JP2002520029A - 哺乳動物のヘパラナーゼをプローブとして用いた潜在的抗転移及び抗炎症薬剤の選抜方法 - Google Patents

哺乳動物のヘパラナーゼをプローブとして用いた潜在的抗転移及び抗炎症薬剤の選抜方法

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ハンナ ベン−アルツィ，
マティー アヤル−ヘルシュコヴィッツ，
イスラエル ヴロダヴスキー，
アイリス ペッカー，
ヨーヴ ペレグ，
ダフナ ミロン，
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インサイトストラテジー アンド マーケティング リミテッド
ハダシット メディカル リサーチ サーヴィシーズ アンド ディヴェロップメント リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 グリコシダーゼ触媒活性を阻害する潜在力について薬剤を試験する定性的及び定量的方法。前記方法はグリコシダーゼ酵素を薬剤の存在下でグリコシダーゼ基質と相互作用させ、グリコシダーゼ基質に関するグリコシダーゼ酵素の触媒活性に対する薬剤の影響を定性的又は定量的に評価するステップを含む。好ましくはグリコシダーゼ酵素はヘパラナーゼ酵素であり、グリコシダーゼ基質はヘパラナーゼ基質である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野及び背景 本発明は新規の定性的及び定量的グリコシダーゼ触媒活性アッセイに関する。
特に本発明は潜在的抗転移及び抗炎症薬剤の選抜方法に関し、更に特異的には哺
乳動物のヘパラナーゼ、好ましくは精製されたヒト組換えヘパラナーゼをプロー
ブとして用いた潜在的抗転移及び抗炎症薬剤の選抜方法に関する。
【０００２】 ヘパラン硫酸プロテオグリカン類（ＨＳＰＧｓ）： ＨＳＰＧｓは脊椎動物及び無脊椎動物の組織の幅広い範囲の細胞の細胞表面及
び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と関連している普遍に存在する巨大分子である
（１−５）。ＨＳＰＧの基本構造はタンパク質コア及びそれに共有結合的に付着
したいくつかの線状ヘパラン硫酸鎖からなる。多糖類の鎖は反復ヘキスロニック
及びＤ−グルコサミンジサッカライド単位（これらはＮ−及びＯ−結合硫酸成分
及びＮ−結合アセチル基で様々な程度に置換されている）から通常なる（１−５
）。細胞付着、増殖及び分化におけるＥＣＭ分子の関与についての研究の結果、
胚の形態形成、血管新生、転移、神経突起伸展及び組織修復におけるＨＳＰＧｓ
の中心的役割が明らかになった（１−５）。ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖は多数のタ
ンパク質に結合するその能力の点で特異的であり、これによって様々なエフェク
ター分子が細胞表面に付着することを確実にする（４−６）。ＨＳＰＧｓは血管
の主要構成成分でもある（３）。太い血管においてはＨＳＰＧｓは最内部中膜及
び内部中膜中に最も集中しているが、毛細血管においてはＨＳＰＧｓは内皮下基
底膜中に主に見出され、そこでそれらは内皮細胞の増殖及び移動を支持し、毛細
血管壁の構造を安定化させる。ＥＣＭ巨大分子（例えばコラーゲン、ラミニン及
びフィブロネクチン）と、及び形質膜の様々な付着部位と相互作用するＨＳＰＧ
ｓの能力はＥＣＭ構成成分の自己集合及び不溶性における、並びに細胞付着及び
移動におけるこのプロテオグリカンの重要な役割を示唆している。それ故、ＨＳ
の開裂は内皮下ＥＣＭの分解をもたらし、従って正常な又は悪性の血液−骨細胞
の血管外遊出における決定的役割を果たすであろう（７−９）。ＨＳ代謝は炎症
、傷修復、糖尿病及び癌転移において観察される。このことはＨＳを分解する酵
素が病気の進行において重要な役割を果たしていることを示唆する。
【０００３】 腫瘍細胞の侵入及び転移におけるヘパラナーゼの関与： 様々な器官の毛細管床において捕縛された循環腫瘍細胞は内皮細胞裏打ちに侵
入し、その横たわる基底膜（ＢＭ）を分解して血管外組織へと逃亡し、そこで転
移を確立するに違いない（１０）。いくつかの細胞酵素（例、コラーゲナーゼIV
、プラスミノーゲンアクチベーター、カテプシンＢ、エラスターゼ）はＢＭの分
解に関与していると考えられている（１０）。これらの酵素の一つがＨＳを特殊
な鎖内部位で開裂するエンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ヘパラナーゼ）であ
る（７，９，１１−１２）。ＨＳ分解ヘパラナーゼの発現はマウスのリンパ球腫
瘍（１１）、線維肉腫及び黒色腫（９）細胞の転移潜在能力と相関があることが
見出された。同じことがヒト胸部、膀胱及び前立腺癌細胞についても当てはまる
（米国特許出願第０９／１０９３８６号及びＰＣＴ／ＵＳ９８／１７９５４参照
。これらはここにその全てが記載されているかの如く参考文献としてここに組入
れる。）。更に、ヘパラナーゼレベルの増大は転移性腫瘍担持動物及び癌患者の
血清（９）及び尿（米国特許出願第０９／０７１７３９号；ＰＣＴ／ＵＳ９９／
０９２５５）において、及び腫瘍生検材料において（１２）検出された。ヘパラ
ナーゼ代替基質及び阻害剤（例、低分子量（ＭＷ）ヘパリン、ラミナリン硫酸の
非抗凝血性種）を用いて実験動物を処理すると、Ｂ１６黒色腫、Lewis肺癌及び
乳腺癌細胞によって誘導される肺転移率を顕著に（＞９０％）減少させた（８，
９，１３）。このことはヘパラナーゼ阻害剤は腫瘍細胞の侵入及び転移を阻害す
るために適用することができるであろうということを示す。
【０００４】 腫瘍の局所的環境による腫瘍進行の制御に関する我々の研究は培養された角膜
及び血管内皮細胞（ＥＣ）によって生成される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と
細胞の相互作用に焦点を合わせている（１４，１５）。このＥＣＭはin vivoで
はその形態的外観及び分子組成の点で内皮下層に極めて似ている。それはコラー
ゲン（主にタイプIII及びIV、加えて少量のタイプＩ及びＶ）、プロテオグリカ
ン（主にヘパラン硫酸−及びデルマタン硫酸−プロテオグリカン、加えて少量の
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ラミニン、フィブロネクチン、エンタ
クチン及びエラスチンを含む（１３，１４）。代謝的に硫酸標識されたＥＣＭと
細胞を相互作用させ、続いて培養培地中へ放出された分解生成物のゲル濾過（Se
pharose 6B）分析を行うことによって、ＥＣＭ中のＨＳを細胞が分解する能力が
調査された（１１）。無傷のＨＳＰＧはカラムの空容量の次に溶出されるが（Ｋ
ａｖ＜０．２，約０．５×１０６のＭｒ）、ＨＳ側鎖の標識された分解フラグメ
ントはカラムのＶｔにより近いところで溶出された（０．５＜Ｋａｖ＜０．８，
約５−７×１０３のＭｒ）（１１）。上述の天然に生成された基底膜様基質をヘ
パラナーゼが分解する能力を有効に阻害する化合物はマウス及びラットにおいて
も実験的転移を阻害することが見出された（８，９，１３，３３）。それ故、ヘ
パラナーゼ阻害化合物についての信頼できるin vitro選抜系が強力な抗転移医薬
を同定して開発するために適用されることができるであろう。
【０００５】 腫瘍血管新生におけるヘパラナーゼの考えられる関与： ヘパラナーゼは細胞移動及び侵入においてのみ作用するのではなく、間接的な
新生血管応答をも引き出すかもしれないということを我々は以前に証明している
（１５）。我々の結果はＥＣＭのＨＳＰＧはβＦＧＦにとっての及びひょっとす
ると他のヘパリン結合増殖促進因子にとっての天然の貯蔵所を提供しているとい
うことを示唆する。それ故、ヘパラナーゼによって媒介されるＥＣＭ中の貯蔵所
からの活性βＦＧＦの放出は正常の及び病気の状況における新生血管形成を誘導
するための新たなメカニズムを提供するかもしれない（６，１８）。
【０００６】 免疫系の細胞によるヘパラナーゼの発現： ヘパラナーゼ触媒活性は免疫系の活性化された細胞が循環を離れて炎症及び自
己免疫応答を引き起こす能力に相関する。血小板、顆粒球、Ｔ及びＢリンパ球、
マクロファージ及びマスト細胞と内皮下ＥＣＭとの相互作用はヘパラナーゼ触媒
活性によるヘパラン硫酸（ＨＳ）の分解と関連している（７）。ヘパラナーゼ酵
素は細胞内区画（例、リソソーム、特殊な顆粒）から様々な活性化シグナル（例
、トロンビン、カルシウムイオノホア、免疫複合体、抗原、マイトジェン）に対
する応答として放出される。このことは炎症部位及び自己免疫傷害におけるその
制御された関与及び存在を示唆する。血小板及びマクロファージによって放出さ
れるヘパラン硫酸分解酵素はアテローム硬化傷害において存在していると思われ
る（１６）。実験動物をヘパラナーゼ代用物質（例、低分子量ヘパリンの非抗凝
血種）で処理すると、実験動物における実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、
アジュバント関節炎及び移植拒絶の発生率が顕著に減少する（７，１７）。この
ことはヘパラナーゼ阻害剤が自己免疫及び炎症病を阻害するために適用されるこ
とができるということを示す（７，１７）。それ故、ヘパラナーゼ阻害化合物に
ついての信頼できるin vitro選抜系は様々な硬化症及び他の炎症病の治療のため
の非毒性抗炎症医薬を同定して開発するために適用されることができるであろう
。
【０００７】 ヘパラナーゼ遺伝子のクローニング及び発現： ヒトの肝がん細胞から単離されたヘパラナーゼの精製画分はトリプシン消化に
曝された。ペプチドは高圧液体クロマトグラフィーによって分離され、微小配列
決定された。ペプチドのうちの一つの配列が対応する逆翻訳されたＤＮＡ配列に
対するホモロジーについてデータベースを検索するために用いられた。この手順
によって９６３塩基対（ｂｐ）のオープンリーディングフレーム及びそれに続く
２７ｂｐの３’非翻訳領域並びにポリＡテールを含む１０２０ｂｐの挿入を含む
クローンが同定された。新規の遺伝子はｈｐａと名付けられた。喪失しているｈ
ｐａの５’端のクローニングは胎盤のｃＤＮＡ混成物からのＤＮＡのＰＣＲ増幅
によって行われた。全ヘパラナーゼｃＤＮＡはｐｈｐａと名付けられた。結合し
たｃＤＮＡフラグメントは計算分子量６１１９２ダルトンの５４３アミノ酸から
なるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。延
長された５’配列のクローニングはMarathon RACEシステムを用いてＰＣＲ増幅
によってヒトのＳＫ−ｈｅｐ１細胞系から可能であった。ＳＫ−ｈｅｐ１ ｈｐ
ａ ｃＤＮＡの５’延長された配列はヒトの胎盤から単離されたｈｐａ ｃＤＮ
Ａの配列と会合した。会合した配列は計算分子量６６４０７ダルトンの５９２ア
ミノ酸からなるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含ん
でいた。クローニングの手順は米国特許出願第０８／９２２１７０号、第０９／
１０９３８６号及び第０９／２５８８９２号及びＰＣＴ／ＵＳ９８／１７９５４
に記載されているのと同様である。これらの文献は全て参考文献としてここに組
入れる。
【０００８】 ｈｐａ遺伝子の生成物がヘパラン硫酸（ＨＳ）のin vitroでの分解を触媒する
能力はｈｐａのオープンリーディングフレーム全体をHigh five及びＳｆ２１昆
虫細胞及び哺乳動物のヒト２９３胚腎臓細胞系発現系において発現させることに
よって調べられた。感染させられた細胞の抽出物はヘパラナーゼ触媒活性につい
てアッセイされた。この目的のため、細胞溶解物は硫酸標識されたＥＣＭ由来Ｈ
ＳＰＧ（ピークＩ）と共にインキュベートされ、次に反応混合物はゲル濾過分析
（Sepharose 6B）された。基質単独では高分子量物質からなるが、ＨＳＰＧ基質
をｈｐａを含むウィルスによって感染させられた細胞の溶解物と共にインキュベ
ートすると高分子量の基質は低分子量の標識されたヘパラン硫酸分解フラグメン
トへと完全に変換された（米国特許出願第０８／９２２１７０号；第０９／１０
９３８６号；及び第０９／２５８８９２号；及びＰＣＴ／ＵＳ９８／１７９５４
）。
【０００９】 続く実験においては標識されたＨＳＰＧ基質は感染させられたHigh Five及び
Ｓｆ２１細胞の培養培地と共にインキュベートされた。ヘパラナーゼ触媒活性（
これは高分子量ＨＳＰＧ基質の低分子量ＨＳ分解フラグメントへの変換によって
反映される）はｐＦｈｐａウィルスによって感染された細胞の培養培地中には見
出されたが、コントロールのｐＦ１ウィルスによって感染された細胞の培養培地
中には見出されなかった。
【００１０】 総合すると、これらの結果はヘパラナーゼ酵素は新規に同定されたヒトｈｐａ
遺伝子を含むバキュロウィルスで感染された細胞又は哺乳動物の発現ベクターに
よって活性型で発現されるということを示す。
【００１１】 他の実験においてはｐＦｈｐａウィルスによって感染された細胞によって発現
されるヘパラナーゼ酵素は天然に生産される無傷のＥＣＭ中に存在する他の巨大
分子構成成分（例、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン）に複合体化され
たＨＳを高度に転移性の腫瘍細胞又は免疫系の活性化された細胞について報告さ
れている（７，８）のと同様の方法で分解することができることが証明された。
【００１２】 組換えヘパラナーゼ酵素の精製： Ｓｆ２１昆虫細胞はｐＦｈｐａウィルスで感染され、培養培地はヘパリン−Se
pharoseカラム上に適用された。画分は塩勾配（０．３５−２．０Ｍ ＮａＣｌ
）で溶出され、ヘパラナーゼ触媒活性及びタンパク質特性（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及
びそれに続く銀染色）について試験された。ヘパラナーゼ触媒活性はｈｐａ遺伝
子生成物の予測される分子量と一致する画分１９−２４における約６３ｋＤａタ
ンパク質バンドの出現と相関する。ヘパリン−Sepharoseから溶出された活性画
分は収集され、濃縮され、Superdex 75 FPLCゲル濾過カラム上に適用された。各
画分から少量がヘパラナーゼ触媒活性及びタンパク質特性について試験された。
画分４−７における主要タンパク質（分子量約６３ｋＤａ）の出現とヘパラナー
ゼ触媒活性の間には相関が見出された。このタンパク質は同一の精製プロトコー
ルに供されたコントロールの非感染Ｓｆ２１細胞によって調節された培地中には
存在しなかった。最近、ソース−Ｓイオン交換カラムを有する単一ステップクロ
マトグラフィーを用いる追加の精製プロトコールが適用された。この精製により
９０％もの精製度の精製タンパク質が得られた。この精製手順についての更なる
詳細は米国特許出願第０９／０７１７３９号及び第０９／０７１６１８号；及び
ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２５５に記載されている。これらの文献はすべて完全に
ここに記載されているかの如くここに参考文献として組入れる。
【００１３】 選抜目的のための組換えヘパラナーゼ： ヘパラナーゼ触媒活性の阻害剤の同定及び開発を目的とする研究に存在する不
利は精製された高活性のヘパラナーゼ酵素を常時得る供給源がないこと、及び信
頼性がある選抜系がないことである。我々が近年行ったヒトのヘパラナーゼをコ
ードする遺伝子のクローニング、発現及び精製は、抗ヘパラナーゼ抗体及びヘパ
ラナーゼを阻害することができる化合物（この化合物は従って腫瘍転移、自己免
疫及び炎症病を阻害することができる薬剤を同定して開発するために適用するこ
とができる。）の選抜のための活性組換え酵素の最も好適で信頼性のある供給源
を初めて提供するものである。
【００１４】 組合せライブラリーを用いた特異的阻害剤の選抜： 特異的な生物学的活性の選抜のため、合理的な薬剤開発を目的とする新規な手
法が最近開発されている。その新規な手法によれば、化学的に多様な分子の巨大
なライブラリーが所望の生物学的活性について選抜される。この新規な手法は効
果的であることが分かってきたので、今では新規薬剤の発見のための重要な道具
となっている。この新規な手法は、所望の生物学的活性に関連していると予測さ
れるいくつかの成分が体系的に変化される多様な分子の「組合せ（combinatoria
l）」合成に基づいている。所望の生物学的活性化合物を選抜するために天然抽
出物を使用する代わりに組合せライブラリーを用いることの利点は、ライブラリ
ーに含まれる成分は全て前もって知られているということである（５０）。
【００１５】 組合せ選抜においては、発見された当たりの数は試された分子の数に比例する
。このことは標的に関する知識を利用することができない場合においても本当で
ある。高処理能力比の選抜手法を含む適切なアッセイ（そこでは実験の自動化及
びロボット化を適用することができるであろう）が存在しさえすれば、多数の化
合物（一日当たり数千の化合物を試すこともできるであろう）を選抜することが
できる。
【００１６】 従来技術のヘパラナーゼ触媒活性アッセイ： ヘパラナーゼ触媒活性を測定する方法は何年もの間にいくつか開発されている
。これらの様々な方法は全て基質の放射能標識化（上述の通りin vitroで又は代
謝的に）、及びヘパラナーゼ触媒活性によって放出されたその分解生成物の分析
に基づいている。これらの従来技術の方法は以下のようないくつかの欠点及び制
限を有する。
【００１７】 第一に触媒活性の測定は定性的であり、定量的ではない。これは以下の二つの
理由のためである；（ｉ）放射能標識は基質鎖に沿って均等には広がらないので
放射能は活性に正確には相関しないかもしれない；（ii）ヘパラナーゼ基質は長
い基質鎖であるので、放出された生成物はヘパラナーゼの基質であるかもしれな
いが従来技術の方法によっては放出された生成物の開裂現象は監視することがで
きない。更に、基質鎖の小部分の複数回の開裂現象を少ない数の開裂現象と区別
することができず、長い基質鎖と区別することもできない。従って多くの場合、
酵素によって触媒される開裂現象を基質鎖の長さに応じて検出することは不可能
であり、このことはアッセイの線型性に影響を与える。
【００１８】 第二に、従来技術の方法はわずらわしくて時間がかかり、しかも多数のサンプ
ルを同時に活性測定することができない。多くの場合、放射能標識された基質の
調製及び未開裂の基質からの分解生成物の分離は長くて複雑な手順を要し、しか
も放射能材料の取扱いは厳格で安全な手順を要する。
【００１９】 第三に、ヘパラナーゼ触媒活性を測定するための従来技術の方法は全て、グル
コサミン残基におけるヨウ素化による、又は部分的にＮ−脱硫酸化された基質の
Ｏ−又はＮ−アセチル化による基質の変性を含む。かかる手順はヘパラナーゼ開
裂部位をマスクするか又は代わりに新しいヘパラナーゼ部位を生成するかもしれ
ない。
【００２０】 異なる従来技術の方法もそれぞれに特異的に関連した特異的な欠点を有する。
いくつかの方法はＥＣＭ関連ＨＳＰＧの生合成的放射能標識及び標識されたＥＣ
Ｍから放出される放射能標識材料のゲル濾過分析によるＨＳ鎖分解の検出を含む
（７，３７）。これらのアッセイにおいては生成物の検出はプロテアーゼとヘパ
ラナーゼの相乗的活性を必要とする。プロテアーゼはＨＳ鎖をヘパラナーゼによ
る開裂に曝すために必要である。
【００２１】 他の方法は化学的に又は生合成的に放射能標識されたヘパラナーゼ基質鎖を固
定することを含む（３８，３９，４０）。これらの方法の主な欠点は固定された
基質は酵素にとって接近しにくいかもしれないということである。
【００２２】 Freeman及びParishによって最近開発されたヘパラナーゼ触媒活性アッセイ（
４１）においては生成物はニワトリのヒスチジンに富む糖タンパク質（ｃＨＲＧ
）セファロースに結合させることによって基質から分離される。この方法におい
てはｃＨＲＧセファロースに結合する能力を失った最小分子量の生成物のみが検
出可能であり、基質と共にカラムに結合する分子量が大きな生成物は除外される
。
【００２３】 ヘパラナーゼがその基質に作用する機構はまだ未知であり、ある鎖はまず長鎖
に開裂されて次に小フラグメントへと分解されるかもしれず、一方他の鎖はその
端で直接開裂されて小フラグメントを形成するかもしれない。従ってFreeman及
びParishによる方法は全ての開裂生成物を検出することはできず、従ってヘパラ
ナーゼ触媒活性をアッセイする他のすべての従来技術の方法と同様にそれは定量
的というよりむしろ定性的である。
【００２４】 定量的ヘパラナーゼ触媒活性アッセイの欠如は、定性的な従来技術の方法を用
いた場合に単一サンプルを分析するために必要な時間及び人員の問題と相俟って
多数のサンプルを同時にアッセイすることができる迅速な定量的ヘパラナーゼ触
媒活性アッセイの必要性を強調する。
【００２５】発明の概要 本発明の第一の側面によれば、薬剤の存在下で組換えヘパラナーゼ酵素をヘパ
ラナーゼ基質と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラ
ナーゼ酵素の触媒活性に対する薬剤の影響を評価するステップを含む、ヘパラナ
ーゼ触媒活性を阻害する潜在力について薬剤を試験する方法が提供される。
【００２６】 本発明の別の側面によれば、個別反応における以下のステップを含む、ヘパラ
ナーゼ触媒活性を阻害し、従って腫瘍転移、自己免疫及び炎症病を潜在的に阻害
する薬剤の選抜方法が提供される：各々の薬剤の存在下で組換えヘパラナーゼ酵
素をヘパラナーゼ基質と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換
えヘパラナーゼ酵素の触媒活性に対する各々の薬剤の影響を評価する。
【００２７】 本発明の更に別の側面によれば、薬剤の存在下でグリコシダーゼ酵素をグリコ
シダーゼ基質と相互作用させ、前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダ
ーゼ酵素の触媒活性に対する薬剤の影響を定量的に評価するステップを含む、グ
リコシダーゼ触媒活性を阻害する潜在力について薬剤を試験する定量的方法が提
供される。好ましくはグリコシダーゼ酵素はヘパラナーゼ酵素であり、グリコシ
ダーゼ基質はヘパラナーゼ基質である。
【００２８】 本発明の更に別の側面によれば、個別反応における以下のステップを含む、ヘ
パラナーゼ触媒活性を阻害し、従って腫瘍転移、自己免疫及び炎症病を潜在的に
阻害する薬剤の選抜方法が提供される：各々の薬剤の存在下でヘパラナーゼ酵素
をヘパラナーゼ基質と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記ヘパラ
ナーゼ酵素の触媒活性に対する各々の薬剤の影響を定量的に評価する。
【００２９】 本発明の更に別の側面によれば、組換えヘパラナーゼ酵素をヘパラナーゼ基質
と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の
触媒活性を評価するステップを含む、ヘパラナーゼ触媒活性の試験方法が提供さ
れる。
【００３０】 本発明の更に別の側面によれば、グリコシダーゼ酵素をグリコシダーゼ基質と
相互作用させ、前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素の触媒
活性を定量的に評価するステップを含む、グリコシダーゼ触媒活性の定量的試験
方法が提供される。
【００３１】 以下に記述する本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、グリ
コシダーゼ又はヘパラナーゼ（組換えヘパラナーゼを含む）はそれぞれ独立して
ヒト起源である。
【００３２】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、ヘパラナーゼは天
然のヘパラナーゼである。
【００３３】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記組換えヘパラ
ナーゼは昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞発現系及び酵母細胞発現系からなる群か
ら選択される発現系中で発現される。
【００３４】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記基質は放射能
標識されている。
【００３５】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記放射能標識さ
れた基質はin vitro放射能標識法及び代謝的放射能標識法からなる群から選択さ
れる放射能標識法によって放射能標識されている。
【００３６】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記基質は細胞外
マトリックス又はその一部分である。
【００３７】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記基質は前記細
胞外マトリックスと関連した巨大分子を含む。
【００３８】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記巨大分子はヘ
パラン硫酸プロテオグリカンを含む。即ち、前記基質は細胞外マトリックス由来
の可溶性ヘパラン硫酸プロテオグリカンを好ましくは含む。
【００３９】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記基質はヘパラ
ン硫酸、ヘパリン、ヘパリンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選
択される。
【００４０】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記基質は固体支
持体、例えばヘパリン−セファロースに固定されている。
【００４１】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、薬剤は抗ヘパラナ
ーゼ抗体を含む。
【００４２】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、薬剤は天然に生じ
た薬剤を含む。
【００４３】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、薬剤は合成薬剤又
は合成薬剤のライブラリーを含む。
【００４４】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記合成薬剤は類
似薬剤の組合せライブラリーに属する複数の薬剤の内の一つである。
【００４５】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記ヘパラナーゼ
基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の触媒活性に対する薬剤の前記影響の
評価は、前記ヘパラナーゼ基質の分解生成物の検出に適合したサイズ分離アッセ
イによって行われる。
【００４６】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記サイズ分離ア
ッセイはゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーからなる群から選択される
。
【００４７】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記グリコシダー
ゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素の触媒活性の定量的評価は、前記グリコ
シダーゼ基質の分解生成物と関連する還元成分の検出に適合したアッセイによっ
て行われる。
【００４８】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記グリコシダー
ゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素の触媒活性の定量的評価は比色アッセイ
によって行われる。
【００４９】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記ヘパラナーゼ
基質に関する前記ヘパラナーゼ酵素の触媒活性の定量的評価は、前記ヘパラナー
ゼ基質の分解生成物と関連する還元成分の検出に適合したアッセイによって行わ
れる。
【００５０】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記アッセイは還
元糖アッセイである。
【００５１】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記比色アッセイ
はテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホルマザン塩へと還元されるテトラゾリウ
ムブルーアッセイである。
【００５２】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記方法は酵素濃
度の範囲内で実質的に線型にふるまう。
【００５３】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記方法は時間の
範囲内で実質的に線型にふるまう。
【００５４】 記述される好ましい実施態様における更なる特徴によれば、前記比色アッセイ
はカルバゾールアッセイ及びメチレンブルーアッセイからなる群から選択される
。
【００５５】 本発明は一つの側面において新規の比色定性的及び定量的ヘパラナーゼ（及び
他のグリコシダーゼ）活性アッセイを提供することによって従来技術の欠点を補
足することに成功する。定性的アッセイは固定化された基質（例、ヘパリン−セ
ファロース）に作用するヘパラナーゼ触媒活性によって放出された生成物の完全
な加水分解物中のウロン酸（例、イズロン酸）の比色検出に基づいているか又は
固定された基質から同様に放出される硫酸化グルコサミノグリカンの比色検出に
基づいている。それ故、それはサイズ分離を必要とする放射能方法と比較して実
施しやすく、しかも放射能方法と同様に粗酵素抽出物並びに精製酵素の活性検出
に適用可能である。
【００５６】 定量的アッセイはグリコシダーゼによる多糖類（例えばヘパリン又はヘパラン
硫酸が挙げられるが、これらに限定されない）の開裂によって生成する新規に形
成された還元末端の検出に基づいている。従ってこのアッセイは単一の開裂現象
を全て検出し、酵素の及びその阻害剤／活性化剤の活性触媒定数を推定するのに
用いることができる。新規のアッセイによれば多数の異なる薬剤を同時に酵素に
対するそれらの阻害効果について有効に選抜することができる。特に、これらの
アッセイは例えば基質としてのヘパラン硫酸又はヘパリンと組合せた組換えヘパ
ラナーゼの使用によってヘパラナーゼ及び他のグリコシダーゼの潜在的阻害剤を
選抜するために用いることができる。
【００５７】図面の簡単な説明 本発明は以下、添付の図面を参照して例示のためだけに説明される。図中：
【００５８】 図１はヘパラナーゼ触媒活性のポリアクリルアミドゲル分析を示す。ヘパリン
及びヘパラン硫酸はヒト組換えヘパラナーゼ酵素と共にインキュベートされた（
２４時間、３７℃、ｐＨ５．４）。インキュベーション後、分解生成物はアクリ
ルアミドゲル上で分画され、メチレンブルーで染色された。レーンＡ−ヘパリン
コントロール；レーンＢ−組換えヘパラナーゼと共にインキュベートされたヘパ
リン；レーンＣ−ヘパラン硫酸コントロール；レーンＤ−組換えヘパラナーゼと
共にインキュベートされたヘパラン硫酸。
【００５９】 図２ａ−ｂはヘパリンによるヘパラナーゼ触媒活性の明らかな阻害を示す。組
換えヘパラナーゼは５μｇ／ｍｌヘパリンの不在下で（ピークII，●）及び存在
下で（ピークＩ，△）硫酸標識されたＥＣＭ（図２ａ）又は硫酸標識されたＥＣ
Ｍ由来可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ物質、図２ｂ，◇）と共にインキュベートされ
た（２４時間、３７℃、ｐＨ６．６）。硫酸標識された分解生成物はSepharose
6B上でゲル濾過によって分析された。
【００６０】 図３は硝酸脱アミノ化に対するピークII物質の感受性を示す。硫酸標識された
ＥＣＭ由来可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ物質）は１ｍｌの総容量の組換えヘパラナ
ーゼと共にインキュベートされた（３７℃、２時間、ｐＨ６．２）。反応混合物
（０．５ｍｌ）は硝酸脱アミノ化に供された（０．２４Ｍ ＮａＮＯ３含有１．
８Ｍ酢酸、８０分、２４℃）。基質（■；ＳＳ６８）、未処理のピークII物質（
△；＋Ｒｅ−ｈ＃２ Ｈｅｐ５，６０’）及び硝酸処理されたピークII物質（○
；＋Ｒｅ−ｈ＃２ Ｈｅｐ５＋Ｎ．酸）はSepharose 6Bカラム上でのゲル濾過に
供された。
【００６１】 図４は様々なサイズのヘパリン由来オリゴサッカライドによるヘパラナーゼの
阻害を示す。硫酸標識されたＥＣＭは１μｇ／ｍｌのヘパリンフラグメント（８
４５８８−フラグミン）又はヘパリンの硝酸脱重合体化によって調製された均一
サイズのテトラ及びテトラデカサッカライド（それぞれ９０４２０−４単位及び
１９４２０−１４単位）の存在下又は不在下（コントロール）で組換えヘパラナ
ーゼと共にインキュベートされた（３７℃、２４時間、ｐＨ６．２）。インキュ
ベーション培地中へ放出された硫酸標識された物質はSepharose 6Bカラム上での
ゲル濾過によって分析された。
【００６２】 図５はヘパリンフラグメントの化学的に変性された種によるヘパラナーゼの阻
害を示す。硫酸標識されたＥＣＭは１μｇ／ｍｌのヘパリンフラグメント（８４
５８８−フラグミン）、完全に脱硫酸化された（Ｎ−、Ｏ−）ヘパリンフラグメ
ント（７０３３４−Ｎ／Ｏ）及びＮ−硫酸がアセチル基（７０４２１，Ｎ−アセ
チル）又はヘキサノイル基（７０９０１，Ｎ−ヘキサノイル）で置換された各種
のヘパリンフラグメントの存在下で又は不在下（コントロール）で組換えヘパラ
ナーゼと共にインキュベートされた（３７℃、２４時間、ｐＨ６．２）。インキ
ュベーション培地中へ放出された硫酸標識された物質はSepharose 6B上でのゲル
濾過によって分析された。
【００６３】 図６ａ−ｃは合成ポリアニオン性ヘパリン模倣化合物によるヘパラナーゼ阻害
を示す。硫酸標識されたＥＣＭ由来の可溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ物質，■）は１
，５又は１０μｇ／ｍｌヘパリン（図６ａ）；化合物Ｐ−９７１００（図６ｂ）
；又は化合物ＲＧ−１３５７７（図６ｃ，○；■；Ｄ）の存在下又は不在下（●
）で組換えヘパラナーゼと共にインキュベートされた（３７℃、２４時間、ｐＨ
６．２）。硫酸標識された分解生成物はSepharose 6B上でのゲル濾過によって分
析された。
【００６４】 図７ａ−ｂは硫酸化されていないヘパリン模倣化合物及び硫酸化されたヘパリ
ン模倣化合物によるヘパラナーゼの阻害を示す。硫酸標識されたＥＣＭ由来の可
溶性ＨＳＰＧ（ピークＩ物質）は０．１，０．５又は１μｇ／ｍｌの化合物Ｐ−
９７１００（図７ａ）；又は化合物ＡＶ−１／９−１（図７ｂ）の存在下又は不
在下（コントロール）で組換えヘパラナーゼと共にインキュベートされた（３７
℃、２４時間、ｐＨ６．２）。硫酸標識された分解生成物はSepharose 6B上での
ゲル濾過によって分析された。
【００６５】 図８は基質としてのヘパリン−セファロースを用いたヘパラナーゼ触媒活性の
ポリアクリルアミドゲル分析を示す。ヘパリン−セファロースは組換えヘパラナ
ーゼの存在下又は不在下でインキュベートされた（３７℃、２４時間、ｐＨ５．
４）。生成物はメチレンブルーで染色された未変性のアクリルアミドゲル上での
分画によって分析された。レーンＡ−ヘパリンセファロースコントロール。レー
ンＢ−組換えヘパラナーゼと共にインキュベートされたヘパリン−セファロース
。ヘパラナーゼ触媒活性は基質と比較した生成物の移動度におけるシフトとして
可視化することができる。
【００６６】 図９ａ−ｂは固定されたヘパリン及びカルバゾール又はジメチルメチレンブル
ー比色アッセイを用いた、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞によって発現さ
れる組換えヘパラナーゼ触媒活性の測定を示す。ヘパリン−セファロースは昆虫
細胞中で発現されて部分的に精製された組換えヘパラナーゼ２０μｌ（０．５μ
ｇ）（棒として表示）又はヒトヘパラナーゼを発現する哺乳動物細胞の増大する
量の抽出物（●）と共にインキュベートされた（３７℃、１７時間、ｐＨ５．４
）。反応生成物はカルバゾールアッセイを用いて分析された。結果は一分間当た
りのグルクロノラクトン当量単位で表される（図９ａ）。ヘパリンセファロース
は昆虫細胞中で発現されて部分的に精製された組換えヘパラナーゼの増大する量
（０．５−１．５μｇ）（●）又は形質転換された酵母細胞から分泌された酵素
（棒として表示）と共にインキュベートされた（３７℃、１７時間、ｐＨ５．４
）。反応生成物はジメチルメチレンブルーアッセイを用いて分析された（図９ｂ
）。結果は一分間当たりのｎｇヘパリンとして表される。
【００６７】 図１０は比色テトラゾリウムブルーアッセイを用いた酵素量の関数としてのヘ
パラナーゼ触媒活性を示す。ヘパラン硫酸は昆虫細胞中で発現されて部分的に精
製されたヘパラナーゼの増大量（０．２５−４μｇ）と共にインキュベートされ
た（３７℃、６時間、ｐＨ５．４）。酵素活性の生成物はテトラゾリウムブルー
アッセイを用いて定量された。結果は一分間当たりのｎｇグルコース当量単位で
表される。各データの点は三つの独立した反応の平均を表す。
【００６８】 図１１はテトラゾリウムブルーアッセイを用いたインキュベーション時間の関
数としてのヘパラナーゼ触媒活性を示す。ヘパラン硫酸は昆虫細胞中で発現され
て部分的に精製された組換えヘパラナーゼ３μｇと共に増大するインキュベーシ
ョン期間（２，４，６，２４時間）の間インキュベートされた（３７℃、ｐＨ５
．４）。酵素活性の生成物はテトラゾリウムブルーアッセイを用いて定量された
。結果はｍｇタンパク質当たりのμｇグルコース当量（ＧＥ）で表される。各デ
ータの点は三つの独立した反応の平均を表す。
【００６９】 図１２はテトラゾリウムブルーアッセイを用いた様々な潜在的ヘパラナーゼ阻
害剤の選抜を示す。ヘパラン硫酸は１０μｇ／ｍｌの潜在的阻害剤（図に示され
る通り）の存在下又は不在下（−阻害剤）で３μｇの組換えヘパラナーゼと共に
インキュベートされた（３７℃、１７時間、ｐＨ５．４）。反応生成物はテトラ
ゾリウムブルーアッセイを用いて分析された。活性は基質ヘパラン硫酸、酵素及
び潜在的阻害剤を含む反応のＯ.Ｄ.から基質を欠く同一反応のＯ.Ｄ.を差し引い
たΔＯ.Ｄ.として計算された。基質ヘパラン硫酸によって寄与されるＯ.Ｄ.も差
し引かれた。結果はミリグラムタンパク質当たりのグルコース当量単位における
比活性として表される。各データの点は三つの独立した反応の平均を表す。
【００７０】好ましい実施態様の記述 本発明は潜在的な抗転移及び抗炎症薬剤の同定に用いることができるヘパラナ
ーゼ阻害剤の選抜方法である。特に本発明はヘパラナーゼ触媒活性をアッセイす
るための新規の定性的及び定量的比色アッセイを提供する。
【００７１】 本発明による方法の原理及び操作は添付の図面及びそれに伴う説明を参照する
ことによってより良く理解されるであろう。
【００７２】 本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は以下の説
明に規定される又は図面に表される構成要素の構築及び配置の詳細に対するその
適用に限定されるわけではないということは理解されるべきである。本発明は他
の実施態様でも可能であるし、又は様々な方法で実施することができる。又、こ
こで用いる表現及び用語は説明のためのものであり、限定要因とみなされるべき
ではないことも理解されるべきである。
【００７３】 いくつかの研究によれば、正常な細胞又は腫瘍細胞によって発現されるヘパラ
ナーゼ触媒活性はヘパリン、ヘパリンの変性された非抗凝血性種及び他の硫酸化
された多糖類（例、ペントサンポリスルフェート）及びポリアニオン性分子（オ
リゴヌクレオチド）によって有効に阻害されることができることが示されている
（８，９，１３，２３）。更にこれらの化合物のヘパラナーゼ阻害活性と実験動
物において腫瘍転移及び炎症病を阻害するそれらの能力の間には合理的な良い相
関があった（８，１３，１７）。
【００７４】 ヘパラナーゼ酵素活性に対するヘパリンの阻害効果は図１に示す通りヘパリン
が酵素の代替基質であるために生ずると推定されている。酵素により接近しやす
い代替基質の存在はヘパラナーゼによるＥＣＭ異化作用を減少させ得るであろう
。
【００７５】 阻害性化合物の多くは抗凝血性であるが、分子における抗転移及び抗炎症潜在
力はそれらの抗凝血活性とは相関しなかった（８，１３，１７，３２）。更に、
阻害性多糖類は血管内皮への腫瘍細胞の接着に影響を与えなかった（３３）。Pa
rish等（１３）は硫酸化された多糖類は腫瘍細胞による血管内皮及びその下に横
たわる基底膜の貫通に関わる腫瘍細胞由来のヘパラナーゼを阻害することによっ
てラットの乳腺癌細胞の転移拡大を阻害することを示した（１３）。それ故、ヘ
パラナーゼ阻害分子を選抜するための好適なツールの開発は極めて重要である。
【００７６】 実施例セクションにおいて記述される結果は粗及び精製されたヒト組換えヘパ
ラナーゼを用いてかつ単純な比色アッセイを用いて抗ヘパラナーゼ触媒活性につ
いてポリアニオン性分子、ヘパリンの化学的に変性された種、脱重合体化された
ヘパリン由来の均一サイズのオリゴサッカライド、小分子及び合理的に設計され
た分子のライブラリーを選抜することの実施可能性を強調する。
【００７７】 ヘパラナーゼによって媒介される無傷のＥＣＭにおけるヘパラン硫酸の分解を
阻害する化合物はＢ１６黒色腫、及び胸部癌の肺転移増殖の強力な阻害剤でもあ
ることが見出された（８）（以下の表１参照）。これらの化合物はいくつかの炎
症病をも阻害し（７，１７）、ここで記述する選抜方法の臨床上の重要性を強調
した。
【００７８】
【表１】
【００７９】 Ｂ１６−ＢＬ６黒色腫細胞の肺転移増殖に対するヘパリン種の影響。Ｃ５７Ｂ
Ｌマウスは４００μｇ／ｍｌのヘパリンフラグメント、Ｎ−ヘキサノイルヘパリ
ンフラグメント、ヘパリン由来のテトラサッカライド、ヘパリン由来のテトラデ
カ−サッカライド、又は完全に脱硫酸化されたフラグミンの単回皮下注射を受け
、続いてＢ１６−ＢＬ６細胞（１０５細胞／マウス）を腹腔内接種された。１５
日後、マウスは屠殺され、肺はBouenの溶液中で固定された。
【００８０】 我々はヘパラナーゼ及び腫瘍転移の阻害は１４以上の糖単位を含有するヘパリ
ン種であってＮ及びＯ位置の両方に硫酸基を有するヘパリン種によって達成され
ることをここで示した（８）。低程度の硫酸化オリゴサッカライドは同一サイズ
の中程度及び高程度の硫酸化画分よりもヘパラナーゼ阻害剤としての効果が劣る
。Ｏ−脱硫酸化はヘパリンのヘパラナーゼ阻害効果を失わせたのに対し、Ｎ−ア
セチル化又はＮ−ヘキサノイルヘパリンは、Ｎ−置換分子が約４０００ダルトン
以上の分子サイズを持つ場合には高阻害活性を保持していた（８）。
【００８１】 我々はＮ−硫酸基の存在はヘパリン種によるＥＣＭ結合βＦＧＦの放出の必須
要件であることを以前に示している（２０）。Ｎ−硫酸基をアセチル基又はヘキ
サノイル基で完全に置換するとＯ−硫酸基の正常含有量にもかかわらず、ヘパリ
ンのβＦＧＦ放出活性がほぼ完全に阻害されることが見出された（２０）。ヘパ
ラナーゼ触媒活性及び肺転移増殖の阻害とは異なり、ＥＣＭ結合βＦＧＦのほぼ
極大の放出がオクタサッカライドによって既に得られた。一方、重量基準で比較
した場合、テトラサッカライドは無傷のヘパリンの活性の約４０％を示した（２
０）。ヘパリンの抗トロンビン活性（抗−因子Ｘａ活性）とその抗転移及びβＦ
ＧＦ−放出活性の間には相関が見出されなかった。このことは抗トロンビンIII
に対する抗凝血性ヘパリンの結合に責任のある特異的ペンタサッカライド配列は
ヘパラナーゼの阻害及びＥＣＭ結合βＦＧＦの放出には必要でないということを
示唆する。
【００８２】 ヘパリン又はヘパラン硫酸プロラオグリカンはβＦＧＦの受容体結合及びマイ
トジェン活性に関与している（３４，３５）。我々は細胞表面ＨＳＰＧを欠くＣ
ＨＯ突然変異体細胞及び可溶性βＦＧＦ受容体アルカリホスファターゼ融合タン
パク質の両方を用いてヘパリンの様々な種及びＨＳがβＦＧＦ受容体結合を促進
する能力を以前に研究した（３６）。Ｏ−硫酸化及びＮ−結合硫酸基の相乗効果
に対する絶対的要求があった。ヘパリンのこれらの構造的特徴は細胞表面及びＥ
ＣＭ上のＨＳに結合したβＦＧＦの置換のために十分なものとは異なる（２０）
。
【００８３】 まとめると、これらの結果はヘパリンの様々な効果が様々な糖配列によって媒
介されるということ、及び特殊なヘパリン様分子が特異的な機能を引き出すか又
は阻害するために設計できるということを示す。例えばヘパリンのＮ−置換種、
特にＮ−ヘキサノイルヘパリンフラグメントは未変性のヘパリンよりも腫瘍転移
を阻害するために適用することができる。何故ならそれらのヘパラナーゼ触媒活
性の効果的な阻害は細胞及びＥＣＭからの活性βＦＧＦの有意な放出とは関連し
ていないからである。
【００８４】 それ故、これらの化合物は、βＦＧＦ放出に対する応答である新生血管形成の
潜在的誘導をほとんど又は全く伴わずに、ヘパラナーゼ触媒活性の阻害と相関す
る転移形成及び炎症病を阻害すると予想される。同様に我々が合成したポリアニ
オン性化合物も好適な選抜系が適用されるならば様々な活性を発揮するであろう
。ここで示す通り、組換えヘパラナーゼ酵素及び特殊なヘパラナーゼアッセイ系
は特異的なヘパラナーゼ阻害薬剤を同定するために用いることができる。次に最
も強力な化合物がin vivoでの臨床効力について試験されるであろう。
【００８５】 放射能標識された基質を使用するアッセイは化合物の阻害効果とそれが代替基
質であることを区別することができない。これらのアッセイにおいては放射能標
識された生成物のみが検出され、代替基質の標識されていない生成物は検出する
ことができない。我々は単純で便利な半定量ゲル分析を改良した（４８）。そこ
では基質並びにヘパラナーゼ触媒活性を介して媒介されるその分解生成物がゲル
上に可視化されることができる。この方法はヘパラナーゼ触媒活性を定性的に同
定するために使用することができるし、酵素による基質利用を検査するための単
純なツールとしても使用することができる。
【００８６】 提示されている他の方法は固定された基質（ヘパリン−セファロース）の使用
及び比色カルバゾール又はジメチルメチレンブルーアッセイによる可溶性反応生
成物の検出である。同様に、基質はカルボ又はヒドラジドプレートの如きマイク
ロプレートに固定することもできる（４９）。これらの方法の利点は活性が精製
された酵素に限らずいかなる源の酵素を用いても測定できるということである。
更に、これらの方法は放射能標識された基質を使用せず、従ってサイズ分離の必
要がない。しかしこれらの方法は元来定性的である。というのも、例えばカルバ
ゾールアッセイにおいては検出は固定された基質に作用するヘパラナーゼによっ
て放出される生成物の完全な加水分解物中に存在するウロン酸（例、イズロン酸
）の検出であるからである。ジメチルメチレンブルーアッセイも固定された基質
から放出される硫酸化されたグリコサミノグリカンをそれらのサイズにかかわら
ず検出するのでやはり定性的である。
【００８７】 ヘパラナーゼ触媒活性を検出するために開発された従来のアッセイは基質の放
射能標識を利用する。これらのアッセイはすべて定量的ではなく、正確ではない
。それらは時間がかかり、多数の阻害剤の迅速な選抜には好適でない。ここで我
々は酵素の各開裂作用によって生成される新たに作られた還元末端の検出に基づ
くアッセイを更に記述する。
【００８８】 このアッセイは既存のアッセイに比べていくつもの利点を有する。定性的カル
バゾール及びジメチルメチレンブルーアッセイに比べてもいくつもの利点を有す
る。
【００８９】 第一に、このアッセイは酵素の各開裂作用によって生成される新たに作られた
還元末端の検出によるヘパラナーゼ触媒活性の正確な定量を可能にする。
【００９０】 第二に、このアッセイは迅速で時間がかからず、単純であり、基質の調製や基
質からの反応生成物の分離という時間がかかる困難な工程を含まない。
【００９１】 第三に、基質が可溶性であるので酵素が接近しやすい。
【００９２】 第四に、基質はヘパラナーゼの新規開裂部位をマスク又は生成するかもしれな
い変性を受けないで使用される。
【００９３】 第五に、この方法は放射性物質又は危険物質を使用しない。
【００９４】 第六に、この方法は多数のサンプルの同時選抜を可能にする。
【００９５】 第七に、この方法は従来の研究室設備（例、９６ウェルマイクロプレート、マ
イクロプレート読み取り機）を利用する。
【００９６】 第八に、この方法は与えられた化合物の阻害活性とそれが代替基質であること
を区別する。
【００９７】 これらの利点は全てこのアッセイを組換え哺乳動物ヘパラナーゼを用いた潜在
的抗転移及び抗炎症阻害剤の選抜用に極めて好適なものにする。
【００９８】 アッセイの感度を増大させるため、ヘパラナーゼによって生成された新たに作
られた還元末端は、ベンザミジン（４７）又はＡＮＴＳ（４４，４５，４６）の
如き還元により蛍光のシフトを与える化合物との蛍光反応を用いて検出すること
もできる。
【００９９】 新たに生成された還元末端がマイクロプレート中で検出されるこの方法は、精
製された酵素及び基質が用いられるならば、グルクロニダーゼ、コンドロイチナ
ーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、ガラクトシダーゼ等の還元末端を
生成するいかなる酵素の活性を検出することに拡大適用されることができる。
【０１００】 かくして本発明の教示の一つの側面によれば、ヘパラナーゼ触媒活性を阻害す
る潜在力について薬剤を試験する方法が提供される。前記方法は以下のステップ
を実施することによって行われる。即ち、第一ステップにおいては組換えヘパラ
ナーゼ酵素が薬剤の存在下でヘパラナーゼ基質と相互作用され、一方第二ステッ
プにおいてはヘパラナーゼ基質に関する組換えヘパラナーゼ酵素の触媒活性に対
する薬剤の影響が評価される。
【０１０１】 本発明の別の側面によれば、ヘパラナーゼ触媒活性を阻害し、従って腫瘍転移
、自己免疫及び炎症病を潜在的に阻害する薬剤の選抜方法が提供される。前記方
法は以下のステップを実施することによって行われる。即ち、第一ステップにお
いては組換えヘパラナーゼ酵素が個別反応において各々の薬剤の存在下でヘパラ
ナーゼ基質と相互作用され、一方第二ステップにおいては前記ヘパラナーゼ基質
に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の触媒活性に対する試験された各々の薬剤
の影響が評価される。
【０１０２】 本発明の更に別の側面によれば、グリコシダーゼ触媒活性を阻害するその潜在
力について薬剤を試験する定量的方法が提供される。前記方法は以下のステップ
を実施することによって行われる。即ち、第一ステップにおいてはグリコシダー
ゼ酵素が薬剤の存在下でグリコシダーゼ基質と相互作用され、一方第二ステップ
においては前記グリコシダーゼ基質に関するグリコシダーゼ酵素の触媒活性に対
する薬剤の影響が定量的に評価される。
【０１０３】 本発明の更に別の側面によれば、ヘパラナーゼ触媒活性を阻害し、従って腫瘍
転移、自己免疫及び炎症病を潜在的に阻害する薬剤の選抜方法が提供される。前
記方法は以下のステップを実施することによって行われる。即ち、第一ステップ
においてはヘパラナーゼ酵素が個別反応において各々の薬剤の存在下でヘパラナ
ーゼ基質と相互作用され、一方第二ステップにおいてはヘパラナーゼ基質に関す
るヘパラナーゼ酵素の触媒活性に対する各々の薬剤の影響が定量的に評価される
。
【０１０４】 本発明の付加的な側面によれば、グリコシダーゼ触媒活性を試験する定量的方
法が提供される。前記方法は以下のステップを実施することによって行われる。
即ち、第一ステップにおいてはグリコシダーゼ酵素がグリコシダーゼ基質と相互
作用され、一方第二ステップにおいてはグリコシダーゼ基質に関するグリコシダ
ーゼ酵素の触媒活性が定量的に評価される。
【０１０５】 明細書において用いられる通り、用語「定性的」は半定量的をも意味する。
【０１０６】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「グリコシダーゼ触
媒活性」は動物のエンドグリコシダーゼ加水分解活性を意味する。
【０１０７】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「グリコシダーゼ酵
素」はグリコシダーゼ触媒活性を有する酵素を意味する。これにはヘパラナーゼ
及び各種のグルクロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラ
ミニダーゼ、ガラクトシダーゼが含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１０８】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「ヘパラナーゼ触媒
活性」はβ−削除によってヘパリン又はヘパラン硫酸を分解する細菌酵素（ヘパ
リナーゼＩ，II及びIII）の活性とは反対に、ヘパリン又はヘパラン硫酸プロテ
オグリカン基質に対して特異的な動物のエンドグリコシダーゼ加水分解活性を意
味する。
【０１０９】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「ヘパラナーゼ酵素
」はヘパラナーゼ触媒活性を有する酵素を意味する。この例にはFuksの米国特許
第５３６２６４１号（これはここに完全に記述されているかの如くここに参考文
献として組入れる）に記載されている方法によって精製することができるヒト又
は他のいかなる天然の哺乳動物のヘパラナーゼ、又は好ましくは組換え哺乳動物
ヘパラナーゼを含む（これをコードする遺伝子、これの発現及び精製は米国特許
出願第０８／９２２１７０号；第０９／０７１７３９号；第０９／０７１６１８
号；第０９／１０９３８６号；第０９／２５８８９２号；及びＰＣＴ出願ＵＳ／
１７９５４，ＵＳ９９／０９２５５及びＵＳ９９／０９２５６に記述されている
。これらの文献はすべて参考文献としてここに組入れる。）。ヒトヘパラナーゼ
遺伝子配列を用いれば他のいかなる動物の組換えヘパラナーゼをも容易にクロー
ニングし、発現させて精製することができるということは当業者には理解される
であろうし、上述の特許文献にも示されている。ある種のある遺伝子を他の種か
らの同一遺伝子の配列に基づいてクローニングすることは特にポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）が用いられるようになって以来、何百もの従来例で成功したこと
が示されている。
【０１１０】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「組換えヘパラナー
ゼ酵素」はコード配列がクローニングされて発現系で発現される酵素を含む。そ
れは活性を増大させるために処理された酵素を含む。かかる処理はプロテアーゼ
開裂を含むことができる。それは例えば導入されたプロテアーゼ開裂部位を含む
改変配列を更に含み、それは開裂されると酵素活性化をもたらす。特にそれは米
国特許出願第０９／２６００３８号及びＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２５６（これら
はここに完全に記述されているかの如くここに参考文献として組入れる）に記載
され論じられた全てのヘパラナーゼ種を含む。
【０１１１】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、「ヘパラナーゼ基質」又
は「グリコシダーゼ基質」はそれぞれの酵素によって分解生成物へと開裂可能な
基質を意味する。
【０１１２】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、表現「ヘパラナーゼ触媒
活性の阻害」又は「グリコシダーゼ触媒活性の阻害」は所定のアッセイにおける
特異的基質に関するそれぞれの酵素の触媒活性の阻害を意味する。かくして、（
他の）基質及び阻害剤の両方がそれぞれの酵素の触媒活性を阻害する可能性があ
る。
【０１１３】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、表現「相互作用された」
は好ましい反応条件、即ち阻害剤の不在下で反応の進行を可能にして反応生成物
を生成する条件下での接触をも意味する。
【０１１４】 本発明による組換えヘパラナーゼを発現させるために用いられる発現系はいか
なる好適な発現系であることができる。この例には昆虫細胞発現系、哺乳動物細
胞発現系、及び酵母細胞発現系が含まれるが、これらに限定されない。しかし細
菌の発現系は除外されない（米国特許出願第０９／０７１６１８号参照）。例え
ば細菌、酵母、昆虫細胞又は哺乳動物細胞又は他のいかなる発現系で生成された
粗又は精製組換えヘパラナーゼの両方が本発明において用いることができる。
【０１１５】 本発明の方法の一つの側面によって用いられる基質は放射能標識法（例えばin
vitro放射能標識及び代謝的放射能標識が含まれるがこれらに限定されない）を
用いて放射能標識される。
【０１１６】 本発明の一実施態様によれば、基質は細胞外マトリックス又はその一部分であ
る。基質は細胞外マトリックスと関連した巨大分子を含むことが好ましい。前記
巨大分子の例としてはヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパラナーゼを含む様々
なグリコシダーゼの天然基質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１１７】 しかし、本発明の好ましい実施態様によれば、基質はヘパラン硫酸、ヘパリン
、ヘパリン−セファロース、又はそれらの誘導体である。
【０１１８】 選抜される薬剤はいかなる種類のものであることができる。
【０１１９】 一例は抗ヘパラナーゼ抗体を含む。抗体を活性部位に結合させることによって
酵素の触媒活性を阻害することができるということは周知である。
【０１２０】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「抗体」はモノクロ
ーナル又はポリクローナル免疫グロブリン又はｓＦｖ（単一鎖抗原結合タンパク
質）、Ｆａｂ１又はＦａｂ２の如き免疫グロブリンのフラグメントを意味する。
免疫グロブリンはネズミ科の動物の可変領域がヒトの定常領域に融合されている
か又はネズミ科の動物の相補的決定領域がヒト抗体構造に移植されている「ヒト
化された」抗体であることができる（Wilder, R. B. 等、J. Clin. Oncol., 14
：1383-1400. 1996）。マウス又はウサギの抗体とは異なり、「ヒト化された」
抗体は患者の免疫系との望ましくない反応を通常引き起こさない。用語「ｓＦｖ
」及び「単一鎖抗原結合タンパク質」は免疫グロブリンのフラグメントのあるタ
イプを意味し、その一例はsFv CC49である（Larson, S. M. 等、Cancer. 80：24
58-68, 1997）。
【０１２１】 抗ヘパラナーゼ抗体は米国特許出願第０９／０７１７３９号及びＰＣＴ／ＵＳ
９９／０９２５５に詳細に記述されている。これらの文献はここに完全に記載さ
れているかの如く参考文献として組入れる。例えば米国特許出願第０９／１８９
２００号（これは参考文献としてここに組入れる）に記述されているようなヘパ
ラナーゼ抗体の中和はヘパラナーゼ触媒活性の不活性化におけるそれらの後ほど
の使用のために特に関心がある。
【０１２２】 他の例は天然又は人工の（合成）薬剤を含む。ヘパラナーゼ触媒活性を阻害す
る候補薬剤にはポリアニオン性分子、ヘパリンの化学的に変性された種、脱重合
体化されたヘパリン由来の均一サイズのオリゴサッカライド、小分子のライブラ
リー（類似薬剤の組合せライブラリー）及び抗ヘパラナーゼ触媒活性について合
理的に設計された分子を含むがこれらに限定されるわけではない。合成又は天然
薬剤のライブラリーが想起される。かかるライブラリーは本発明の教示に従って
潜在的ヘパラナーゼ阻害剤について選抜されることができる。
【０１２３】 本発明の一実施態様によれば、ヘパラナーゼ基質に関する組換えヘパラナーゼ
酵素の触媒活性及びそれに対する薬剤の影響の評価はヘパラナーゼ基質の分解生
成物を検出するために適合されたサイズ分離アッセイによって行われる。好適な
サイズ分離アッセイはゲル電気泳動及びカラムクロマトフラフィーを含むが、こ
れらに限定されるわけではない。他のサイズ分離方法も除外されない。
【０１２４】 しかし、本発明の好ましい実施態様によれば、グリコシダーゼ又はヘパラナー
ゼ基質に関するグリコシダーゼ又はヘパラナーゼの触媒活性及びそれに対する薬
剤の影響の定量的評価はグリコシダーゼ又はヘパラナーゼ基質の分解生成物と関
連する還元成分の検出に適合したアッセイによって行われる。アッセイは還元糖
アッセイであることが好ましい。
【０１２５】 グリコシダーゼ基質に関するグリコシダーゼ酵素の触媒活性及びそれに対する
薬剤の効果の定量的評価は比色アッセイによって行うことが好ましい。好適な比
色アッセイはテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホルマザン塩へと還元されるテ
トラゾリウムブルーアッセイである。例えば上述したような他の定量的比色アッ
セイも用いることもできる。
【０１２６】 明細書及び特許請求の範囲において用いられる通り、用語「比色」は、容易に
検出可能な単純な色反応であれ、蛍光検出装置によって容易に検出可能な蛍光測
光反応又は発光（例、化学発光）反応であれいかなる呈色反応をも意味する。
【０１２７】 方法は酵素濃度及び時間の好適な範囲内で実質的に線型にふるまうことが好ま
しく、かくしてアッセイされる酵素の動力学定数は例えば阻害剤の存在下又は不
在下で容易に導出することができる。
【０１２８】 本発明はグリコシダーゼ（例、ヘパラナーゼ）触媒活性を測定する新規の定性
的及び定量的アッセイを提供する。このアッセイは従ってグリコシダーゼの潜在
的阻害剤を選抜するために用いることができ、これらの潜在的阻害剤は治療の目
的のために役立つことができる。
【０１２９】 アッセイは比色アッセイであり、従ってサイズ分離の必要性及び放射能標識さ
れた基質の使用を不要とする。
【０１３０】 固定された基質から放出される生成物の完全な加水分解物中に存在するウロン
酸誘導体を検出するカルバゾールアッセイ及びポリアニオン性化合物の存在下で
色シフトを生ずるジメチルメチレンブルーアッセイの如き定性的アッセイは粗抽
出物並びに精製された酵素の両方について適用可能である。
【０１３１】 一方、定量的アッセイは基質から放出される還元末端を比色的に検出するテト
ラゾリウムブルーアッセイに基づいているので、可溶性又は固定形態のいずれか
であることもできる。
【０１３２】 定量的アッセイは正確さと線型性のために純粋な酵素及び基質を必要とする。
しかしこのことは例えばクローニングと発現によって容易に多量に利用可能なヘ
パラナーゼを試験する場合には制限とはならない。
【０１３３】 背景セクションで論じた通り、ヘパラナーゼは腫瘍細胞の侵入及び転位並びに
腫瘍の脈管形成に関与しており、免疫系の細胞によって発現される。それ故、ヘ
パラナーゼ阻害化合物についての信頼できるin vitro選抜系は細胞侵入、転位及
び／又は腫瘍脈管形成を防止する非毒性の抗癌医薬、及び例えば様々な硬化症及
び他の炎症及び自己免疫病の治療用の抗炎症及び抗自己免疫応答医薬の同定及び
開発のために適用することができる。
【０１３４】 実施例 これまでの説明と共に以下の実施例を参照して本発明を非限定的な様式で説明
する。
【０１３５】材料及び実験方法 材料：豚の腸粘膜からのナトリウムヘパリン（ＰＭ−ヘパリン）（分子量１４
０００，Anti-FXa １６５ＩＵ／ｍｇ、硫黄含有量１２％）はHepar Industries
（Franklin, Ohio）から得た。このヘパリンの低分子量フラグメント（Kabi ２
１６５，Fragmin）（分子量５１００，Anti-FXa １３０ＩＵ／ｍｇ、硫黄含有量
１２．４％）は硝酸脱重合体化によってナトリウム塩として調製された（１８）
。ウシ腎臓からのヘパラン硫酸（Cat. No. Ｈ７６４０）、ＰＥＧ３００（Cat.
No. Ｐ３１４０）、テトラゾリウムブルークロライド（Cat. No. Ｔ４３７５）
及びカルバゾール（Cat. No. Ｃ５１３２）はSigmaから購入した。ヘパリンはWe
ldingから購入した。ヘパリン−セファロースはPharmaciaから購入した。１，９
−ジメチルメチレンブルーはAldrichから購入した（Cat. No. ３４１０８）。
【０１３６】 硝酸脱重合体化したヘパリンからのオリゴサッカライドの調製及び特性決定： 様々なサイズの糖鎖からなるヘパリンフラグメントは参考文献（１８）に記述
のように硝酸を用いて豚の腸粘膜からのヘパリンの部分的脱アミノ開裂によって
得られた。サイズはジサッカライドから開始ヘパリンの平均長を持つ鎖、つまり
約４０−５０サッカライドの鎖まで分布していた。硫黄／炭素比率が開始ヘパリ
ンと類似の均一サイズのオリゴサッカライドは参考文献（１９）に記述のように
ヘパリンメチルエステルのアルカリ処理（β−削除）によっても調製された。同
様の結果が得られた。両方の場合において、ヘパリンフラグメントの混合物は塩
化ナトリウムを溶出剤として用いるDEAE Sepharose上でのイオン交換クロマトグ
ラフィーに供された。三つの画分が収集された：硫黄／炭素比率（元素分析によ
る）０．１４の低硫酸画分；硫黄／炭素比率０．１９の中程度硫酸画分；及び硫
黄／炭素比率０．２１の高硫酸画分（１９，２０）。低硫酸画分、中程度硫酸画
分及び高硫酸画分の各々はSephadex Ｇ−５０ スーパーファイン上でのゲル浸透
クロマトグラフィーによって均一サイズの均一数のオリゴサッカライドへと更に
分離された（１９，２０）。この処理により、異なるサイズ及び硫酸化度の一組
のオリゴサッカライドが得られた。ヘパリンよりも高い硫黄／炭素比率を有する
オリゴサッカライドは、Ｎ−アセチル基よりもＮ−硫酸基が大きな割合を占める
ということ及び６−ＯＨ基よりも６−Ｏ硫酸基が大きな割合を占めるということ
によって示されるように主にグルコサミン中に追加の硫酸基を持つということが １ Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分光分析によって見出された。低硫酸含有オリ
ゴサッカライドはそれらのグルコサミン並びにそれらのイズロン酸中の硫酸含有
量がかなり低かった（１９）。
【０１３７】 変性ヘパリン：ヘパリンの化学的に変性された非抗凝血性種は未変性ヘパリン
及びヘパリンフラグメントから調製された（Fragmin、分子量約５１００）。簡
単に述べると、ヘパリン及びヘパリンフラグメントのピリミジン塩はジメチルス
ルホキサイド及びメタノールと共にインキュベートすることによって完全にＮ−
脱硫酸化された（２１）。１０％メタノール及び０．４％トリフルオロ酢酸を含
有するジメチルスルホキサイドを用いた徹底的な脱硫酸化によってＮ及びＯ硫酸
基は完全に脱硫酸化された。Ｎ−脱硫酸化されたヘパリンフラグメントは参考文
献（２０）に記述の通りｐＨ７−８の無水酢酸水溶液を用いてＮ−アセチル化さ
れるか又は三酸化硫黄トリメチルアミン複合体を用いてＮ−再硫酸化された。Ｏ
−脱硫酸化されかつＮ−アセチル化されたヘパリンフラグメントは参考文献（２
０，２２）に記述の通りＮ−アセチル化されたヘパリンフラグメントをＯ−脱硫
酸化することによって得られた。無傷のヘパリンは同様の手順によって化学的に
変性された。これらの変性されたヘパリンはヘパリンの抗凝血活性の５％未満を
示した（２３）。ヘパリンフラグメントになされた化学的変性はＪＥＯＬ ＧＸ
−４００装置を用いて、１Ｈについては４００Ｍｈｚで、１３Ｃについては１０
０Ｍｈｚで、及びＴＳＰ（２，２，３，３−テトラドイテリオ−３−トリメチル
シリルプロピオネート）を内部標準として１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲ分光
分析によって調査された（２３）。
【０１３８】 ポリアニオン性分子：化合物ＲＧ−１３５７７及びＰ−９７１００（４−ヒド
ロキシフェノキシ酢酸の重合体、分子量約５８００）及びそれらの硫酸化変異体
ＡＶ−１／９−１は参考文献（２７）に記述の通り合成された。コンピュータに
よる分子モデリングによればこれらの化合物はヘパリンと類似の陰電荷の規則正
しい空間分布を保証する超構造を形成しているということが示唆される。
【０１３９】 細胞：ウシ角膜内皮細胞の培養は参考文献（２４）に記述の通り雄の子牛の眼
から確立された。株培養物は１０％新生子牛血清、５％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）
、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥ
Ｍ（１ｇグルコース／リットル）中で３７℃で１０％ＣＯ２湿潤インキュベータ
中で維持された。部分的に精製された脳由来のβＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）は
活性細胞増殖相中一日置きに添加された（２０）。高度転移性Ｂ１６−ＢＬ６黒
色腫細胞はDr. I. J. Fidler（University of Texas System Cancer Center, Ho
uston, Texas, 8）から提供された。黒色腫細胞は１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミ
ン及び抗生物質を含むＤＭＥＭ（４．５ｇグルコース／リットル）中の培地中で
維持された。
【０１４０】 ＥＣＭで被覆された皿の調製：ウシ角膜内皮細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ溶液
を用いて株培養物（第２から第５パッセージ）から分離され、２×１０５細胞／
ｍｌの組換え体初期密度で４ウェルプレートに広げられた。細胞は５％デキスト
ランＴ−４０が増殖培地中に含まれていたこと及びβＦＧＦを添加せずに１２日
間維持されたことを除いては上述の通り維持された。内皮下ＥＣＭは細胞層を０
．５％Triton Ｘ−１００及び２０ｍＭ ＮＨ４ＯＨを含むＰＢＳ中に溶解させ
（５分間、室温）、続いてＰＢＳで４回洗浄することによって露出された。ＥＣ
Ｍは無傷で細胞の破片なしに残存し、組織培養皿の全領域に堅固に付着していた
（１１，２０）。硫酸標識されたＥＣＭを調製するため、角膜の内皮細胞は４ウ
ェルプレートに広げられ、上述の通り培養された。Ｎａ２［３５Ｓ］Ｏ４（５４
０−５９０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）は接種の２〜５日後に添加され（４０μＣｉ／ｍ
ｌ）、培養物は培地を変更せずに標識と共にインキュベートされた（１１，２０
）。接種の１０〜１２日後、細胞単層は溶解され、ＥＣＭは上述の通り露出され
た。
【０１４１】 可溶性硫酸標識されたプロテオグリカン（ピークＩ物質）を調製するため、Ｅ
ＣＭはトリプシンで消化され（２５μｇ／ｍｌ、６時間、３７℃）、消化物は逆
透析によって濃縮され、Sepharose 6Bゲル濾過カラム上に適用され、高分子量物
質（Ｋａｖ＜０．２、ピークＩ）が収集された（２５）。標識された物質の８０
％以上がヘパラン硫酸プロテオグリカンからなることが示された（１１）。
【０１４２】 硫酸化プロテオグリカンの分解：硫酸標識されたＥＣＭは無傷の細胞又は調節
培地と共にそれぞれｐＨ６．６，ｐＨ６．２でインキュベートされた（３時間、
３７℃、１０％ＣＯ２インキュベーター）。プロテオグリカン分解の発生を評価
するため、インキュベーション培地は収集され、Sepharose 6Bカラム（０．９×
３０ｃｍ）上でのゲル濾過に適用された。画分（０．２ｍｌ）はＰＢＳを用いて
５ｍｌ／時間の流速で溶出され、Bio-fluorシンチレーション流体を用いて放射
能活性について計数された。溶出した容積（Ｖｏ）はブルーデキストランによっ
てマークされ、総包含容積（Ｖｔ）はフェノールレッドによってマークされた。
後者は遊離硫酸と共に移動するということが示されている（１１，２０）。ＨＳ
側鎖の分解フラグメントはSepharose 6Bから０．５＜Ｋａｖ＜０．８で溶出され
た（ピークII、１１，２０）。トリプシンによって、及びＰＢＳ単独でのインキ
ュベーション中に低程度にＥＣＭから放出されるほぼ無傷のＨＳＰＧはＶｏの隣
に溶出された（Ｋａｖ＜０．２、ピークＩ）。カラムに適用された標識された物
質の回収率は様々な実験において８５〜９５％の範囲にあった。各実験は少なく
とも３回行われ、溶出位置（Ｋａｖ値）の変動は＋／−１５％を越えることはな
かった。
【０１４３】 腫瘍転移：Ｃ５７ＢＬマウスはヘパリン（４００μｇ／０．２ｍｌ／マウス、
特記しない限り以下同じ）の単回皮下（特記しない限り以下同じ）注射を受け、
その２０分後Ｂ１６−ＢＬ６黒色腫細胞（１×１０５細胞／マウス）を腹腔内接
種された。マウスは１５日後屠殺され、肺はBouenの溶液中に固定され、転移節
の数を計数された（８）。
【０１４４】 酵母細胞中でのヘパラナーゼの発現： 酵母における発現のための発現ベクターの構築： 酵母発現ベクターの構築は複数のステップで行われた。プラスミドｐＦＡＳＴ
ｈｐａ２（米国特許出願第０９／０７１６１８号に記載）は制限酵素ＳｔｕＩ及
びＢｆｒＩを用いて消化された。単離されたフラグメントは以下のようにして生
成されたＰＣＲ増幅生成物に結合された：一対のプライマーＭＦ−５３３ 5'-A
CCATATGAAAAAGTTCAAGAACAGC-3'（配列番号：１）（このヌクレオチド９−２６は
ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７９５４に記載されている配列番号：９のヌクレオチド５
３４−５５１に相当する）及びアンチセンスｈｐａプライマーＨＰＬ−Ｍ１１６
０ 5'-CAGCCACATAAAGCCAGCTGC-3'（配列番号：２）（これはＰＣＴ／ＵＳ９８
／１７９５４に記載されている配列番号：９のヌクレオチド１１６０−１１４０
に相当する）がｐＦＡＳＴｈｐａ２のＰＣＲ増幅に用いられた。ＰＣＲ条件は次
の通りであった：変性（９４℃、４０秒）；アニーリング（５０℃、８０秒）；
及び伸長（７２℃、１８０秒）、合計３０サイクル。ＰＣＲ生成物はＮｄｅＩを
用いて消化され、Klenowフラグメントを用いて処理されて平滑化された端を持つ
ＤＮＡフラグメントを生成した。平滑な生成物はＢｆｒＩを用いて更に消化され
、約２２０ｂｐのＤＮＡフラグメントがゲル電気泳動によって単離され、その後
上述のｐＦＡＳＴｈｐａ２ ＳｔｕＩ−ＢｆｒＩフラグメントに結合された。生
じたプラスミドはｐＦＡＳＴｈｐａ４５と名付けられた。ｐＦＡＳＴｈｐａ４５
はＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを用いて消化され、挿入物は次に発現ベクターｐＰＩ
Ｃ３．５Ｋ（Invitrogen）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位に結合された。生じたプ
ラスミドはｐＰＩＣ３．５Ｋ−ＩＭｈｐａと名付けられた。
【０１４５】 形質転換及び選抜：酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＭＤ１１
６８（ｈｉｓ３，ｐｅｐ４，Invitrogen）が形質転換用のホストとして用いられ
た。形質転換及び選択はPichia発現キットプロトコール（Invitrogen）に記載の
通り行われた。発現ベクターｐＰＩＣ３．５Ｋ−ＩＭｈｐａはＳａｌＩを用いて
消化されてから酵母細胞中へ導入された。
【０１４６】 多数コピークローンはＧ−４１８（Boeheringer Mannehime）を用いて以下の
ようにして選択された：形質転換後、酵母細胞を含む寒天層の上部が除去され、
１０ｍｌの滅菌水中に再懸濁された。少量が除去され、Ｇ−４１８の増大する濃
度（４ｍｇ／ｍｌまで）を含有するＹＰＤプレート（１％酵母抽出物、２％ペプ
トン、２％グルコース）上に広げられた。単一コロニーは取り出され、再びＹＰ
Ｄに画線接種された。Ｇ−４１８抵抗性は単離物をＹＰＤ−Ｇ−４１８プレート
に再び画線接種することによって更に確認された。
【０１４７】 発現実験：単一コロニーは５ｍｌの緩衝されたグリセロール複合培地（ＢＭＧ
Ｙ、１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．
０、１．３４％酵母窒素基（硫酸アンモニウムを含むがアミノ酸を含まない）、
４×１０−５％ビオチン及び１％グリセロール）中に接種され、３０℃で１分間
当たり２５０回転（２５０ｒｐｍ）の撹拌で４８時間インキュベートされた。細
胞は臨床用遠心分離を用いて収集され、３ｍｌの緩衝されたメタノール複合培地
（ＢＭＭＹ、１％グリセロールの代わりに０．５％メタノールを含むことを除い
てＢＭＧＹと同一）中に再懸濁された。次に細胞は３０℃で２５０ｒｐｍの撹拌
で４８時間インキュベートされた。３ｍｇ／ｍｌ Ｇ−４１８ＹＰＤプレートか
ら単離されたピキア・パストリスのクローンの一つの培養物上澄み（誘導培地）
が酵母から分泌されるヒトヘパラナーゼの触媒活性を検出するために用いられた
。
【０１４８】 ヘパラナーゼ触媒活性アッセイ： ヘパラナーゼ触媒活性のポリアクリルアミドゲル分析：Ｈ２Ｏ中に溶解された
６μｇのヘパリン（Welding）又はヘパラン硫酸（Sigma）は、２０ｍＭリン酸ク
エン酸緩衝液ｐＨ５．４，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ
ＤＴＴを含有する反応混合物緩衝液Ａ１００μｌ中で組換え精製ヘパラナーゼ（
１μｇ）と共に３７℃で６−２４時間インキュベートされた。インキュベーショ
ン期間の終わりに０．２５容量の５×グリセロール充填緩衝液（８０％グリセロ
ール、５ｍＭ ＣＤＴＡ）が添加された。サンプル（５０μｌ）はＴＡＣ緩衝液
（４０ｍＭトリス、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＣＤＴＡ、ｐＨ７．８）
中で７．５％（ヘパラン硫酸サンプル用）又は１０％（ヘパリンサンプル用）ポ
リアクリルアミドミニゲルで分別された。ゲルは１００ボルトで４５分間通電さ
れ、０．１％メチレンブルー含有５０％エタノールを用いて１０分間染色された
。脱染色はＨ２Ｏを用いて行われた。活性は非処理の基質と比較した酵素活性に
よって生成された生成物の移動度におけるシフトとして検出された。
【０１４９】 固定された基質：１００μｌのヘパリンセファロース（１×緩衝液Ａ中の５０
％懸濁液）は２０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ５．４，１ｍＭ ＣａＣｌ２，
１ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＤＴＴを含む反応混合物中の組換えヘパラナーゼ
調製物（最終容量２００μｌ）と共に上下反転振盪機中に置かれた０．５ｍｌエ
ッペンドルフチューブ中でインキュベートされた（３７℃、１７時間）。用いら
れた酵素調製物は昆虫細胞中で発現される精製された組換えヘパラナーゼ、組換
えヒトヘパラナーゼを発現するヒト２９３細胞の粗抽出物又は組換えヒトヘパラ
ナーゼを発現する細胞からヘパラナーゼが分泌される酵母の増殖培地であった。
インキュベーション時間の終わりにサンプルは１３２００ｒｐｍで５分間遠心分
離された。インキュベーション後、ヘパラナーゼ活性のために上澄み中へ放出さ
れた生成物はカルバゾールアッセイ又はジメチルメチレンブルーアッセイの比色
アッセイの一つを用いて分析された。
【０１５０】 カルバゾールアッセイ：上澄み（８３μｌ）はガラス管に移された。４２０μ
ｌの硫酸四ホウ酸塩（２．３９グラムの四ホウ酸ナトリウム十水和物を含有する
２５０ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４）が添加された。サンプルは２０分間煮沸された。煮
沸後、サンプルは氷上で５分間冷却され、１６．７μｌのカルバゾール試薬（１
００ｍｌのエタノール中１２５グラムのカルバゾール）が各サンプルに添加され
た。サンプルはもう１０分間煮沸された。冷却後、サンプルの吸光度は分光光度
計（ＣＥＣＩＬ ＣＥ２０４０）を用いて５３０ｎｍで測定された。各サンプル
に対して煮沸された酵素を含むコントロールが含められた。各アッセイにおいて
３−１７μｇのグルクロノラクトンを含む標準曲線が含められた。ヘパラナーゼ
活性は１分間当たりに生成されるグルクロノラクトン当量（μｇ）の量として表
される。
【０１５１】 ジメチルメチレンブルーアッセイ：上澄み（１００μｌ）はプラスチックのキ
ュベットに移された。サンプルは１％ＢＳＡを添加されたＰＢＳで０．５ｍｌに
希釈された。０．５ｍｌ １，９−ジメチルメチレンブルー（３２ｍｇを５ｍｌ
エタノール中に溶解させ、蟻酸緩衝液で１リットルに希釈する）が各サンプルに
添加された。サンプルの吸光度は分光光度計（ＣＥＣＩＬ ＣＥ２０４０）を用
いて５３０ｎｍで測定された。各サンプルに対して煮沸された酵素を含むコント
ロールが含められた。各アッセイにおいて１−１２μｇの低分子量ヘパリンを含
む標準曲線が含められた。ヘパラナーゼ活性は１分間当たりに生成されるヘパリ
ンの量（μｇ）として表される。
【０１５２】 ヘパラナーゼ触媒活性高処理能力比アッセイ：昆虫細胞中で発現されるヒト組
換えヘパラナーゼはＤＴＴが溶出緩衝液中には添加されなかったことを除いては
米国特許出願第０９／０７１７３９号及び第０９／０７１６１８号に記述される
通りに精製された（ＤＴＴはその還元活性のため、テトラゾリウムブルーアッセ
イにおいては高い背景を生じた）。ヘパラナーゼ触媒活性は２０ｍＭリン酸クエ
ン酸緩衝液ｐＨ５．４，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＮａＣｌ，１０％ＰＥＧ
３００及び５０μｇヘパラン硫酸を１００μｌの最終容量中に含む反応において
測定された。反応は０．２５−４μｇの部分的に精製された組換えヘパラナーゼ
酵素を有する９６ウェルマイクロプレート中で行われた。サンプルは３７℃のイ
ンキュベーター中で２−２４時間渦流振盪機でインキュベートされた。インキュ
ベーションの終わりに反応は１００μｌのテトラゾリウムブルー試薬（０．１１
％テトラゾリウムブルー含有０．１Ｍ ＮａＯＨ）を各ウェルに添加することに
よって停止された。色はプレートを６０℃で４０分間インキュベートすることに
よって呈された。色強度はマイクロプレート読取り機（Dynatech）で５８０ｎｍ
で定量的に測定された。各アッセイについて基質（ヘパラン硫酸）を含まないコ
ントロール反応が含められた。１−１５μｇのグルコースのグルコース標準曲線
も各アッセイに含められた。ヘパラナーゼ触媒活性は基質を含むサンプルのＯ.
Ｄ.から基質を含まないサンプルのＯ.Ｄ.を差し引いたΔＯ.Ｄ.として計算され
た。基質によって生成される背景Ｏ.Ｄ.もすべてのサンプルから差し引かれた。
結果はμｇグルコース当量に変換された。１グルコース単位は１分間当たり生成
されるμｇグルコース当量として定義される。比活性はｍｇタンパク質当たりの
単位として定義される。
【０１５３】実験結果 ヘパラナーゼ酵素に対する基質の同定：ヘパリン及びヘパラン硫酸に関する組
換えバキュロウィルス由来のヒト組換えヘパラナーゼの基質特異性の調査が改変
された半定量的ポリアクリルアミドゲルアッセイを用いて測定された（４８）。
この分析を用いると基質（ヘパリン又はヘパラン硫酸）及びヘパラナーゼによっ
て媒介される分解生成物はポリアクリルアミドゲル中で分離される。ゲルは非処
理の基質並びにヘパリン及びヘパラン硫酸フラグメントと反応するメチレンブル
ーを用いて染色される。酵素の不在下でインキュベートされた基質（コントロー
ル）は消化されたヘパリン又はヘパラン硫酸よりも遅く移動する。図１に示され
る通り、ヘパリン（レーンａ及びｂ）及びヘパラン硫酸（レーンｃ及びｄ）の両
方の場合において分解生成物はゲルの底に向かって移動する。このことはヘパラ
ン硫酸及びヘパリンの両方がヒト組換えヘパラナーゼ酵素に対する基質であるこ
とを示す。
【０１５４】 ヘパリン、ヘパリンフラグメント及び脱重合体化したヘパリン由来のオリゴサ
ッカライドのヘパラナーゼ触媒活性に対する影響： （ｉ） 無傷のヘパリン：硫酸標識されたＥＣＭはヘパラナーゼ酵素の代替基
質である無傷のヘパリンの存在下及び不在下で組換えヘパラナーゼと共にインキ
ュベートされた（２４時間、３７℃）（図２ａ，２ｂ）インキュベーション培地
中へ放出された硫酸標識された物質はSepharose 6B上でのゲル濾過によって分析
された。インキュベーション培地のみの存在下ではＶｏと共に又はＶｏの隣に溶
出される大分子量フラグメントのほぼすべて（＞９０％）からなる標識された物
質の定常的放出があった。我々はＥＣＭ自体に存在するタンパク質分解活性が高
分子量物質を放出させるということを以前に示している（２６）。このほぼ無傷
のヘパラン硫酸プロテオグリカンはヘパラナーゼ酵素がヘパリンによって明らか
に阻害される場合に蓄積する比較的多量のピークＩ物質によって示される通り（
図２ａ）、ヘパラナーゼによる続く分解のための可溶性基質を提供する。他方、
標識されたＥＣＭを組換えヘパラナーゼと共にインキュベートすると低分子量硫
酸標識フラグメントの形で（ピークII、０．５＜Ｋａｖ＜０．７５、図２ａ）Ｅ
ＣＭ関連放射能の６０−７０％が放出される。
【０１５５】 同様の実験において可溶性硫酸標識されたピークＩ物質（ほぼ無傷のＥＣＭ由
来ヘパラン硫酸プロテオグリカン）がヘパリンの存在下又は不在下で組換えヘパ
ラナーゼと共にインキュベートされた（図２ｂ）。我々はヘパリン及び他の化合
物をヘパラナーゼ阻害剤として以下言及する（これらのうちのいくつか又は全て
（例えばヘパリン）はヘパラナーゼ基質であることができるが）。放射能標識さ
れた高分子量ピークＩ基質の低分子量ピークII物質への変換は１μｇ／ｍｌヘパ
リンの存在下で完全に阻害された（図２ｂ）。この影響はたぶん非標識基質（ヘ
パリン）が過剰であるためであろう。というのも基質を過剰に添加するとヘパラ
ナーゼ内因性基質と干渉することがあるからである。ピークII中に溶出された分
解フラグメントはヘパラン硫酸の分解生成物であることが示された。というのも
それらは（ｉ）アルカリ性水酸化ホウ素又はパパインを用いた処理によってＥＣ
Ｍから放出される無傷のヘパラン硫酸側鎖より５〜６倍小さく（Ｋａｖ約０．３
３）；及び（ii）パパイン又はコンドロイチナーゼＡＢＣを用いた更なる消化に
対して抵抗性であり（データは示さず）、かつ硝酸による脱アミノ化に対して感
受性であるからである（図３）。
【０１５６】 （ii） ヘパリン由来オリゴサッカライド：我々は硝酸脱重合体化によってヘ
パリンから調製された４〜１４糖単位を含む均一サイズのオリゴサッカライドの
阻害的影響を調査した（図４）。図４に示される通り、組換えヘパラナーゼの完
全な阻害は１μｇ／ｍｌのテトラデカサッカライド（９１４２０−１４単位）の
存在下で観察された。同様の結果は１μｇ／ｍｌのテトラサッカライド（９０４
２０−４単位）による極めてわずかな阻害があったものの１６−１８糖単位を含
むヘパリン由来のオリゴサッカライドで観察された（データは示さず）。同様の
結果は硝酸脱重合体化によって（図４。８４５８８−フラグミン）又はアルカリ
β−削除によって（データは示さず）ヘパリン由来のオリゴサッカライドで観察
された。
【０１５７】 (iii) ヘパリンの化学的変性種：実験方法の欄において記述された通り調製さ
れたヘパリンフラグメントの化学的に変性された非抗凝血種（低分子量ヘパリン
フラグミン、分子量約５１００）は、ヘパリンフラグメント（８４５８８−フラ
グミン）、Ｎ／Ｏ完全に脱硫酸化されたヘパリンフラグメント（硫酸基＜１％、
７０３３４−Ｎ／Ｏ脱硫酸化）及びＮ−アセチル化（７０４２１−ｔｏｔ）又は
Ｎ−ヘキサノイル化（７０９０１−ｔｏｔ）ヘパリンフラグメントの存在下又は
不在下で硫酸標識されたＥＣＭと共にインキュベートされた。低分子量硫酸標識
分解フラグメントの培地中での蓄積は１μｇ／ｍｌヘパリンフラグメントの存在
下で完全に阻害された。しかし１０μｇ／ｍｌのＮ／Ｏ脱硫酸化されたヘパリン
フラグメントによっては極くわずかしか阻害されなかった（図５）。１μｇ／ｍ
ｌのＮ−脱硫酸化されたヘパリン種（硫酸基当量９．７％）、又はＮ／Ｏ脱硫酸
化されＮ−再硫酸化されたヘパリン種（硫酸基当量５．３％）によってはヘパラ
ナーゼ触媒活性は阻害されなかった（データは示さず）。このことはヘパリンの
Ｎ−及びＯ−硫酸基の両方が組換えヘパラナーゼの阻害に必要であることを示す
。ヘパリンフラグメントのＮ−硫酸基をアセチル基又はヘキサノイル基（硫酸基
当量はそれぞれ８．７％及び７．５％）で置換すると、ヘパラナーゼ触媒活性を
ヘパリンフラグメントと同じくらい阻害するヘパリン種が生じた（図５。即ち１
μｇ／ｍｌの存在下で完全な阻害）。
【０１５８】 組換えヘパラナーゼ酵素を用いる我々の選抜実験はＯ−脱硫酸化はヘパリンの
ヘパラナーゼ阻害効果を失わせるが、ヘパリンのＯ−硫酸化されかつＮ−置換さ
れた（例、Ｎ−アセチル化又はＮ−ヘキサノイル化）種は高い阻害活性を維持し
ていることを示した。組換えヘパラナーゼの阻害は１６以上の糖単位を含むヘパ
リン種であってＮ及びＯ位置の両方に硫酸基を有するヘパリン種によって最も良
好に達成された。低硫酸化オリゴサッカライドは同一サイズのサッカライドの中
程度及び高硫酸化画分よりもヘパラナーゼ阻害作用が小さかった。抗トロンビン
IIIに対して高及び低親和性を示すヘパリン画分は、それらの抗凝血活性におけ
る２００倍もの差異（データは示さず）にもかかわらず、同様の高ヘパラナーゼ
阻害活性を示した。
【０１５９】 （iv） 合成ポリアニオン性ヘパリン模倣化合物：ヘパリン及びヘパラン硫酸
（ＨＳ）は多くの細胞過程の制御に関与している。特にそれらはそれらの作用様
式はまだはっきり解明されてはいないものの細胞増殖及び分化、腫瘍転移及び血
管新生、自己免疫、リポタンパク質代謝及び遺伝子発現に関与している（２）。
それ故、ヘパリン及び／又はＨＳの機能的特性を調節する化合物は広範囲の用途
を持つ治療用薬剤の開発のために益々重要であるだろう。Rhone-Poulenc Rorer
Co., との協同研究において我々はヘパリン／ＨＳの強力な模倣物を合成し、そ
れらの作用様式及び再狭窄、血管新生及び腫瘍進行の阻害における適用可能性を
調査した（２７−３１）。この目的のため、我々はフェノール及びホルムアルデ
ヒドの酸触媒重合体化を適用して負に帯電した非硫酸化ポリアニオン性化合物を
合成した（２７、米国特許第５６７４４８２号。この文献はここに完全に記載さ
れているが如く参考文献として組入れる）。芳香族環単量体が選択され、強力な
酸化試薬は回避され、かくしてホルムアルデヒドを用いた重合体プロセスは実質
的に秩序立った規定された骨格を生じた。このアプローチを用いて一連の非毒性
線状ポリアニオン性重合体がポリ−４−ヒドロキシフェノキシ酢酸を含む反復フ
ェノールベース単量体を用いて同定され、ヘパリンの効果をいくらか模倣する化
合物ＲＧ−１３５７７と名付けられた。特に重要なことはこれらの化合物の細胞
増殖（例、血管内皮及び平滑筋細胞、メサンギウム細胞、２８−３０）を阻害す
る能力及び基本線維芽細胞増殖因子（βＦＧＦ）トランスフェクト細胞の形質転
換された表現型を反転させる能力（３１）である。
【０１６０】 詳細な化学的構造に関してはＲＧ−１３５７７とヘパリンの間にはいくつかの
差異がある。ヘパリンは主要なアニオン性基としてスルホン酸基を含むのに対し
、ＲＧ−１３５７７はカルボキシル残基のみを含む。加えてＲＧ−１３５７７は
酵素抵抗性のメチレン基によって結合された芳香族環から構成されるがヘパリン
は生物分解可能な糖骨格を有する。ＲＧ−１３５７７及びヘパリンは反復単位の
重合体の族をそれぞれ代表する。ＲＧ−１３５７７の活性化合物の推定分子量は
約８０００であるが、商業的に入手可能なヘパリンの分子量は５０００−３００
００の範囲内にある。最近二つのポリアニオン性化合物がInSight Ltd., Israel
によって合成された。Ｐ−９７１００と名付けられた一つは化合物ＲＧ−１３５
７７と同一であり、第二のものは化合物Ｐ−９７１００の硫酸化されたものであ
り、そこではカルボキシル基が硫酸基によって置換されている。組換えヘパラナ
ーゼ酵素及び上述のアッセイ系を用いて我々はこれらの化合物がヘパラナーゼ触
媒活性を阻害する能力を選抜した。
【０１６１】 可溶性の硫酸標識されたＥＣＭ由来のＨＳＰＧ基質（ピークＩ物質）はヘパリ
ン（図６ａ）、化合物Ｐ−９７１００（ポリ−４−ヒドロキシフェノキシ酢酸。
InSightによって合成されたもの。図６ｂ）又は化合物ＲＧ−１３５７７（ポリ
−４−ヒドロキシフェノキシ酢酸。RhOne-Poulenc Rorerによって合成されたも
の。図６ｃ）の増大する濃度（１，５及び１０μｇ／ｍｌ）の存在下及び不在下
で精製された組換えヘパラナーゼと共にインキュベートされた。１８時間のイン
キュベーション（３７℃、ｐＨ５．８）後、反応混合物はSepharose 6B上でのゲ
ル濾過に供され、ピークＩ基質の低分子量分解フラグメントへの変換について分
析された。この変換（ヘパラナーゼ触媒活性）の完全な阻害は５μｇ／ｍｌヘパ
リン（図６ａ）又は他の化合物それぞれ１０μｇ／ｍｌの存在下で得られた（図
６ｂ−ｃ）。ヘパリン及び化合物Ｐ−９７１００は１μｇ／ｍｌで既に阻害効果
を少し示した（図６ａ−ｂ）が、この濃度ではＲＧ−１３５７７は何の阻害効果
も示さなかった（図６ｃ）。このアッセイ系においてはInSightによって調製さ
れた化合物Ｐ−９７１００はＲＧ−１３５７７よりもわずかに有効であり、ヘパ
リンとほぼ同じくらい活性があった。
【０１６２】 無傷の硫酸標識されたＥＣＭが化合物ＡＶ−１／９−１対化合物Ｐ−９７１０
０のヘパラナーゼ阻害活性を比較するために適用された。図７ａに示される通り
、組換えヘパラナーゼ触媒活性の完全な阻害は０．５及び１μｇ／ｍｌの化合物
Ｐ−９７１００の存在下で得られた。ほぼ完全な阻害は０．１μｇ／ｍｌの化合
物Ｐ−９７１００で得られた。同一条件下では化合物ＡＶ−１／９−１（硫酸化
ポリ−４−ヒドロキシフェノキシ酢酸。InSightによって合成されたもの。）は
０．５及び１μｇ／ｍｌで部分的阻害を示したが、０．１μｇ／ｍｌのＡＶ−１
／９−１では阻害は起こらなかった（図７ｂ）。これらの結果は化合物Ｐ−９７
１００がその硫酸化された類似体ＡＶ−１／９−１と比較してより強力なヘパラ
ナーゼ触媒活性阻害剤であること、及び組換えヘパラナーゼ酵素は選抜目的及び
潜在的ヘパラナーゼ阻害化合物の間の小さな差異をも検出するために適用するこ
とができるということを示す。
【０１６３】 固定された基質を用いたヘパラナーゼ触媒活性：組換えヘパラナーゼが固定さ
れた基質を利用することができるかどうか測定するため、ヘパリン−セファロー
スを基質として用いて反応が行われ、反応生成物はポリアクリルアミドゲルアッ
セイを用いて観察された。図８に示される通り、酵素反応の生成物の移動度にお
けるシフトが検出可能である。このことは組換えヘパラナーゼが固定された基質
を開裂することができるということを示す。
【０１６４】 粗又は精製されたヘパラナーゼを用いて反応生成物を定量することができるア
ッセイを開発しようという試みにおいて、酵素はヘパリン−セファロースと共に
同様にインキュベートされた。しかし生成物はカルバゾールアッセイ（このアッ
セイはヘパリン及びヘパラン硫酸のウロン酸、例えばイズロン酸又はウロン酸の
ラクトン体、例えばグルクロノラクトンの推定を可能にする（４３））又はジメ
チルメチレンブルーアッセイ（このアッセイは硫酸化グリコサミノグリカンの推
定を可能にする（５１））の比色方法を用いて分析された。
【０１６５】 図９ａに示される通り、哺乳動物又は昆虫細胞中で発現される組換えヘパラナ
ーゼ触媒活性はカルバゾールアッセイを用いて定量的に検出することができた。
哺乳動物細胞に対しては粗調製物が用いられ、一方昆虫細胞中で発現される酵素
は部分的に精製されていたが、活性は哺乳動物細胞中で発現されるヘパラナーゼ
の方が約６倍高いことが見出された。同様に図９ｂに示される通り、酵母細胞又
は昆虫細胞中で発現されるヘパラナーゼ活性の生成物はジメチルメチレンブルー
アッセイを用いて検出可能であった（図９ｂ）。μｌ当たりの活性は昆虫細胞中
で発現される酵素の方が高いが、酵母中で発現されるヘパラナーゼの量はずっと
低い。酵母からは誘導培地（ここにヘパラナーゼが分泌される）の調製物が試験
されたが、一方昆虫細胞中で発現される酵素については精製された酵素が用いら
れた。
【０１６６】 組換え哺乳動物ヘパラナーゼをプローブとして用いた潜在的抗転移及び抗炎症
薬剤を選抜するための高処理能力比ヘパラナーゼ触媒活性アッセイ：潜在的阻害
剤の選抜に用いられる新規アッセイの潜在力を研究する前に、アッセイが可溶性
基質について増大する酵素量及びインキュベーション時間に関して線型範囲を有
することを示す必要があった。昆虫細胞中で発現されて部分的に精製された組換
えヘパラナーゼが活性の測定のために用いられた。ＰＥＧ３００が酵素を安定化
するために反応混合物に添加された。０．２５−４μｇヘパラナーゼの増大する
酵素量が反応混合物に添加され、３７℃で６時間インキュベートされた。図１０
に示す通り、ヘパラナーゼ活性は０．２５−４μｇタンパク質の増大する酵素量
に関して線型であった。
【０１６７】 次に時間に関する活性の線型性が調査された。反応液は各反応につき３μｇの
酵素と共に２，４，６及び２４時間インキュベートされた。図１１に示す通り、
活性は２４時間まで線型であった。
【０１６８】 このアッセイがヘパラナーゼ阻害剤を選抜するために好適であるかどうか決定
するため、いくつかの異なる種のヘパリン（化学的に変性されたもの）及びヘパ
リン模倣化合物が組換え酵素及び新規アッセイ系を用いてヘパラナーゼ触媒活性
に対するそれらの阻害効果について試験された。１又は１０μｇ／ｍｌの各潜在
的阻害剤が基質ヘパラン硫酸を含む又は欠く反応液に添加された。各反応液は３
μｇの酵素を含有しており、３７℃で１７時間インキュベートされた。潜在的阻
害剤が含まれる反応液は化合物を含まない反応液と比較された。基質により生じ
た背景は全ての活性結果から差し引かれた。１０μｇ／ｍｌの濃度における様々
な潜在的阻害剤の影響の結果は図１２に示されている。一般的にこのアッセイを
用いたヘパラナーゼ阻害結果は標識されたＥＣＭで得られた結果と良く相関する
。化合物７０４２１−Ｎ−脱硫酸化Ｎ−アセチル化フラグミン、７０９０１−Ｎ
−脱硫酸化及びＮ−ヘキサノイル化フラグミンはヘパラナーゼ触媒活性を完全に
阻害したが、化合物７０３３４−Ｎ／Ｏ脱硫酸化フラグミンは有意な阻害を引き
起こさなかった。合成ポリアニオン性ヘパリン模倣ＲＧ−１３５７７（２５）は
ヘパラナーゼ触媒活性を部分的に阻害した。
【０１６９】 本発明はその特別な実施態様との関連でこれまで説明されてきたが、多くの代
替案、改変及び変形が可能であることは当業者には明らかであろう。従って、上
記特許請求の範囲の精神及び広範囲の範囲内に含まれるすべてのかかる代替案、
改変及び変形を包含することが意図される。
【参考文献】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はヘパラナーゼ触媒活性のポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図２】 図２ａ−ｂはヘパリンによるヘパラナーゼ触媒活性の明らかな阻害を示す。
【図３】 図３は硝酸脱アミノ化に対するピークII物質の感受性を示す。
【図４】 図４は様々なサイズのヘパリン由来オリゴサッカライドによるヘパラナーゼの
阻害を示す。
【図５】 図５はヘパリンフラグメントの化学的に変性された種によるヘパラナーゼの阻
害を示す。
【図６】 図６ａ−ｃは合成ポリアニオン性ヘパリン模倣化合物によるヘパラナーゼ阻害
を示す。
【図７】 図７ａ−ｂは硫酸化されていないヘパリン模倣化合物及び硫酸化されたヘパリ
ン模倣化合物によるヘパラナーゼの阻害を示す。
【図８】 図８は基質としてのヘパリン−セファロースを用いたヘパラナーゼ触媒活性の
ポリアクリルアミドゲル分析を示す。
【図９】 図９ａ−ｂは固定されたヘパリン及びカルバゾール又はジメチルメチレンブル
ー比色アッセイを用いた、昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞によって発現さ
れる組換えヘパラナーゼ触媒活性の測定を示す。
【図１０】 図１０は比色テトラゾリウムブルーアッセイを用いた酵素量の関数としてのヘ
パラナーゼ触媒活性を示す。
【図１１】 図１１はテトラゾリウムブルーアッセイを用いたインキュベーション時間の関
数としてのヘパラナーゼ触媒活性を示す。
【図１２】 図１２はテトラゾリウムブルーアッセイを用いた様々な潜在的ヘパラナーゼ阻
害剤の選抜を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１１日（２０００．８．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ベン−アルツィ， ハンナ イスラエル， 75284 リション レジオ ン， シェインキン 14 (72)発明者 アヤル−ヘルシュコヴィッツ， マティー イスラエル， 46425 ヘルツリア， タ ベンキン 17 (72)発明者 ヴロダヴスキー， イスラエル イスラエル， 90805 メヴァセレット ズィオン， アルベル 34 (72)発明者 ペッカー， アイリス イスラエル， 75203 リション レジオ ン， ウォルフソン 42 (72)発明者 ペレグ， ヨーヴ イスラエル， 76455 レホヴォット， ネヴ−アロン 15 (72)発明者 ミロン， ダフナ イスラエル， 76100 レホヴォット， ハブスタン ３／５ Ｆターム(参考） 4B050 CC02 CC03 CC10 DD04 DD07 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QQ07 QQ08 QQ35 QQ67 QQ68 QQ95 QQ96 QR15 QR41 QR43 QR56 QR58 QR66 QR82 QS03 QS16 QS17 QX01 4H045 AA11 AA30 BA10 CA10 CA40 CA51 DA55 EA22

Claims (131)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 薬剤の存在下で組換えヘパラナーゼ酵素をヘパラナーゼ基質
    と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の
    触媒活性に対する薬剤の影響を評価するステップを含む、ヘパラナーゼ触媒活性
    を阻害する潜在力について薬剤を試験する方法。
  2. 【請求項２】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞発
    現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請求項
    １の方法。
  4. 【請求項４】 前記ヘパラナーゼ基質が放射能標識されている請求項１の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記放射能標識されたヘパラナーゼ基質がin vitro放射能標
    識法及び代謝的放射能標識法からなる群から選択される放射能標識法によって放
    射能標識されている請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一部分
    である請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連した
    巨大分子を含む請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項
    ７の方法。
  9. 【請求項９】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶性ヘ
    パラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリ
    ンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項１の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 薬剤が抗ヘパラナーゼ抗体である請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 薬剤が天然に生じた薬剤である請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 薬剤が合成薬剤又は合成薬剤のライブラリーである請求項
    １の方法。
  15. 【請求項１５】 前記合成薬剤が類似薬剤の組合せライブラリーに属する複
    数の薬剤の内の一つである請求項１４の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵
    素の触媒活性に対する薬剤の前記影響の評価が、前記ヘパラナーゼ基質の分解生
    成物の検出に適合したサイズ分離アッセイによって行われる請求項１の方法。
  17. 【請求項１７】 前記サイズ分離アッセイがゲル電気泳動及びカラムクロマ
    トグラフィーからなる群から選択される請求項１６の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵
    素の触媒活性に対する薬剤の前記影響の評価が比色アッセイによって行われる請
    求項１の方法。
  19. 【請求項１９】 前記比色アッセイがカルバゾールアッセイ及びメチレンブ
    ルーアッセイからなる群から選択される請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】 個別反応における以下のステップを含む、ヘパラナーゼ触
    媒活性を阻害し、従って腫瘍転移、自己免疫及び炎症病を潜在的に阻害する薬剤
    の選抜方法：各々の薬剤の存在下で組換えヘパラナーゼ酵素をヘパラナーゼ基質
    と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の
    触媒活性に対する各々の薬剤の影響を評価する。
  21. 【請求項２１】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項２０の方
    法。
  22. 【請求項２２】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞
    発現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請求
    項２０の方法。
  23. 【請求項２３】 前記ヘパラナーゼ基質が放射能標識されている請求項２０
    の方法。
  24. 【請求項２４】 前記放射能標識されたヘパラナーゼ基質がin vitro放射能
    標識法及び代謝的放射能標識法からなる群から選択される放射能標識法によって
    放射能標識されている請求項２０の方法。
  25. 【請求項２５】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一部
    分である請求項２０の方法。
  26. 【請求項２６】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連し
    た巨大分子を含む請求項２５の方法。
  27. 【請求項２７】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求
    項２６の方法。
  28. 【請求項２８】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶性
    ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項２０の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリ
    ンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項２０の方法
    。
  30. 【請求項３０】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項２０の方法
    。
  31. 【請求項３１】 薬剤が少なくとも一つの抗ヘパラナーゼ抗体を含む請求項
    ２０の方法。
  32. 【請求項３２】 薬剤が少なくとも一つの天然に生じた薬剤を含む請求項２
    ０の方法。
  33. 【請求項３３】 薬剤が少なくとも一つの合成薬剤又は合成薬剤のライブラ
    リーを含む請求項２０の方法。
  34. 【請求項３４】 前記少なくとも一つの合成薬剤が類似薬剤の組合せライブ
    ラリーに属する複数の薬剤の内の一つである請求項３３の方法。
  35. 【請求項３５】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵
    素の触媒活性に対する薬剤の前記影響の評価が、前記ヘパラナーゼ基質の分解生
    成物の検出に適合したサイズ分離アッセイによって行われる請求項２０の方法。
  36. 【請求項３６】 前記サイズ分離アッセイがゲル電気泳動及びカラムクロマ
    トグラフィーからなる群から選択される請求項３５の方法。
  37. 【請求項３７】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵
    素の触媒活性に対する薬剤の前記影響の評価が比色アッセイによって行われる請
    求項２０の方法。
  38. 【請求項３８】 前記比色アッセイがカルバゾールアッセイ及びジメチルメ
    チレンブルーアッセイからなる群から選択される請求項３７の方法。
  39. 【請求項３９】 薬剤の存在下でグリコシダーゼ酵素をグリコシダーゼ基質
    と相互作用させ、前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素の触
    媒活性に対する薬剤の影響を定量的に評価するステップを含む、グリコシダーゼ
    触媒活性を阻害する潜在力について薬剤を試験する定量的方法。
  40. 【請求項４０】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前記
    グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項３９の定量的方法。
  41. 【請求項４１】 前記ヘパラナーゼが天然のヘパラナーゼである請求項４０
    の定量的方法。
  42. 【請求項４２】 前記ヘパラナーゼが組換えヘパラナーゼである請求項４０
    の定量的方法。
  43. 【請求項４３】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項４２の定
    量的方法。
  44. 【請求項４４】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞
    発現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請求
    項４２の定量的方法。
  45. 【請求項４５】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一部
    分である請求項４０の定量的方法。
  46. 【請求項４６】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連し
    た巨大分子を含む請求項４５の定量的方法。
  47. 【請求項４７】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求
    項４６の定量的方法。
  48. 【請求項４８】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶性
    ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項４０の定量的方法。
  49. 【請求項４９】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリ
    ンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項４０の定量
    的方法。
  50. 【請求項５０】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項４０の定量
    的方法。
  51. 【請求項５１】 薬剤が抗ヘパラナーゼ抗体である請求項４０の定量的方法
    。
  52. 【請求項５２】 薬剤が天然に生じた薬剤である請求項４０の定量的方法。
  53. 【請求項５３】 薬剤が合成薬剤である請求項４０の定量的方法。
  54. 【請求項５４】 前記合成薬剤が類似薬剤の組合せライブラリーに属する複
    数の薬剤の内の一つである請求項５３の定量的方法。
  55. 【請求項５５】 前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素
    の触媒活性に対する薬剤の前記影響の定量的評価が、前記グリコシダーゼ基質の
    分解生成物と関連する還元成分の検出に適合したアッセイによって行われる請求
    項３９の定量的方法。
  56. 【請求項５６】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前記
    グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項５５の定量的方法。
  57. 【請求項５７】 前記アッセイが比色アッセイである請求項５５の定量的方
    法。
  58. 【請求項５８】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項５５の定量的
    方法。
  59. 【請求項５９】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホ
    ルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項５７の定
    量的方法。
  60. 【請求項６０】 前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素
    の触媒活性に対する薬剤の前記影響の定量的評価が比色アッセイによって行われ
    る請求項３９の定量的方法。
  61. 【請求項６１】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前記
    グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項６０の定量的方法。
  62. 【請求項６２】 前記比色アッセイが前記グリコシダーゼ基質の分解生成物
    と関連する還元成分の検出に適合している請求項６０の定量的方法。
  63. 【請求項６３】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項６２の定量的
    方法。
  64. 【請求項６４】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホ
    ルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項６０の定
    量的方法。
  65. 【請求項６５】 前記方法が酵素濃度の範囲内で実質的に線型にふるまう請
    求項３９の定量的方法。
  66. 【請求項６６】 前記方法が時間の範囲内で実質的に線型にふるまう請求項
    ３９の定量的方法。
  67. 【請求項６７】 個別反応における以下のステップを含む、ヘパラナーゼ触
    媒活性を阻害し、従って腫瘍転移、自己免疫及び炎症病を潜在的に阻害する薬剤
    の選抜の定量的方法：各々の薬剤の存在下でヘパラナーゼ酵素をヘパラナーゼ基
    質と相互作用させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記ヘパラナーゼ酵素の触媒
    活性に対する各々の薬剤の影響を定量的に評価する。
  68. 【請求項６８】 前記ヘパラナーゼが天然のヘパラナーゼである請求項６７
    の定量的方法。
  69. 【請求項６９】 前記ヘパラナーゼが組換えヘパラナーゼである請求項６７
    の定量的方法。
  70. 【請求項７０】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項６９の定
    量的方法。
  71. 【請求項７１】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞
    発現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請求
    項６９の定量的方法。
  72. 【請求項７２】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一部
    分である請求項６７の定量的方法。
  73. 【請求項７３】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連し
    た巨大分子を含む請求項７２の定量的方法。
  74. 【請求項７４】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求
    項７３の定量的方法。
  75. 【請求項７５】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶性
    ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項６７の定量的方法。
  76. 【請求項７６】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリ
    ンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項６７の定量
    的方法。
  77. 【請求項７７】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項６７の定量
    的方法。
  78. 【請求項７８】 薬剤が少なくとも一つの抗ヘパラナーゼ抗体を含む請求項
    ６７の定量的方法。
  79. 【請求項７９】 薬剤が少なくとも一つの天然に生じた薬剤を含む請求項６
    ７の定量的方法。
  80. 【請求項８０】 薬剤が少なくとも一つの合成薬剤を含む請求項６７の定量
    的方法。
  81. 【請求項８１】 前記少なくとも一つの合成薬剤が類似薬剤の組合せライブ
    ラリーに属する複数の薬剤の内の一つである請求項８０の定量的方法。
  82. 【請求項８２】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記ヘパラナーゼ酵素の触
    媒活性に対する薬剤の前記影響の定量的評価が、前記ヘパラナーゼ基質の分解生
    成物と関連する還元成分の検出に適合したアッセイによって行われる請求項６７
    の定量的方法。
  83. 【請求項８３】 前記アッセイが比色アッセイである請求項８２の定量的方
    法。
  84. 【請求項８４】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項８２の定量的
    方法。
  85. 【請求項８５】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホ
    ルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項８４の定
    量的方法。
  86. 【請求項８６】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記ヘパラナーゼ酵素の触
    媒活性に対する薬剤の前記影響の定量的評価が比色アッセイによって行われる請
    求項６７の定量的方法。
  87. 【請求項８７】 前記比色アッセイが前記ヘパラナーゼ基質の分解生成物と
    関連する還元成分の検出に適合している請求項８６の定量的方法。
  88. 【請求項８８】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項８７の定量的
    方法。
  89. 【請求項８９】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色ホ
    ルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項８６の定
    量的方法。
  90. 【請求項９０】 前記方法が酵素濃度の範囲内で実質的に線型にふるまう請
    求項６７の定量的方法。
  91. 【請求項９１】 前記方法が時間の範囲内で実質的に線型にふるまう請求項
    ６７の定量的方法。
  92. 【請求項９２】 グリコシダーゼ酵素をグリコシダーゼ基質と相互作用させ
    、前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵素の触媒活性を定量的
    に評価するステップを含む、グリコシダーゼ触媒活性を試験する定量的方法。
  93. 【請求項９３】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前記
    グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項９２の定量的方法。
  94. 【請求項９４】 前記ヘパラナーゼが天然のヘパラナーゼである請求項９３
    の定量的方法。
  95. 【請求項９５】 前記ヘパラナーゼが組換えヘパラナーゼである請求項９３
    の定量的方法。
  96. 【請求項９６】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項９５の定
    量的方法。
  97. 【請求項９７】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞
    発現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請求
    項９５の定量的方法。
  98. 【請求項９８】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一部
    分である請求項９３の定量的方法。
  99. 【請求項９９】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連し
    た巨大分子を含む請求項９８の定量的方法。
  100. 【請求項１００】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請
    求項９９の定量的方法。
  101. 【請求項１０１】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶
    性ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項９３の定量的方法。
  102. 【請求項１０２】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパ
    リンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項９３の定
    量的方法。
  103. 【請求項１０３】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項９３の定
    量的方法。
  104. 【請求項１０４】 前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵
    素の触媒活性の定量的評価が、前記グリコシダーゼ基質の分解生成物と関連する
    還元成分の検出に適合したアッセイによって行われる請求項９２の定量的方法。
  105. 【請求項１０５】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前
    記グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項１０４の定量的方法。
  106. 【請求項１０６】 前記アッセイが比色アッセイである請求項１０４の定量
    的方法。
  107. 【請求項１０７】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項１０４の定
    量的方法。
  108. 【請求項１０８】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色
    ホルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項１０６
    の定量的方法。
  109. 【請求項１０９】 前記グリコシダーゼ基質に関する前記グリコシダーゼ酵
    素の触媒活性の定量的評価が比色アッセイによって行われる請求項９２の定量的
    方法。
  110. 【請求項１１０】 前記グリコシダーゼ酵素がヘパラナーゼ酵素であり、前
    記グリコシダーゼ基質がヘパラナーゼ基質である請求項１０９の定量的方法。
  111. 【請求項１１１】 前記比色アッセイが前記グリコシダーゼ基質の分解生成
    物と関連する還元成分の検出に適合している請求項１０９の定量的方法。
  112. 【請求項１１２】 前記アッセイが還元糖アッセイである請求項１１１の定
    量的方法。
  113. 【請求項１１３】 前記比色アッセイがテトラゾリウムブルーが可溶性着色
    ホルマザン塩へと還元されるテトラゾリウムブルーアッセイである請求項１０９
    の定量的方法。
  114. 【請求項１１４】 前記方法が酵素濃度の範囲内で実質的に線型にふるまう
    請求項９２の定量的方法。
  115. 【請求項１１５】 前記方法が時間の範囲内で実質的に線型にふるまう請求
    項９２の定量的方法。
  116. 【請求項１１６】 組換えヘパラナーゼ酵素をヘパラナーゼ基質と相互作用
    させ、前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ酵素の触媒活性を
    評価するステップを含む、ヘパラナーゼ触媒活性の試験方法。
  117. 【請求項１１７】 前記組換えヘパラナーゼがヒト起源である請求項１１６
    の試験方法。
  118. 【請求項１１８】 前記組換えヘパラナーゼが昆虫細胞発現系、哺乳動物細
    胞発現系及び酵母細胞発現系からなる群から選択される発現系中で発現される請
    求項１１６の試験方法。
  119. 【請求項１１９】 前記ヘパラナーゼ基質が放射能標識されている請求項１
    １６の試験方法。
  120. 【請求項１２０】 前記放射能標識されたヘパラナーゼ基質がin vitro放射
    能標識法及び代謝的放射能標識法からなる群から選択される放射能標識法によっ
    て放射能標識されている請求項１１６の試験方法。
  121. 【請求項１２１】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス又はその一
    部分である請求項１１６の試験方法。
  122. 【請求項１２２】 前記ヘパラナーゼ基質が前記細胞外マトリックスと関連
    した巨大分子を含む請求項１２１の試験方法。
  123. 【請求項１２３】 前記巨大分子がヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請
    求項１２２の試験方法。
  124. 【請求項１２４】 前記ヘパラナーゼ基質が細胞外マトリックス由来の可溶
    性ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む請求項１１６の試験方法。
  125. 【請求項１２５】 前記ヘパラナーゼ基質がヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパ
    リンセファロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される請求項１１６の
    試験方法。
  126. 【請求項１２６】 前記ヘパラナーゼ基質が固定されている請求項１１６の
    試験方法。
  127. 【請求項１２７】 薬剤が抗ヘパラナーゼ抗体である請求項１１６の試験方
    法。
  128. 【請求項１２８】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ
    酵素の触媒活性の前記影響の評価が、前記ヘパラナーゼ基質の分解生成物の検出
    に適合したサイズ分離アッセイによって行われる請求項１１６の試験方法。
  129. 【請求項１２９】 前記サイズ分離アッセイがゲル電気泳動及びカラムクロ
    マトグラフィーからなる群から選択される請求項１２８の試験方法。
  130. 【請求項１３０】 前記ヘパラナーゼ基質に関する前記組換えヘパラナーゼ
    酵素の触媒活性の前記影響の評価が比色アッセイによって行われる請求項１１６
    の試験方法。
  131. 【請求項１３１】 前記比色アッセイがカルバゾールアッセイ及びメチレン
    ブルーアッセイからなる群から選択される請求項１３０の試験方法。
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