CN115287333A - 肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、TritonX‑100、第一缓冲剂；R2试剂包含FⅩa、精氨酸、NP‑40、氯化镁、第二缓冲剂。本发明试剂盒一定程度下解决血浆的来源，更符合中国国情，同时制备方便，操作简便，具有较高的灵敏度、稳定性和抗干扰能力，检测结果精确度高，市场竞争优势强。

Description

肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法

技术领域

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。

背景技术

肝素是一种酸性黏多糖，由分布在肠黏膜的肥大细胞合成。正常人血液中含量极少，生理情况下其抗凝作用很小。它可通过加速抗凝血酶、HCⅡ起抗凝作用，对TFPI和蛋白C系统也有影响。天然肝素是不均一的，其分子量在3-57kD之间(王振义.血栓与止血基础理论与临床[M].第三版.上海：上海科学基础出版社，2004:119-119)。临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术上、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。

肝素是临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，肝素类药物在抗血栓药物中占有极大的市场份额，其中又以低分子肝素类药物占主导。作为药物，肝素活性功能的精确检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。肝素测定方法主要为凝固法和发色底物法(US4234682、US 4948724、US 5308755 A、CN104048931A、CN 103063592A、CN103323416A；Ten C H,Lamping R J,Henny C P,et al.Automatedamidolytic method for determining heparin,a heparinoid,and a low-Mr heparinfragment,based on their anti-Xa activity[J].Clinical Chemistry,1984,30(6):860-864)。发色底物法是利用肝素糖链中含有与抗凝血酶高亲和的五糖结构域，能够特异性结合体内AT，形成肝素-抗凝血酶复合物，肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ(或凝血因子Ⅱ)水解发色底物的显色反应的基本原理，具有灵敏度高、操作简便、特异性强的特点。肝素的抗血栓活性与抗凝活性与肝素分子中特征组成和相对质量有关，研究显示在抗Ⅹa因子相互作用过程中，只需含肝素核心五糖结构域糖链激活AT进而达到抗凝血的目的；在抗Ⅱa因子相互作用过程中不仅需要肝素包含有核心五糖结构域，还要包括至少十八个单糖组成的糖链(Lane D A,Denton J,Flynn A M,et al.Anticoagulantactivities of heparin oligosaccharides and their neutralization by plateletfactor4.[J].Biochemical Journal,1984,218(3):725-732)。

市面上采用发色底物法的肝素测定试剂盒亦分成两种，一种是两步法，该法包含额外添加的抗凝血酶(AT)，不依赖于样本血浆中的AT含量，检测样品血浆中总肝素含量。另外一种是一步法，该法依赖样本血浆中的AT含量(血浆中AT含量在35％～130％范围)，检测是基于竞争抑制原理，检测样品血浆中起抗凝作用的肝素，如IL公司的LiquidHeparin-0020300100，Aniara Biophen HeparinLRT、STAGO公司的

-LiquidAnti-Xa。显而易见，市面上肝素检测常用的一步法试剂盒基本为液体试剂，这使得其稳定性在某种程度上是有限的。

分析目前市售肝素检测试剂盒的应用情况发现：

首先，临床上应用的肝素类药物种类较多，通常发色底物法测定肝素时需要依据不同种类的肝素制定相应的新的标准曲线，且研究表明不同市售试剂盒对直接FXa抑制剂的敏感性存在显著性差异(Dogne,Jean-Michel,Sabor,et al.Heparin-calibratedchromogenic anti-Xa assays are not suitable to assess the presence ofsignificant direct factor Xa inhibitors levels[J].Thrombosis Research AnInternational Journal on Vascular Obstruction Hemorrhage&Hemostasis,2017.)。这一定程度上降低了肝素测定试剂盒(发色底物法)的简便性。

其次，绝大部分市售试剂盒中均含有硫酸葡聚糖，以降低样本血浆中PF4等对肝素检测的干扰；然而也有研究表明在高浓度普通肝素治疗的情况下，硫酸葡聚糖的存在可能导致过高的肝素检测结果(Ignjatovic V,Summerhayes R,Gan A,et al.MonitoringUnfractionated Heparin(UFH)therapy:Which Anti FactorXa assay is appropriate？[J].Thrombosis Research,2007,120(3):347-351.)。从而此类情况下，如何降低PF4的干扰的同时确保检测结果的准确性也是重要的。

此外，我国对血液的管理比较严格，人血来源受限，且牛FⅩa的制备方法简便且由来已久，因而专利报道中优选的FⅩa来源以及市售肝素测定试剂盒(发色底物法)中FⅩa组分绝大部分来自牛血。然而，相比牛血资源，我国猪血资源更为丰富，利用率却不高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。该试剂盒一定程度下解决血浆的来源，更符合中国国情，同时制备方便，操作简便，具有较高的灵敏度、稳定性和抗干扰能力，检测结果精确度高，市场竞争优势强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种肝素测定试剂盒，试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、TritonX-100、第一缓冲剂；R2试剂包含FⅩa、精氨酸、NP-40、氯化镁、第二缓冲剂。

作为优选，R1试剂中，发色底物为S-2732、S-2765与S-2222中的任意一种；优选发色底物为S-2732。

作为优选，肝素水解酶为肝素酶II或acharan sulfate裂解酶；

作为优选，第一缓冲剂选自HEPES、Tris-HCl或磷酸盐缓冲物的一种或多种，pH为6.5～9.0；优选pH为pH7.0～8.0。

优选地，第一缓冲剂为HEPES和Tris-HCl缓冲物。

作为优选，R2试剂中，FⅩa为猪FⅩa或牛FⅩa；优选猪FⅩa。

作为优选，第二缓冲剂选自HEPES、Tris-HCl或磷酸盐缓冲物的一种或多种，pH为6.5～9.0；优选pH为pH7.5～8.4。

优选地，第二缓冲剂为Tris-HCl缓冲物。

作为优选，R1试剂还包含第一冻干保护剂，第一冻干保护剂选自甘露醇、BSA、PEG6000或抑肽酶中的任意一种或者几种的混合物；

优选地，第一冻干保护剂为甘露醇。

作为优选，R2试剂还包含第二冻干保护剂，第二冻干保护剂选自甘露醇、BSA、PEG6000或抑肽酶中的任意一种或者几种的混合物。

优选地，第二冻干保护剂为甘露醇和BSA的混合物。

作为优选，R1试剂中各组分的工作浓度为：

R2试剂中各组分的工作浓度为：

优选地，R2试剂中，氯化镁0.05～0.25mol/L。优选地，R1试剂中各组分的工作浓度为：

R2试剂中各组分的工作浓度为：

在本发明提供的具体实施例中，第一缓冲剂的pH值为7.5，第二缓冲剂的pH值为8.4。

在本发明中，R1试剂或R2试剂为液体型试剂或冻干型试剂。

本发明还提供了一种非诊断目的的肝素含量测定方法，采用权利要求1至8中任一项的肝素测定试剂盒对样本进行测定，包括如下步骤：

①R1试剂与样本混合，于37℃孵育0.5～2分钟；

②向步骤①所得混合物中加入R2试剂，于37℃孵育3～4分钟，读取反应产物于405nm波长下的吸光度值；

③根据已知的标准曲线，得到样本中的肝素含量。

作为优选，样本为液体样本，R1试剂和R2试剂为液体型试剂，或者R1试剂和R2试剂为冻干型试剂复溶后的试剂，R1试剂、样本与R2试剂的体积比为(1～2):(1～2):(1～2)。

优选地，样本为液体样本，R1试剂、样本与R2试剂的体积比为1:1:1。

本发明提供了一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、TritonX-100、第一缓冲剂；R2试剂包含FⅩa、精氨酸、NP-40、氯化镁、第二缓冲剂。与现有技术相比，本发明试剂盒具有以下的效果：

(1)本发明所用FXa由猪血浆制备而得，解决血浆来源，适合中国国情，制备方便，降低成本；

(2)本发明试剂盒得到的一条标准曲线可用于多种肝素类药物的检测，无需制定多条不同肝素类药物的标准曲线，操作简便；

(3)本发明在R1试剂中所添加的赖氨酸与Triton X-100协同作用的情况下，能够有效提升发色底物与肝素水解酶的稳定性，且确保冻干过程中酶活的稳定性；

(4)本发明在R2试剂中所添加的精氨酸与NP-40协同作用的情况下，能够使FXa因子的活性的稳定性较常规试剂盒有所提升，且确保了冻干过程中酶活的稳定性；

(5)本发明发现在试剂中添加TritonX-100、NP-40与氯化镁的协同作用下，能够提高试剂盒检测过程中抗干扰的效果，提高其检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明试剂盒与现有市售试剂盒检测结果的相关性分析。

具体实施方式

本发明公开了一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种肝素测定试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、Triton X-100、缓冲剂；所述R2试剂包含猪FⅩa试剂、精氨酸、NP-40、氯化镁、缓冲剂。

上述试剂盒中所述R1试剂及R2试剂可以是液体型，也可以是冻干型试剂。在用上述试剂盒检测样本肝素活性的过程中，检测方法可以是终点法或者动态法，具体步骤为：

①R1试剂与样本血浆以体积比1:1的方式混合，于37℃混合并孵育0.5-2分钟；

②加入R2试剂，其与样品血浆混合体积比为1:1，37℃下作用3分钟后，读取上述样品于405nm波长下的吸光度值；

③根据已知的标准曲线计算得到样品血浆中的肝素含量。

工作浓度的定义：在上述任一试剂检测样品肝素活性的过程中，所述R1及R2试剂(液体型试剂或冷冻干燥试剂用蒸馏水复溶后)，与样本血浆混合，所形成的分析混合物中各组分的浓度被定义为其工作浓度。

在发色底物法检测肝素的活性的过程中，作为FⅩa底物，要求具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能有效提高检测的灵敏度，保证检测结果的准确性。本发明试剂盒中，所述R1试剂中的发色底物为Suc-Ile-Glu-(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl(S-2732)、Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·HCl(S-2765)与Bz-Ile-Glu(-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl(S-2222)中的任意一种；优选发色底物为Suc-Ile-Glu-(γ-Piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl(S-2732)，其工作浓度为1.2-3.0mg/mL，最佳工作浓度为1.5mg/mL。

本发明试剂盒中，所述R1试剂中所包含的肝素水解酶种类为肝素酶II或acharansulfate裂解酶，其中acharan sulfate裂解酶性质与肝素酶Ⅱ性质相似；两者均能够修饰和剪切糖胺聚糖链，对肝素及硫酸肝素均有一定的裂解作用。肝素酶II可经采购获得，还可同acharan sulfate裂解酶一样，由本领域技术人员通过已知的分离纯化方法从相应的菌株中制备而得，如参考KimB T等人的文献(Kim B T,Hong S W,Kim W S,etal.Purification and characterization ofacharan sulfate lyases,two novelheparinases,from Bacteroides stercoris,HJ-15[J].European JournalofBiochemistry,2001,268(9):2635-2641.)。在一个优选的实施方案中，肝素水解酶的工作浓度为0.1U/mL-0.7U/mL，最佳工作浓度为0.5U/mL；此工作浓度范围内，其能够使样品中的肝素部分降解，但保留其与AT结合的能力。肝素酶II或acharan sulfate裂解酶的酶活定义为在特定条件下，1min内转化1μmol肝素不饱和寡糖链所需酶量，称为一个国际单位(IU或U)。

本发明所述R1试剂中的缓冲剂选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，pH范围为6.5-9.0。在一些实施方案中，优选Tris-HEPES缓冲液，缓冲液中Tris的浓度为10～50mM，HEPES的浓度为2～10mM。为确保R1试剂有足够水平的固含量，其缓冲剂中进一步包括了甘露醇、BSA、PEG6000及抑肽酶中的任意一种或者几种混合，优选甘露醇。

在本发明的一些实施方案中，所述R1试剂的组成中赖氨酸和TritonX-100共同用作稳定剂与冻干酶活保护剂，所述赖氨酸的浓度为1～10％，TritonX-100的含量为0.2～0.5mL/L。

本发明试剂盒中，所述R2试剂中猪FXa依据专利(CN201710780196.4)从猪血浆中提取纯化制备而得，其工作浓度为0.1-0.45U/mL，最佳工作浓度为0.25U/mL。

本发明所述R2试剂中的缓冲剂选自HEPES、Tris和磷酸盐缓冲液的一种或多种，pH范围为6.5-9.0。在一些实施方案中，优选Tris-HCl缓冲液，缓冲液中Tris的浓度为10～50mM，优选pH范围为pH7.5-8.4。为确保R2试剂有足够水平的固含量，其缓冲剂中进一步包括了甘露醇、BSA、PEG6000及抑肽酶中的任意一种或者几种混合，优选甘露醇与BSA混合。

在本发明的一些实施方案中，所述R2试剂的组成中精氨酸和NP-40共同用作稳定剂与冻干酶活保护剂，所述精氨酸的浓度为1～10％，NP-40的含量为0.05～2mL/L。

在本发明的实施方案中，所述R2试剂还进一步包括了镁盐，优选氯化镁，其浓度为0.01～0.25mol/L。镁盐的存在除了确保R2试剂中的离子强度外，还可有效提高试剂盒检测的灵敏度。

在以下实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明试剂盒与对照实验组的制备

(1)本发明试剂盒

表1本发明试剂盒配方(液体型试剂)(实验组1)

表2本发明试剂盒配方(冻干型试剂)(实验组2与实验组3)

注：①冻干型试剂均以1mL/瓶分装冻干；冻干品使用前用2mL蒸馏水复溶。②实验组2的R1试剂为采用肝素酶II制备；实验组3的R1试剂为采用acharan sulfate裂解酶制备。

(2)对照实验组的制备

表3对照实验组配方

实施例2本发明试剂盒检测方法的建立

(1)肝素水解酶浓度的筛选

以BioTek ELx800酶标仪操作(终点法)为例，根据仪器说明，设定分析程序：测定波长为405nm；

首先用生理盐水将已知效价的肝素稀释成100U/mL的肝素。取10μL100U/mL的肝素，加入990μL人血浆标准品稀释，得1.0U/mL的肝素标准品。继续用人血浆标准品稀释1.0U/mL的肝素标准品，配制0.0、0.2、0.5、0.8、1.0U/mL的肝素5个标准点的样本，在37℃孵育30秒。取50μL稀释后样本，加入50μL R1试剂在37℃孵育60秒，再加入50μL R2试剂在37℃孵育180秒，再加入50μL 20％乙酸溶液终止反应，于405nm下测定吸光度值(OD_405nm)。每管重复测定3次，以OD_405nm的均值为纵坐标，对应的肝素活性为横坐标，制作“活性-吸光度值”标准曲线。同理制定低分子量肝素标准曲线。实验组1与对照组1～4的肝素和低分子量肝素各个标准点的测定结果与曲线的分析结果如表4所示。依照线性检验结果，不同试剂组的UFH和LMWH的标准曲线均具有较好的相关系数，运用SPSS 17.0软件检验两条标准曲线间(同一试剂组下UFH与LMWH的校准曲线)的显著性差异，协方差分析结果显示在置信度95％的水平下，R1试剂中肝素酶II的含量在0.1～0.7U/mL的情况下，两条标准曲线截距和斜率的检验结果Sig.P值均大于0.05，即当肝素酶II的含量在0.1～0.7U/mL的情况下，两条标准曲线的截距和斜率无显著性差异，两者可以合并成一条共用的标准曲线或任选其中一条曲线应用于检测。由于肝素酶II对肝素结构的降解作用，使得降解后的肝素成分保留了其与AT的活性，但其链长变短，故标准曲线最终采用低分子量肝素的标准曲线，实验组1的LMWH标准曲线方程为：y＝-0.5064x+1.0221。

表4不同试剂组(液体型试剂)标准曲线的测定结果汇总与分析

(2)肝素水解酶种类的筛选与本发明试剂盒检测方法的建立

与实施例1(1)的实验方法相同，分别采用实验组2～3与对照组5～7进行肝素和低分子量肝素各个标准点的测定，其中对照组7对换了R1试剂与R2试剂的加样顺序，结果如表5所示。依照线性检验结果，不同试剂组的UFH和LMWH的标准曲线均具有较好的相关系数，运用SPSS 17.0软件检验两条标准曲线间(同一试剂组下UFH与LMWH的校准曲线)的显著性差异，协方差分析结果显示：在置信度95％的水平下，R1试剂中肝素水解酶的种类为肝素酶II或acharan sulfate裂解酶的情况下，两条标准曲线截距和斜率的检验结果Sig.P值均大于0.05，而配方组成为肝素酶I与肝素酶III的情况下，其两条标准曲线的截距与斜率的检验结果存在Sig.P值小于0.05的情况，即在本发明试剂盒的配方组合中，只有肝素酶II和acharan sulfate裂解酶作用的情况下，才能使得UFH与LMWH测定所用标准曲线采用同一定标曲线，才能确保样本检测结果的准确性。由于肝素酶II对肝素结构的降解作用，使得降解后的肝素成分保留了其与AT的活性，但其链长变短，故标准曲线最终采用低分子量肝素的标准曲线，实验组2的LMWH标准曲线方程为：y＝-0.5008x+1.0307。

此外，表5的结果还显示，采用本发明试剂盒进行检测时，其R1试剂与R2试剂的加样顺序不可调换，检测步骤为：①R1试剂与样本血浆以体积比1:1的方式混合，于37℃混合并孵育0.5-2分钟；②加入R2试剂，其与样品血浆混合体积比为1:1，37℃下作用3分钟后，读取上述样品于405nm波长下的吸光度值；③根据已知的标准曲线计算得到样品血浆中的肝素含量。

表5不同试剂组(冻干型试剂)标准曲线的测定结果汇总与分析

本试剂盒适用于各种品牌和型号可采用发色底物法原理进行检测的半自动和全自动的检测仪上(生化分析仪或者血凝分析仪)。如法国思达高STA-REvolution血凝仪、美国贝克曼库尔特ACL TOP系列血凝仪、西门子CA/CS系列血凝仪等，具体参数可根据仪器不同进行适当调整。

实施例3本发明试剂盒的分析性能评估

(1)灵敏度

首先，以正常人混合血浆(血浆中AT含量在80％～100％)为空白样本，分别采用实验组1与对照组8～10试剂按照实施例2的检测方法对空白样本进行检测，重复测定20次，分别计算此样本OD_405nm均值

和标准差(SD)，以空白均值减两倍标准差代入LMWH的标准曲线方程中，计算最低检测限，其结果如表6所示。

其次，用DMSO分别将利伐沙班、依度沙班、阿哌沙班溶解配成0.6mg/mL的母液，然后再用正常人混合血浆分别将上述三种母液稀释至30ng/mL，以获得处于临床临界值处的三种待测样本。分别采用实验组1与对照组8～10试剂按照实施例2的检测方法对三种样本进行检测，重复测定3次，计算其抗Xa的活性的均值，结果如表7所示。

表6与表7的结果显示：氯化镁与NP-40协同作用的情况下能够有效提高本发明试剂盒的检测灵敏度，且对直接FXa抑制剂同样有效。本发明试剂盒检测肝素的最低检测限可达0.02U/mL，低于市售肝素检测试剂盒(发色底物法)说明书中所述的最低检测限(0.04U/mL)。

表6最低检测限的分析结果

表7对临床临界值处直接FXa抑制剂的灵敏度验证结果

(2)抗干扰能力

分别按照血红蛋白、胆红素、甘油三酯以及血小板因子PF4的说明书将上述物质溶解配成一定浓度的母液，然后用含UFH的人血浆标准品分别将上述母液分别稀释至所需浓度，以获得不同浓度梯度的含血红蛋白、胆红素、甘油三酯或血小板因子PF4的待测样本(含血红蛋白、胆红素以及甘油三酯样本中UFH的理论含量为0.50U/mL，含PF4的样本中UFH的理论含量为1.0U/mL，各干扰物质的浓度见表8)。分别采用实验组1与对照组9、对照组11～12试剂按照实施例2的检测方法对待测样本进行检测，重复测定3次，计算其抗Xa的活性的均值，结果如表8所示。结果显示，氯化镁、TritonX-100与NP-40的协同作用下能够有效提高本发明试剂的抗干扰能力，当样本血浆中血红蛋白的含量低于3.5g/L、胆红素的含量低于0.3g/L、甘油三酯的含量低于9g/L、PF4低于80ng/mL的情况下，本发明试剂盒对样本中肝素含量的检测不会造成影响。

表8抗干扰能力的检测结构

(3)稳定性

(I)R1试剂稳定剂的筛选

将实验组1与对照组12～16的试剂置于37℃的电热恒温培养箱中，在第0天、7天与14天取出进行检测。每个检测时间间隔下，分别采用实验组1与对照组12～16试剂按照实施例2的检测方法对HYPHEN的5个质控品(分别为：UFH Control level1、UFH Controllevel2、LWMH Control level1、LWMH Control level2、LWMH Control level3)进行检测，重复测定3次，根据其检测结果的均值分别计算第7天或第14天与第0天检测结果均值的相对偏差，结果如表9所示。结果显示，赖氨酸与TritonX-100协同作用的情况下能够有效提高R1试剂的稳定性，当采用其他氨基酸替换赖氨酸与Triton X-100协同作用的情况下，其稳定性效果不如本发明的试剂盒。

表9 R1试剂稳定剂的筛选结果

(II)R2试剂稳定剂的筛选

将实验组1与对照组17～21的试剂置于37℃的电热恒温培养箱中，在第0天、7天与14天取出进行检测。每个检测时间间隔下，分别采用实验组1与对照组17～21试剂按照实施例2的检测方法对HYPHEN的5个质控品(分别为：UFH Control level1、UFH Controllevel2、LWMH Control level1、LWMH Control level2、LWMH Control level3)进行检测，重复测定3次，根据其检测结果的均值分别计算第7天或第14天与第0天检测结果均值的相对偏差，结果如表10所示。结果显示，精氨酸与NP-40协同作用的情况下能够有效提高R2试剂的稳定性，当采用其他氨基酸替换精氨酸与NP-40协同作用的情况下，其稳定性效果不如本发明的试剂盒。

表10 R1试剂稳定剂的筛选结果

(III)本发明试剂盒的稳定性检测

将实验组1的试剂置于37℃的电热恒温培养箱中，在第0天、7天、14天、21天、28天与38天取出进行检测。每个检测时间间隔下，分别采用实验组1试剂按照实施例2的检测方法对HYPHEN的5个质控品(分别为：UFH Control level1、UFH Control level2、LWMHControl level1、LWMH Control level2、LWMH Control level3)进行检测，重复测定3次，计算其检测结果的均值，结果如表11所示。结果显示，本发明试剂盒在37℃条件下的35天内，其各不同浓度水平质控品的测定结果几乎无变化，即本发明试剂盒可在37℃条件下有效稳定35天。

表11本发明试剂盒在37℃条件下稳定性效果

(III)本发明试剂盒冻干品复溶稳定性检测

分别对实验组2与对照组22～对照组27的试剂先按照实施例2的方法进行冻干前检测，检测结果满足要求后进行冷冻干燥。冻干结束后将冻干品经蒸馏水复溶后按照实施例2的方法进行冻干后检测。实验组2的试剂冻干后检测结果作为其第0天的检测结果，同时将复溶后的实验组2的试剂放置在常温下(18-25℃)，分别在第5天、10天、20天与30天取出进行检测。每次的检测方法为采用实验组1试剂按照实施例2的检测方法对HYPHEN的2个质控品(分别为：UFH Control level2、LWMH Control level2)进行检测，重复测定3次，计算其检测结果的均值，并运用SPSS 17.0软件进行线性回归分析斜率的显著性检验结果如表12与表13所示。结果显示，相比于其他氨基酸与Triton X-100或NP-40的组合，本发明试剂盒的R1试剂中所含赖氨酸与Triton X-100与R2试剂中所含的精氨酸与NP-40的组合，能够有效维持酶活的稳定，使试剂利于冻干，可进一步延长试剂的效期；表13结果表明本发明试剂盒冻干品复溶后可在常温下稳定30天，效期大于市售肝素检测试剂盒(发色底物法)说明书中期限(14天)。

表12不同稳定剂的冻干前后试剂的稳定性情况

表13本发明试剂盒冻干品复溶后在常温条件下的稳定性效果

实施例4与已上市产品的比较

从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙华医院的住院及门诊随机抽取经肝素治疗的病人血液样本共170份。血液按9:1的比例与0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液混匀后，2500r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例1所得本发明试剂盒(实验组1)和STAGO公司

-Liquid Anti-Xa试剂盒(货号：00311)分别对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。结果显示两种试剂盒的相关系数r＝0.9908，线性回归方程为y＝1.0039x-0.0046，见图1。

根据美国临床实验室标准化组织(CLSI)文件的要求(r＞0.975)，本发明试剂盒和法国STAGO公司进口试剂盒的检测数据具有良好的一致性。

实施例5主要组分的浓度范围

首先，分别采用实验组16～实验组17(配方见表14)的试剂按实施例2的检测方法对实施例3中(2)所述的各干扰组分(血红蛋白、胆红素、甘油三酯与PF4)最高的浓度与不含干扰组分的样本(即浓度为0的样本)进行检测，重复测定3次，计算各样本检测结果的均值，结果如表15所示。

其次，将实验组4～实验组17(配方见表14)置于37℃的电热恒温培养箱中，在第0天与第20天取出按实施例2的检测方法对2个质控品(分别为：UFH Control level2、LWMHControl level2)进行检测，重复测定3次，根据其检测结果的均值分别计算第20天与第0天检测结果均值的相对偏差，结果如表16所示。

表15与表16的结果显示：本发明试剂盒中R1试剂中的主要成分S-2732的含量在1.2～3.0mg/mL、赖氨酸的含量在1％～10％、Triton X-100的含量在0.2～0.5mL/L的范围内，其37℃条件下放置20天的稳定性仍符合要求；而本发明试剂盒中R2试剂中主要成分猪FXa的含量在0.1～0.45U/mL、精氨酸的含量在1％～10％、NP-40的含量在0.5～2.0mL/L、氯化镁的含量在0.05～0.25mol/L的范围内，其37℃条件下放置20天的稳定性同样符合要求。此外，氯化镁的含量在0.05～0.25mol/L的范围内时，其抗干扰的能力仍然较好。

表14主要组分的浓度范围的实验组配方

表15不同浓度氯化镁的抗干扰能力的验证结果

表16不同浓度范围的实验组配方的稳定性验证结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种肝素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、Triton X-100、第一缓冲剂；所述R2试剂包含FⅩa、精氨酸、NP-40、氯化镁、第二缓冲剂。

2.根据权利要求1所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，发色底物为S-2732、S-2765与S-2222中的任意一种；

肝素水解酶为肝素酶II或acharan sulfate裂解酶；

第一缓冲剂选自HEPES、Tris-HCl或磷酸盐缓冲物的一种或多种，pH为6.5～9.0。

3.根据权利要求1所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，FⅩa为猪FⅩa或牛FⅩa；

第二缓冲剂选自HEPES、Tris-HCl或磷酸盐缓冲物的一种或多种，pH为6.5～9.0。

4.根据权利要求1所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂还包含第一冻干保护剂，所述第一冻干保护剂选自甘露醇、BSA、PEG6000或抑肽酶中的任意一种或者几种的混合物；

所述R2试剂还包含第二冻干保护剂，所述第二冻干保护剂选自甘露醇、BSA、PEG6000或抑肽酶中的任意一种或者几种的混合物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中各组分的工作浓度为：

所述R2试剂中各组分的工作浓度为：

6.根据权利要求5所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中各组分的工作浓度为：

所述R2试剂中各组分的工作浓度为：

7.根据权利要求1至6中任一项所述的肝素测定试剂盒，其特征在于，R1试剂或R2试剂为液体型试剂或冻干型试剂。

8.一种非诊断目的的肝素含量测定方法，其特征在于，采用权利要求1至7中任一项所述的肝素测定试剂盒对样本进行测定，包括如下步骤：

①将R1试剂与样本混合，于37℃孵育0.5～2分钟；

②向步骤①所得混合物中加入R2试剂，于37℃孵育3～4分钟，读取反应产物于405nm波长下的吸光度值；

③根据已知的标准曲线，得到样本中的肝素含量。

9.根据权利要求8所述的肝素含量测定方法，其特征在于，所述样本为液体样本，R1试剂和R2试剂为液体型试剂，或者R1试剂和R2试剂为冻干型试剂复溶后的试剂，R1试剂、样本与R2试剂的体积比为(1～2):(1～2):(1～2)。

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