있거나, 및/또는 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있으며, 이는 세포분열억제 (cytostatic) 및/또는 세포독성을 나타낼 수 있다. 암 치료의 경우, 생체내 효과는, 예를 들어, 생존성, 종양 진행 시간 (TTP), 치료에 대한 종양 반응률 (RR), 반응 지속 기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 면역사이토카인은 추가적인 치료학적 치료없이, 즉 독립 요법으로서 투여할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 면역사이토카인에 의한 치료는 하나 이상의 부가적인 치료학적 치료 (병용 요법)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역사이토카인은 암을 치료하기 위한 다른 약물/조제물과 연합하여 투여하거나 또는 이와 함께 제형화할 수 있다.
본원에서, 본 발명에 따른 면역사이토카인 및 하나 이상의 다른 치료학적 물질과 관련하여 용어 "공동-투여 (co-administration)", "공동-투여된다" 및 "와 조합하여 (in combination with)"는, 하기 방식을 의미, 언급 또는 포함하는 것으로 간주된다:
1) 환자에게 구성 성분들을 실질적으로 동시에 방출하는 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 제형화되는 경우의, 본 발명의 면역사이토카인과 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시 투여하는 방식,
2) 환자에게 실질적으로 동시에 섭취되어 이들 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 동시에 방출되는, 개별 투약 형태로 구성 성분들이 각각 분리되어 제형화되는 경우의, 본 발명에 따른 면역사이토카인과 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여하는 방식,
3) 환자가 충분한 투여 간격으로 연속 복용하여 구성 성분들이 환자에서 실질적으로 다른 시기에 방출되는, 개별 투약 형태로 구성 성분들이 각각 분리되어 제형화되는 경우의, 본 발명에 따른 면역사이토카인과 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식, 및
4) 환자에게 동일 시점에 및/또는 다양한 시점에 연속적으로 또는 동일 시점에 및/또는 중첩적으로 방출되는 조절된 방식으로 구성 성분들이 방출되는, 단일한 투약 형태로 구성 성분들이 함께 제형화되고, 각각이 동일 경로에 의해 또는 서로 다른 경로에 의해 투여될 수 있는 경우의, 본 발명에 따른 사이토카인과 치료학적 물질의 조합을 치료가 필요한 환자에게 순차적으로 투여하는 방식.
본 발명의 면역사이토카인은 세포독성제, 화학치료제, 항-호르몬제 또는 다른 치료학적 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는 치료학적 물질과 조합될 수 있다.
본원에서, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하거나 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 식물 기원의 효소학적 활성 독소와 같은 독소를 이의 단편 및/또는 변이체를 비롯하여 포함하는 것으로 의도된다.
"화학치료제"는 암 치료에 이용가능한 화학적 화합물이다. 화학치료제에 대한 예로는 알킬화제, 예로 티오테파 (thiotepa) 및 사이클로스포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan) 아지리딘 (aziridine), 예를 들어 벤조도파 (benzodopa), 카르보쿠온(carboquone), 메투레도파 (meturedopa), 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (methylamelamine), 예로 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸멜라민; 아세토게닌 (acetogenin) (예를 들어, 불라탁신 (bullatacin) 및 불라탁시논 (bullatacinone)); δ-9-테트라하이드로카나비놀 (드로나비놀 MARINOL®); β-라파콘 (lapachone); 라파콜 (lapachol); 콜히친; 베툴린산 (betulinic acid); 캄프토테신 (camptothecin) (예, 합성 유사체 토포테칸 (topotecan) (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸 (irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 (scopolectin) 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴 (bryostatin); 칼리스타틴 (callystatin); CC-1065 (이의 합성 유사체 아도젤레신 (adozelesin), 카르젤레신 (carzelesin) 및 바이젤레신 (bizelesin) 등); 포도필로톡신 (podophyllotoxin); 포도필린산 (podophyllinic acid); 테니포시드 (teniposide); 크립토피신 (cryptophycin) (예를 들어, 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴 (dolastatin); 두오카르마이신 (duocarmycin) (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘루테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사르코딕틴 (sarcodictyin); 스폰기스타틴 (spongistatin); 니트로겐 머스타드, 예로 클로람부실 (chlorambucil), 클로르나파진 (chlornaphazine), 콜로포스파미드 (cholophosphamide), 에스트라무스틴 (estramustine), 이포스파미드 (ifosfamide), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란 (melphalan), 모벰비신 (novembichin), 펜에스테린 (phenesterine), 프레드무스틴 (prednimustine), 트로포스파미드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴 (carmustine), 클로로조톡신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine) 및 라님누스틴 (ranimnustine); 항생제, 예를 들어 엔다이인 항생제 (enediyne antibiotic) (예, 칼리케아미신 (calicheamicin), 예를 들어, 칼리케아미신 gamma II 및 칼리케아미신 omega II (예, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)를 참조함); 디네미신 (dynemicin), 예를 들어 디네미신 (dynemicin) A; 에스페라미신 (esperamicin); 및 네오카르지노스타틴 크로모포어 (neocarzinostatin chromophore) 및 관련된 크로모프로테인 엔다이인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신 (aclacinomysin), 액티노마이신 (actinomycin), 오트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycin), 칵티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 카르미노마이신 (carminomycin), 카르지노필린 (carzinophilin), 크로모마이시니스 (chromomycinis), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-다이아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신 (예로, ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사제 (DOXOL®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (MYOCET®), 페길화된 리포솜 독소루비신 (CAELYX®) 및 데옥시독소루비신), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마르셀로마이신 (marcellomycin), 미토마이신 (mitomycin), 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycin), 페플로마이신 (peplomycin), 포트피로마이신 (potfiromycin), 푸로마이신 (puromycin), ??라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptonigrin), 스트렙토족신 (streptozocin), 투베르시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin) 항-대사산물제, 예를 들어 메토트렉세이트 (methotrexate), 겜시타빈 (gemcitabine)(GEMZAR®), 테가푸르 (tegafur)(UFTORAL®), 카페시타빈 (capecitabine)(XELODA®), 에포틸론 (epothilone) 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린 (denopterin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate); 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈 (fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘 (azacitidine), 6-아자우리딘, 카르모푸르 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록스우리딘 (floxuridine); 항-아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 미토탄 (mitotane), 트릴로스탄 (trilostane); 엽산 보충제 (folic acid replenisher), 예를 들어 프롤린산 (frolinic acid); 아세글라톤 (aceglatone); 알도포스파미드글리코시드 (aldophosphamideglycoside); 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 에닐우라실 (eniluracil); 암사크린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비스안트렌 (bisantrene); 에다트렉세이트 (edatraxate); 데포파민 (defofamine); 데메콜신 (demecolcine); 다이아지쿠온 (diaziquone); 엘포르니틴 (elfornithine); 엘립티늄 아세테이트 (elliptinium acetate); 에토글루시드 (etoglucid); 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 메이탄시노이드 (maytansinoid), 예를 들어 메이탄신 (maytansine) 및 안사미톡신 (ansamitocin); 미토구아존 (mitoguazone); 미톡산트론 (mitoxantrone); 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet); 피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 2-에틸하이드라지드 (2-ethylhydrazide); 프로카바진 (procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural product, Eugene, OR); 라족산 (razoxane); 리족신 (rhizoxin); 시조피란 (sizofiran); 스피로게르마늄 (spirogermanium); 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온 (triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (trichothecene) (예, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄; 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노사이드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드 (taxoid), 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (ABRAXANETM) 및 도세탁셀 (docetaxel) (TAXOTERE®); 클로람부실 (chlorambucil); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트 (methotrexate); 플라티늄 제제, 예를 들어, 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin); 미소관 형성으로부터 튜불린 중합을 방해하는 빈카 (vincas), 예를 들어, 빈블라스틴 (vinblastine) (VELBAN®), 빈크리스틴 (vincristine)(ONCOVIN®),빈데신 (vindesine) (ELDISINE®), FILDESIN®), 및 비노렐빈 (vinorelbine) (NAVELBINE®); 에토포시드 (etoposide) (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론 (mitoxantrone); 루코보린 (leucovorin); 노반트론 (novantrone); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 이반드로네이트 (ibandronate); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노익산, 예로 벡사로텐 (bexarotene)(TARGRETIN®); 비스포스포네이트, 예로 클로드로네이트 (clodronate)(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (etidronate)(DIDROCAL®), NE- 58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (zoledronate) (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (alendronate)(FOSAMAJX®), 파미드로네이트 (pamidronate)(AREDIA®), 틸루드로네이트 (tiludronate)(SKELID®) 또는 리세드로네이트 (risedronate)(ACTONEL®); 트록사시타빈 (1,3-다이옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-alpha, Raf, H-Ras, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예를 들어 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙 (sorafenib) Bayer); SU-11248 (Pfizer); 페리포신 (perifosine), COX-2 저해제 (예를 들어, 셀레콕십 (celecoxib) 또는 에토리콕십 (etoricoxib)), 프로테오좀 저해제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (bortezomib)(VELCADE®); CCI-779; 티피파르닙 (tipifarnib)(811577); 오라페닙 (orafenib), ABT510; Bcl-2저해제, 예를 들어, 오블리메르센 소듐 (oblimersen sodium)(GENASENSE®); 피산트론 (pixantrone); EGFR 저해제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 저해제 (하기 정의 참조); 및 전술한 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체, 아울러 상기한 물질들의 2 이상의 조합, 예를 들어 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 조합 요법의 약칭인 CHOP, 및 옥살리플라틴 (ELOXATINTM)을 5-FU 및 루코보빈과 조합하는 치료 요법의 약칭인 FOLFOX를 포함한다.
또한, 이러한 정의에는, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제, 예를 들어, 혼합형 작용제/길합제 프로파일을 가진 항-에스테로겐, 예컨대, 타목시펜 (tamoxifen)(NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 토레미펜 (toremifene)(FARESTON®), 이독시펜 (idoxifene), 드롤록시펜, 랄록시펜 (raloxifene)(EVTSTA®), 트리옥시펜 (trioxifene), 케옥시펜 (keoxifene), 및 선택적인 에스트로겐 수용체 모듈레이터 (SERM), 예를 들어 SERM3; 작용제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (fulvestrant) (FASLODEX®), 및 EM800 (이러한 제제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량화를 차단하고, DNA 결합을 저해하며, ER 반감기를 연장하고 및/또는 ER 수준을 억제할 수 있음); 아로마타제 저해제, 예로, 스테로이드계 아로마타제 저해제, 예컨대 포르메스탄 (formestane) 및 엑세메스탄 (exemestane)(AROMASIN®), 및 비스테로이드계 아로마타제 저해제, 예를 들어 아나스트라졸 (anastrazole)(AREVIIDEX®), 레트로졸 (letrozole)(FEMARA®) 및 아미노글루테티미드, 및 기타 아로마타제 저해제, 예로, 보로졸 (vorozole)(RIVISOR®), 메게스트롤 (megestrol) 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸 (fadrozole), 이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 작용제, 예로, 루프롤라이드 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 (goserelin), 부세렐린 (buserelin) 및 트리프테렐린 (tripterelin); 성 스테로이드, 예를 들어, 프로게스틴 (progestine), 예컨대 메게스트롤 아세테이트 (megestrol acetate) 및 메드록시프로게스테론 아세테이트 (medroxyprogesterone acetate), 에스트로겐, 예를 들어, 다이에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol) 및 프레마린 (premarin), 및 안드로겐/레티노이드, 예를 들어 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 모든 트란스레티온 산 (transretionic acid) 및 펜레티니드 (fenretinide); 오나프리스톤 (onapristone); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절인자 (ERD); 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드 테스토락톤 및 전술한 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 및 전술한 물질 2종 이상의 조합도 포함된다.
본 발명의 면역사이토카인과 조합하여 이용할 수 있는 다른 치료학적 물질은 PD1에 대한 항체 (예, 프롤고리맵, 펨브롤리주맵 또는 니볼루맵), PD-L1에 대한 항체, CTLA4에 대한 항체, 4-1BB에 대한 항체, OX40에 대한 항체, GITR에 대한 항체, CD20에 대한 항체 (예, 리툭시맵), HER2에 대한 항체 (예, 트라스투주맵 또는 퍼투주맵), VEGF에 대한 항체 (예, 베박시주맵), 또는 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 치료학적 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 면역사이토카인과 조합하여 이용할 수 있는 다른 치료학적 물질은 선천 면역 또는 적응 면역의 활성인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료학적 활성의 항-종양 화합물일 수 있다.
본 발명에 따른 면역사이토카인은 전술한 바와 같은 치료 방법에 이용할 수 있거나, 전술한 치료에 이용할 수 있거나, 및/또는 전술한 치료학적 용도를 위한 약제의 제조에 이용할 수 있는 것으로 이해된다.
투여량 및 투여 경로
본 발명에 따른 면역사이토카인은 대상 병태를 치료하는데 유효한 양으로, 즉 원하는 결과를 달성하는데 필요한 용량 및 시간 동안 투여될 것이다. 치료학적 유효량은 치료할 구체적인 병태, 환자의 나이, 성별 및 체중뿐 아니라 면역사이토카인이 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 약물 또는 치료 기법과 조합하여 투여되는 지의 여부와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다.
투약 용법은 최적의 요망하는 반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스를 투여하거나, 분할된 수회의 용량을 일정 기간 동안 투여하거나, 또는 용량을 치료학적 상황의 긴급성에 의해 지정되는 바와 같이 비례적으로 줄이거나 늘릴 수 있다. 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 단위 투약 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유익하다. 본원에서 단위 투약 형태는 치료할 환자/개체에게 단일한 용량 (unitary dosages)으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 바람직한 약제학적 담체와 조합하여 바람직한 치료학적 효과를 발휘하도록 계산된 기-결정된 함량으로 활성 화합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 단위 투약 형태에 대한 사양 (specification)은, (a) 화학요법제의 고유한 특징 및 달성할 구체적인 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서 민감성을 치료하기 위한 활성 화합물의 컴파운딩 기술 분야에서 고유한 한계에 의해 기술되며, 이에 의해 직접 결정된다.
따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본원에 제공된 내용을 기초로, 용량 및 투여 용법이 치료 분야에서 잘 공지된 방법에 따라 조정됨을 알 것이다. 즉, 최대 허용량은 쉽게 확립할 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료학적 이점을 제공하는 유효량 역시 환자에게 검출가능한 치료학적 효과를 제공하기 위해 각 물질을 투여하는 시간적 요건처럼 결정할 수 있다. 따라서, 일부 용량 및 투여 용법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 발명의 구현예 수행시 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 용법을 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다.
용량 값은 완화할 병태의 유형과 중증도에 따라 달라질 수 있으며, 1회 투여 또는 다회 투여를 포함할 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, 임의 특정 환자의 경우, 구체적인 투여 용법은 개체 필요성에 따라, 그리고 조성물의 투여를 수행 또는 감독하는 의료 전문가의 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 기술된 용량 범위는 단순 예이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용한 투여 용법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적인 상태, 병태의 중증도, 투여 경로 및 사용되는 본 발명의 구체적인 면역사이토카인 등의, 여러가지 인자들에 기초할 수 있다. 즉, 투여 용법은 광범위하게 달라질 수 있지만, 표준 방법을 이용해 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 독성 효과 또는 실험 값과 같은 임상적인 효과를 포함할 수 있는 약동학 및 약력학 파라미터를 기반으로 조정할 수 있다. 이에, 본 발명은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되는 환자별 용량-증가 (dose-escalation)를 포함한다. 적정 용량 및 용법을 결정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 아이디어가 제공된다면 당해 기술 분야의 당업자라면 이해할 것이다.
적합한 투여 방법에 대한 예들은 상기에 제공된다.
본 발명에 따른 면역사이토카인의 적정 용량은 0.1-200 mg/kg, 바람직하게는 0.1-100 mg/kg, 예로, 약 0.5-50 mg/kg, 예를 들어, 약 1-20 mg/kg의 범위일 것으로 고려된다. 면역사이토카인은, 예를 들어, 적어도 0.25 mg/kg, 예를 들어, 적어도 0.5 mg/kg, 예로, 적어도 1 mg/kg, 예를 들어, 적어도 1.5 mg/kg, 예를 들어, 적어도 2 mg/kg, 예를 들어, 적어도 3 mg/kg, 예로, 적어도 4 mg/kg, 예를 들어 적어도 5 mg/kg; 예를 들어, 최대 50 mg/kg, 예로, 최대 30 mg/kg, 예를 들어, 20 mg/kg, 예로, 최대 15 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다. 투여는 전형적으로 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 주당 1회, 2주당 1회, 3주당 1회 또는 4주당 1회로, 그리고 주치의가 적절하다고 생각하는 동안 반복될 것이며, 일부 경우에는 필요에 따라 용량을 늘리거나 또는 줄일 수 있다.
실시예
아래 실시예들은 본 발명은 본 발명을 더 잘 이해하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 본 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명하고 예를 들어 일부 상세히 기술되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 구현예의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에 대한 일부 변화 및 수정이 행해질 수 있음은 매우 자명할 것이다.
재료 및 일반적인 방법
재조합 DNA 기법
Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에 기술된 바와 같은 표준 기법을 이용해 DNA 조작을 수행하였다. 분자 생물 시약들은 제조사의 지침에 따라 이용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 세그먼트를 화학 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드로부터 준비하였다. 단일 제한효소 부위가 측면에 위치한 300-4000 bp 길이의 유전자 세그먼트를 PCR 증폭 등의 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 조립한 다음 명시된 제한효소 부위를 통해 클로닝하였다. 서브클로닝한 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 검증하였다.
DNA 서열 결정
DNA 서열을 생거 서열분석에 의해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Infomax's Vector NT1 Advance suite version 8.0 및 SnapGene Viewer를 서열 구축, 맵핑, 분석, 주석 (annotation) 및 예시에 이용하였다.
실시예 1
포유류 세포의 현탁 배양에서 재조합 단백질의 생산
도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 도식적으로 나타낸 재조합 IL15 슈퍼-작용제 단백질을 생산하기 위해, 인간 IL15 리간드 (https://www.uniprot.org/uniprot/P40933) 및 IL15Rα (https://www.uniprot.org/uniprot/Q13261) 서열의 단편을 포함하는 구조체들을 합성하였다. 양쪽 유전자들의 서열을 PCR을 이용해 올리뉴클레오티드로부터 합성하였다.
도 1의 CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 및 도 2의 CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA로 표시되는 IL15 슈퍼-작용제 변이체 (이하, IL15SA 또는 BCD225로 언급됨)를 제조하기 위해, 상기 유전자를 플라스미드에 항체 κ 경쇄의 제1 불변 도메인과의 N-말단 융합 (융합 단백질)으로서 벡터 pEE-IL15Ra-CK (또는 pEE-IL15-CK)에 SalI/BsiWI 제한효소 부위 (도 5)에서, 그리고 항체 중쇄의 제1 불변 도메인과의 융합으로서 벡터 pEE-IL15-CH1-Fc-LALA (또는 pEE-IL15Ra-CH1-Fc-LALA) IgG1에 SalI/NheI 제한효소 부위 (도 6)에서 클로닝하였으며, 이들 2가지 벡터는 형질감염 단계에서 조합하였다.
도 4의 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA (이하 IL15SA/PD1 또는 항-PD1/IL15SA 또는 IL15SA/PDL1 또는 항-PDL1/IL15SA로 언급됨) 및 도 3의 Fab- CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcknobLALA로 표시되는 2중 특이성 IL15 슈퍼-작용제 변이체를 제조하기 위해, IL15 리간드 및 수용체 유전자를 항체 κ 경쇄의 제1 불변 도메인과의 N-말단 융합으로서 벡터 pEE-IL15Ra-CK (또는 pEE-IL15-CK)에 SalI/BsiWI 제한효소 부위 (도 5)에서, 그리고 항체 중쇄의 제1 불변 도메인과의 융합으로서 벡터 pEE-IL15-CH1-Fc-knob-LALA (또는 pEE-IL15Ra-CH1-Fc-knob-LALA) IgG1에 SalI/NheI 제한효소 부위 (도 9)에서 플라스미드에 클로닝하였다. 또한, 도 3 및 도 4에 도시된 비대칭적인 항체의 Fab 부분을 제조하기 위해, 항-PD1 항체 (프롤고리맵)(이하, IL15SA/PD1 또는 항-PD1/IL15SA로 언급됨) 또는 항-PDL1 (BCD-135) 항체 (이하, IL15SA/PDL1 또는 항-PDL1/IL15SA로 언급됨)의 가변성 도메인의 유전자들을 항체 κ 경쇄의 제1 불변 도메인과의 N-말단 융합으로서 벡터 pEE-BCD100-02-VL-CK에 SalI/BsiWI 제한효소 부위 (도 7)에서, 그리고 항체 중쇄의 제1 불변 도메인과의 융합으로서 벡터 pEE-BCD100-02-VH-CH1-Fc-hole-LALA IgG1에 SalI/NheI 제한효소 부위 (도 8)에서 플라스미드에 클로닝하였다. 이로써, 이들 벡터 4종은 형질감염 단계에서 조합되어 하나의 세포에서 개별 폴리펩타이드 4개가 합성되며, 2중 특이성 면역사이토카인이 형성된다.
상기한 플라스미드 4종 모두 필요한 양이 E. coli 세포에서 생산되었으며, 이를 Maxiprep Qiagen 키트를 사용해 정제하였다.
IL15SA를 포함하는 재조합 단백질을 공개된 프로토콜 [Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6):670-677, Liao Metal., 2004; Biotechnol Lett. 2006 Jun;28(11):843-848; Biotechnol Bioeng. 2003 Nov 5;84(3):332-342]에 따라 준비된 중국 햄스터 난소 세포주 (CHO-K1)에서 일시적으로 배양하였다. EBNA1 (엡스타인 바 바이러스 핵 항원 1) 단백질 유전자를 구성적으로 발현하는 세포를 이용하였다. 현탁 배양을 Life Technologies Corporation 사의 무혈청 배지를 사용해 제조사의 지침에 따라 오르비탈 교반기 상에서 플라스크에서 수행하였다. 일시적인 발현을 위해, 2×106/ml 농도의 세포에 선형 폴리에틸렌이민 (PEI MAX, Polysciences)을 이용하여 형질감염하였다. DNA/PEI 비율은 1:3 내지 1:10이었다. 형질감염 후 5-7일에, 세포 배양물을 2000 g에서 20분간 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 표적 단백질을 affine HPLC에 의해 배양액으로부터 단리하였다.
재조합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 이용해 배양액으로부터 단리 및 정제하였다. 맑은 (cleared) 배양액을, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS, pH 7.4)로 평형화한 HiTrap rProtein A 세파로스 FF 컬럼 (GE Healthcare) 5 ml을 통과시켰다. 그런 후, 컬럼을 컬럼 부피의 5배의 PBS로 세척하여 비-특이적으로 결합된 성분들을 제거하였다. 결합된 항원을 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3)를 사용해 용출시켰다. 주 단백질 용출 피크를 수집하고, 1 M 트리스 완충제 (pH 8)를 이용해 중성 pH로 적정하였다. 모든 단계는 유속 110 cm/h로 수행하였다. 이후, SnakeSkin 투석 튜빙 기법을 이용해 단백질을 PBS (pH 7.4)로 투석한 다음 여과 (0.22 ㎛)하여 시험관에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
수득한 단백질 용액의 순도를 SDS 겔 전기영동에 의해 평가하였다 (도 10의 일예 참조함).
실시예 2
(IL15SA)2-Fc와 인간 IL2βγ 수용체의 상호작용에 대한 동적 분석
(IL15SA)2-Fc (이하, 도 1에서 CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA, 도 2에서 CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA로 언급됨)와 인간 IL2βγ의 결합 친화성 상수를 OctetRedBio 장치에서 ForteBio 지침에 따라 구하였다. AR2G 바이오센서를 1시간 동안 mQ에서 미리 재수화하였다. 바이오센서를 활성화한 후, 아세테이트 완충제 pH4 중의 25 ㎍/ml 농도의 (IL15SA)2-Fc 산물을 바이오센서에 비-특이적으로 (NH2 기를 통해) 고정하였다. 그 후, 센서를, 30℃에서 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS 완충제 중의 인간 CD122/IL-2RB 단백질 (Fc Tag) 용액 (1 및 0.5 ㎍/ml)이 수용된 웰에 침지하였다. 이 용액에서 IL15SA/IL2βγ 복합체가 조립되었다. 이후, 센서를 후속 해리 단계 동안에 완충액에 침지하였다. 워킹 완충제로서 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS를 이용해 30℃에서 분석을 수행하였다.
기준 신호를 제한 후 Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Version 8.0)를 표준 절차에 따라 1:1 상호작용 모델을 이용해 분석한, CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 및 CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA에 대해 수득한 센소그램을 표 1에 제시한다. 이들 실험한 2종의 변이체는 인간 IL2βγ에 대해 높은 친화성 및 특이성을 나타내었다.
표 1. 인간 IL2βγ-Fc와의 상호작용에 대한 (IL15SA)2-Fc 면역사이토카인의 친화성 상수.
로딩 샘플 ID 농도 (nM) 반응 KD (M) kon (1/Ms) kdis (1/s)
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 19.4 0.3774 2.47E-10 3.69E+05 9.11E-05
CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA 9.69 0.3301 3.80E-10 3.02E+05 1.15E-04
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 19.4 0.325 2.13E-10 3.58E+05 7.63E-05
CK_IL15_Hc_IL15RaCH1FcLALA 9.69 0.2832 2.12E-10 3.57E+05 7.55E-05
실시예 3
2중 특이성 IL15 슈퍼-작용제와 인간 IL2βγ 수용체 및 면역 세포의 다른 세포 수용체 간의 상호작용에 대한 동적 분석
IL2βγ 및 인간 PD-1/PD-L1 수용체에 대한 IL15SA 2중 특이성 면역사이토카인 (이하, 항-PD1-Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA 및 항-PD-L1-Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA로 언급됨)의 결합 친화성 상수를 OctetRed 96을 ForteBio 지침에 따라 이용해 측정하였다. AR2G 바이오센서를 1시간 동안 mQ에서 미리 재수화하였다. 바이오센서를 활성화한 후, 아세테이트 완충제 pH4 중의 25 ㎍/ml 농도의 이중 특이성 면역사이토카인을 바이오센서에 비-특이적으로 (NH2 기를 통해) 고정하였다. 그 후, 센서를, 0.1% Tween-20 및 0.1% BSA가 첨가된 PBS 완충제 중의 인간 CD122/IL-2RB 단백질 (Fc Tag) 또는 PD-1-Fc 수용체 또는 PD-L1-Fc 수용체 (1 및 0.5 ㎍/ml)이 수용된 웰에 침지하여, 2중 특이성 슈퍼-작용제와 검사 수용체를 조립하였다. 이후, 후속 해리 단계 동안에는 센서를 완충액에 침지하였다.
기준 신호를 제한 후, 실험 데이터를 Octet 데이터 분석 소프트웨어 (Version 8.0)를 표준 절차에 따라 1:1 상호작용 모델을 이용해 분석하였다.
수득한 친화성 상수를 표 2에 제시한다. 이들 실험한 2종의 변이체는 인간 IL2βγ 및 페어링된 수용체 둘다에 대해 높은 친화성 및 특이성을 나타내었으며, 다른 수용체에 대한 비-특이적인 활성은 결여되어 있었다.
표 2. 인간 IL2βγ-Fc 및 제2 수용체와의 상호작용에 대한 2중 특이성 IL15 슈퍼-작용제 항체의 친화성 상수.
로딩 샘플 ID PD1 IL2Rb PDL1
반응 KD (M) 반응 KD (M) 반응 KD (M)
항-PD1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA 0.7606 8.718E-10 0.4504 1.25E-10 0 0
항-PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA 0 0 0.3251 2.39E-11 0.3084 2.38E-11
항-PD-1 프롤고리맵 0.9216 1.86E-10 0 0 0 0
항-PD-L1 BCD-135 0 0 0 0 0.8183 < 1.0E -12
실시예 4
NK92 세포주에서 IL15 슈퍼-작용제의 증식 활성을 결정하기 위한 세포 분석
본 분석에서 NK-92 세포주를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 NK-92 세포, 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성하였다. 모든 현탁물 성분들은 소 태아 혈청과 글루타민이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후, Alamar Blue를 웰에 첨가하였다. 인큐베이션한 후, 웰에서 형광 강도를 측정하였다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), IL15SA/PD1 (항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA) 및 IL15SA/PDL1 (항-PDL-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcLALA)을 비교 연구하였다.
상기한 면역사이토카인의 비활성을 결정한 결과, NK92 세포주 대비 높은 증식 활성을 나타내었다. 모든 후보물질에 대한 추정 EC50 값은 동일하였으며, 상부 안정기 (upper plateau)에 의해 결정되는 활성화 수준 역시 완전히 동일하였다 (도 11). IL15SA 부위의 원자가 (valence), 즉 차별적인 항원-항체 결합성 (avidity)이 이러한 활성에 현저하게 영향을 미치지 않는다는 점에 주목하여야 한다.
실시예 5
자연 살상 세포주에서 IL15 슈퍼-작용제의 증식 활성을 결정하기 위한 세포 분석
분석에서는 건강한 공여자의 PBMC로부터 음성 선별에 의해 분리한 단리된 자연 살상 세포를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 자연 살상 세포, 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성하였다. 모든 현탁물 성분들은 자가 인간 혈장이 첨가된 배양 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후, Alamar Blue를 웰에 첨가하였다. 인큐베이션한 후, 웰에서 형광 강도를 측정하였다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), IL15SA/PD1 (항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA) 및 인간 인터루킨-2 (IL2) (Ronleukin, PCI Biotech)이 자연 살상 세포의 증식 능력에 미치는 효과를 비교 분석하였다.
상기한 면역사이토카인의 비활성을 결정한 결과, 자연 살상 세포에 대해 높은 증식성 활성이 확인되었다 (도 12). 모든 후보물질에 대한 추정 EC50 값은 오차 범위내에서 동일하였으며, IL2 사이토카인보다 약간 낮았다. 아울러, 상부 안정기에 의해 결정되는 활성화 수준 역시 완전히 동일하였다. IL15SA 부위의 원자가, 즉 차별적인 항원-항체 결합성이 이러한 활성에 현저하게 영향을 미치지 않는다는 점에 주목하여야 한다.
실시예 6
리포터 세포주에서 IL15 슈퍼-작용제의 항-PD1 길항 활성을 결정하기 위한 세포 분석
분석에서는 Jurkat 세포주를 기반으로 구축되고 표면에 PD-1을 안정적으로 발현하며 NFAT 프로모터의 통제 하에 반딧불이 루시퍼라제 코딩 유전자를 가진 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포주; 및 Raji 세포주에 기반하여 구축되고 표면에 PDL1을 안정적으로 발현하는 Raji PDL1 세포주를 이용하였다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), 항-PD1/IL15SA (항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA) 및 항-PD1 길항제 (프롤고리맵)가 리포터 세포 시스템에서 활성화 능력에 미치는 효과를 비교 분석하였다.
분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰의 현탁물은 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포, Raji PDL1 세포, 1 ng/ml 농도의 aCD3/aTAA1 세포, 및 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 웰에서 루시퍼라제 강도를 발광 분석 키트를 사용해 측정하였다.
상기한 면역사이토카인의 비활성을 결정한 결과, 항-PD1/IL15SA는 비활성 EC50 값이 치료학적으로 유효한 항-PD1 단일클론 항체 프롤고리맵과 비교해 10배 낮게 관찰되었다 (도 13). 또한, (상부 안정기) 최대 활성 수준 역시 30% 감소하였다. 프롤고리맵 대비 항-PD1/IL15SA의 낮은 비활성은 고전적인 항체와 비교해 항-PD1/IL15SA 분자내 일가 Fab 결합성 PD1에 의해서만 설명될 수 있다. 이는 또한 실시예 3의 데이터 및 프롤고리맵에 대해 명시된 값 (표 2)에 따르면, PD-1 수용체에 대한 친화성 대비 거의 10배 차이에 의해 뒷받침된다. IL15SA의 길항 활성이 백그라운드로서 관찰되며, 즉 실질적으로 없다는 점에 주목하여야 한다.
실시예 7
리포터 세포주에서 IL15 슈퍼-작용제의 항-PDL1 길항 활성을 결정하기 위한 세포 분석
분석에서는 Jurkat 세포주를 기반으로 구축되며 표면에 PD-1을 안정적으로 발현하고 NFAT 프로모터의 통제 하에 반딧불이 루시퍼라제 코딩 유전자를 가진 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포주; 및 Raji 세포주에 기반하여 구축되며 표면에 PDL1을 안정적으로 발현하는 Raji PDL1 세포주를 이용하였다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), 항-PDL1/IL15SA (항-PD-L1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA) 및 항-PDL1 길항제 (아테졸리주맵)가 리포터 세포 시스템의 활성화 능력에 미치는 효과를 비교 분석하였다.
분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 각 웰의 현탁물은 Jurkat NFAT-FLuc PD-1 세포, Raji PDL1 세포, 1 ng/ml 농도의 aCD3/aTAA1 세포, 및 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션한 다음, 웰에서 루시퍼라제 강도를 발광 분석 키트를 사용해 측정하였다.
상기한 면역사이토카인의 비활성을 결정한 결과, 항-PDL1/IL15SA에 대한 비활성 EC50 값이 치료학적으로 유효한 항-PDL1 단일클론 항체 아테졸리주맵과 비교해 30X 낮았다 (도 14). 그러나, 최대 활성 수준 (상부 안정기)은 10%만 감소하였다. 아테졸리주맵 대비 항-PDL1/IL15SA의 낮은 비활성은 고전적인 항체와 비교해 항-PDL1/IL15SA 분자내 일가 Fab 결합성 PD-L1에 의해서만 설명할 수 있다. 즉, IL15SA의 현저한 길항 활성은 관찰되지 않았다.
실시예 8
TAA-리포터 세포주에 대한 자연 살상 세포의 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)에 대한 종양-관련 항원 (TAA)에 특이적인 항체의 존재 하에 IL15 슈퍼-작용제의 효과를 결정하기 위한 세포 분석.
분석에서는 건강한 공여자의 PBMC로부터 음성 선별에 의해 단리한 자연 살상 세포를 이용하였다. 분석은 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 자연 살상 세포 및 Raji 세포, 작동자 항체 리툭시맵 및 도표에 표시된 농도의 검사 항체로 구성하였다. 모든 현탁물 성분들은 소 태아 혈청과 글루타민이 첨가된 배양 배지에서 준비하였다. 성분들을 모두 첨가한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이후, 배양액을 수집한 다음, 락테이트 데하이드로게나제 함량을 LDH 분석 키트를 사용해 측정하였다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), 항-PD1/IL15SA (항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc _IL15CH1FcknobLALA)이 리포터 세포 시스템에서 리툭시맵의 ADCC 능력에 미치는 효과를 비교 분석하였다.
상기한 면역사이토카인의 비활성을 측정한 결과, TAA-리포터 세포주에 대한 리툭시맵의 ADCC 능력 강화와 비교해 높은 활성이 관찰되었다 (도 15 및 도 16). 표면에 과다 발현된 CD20 수용체를 가진 Raji 세포의 세포용해 %로 측정한, 리툭시맵-의존적인 ADCC 효과는, 리툭시맵 단독 대비, 각 검사 후보물질의 존재시 30% 증가하였다. 이러한 효과는 실시예 4 및 5에 제시된 결과에 따르면 본 분석에서 IL15SA 및 항-PD1/IL15SA의 영향 하에 활성 자연 살상 세포의 증식으로 설명되는 것으로 보인다. 모든 후보물질에서 추정된 EC50 값들이 오차 범위내에서 동일하였다. IL15SA 부위의 원자가, 즉 차별적인 항원-항체 결합성이 이러한 활성에 현저하게 영향을 미치지 않으며, 이러한 사실이 실시예 4 및 5에 의해 추가적으로 뒷받침된다는 점에 주목하여야 한다.
실시예 9
건강한 공여자의 전혈 유래 PBMC에서 IL15 슈퍼-작용제의 세포독성을 결정하기 위한 세포 분석
건강한 공여자의 전혈로부터 피콜 밀도 구배 원심분리를 통해 PBMC를 단리하였다.
분석을 96웰 배양 플레이트에서 수행하였다. 현탁물은 (웰 당) 신선하게 단리한 PBMC와 도표에 표시된 농도 0.1 ㎍/ml의 항체로 구성하였다. PBMC를 항체와 혼합한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 현탁물을 해당 CD에 대한 형광-표지된 항체로 직접 염색한 다음 세포를 유세포 형광측정으로 분석하여, 현탁물내 PBMC의 CD56+, CD19+, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 하위집단의 %를 측정하였다. 그래프는 CD56+, CD19+, CD3+ 세포의 경우 검사 현탁물의 세포 전체에 대한 이의 비율을 도시하고, CD4+, CD8+ 세포의 경우에는 CD3+ 세포에 대한 이의 비율을 도시한다. IL15SA 생산물 (CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcLALA), 항-PD1/IL15SA (항-PD-1 Fab-CK_IL15Ra_Hc_IL15CH1FcknobLALA), 항-PD1 (프롤고리맵), 항-PD1 (프롤고리맵) + IL15SA 혼합물, 항-CD20 GA101 항체가 인간 PBMC에 미치는 세포독성 효과를 비교 분석하였다.
도 17-21에 제시된 결과는, 후보물질이 현저한 세포독성 효과가 없다는 것을, 즉 AB 음성 대조군 (즉, 임의의 외인성 항체가 존재하지 않음)과 비교해 면역반응성 세포의 수적 감소가 10% 이하임을, 입증해준다. 즉, 대조군 항-CD20 항체는 CD20+ B 세포 집단의 일관적인 완전한 고갈을 나타내었다. 따라서, 대상 후보물질들 모두 인간 혈액 세포에 대해 어떠한 현저한 비-특이적인 시험관내 세포독성을 나타내지 않았다.
실시예 10
열 스트레스 조건에서 IL15 슈퍼-작용제의 응집 안정성 결정
PBS 완충제 중의 9 mg/ml 농도로 IL15 슈퍼-작용제 생산물을 50℃에서 12시간 동안 가열하였다. 열 스트레스 적용 후 응집을 고-성능 겔-여과 크로마토그래피에 의해 결정하였다. Tosoh TSK-Gel G3000SWXL 컬럼 (7.8 mm x 30 cm, order no. 08541) 및 Tosoh TSKgel Guard SWXL 프리컬럼 (6.0 mm x 4.0 cm, 입자 직경 7 μm, order no. 08543)을 이용해 HPLC 시스템 (Agilent)에서 크로마토그래피를 수행하였다. 등용매 방식의 이동상: 50 mM NaFb, 0.3 M NaCl, pH 7.0을 이용해 유속 0.5 ml/min으로 용출을 수행하였다. 파장 214 및 280 nm에서 검출하였다. 항체 샘플을 PBS 완충제, pH 7.5로 ~1 mg/ml 농도로 희석하였다. 주입 부피는 10 ㎕였다. 겔 여과 표준 교정 혼합물 (Bio-Rad, order. no 151- 1901)을 미리 크로마토그래피로 분석하였다. 도 22는, IL15 슈퍼-작용제가 높은 동질성을 가짐을 보여주는, 크로마토그램을 도시한다 (용액에서 응집물의 함량은 5% 이하임).
실시예 11
동계 B16F10 흑색종 모델에서 IL15 슈퍼-작용제 생산물의 항-종양 활성에 대한 평가
면역적격 C57BL/6 마우스에 B16F10 종양 세포주를 접종하여 효능을 평가하였다. 종양 세포 1,5x105개를 각 군의 동물 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 세포 접종 (실험 1일) 후 7일차에, 동물을 표 3에 나타낸 바와 같이 군으로 분할하였다. 다음과 같은 생산물을 1회 투여하여 효능을 평가하였다: BCD-225, IL15SA/a-mPD-1 (IL-15SA 및 마우스 PD-1에 대한 Fab 단편을 포함하는 2중 특이성 단일클론 항체, 마우스 RMP1-14 항체의 유도체). RMP1-14 항체의 가변성 도메인의 서열은 준텐도 대학병원의 히데오 야기타 박사로부터 친절하게 제공받았다. 유전자 및 RMP1-14 항체 생산물 가변성 도메인을 실시예 1에 따라 합성하였다. 또한, 기준 생산물 ALT-803 [Han KP et al, Cytokine . 2011 Dec;56(3):804-10] (양성 대조군) 및 위약 (음성 대조군)을 합성하였다. 항-마우스 PD-1 항체 (a-mPD-1)와 조합하여 생산물의 항-종양 활성을 또한 평가하였다.
표 3. IL15 슈퍼-작용제의 항-종양 활성 실험에서 동물 군.
군 동물 수 용량
BCD-225(IL15SA) 9 0.2 mg/kg
IL15SA/a-mPD-l 9 0.2 mg/kg
ALT-803 9 0.2 mg/kg
항-mPD-1 10 10 mg/kg
BCD-225(IL15SA) + 항-mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
IL15SA/a-mPD-l + 항-mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
ALT-803 + 항-mPD-1 9 0.2 mg/kg + 10 mg/kg
음성 대조군 10 -
BCD-225 (IL15SA), IL15SA/a-mPD-1 및 ALT-803 생산물을 실험 1일, 4일, 8일 및 11일에 0.2 ml 부피로 복막내 주사하였다. 항-mPD-1 생산물을 실험 2일, 5일, 9일 및 12일에 0.2 ml 부피로 복막내 주사하였다. 음성 대조군은 실험 1일, 2일, 4일, 5일, 8일, 9일, 11일 및 12일에 초산나트륨 완충제와 함께 0.2 ml 부피로 주사하였다 (도 23).
마우스 체중 및 종양 선형 직경을 실험 내내 측정하였다. 종양 부피를 식: V=L×W×W×π/6으로 계산하였다. 검사 생산물의 효과를, 음성 대조군 (Vc) 및 생산물 군 (Vt)의 종양 부피 중앙값을 고려하여 하기 식으로 계산한 종양 증식 저해 (TGI) 지수에 의해, 평가하였다:
Figure pct00001
실험 결과를 도 24 및 25에 도시한다. 거의 전체 실험 군들에서 동물들이 종양 부담으로 인해 사망하여 15일에 생산물의 항-종양 활성을 확실하게 평가하기 어려워, 실험 11일까지의 데이터를 도시하였다.
실험 결과에 따르면, BCD-225 생산물 및 기준 ALT-803 생산물은 비슷한 항-종양 활성을 나타내었으며, TGI가 BCD-225 군의 경우 52%, ALT-803 군의 경우 53%이었다. IL15SA/항-mPD-1 2중 특이성 항체 군에서 TGI 값이 BCD-225 및 ALT-803 군에서의 TGI 값과 비교해 증가하는 경향이 관찰되었다. IL15SA/항-mPD-1 군의 TGI는 실험 11일에 58%였다.
생산물 조합 군 BCD-225 + 항-mPD-1 및 ALT-803 + 항-mPD-1의 TGI 값은 실험 11일에 72%이었으며, 생산물 조합 군 IL15SA/a-mPD-1 및 항-mPD-1의 경우에는 TGI 값이 69%이었다. 수득한 TGI 값은 검사 생산물 및 항-mPD-1의 조합의 항-종양 활성이, 이들 생산물의 단일 요법에서의 활성화 비교해, 보다 현저하다는 것을 보여준다.
실시예 12
동계 B16F10 흑색종 모델에서 IL15 슈퍼-작용제 및 ALT803 생산물을 이용한 마우스에서 비교 사망률 평가 및 분석
IL15 슈퍼-작용제 생산물을 사용한 후 마우스에서 비교 사망률 평가를 실시예 11에 기술된 바와 같이 모델 및 동물을 이용해 수행하였다. 고통 상태에서 사망 또는 안락사한 동물의 수를 측정하여 생존성을 분석하였다.
그 결과를 표 4에 나타낸다. 수득한 데이터에 따르면, IL15SA/a-mPD-1 및 IL15SA/a-mPD-1 + 항-mPD-1 생산물 군에서의 사망률은 평균적으로 IL15SA (BCD225), IL15SA + 항-mPD-1, ALT-803, ALT-803 + 항-mPD-1 군과 비교해, 마우스 수 및 생존 기간 측면에서 더 낮았다. 수득한 사망률 값은 IL15SA/a-mPD-1 2중 특이성 면역사이토카인의 독성이 단일 특이성 2가 IL15SA 및 ALT-803과 비교해 덜 현저할 수 있음을 보여준다. 항-PD1 항체의 존재 또는 부재는 사망률에 통계학적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 아울러, IL15SA 및 ALT-803 배치에서 사망 마우스에 대한 장기 검사에서는 간 세포의 괴사를 동반한 간의 수종성 이영양증 (hydropic dystrophy), 동양혈관의 압박; 실질내 림프조직구의 침윤, 및 동양 혈관내 림프구의 축적이 존재하는 것으로 드러났다. 이러한 사실은 마우스에서 IL15-기반의 슈퍼-작용제의 간 손상 유발력에 대해 이전에 발표된 문헌 데이터와 일치하였다.
표 4. IL15 슈퍼-작용제, ALT803 슈퍼-작용제 생산물 및 이들의 조합과 항-PD1 항체의 투여 후 사망 실험에서의 동물 군
군 번호 처리 사망 동물의 수 실험 일 총
1 IL15SA (BCD-225) 2
2		 10
14		 4
2 IL15SA/a-mPD-l 2 15 2
3 ALT-803 2 7 2
4 항-mPD-1 3 14 3
5 IL15SA(BCD-225) + 항-mPD-1 1 14 1
6 IL15SA/a-mPD-l + 항-mPD-1 1
1		 11
14		 2
7 ALT-803 + 항-mPD-1 3 7 3
8 위약 1 14 1
SEQUENCE LISTING <110> JOINT STOCK COMPANY "BIOCAD" <120> IMMUNOCYTOKINE COMPRISING HETERODYMERIC PROTEIN COMPLEX BASED ON IL-15/IL-15RΑ <150> RU2019129569 <151> 2019-09-19 <160> 24 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15R慣-CK artificial sequence <400> 1 Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp 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Gly Gly Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala 210 215 <210> 20 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15-CH1CH2CH3- CiA artificial sequence <400> 20 Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210> 21 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15-CK- CiA artificial sequence <400> 21 Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala 225 230 <210> 22 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15R慣-CH1CH2CH3- CiA artificial sequence <400> 22 Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Asn 340 345 350 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 355 360 365 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 370 375 380 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 405 410 415 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 420 425 430 Ser Leu Ser Pro 435 <210> 23 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15-CH1CH2CH3 knob-Fc artificial sequence <400> 23 Asp Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser Ala Gly Gly Lys Pro Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro 450 <210> 24 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL15R慣-CH1CH2CH3 knob-Fc artificial sequence <400> 24 Asp Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 325 330 335 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 340 345 350 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 355 360 365 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 370 375 380 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 385 390 395 400 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 405 410 415 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 420 425 430 Ser Leu Ser Pro 435

Claims (70)

  1. IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인 (immunocytokine)으로서,
    1) IL-15Rα로서,
    a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
    b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα;
    2) IL-15로서.
    a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
    b) 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15
    를 포함하는, IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체를 포함하고,
    상기 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 또는 공유 결합되지 않으며,
    IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 경쇄 불변 도메인에 연결되면, IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 이형이량체 단백질 복합체의 다른 하나는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인이 CK 또는 CL로부터 선택되는, 면역사이토카인.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15Rα 변이체인, 면역사이토카인.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15가 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15 변이체인, 면역사이토카인.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진, 면역사이토카인.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15가 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진, 면역사이토카인.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 상기 Fc 단편 모노머가 힌지를 통해 연결된, 면역사이토카인.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 또는 IL-15Rα가 CH1-힌지-CH2-CH3 순서로 정렬된 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 4 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 IL-15가 상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 2 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지고,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 2 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 4 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 가지고,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  17. 제1항에 있어서,
    면역사이토카인에 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 유발하는 돌연변이를 상기 Fc 단편 모노머에 포함하는, 면역사이토카인.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 단편이 IgG에 속하는, 면역사이토카인.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 Fc 단편 이소형이 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는, 면역사이토카인.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체 2개를 포함하는, 면역사이토카인.
  21. 제20항에 있어서,
    암 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료학적 물질로서 사용하기 위한 것인, 면역사이토카인.
  22. IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 면역사이토카인으로서,
    IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체와, PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며,
    상기 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체가
    1) IL-15Rα로서,
    a) 항체 경쇄 불변 도메인, 또는
    b) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15Rα;
    2) IL-15로서,
    a) 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는, 항체 중쇄 불변 도메인, 또는
    b) 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, IL-15
    를 포함하고,
    상기 이형이량체 복합체에서 제1 항체 중쇄 불변 도메인과 항체 경쇄 불변 도메인은 천연 S-S 브릿지를 통해 공유 결합되거나 또는 공유 결합되지 않으며,
    IL-15 또는 IL-15Rα가 항체 경쇄 불변 도메인에 연결되면, IL-15Rα 또는 IL-15로부터 선택되는 이형이량체 단백질 복합체의 다른 하나는 항체 중쇄 불변 도메인에 연결되는, 면역사이토카인.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인이 CK 또는 CL로부터 선택되는, 면역사이토카인.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15Rα 변이체인, 면역사이토카인.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 IL-15가 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 가지거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 임의의 공지된 돌연변이 IL-15 변이체인, 면역사이토카인.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가진, 면역사이토카인.
  28. 제22항에 있어서,
    상기 IL-15가 상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가진, 면역사이토카인.
  30. 제22항에 있어서,
    상기 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 상기 Fc 단편 모노머가 힌지를 통해 연결된, 면역사이토카인.
  31. 제22항에 있어서,
    상기 IL-15 또는 IL-15Rα가 CH1-힌지-CH2-CH3 순서로 정렬된 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 IL-15Rα가 상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα가 서열번호 6 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 IL-15가 상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된, 면역사이토카인.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15가 서열번호 5 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는, 면역사이토카인.
  36. 제22항에 있어서,
    PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 상기 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역사이토카인.
  37. 제22항에 있어서,
    상기 면역조절 항체가
    a) 경쇄 가변성 도메인과 경쇄 불변 도메인을 포함하는 경쇄;
    b) 중쇄 가변성 도메인; 및 제1 (CH1) 중쇄 불변 도메인과, 제2 (CH2) 중쇄 불변 도메인 및 제3 (CH3) 중쇄 불변 도메인을 포함하는 Fc 단편 모노머를 포함하는 항체 중쇄 불변 도메인을 포함하는, 중쇄
    를 포함하는, 면역사이토카인.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는, 면역사이토카인.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역사이토카인.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는, 면역사이토카인.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역사이토카인.
  42. 제37항에 있어서,
    1) 상기 경쇄 가변성 도메인이 각각 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 LCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하고,
    2) 상기 중쇄 가변성 도메인이 각각 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 HCDR 1, 2 및 3 (과가변부 1, 2 및 3)를 포함하는, 면역사이토카인.
  43. 제42항에 있어서,
    1) 상기 경쇄 가변성 도메인이 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    2) 상기 중쇄 가변성 도메인이 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역사이토카인.
  44. 제37항에 있어서,
    상기 면역조절 항체가 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 면역사이토카인.
  45. 제37항에 있어서,
    상기 면역조절 항체가 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 면역사이토카인.
  46. 제37항에 있어서,
    상기 면역조절 항체가
    서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 면역사이토카인.
  47. 제22항에 있어서,
    PD-1 경로를 특이적으로 저해하는 상기 면역조절 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체인, 면역사이토카인.
  48. 제22항에 있어서,
    a) 상기 IL-15/IL-15Rα에 기반한 이형이량체 단백질 복합체에서, 항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα는 서열번호 1 또는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 가지고, 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15는 서열번호 5 또는 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    b) 상기 면역조절 항체는
    서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 면역사이토카인.
  49. 제22항에 있어서,
    a) 항체 중쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα는 서열번호 6 또는 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 가지고,
    항체 경쇄 불변 도메인에 연결된 IL-15는 서열번호 3 또는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 가지며;
    b) 상기 면역조절 항체는
    서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄;
    서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는, 면역사이토카인.
  50. 제22항 또는 제37항에 있어서,
    공유 또는 비-공유 결합된 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15Rα와 항체 불변 도메인에 연결된 IL-15를 포함하는 하나와, 공유 또는 비-공유 결합된 항체의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 다른 하나로 이루어진 2종 간의 이형이량체의 형성을 유도하는 돌연변이를 항체 불변 도메인에 가지는, 면역사이토카인.
  51. 제22항 또는 제37항에 있어서,
    제1 Fc 모노머 및 제2 Fc 모노머는 제1 Fc 모노머가 Knob 변형된 Fc이고 제2 Fc 모노머가 Hole 변형된 Fc이거나 또는 제2 Fc 모노머가 a Knob 변형된 Fc이고 제1 Fc 모노머가 Hole 변형된 Fc인 군으로부터 선택되는 면역사이토카인.
  52. 제51항에 있어서,
    a) 상기 제1 Fc 모노머는 아미노산 치환 S354C/T366W를 가지고, 상기 제2 Fc 모노머는 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407V를 가지거나, 또는
    b) 상기 제1 Fc 모노머는 아미노산 치환 Y349C/T366S/L368A/Y407을 가지고, 상기 제2 Fc 모노머는 아미노산 치환 S354C/T366W를 가지는, 면역사이토카인.
  53. 제22항 또는 제37항에 있어서,
    상기 Fc 단편이 IgG에 속하는, 면역사이토카인.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 Fc 단편 이소형이 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4를 포함하는 군으로부터 선택되는, 면역사이토카인.
  55. 제22항 또는 제37항에 있어서,
    면역사이토카인에 ADCC, CDC 및/또는 ADCP 특성의 결핍을 유발하는 돌연변이를 상기 Fc 단편 모노머에 포함하는, 면역사이토카인.
  56. 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것인, 면역사이토카인.
  57. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인을 코딩하는 단리된 핵산.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA인, 핵산.
  59. 제57항 또는 제58항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  60. 세포를 제59항의 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포의 제조 방법.
  61. 제57항 또는 제58항의 핵산을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인을 생산하기 위한 숙주 세포.
  62. 제61항의 숙주 세포를 배양 배지에서 면역사이토카인을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양한 다음 필요에 따라 생산된 면역사이토카인을 단리 및 정제하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인을 포함하는 생산물의 생산 방법.
  63. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인을 치료학적 유효량으로, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는, IL-15Rβ/γ-양성 세포의 활성화 및/또는 증식을 자극하기 위한 약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서,
    종양 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 것인, 약학적 조성물.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 종양 질환이 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  66. 치료가 필요한 개체에 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인 또는 제63항에 따른 약학적 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 종양 질환의 치료 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 종양 질환이 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  68. 개체에 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인 또는 제63항에 따른 약학적 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 활성화가 필요한 개체에서 T 세포 집단 또는 NK 세포 집단의 생물학적 활성을 활성화하는 방법.
  69. 치료가 필요한 개체에서 종양 질환을 치료하기 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항 또는 제22항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 면역사이토카인 또는 제63항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  70. 제69항에 있어서,
    상기 종양 질환이 HNSCC (두경부 편평 세포암), 자궁경부암, 원발성 불명 암, 교모세포종, 식도암, 방광암, TNBC (3중 음성 유방암), CRC (결장직장암), 간세포암, 흑색종, NSCLC (비-소 세포성 폐암), 신장암, 난소암, MSI CRC (현미부수체 불안정형 결장직장암), 백혈병 (급성 백혈병 또는 골수모구성 백혈병), 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 방광암, 육종, 간세포암, 교모세포종, 호지킨 림프종, T 세포 및 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 소 세포성 폐암, 급성 골수모구성 백혈병, 난치성 비-호지킨 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 두경부 편평 세포암, 췌장암, 난소암, 급성 골수모구성 백혈병 및 고-위험 골수이형성 증후군을 포함하는 군으로부터 선택되는, 용도.
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