CN115286507A - 一种薄荷醇半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 - Google Patents

一种薄荷醇半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本申请适用于质量检测技术领域，提供了一种薄荷醇半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用，本申请提供的薄荷醇半抗原既最大程度保留了薄荷醇特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用本申请的薄荷醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的薄荷醇人工抗原，能更好制备特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立薄荷醇的各种免疫分析方法提供基础；同时，采用本申请的薄荷醇人工抗原得到的薄荷醇抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好，为建立快速、简便、价廉、灵敏的薄荷醇检测方法提供了新手段，并可应用于食品特别是烟草制品中薄荷醇的免疫检测。

Description

一种薄荷醇半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用
技术领域
本申请属于质量检测技术领域，尤其涉及一种薄荷醇半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用。
背景技术
薄荷醇(CAS:89-78-1)，又名薄荷脑，因其特殊的强烈薄荷香气和凉爽味道，广泛应用于香烟、化妆品、牙膏、口香糖、涂擦剂等中，可发挥局部清凉、止痒及轻微局麻等作用。特别是在卷烟和电子烟中，烟丝、滤棒、烟用包装纸、电子烟烟液等中添加薄荷醇，成为生产薄荷型口味烟草制品的重要方式。作为常规香料和食品添加剂，如何实现薄荷醇简单、有效分析，对于薄荷醇的安全监管具有重要意义。
目前，食品、烟草制品中薄荷醇的检测方法很多，如气相色谱法、气质联用法、旋光度法、液相色谱法、液质联用法和近红外光谱法等。但上述方法不同程度存在样品前处理较为复杂，仪器设备较为昂贵，有机溶剂消耗多等缺点，限制了薄荷醇快速筛查，满足不了现场、快速、低成本、大批量检测要求。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种薄荷醇半抗原，旨在解决现有检测食品中香料成分薄荷醇的方法普遍存在样品前处理繁琐、有机试剂用量多、仪器贵重的问题。
本申请实施例是这样实现的，一种薄荷醇半抗原，所述薄荷醇半抗原的结构式如下所示：
Figure BDA0003750655480000021
本申请实施例的另一目的在于一种上述的薄荷醇半抗原的制备方法，包括：
将薄荷醇与第一琥珀酸酐溶解于吡啶中进行反应，得混合液；
向所述混合液中加入第二琥珀酸酐进行搅拌，得到薄荷醇半抗原。
本申请实施例的另一目的在于一种薄荷醇人工抗原，所述薄荷醇人工抗原是由上述的薄荷醇半抗原或者上述的薄荷醇半抗原的制备方法制备得到的薄荷醇半抗原与载体蛋白进行偶联反应得到的偶联物。
本申请实施例的另一目的在于一种上述的薄荷醇人工抗原的制备方法，包括：
将薄荷醇半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺分别溶解于N,N-二甲基甲酰胺中进行搅拌活化处理，得到溶液I；
将钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白分别溶解于PBS缓冲液中，经预冷后进行搅拌处理，得到溶液II；
将所述溶液I缓慢滴加至所述溶液II中，经搅拌、透析处理，得到薄荷醇人工抗原。
本申请实施例的另一目的在于一种薄荷醇抗体，所述薄荷醇抗体是由上述的薄荷醇人工抗原或由上述的薄荷醇人工抗原的制备方法制备得到的薄荷醇人工抗原经动物免疫得到。
本申请实施例的另一目的在于一种上述的薄荷醇人工抗原或者上述的薄荷醇人工抗原的制备方法制备得到的薄荷醇人工抗原或者上述的薄荷醇抗体在薄荷醇免疫检测中的应用或者在制备薄荷醇免疫试剂盒、或胶体金免疫层析试纸条、或时间分辨荧光试纸条中的应用。
本申请实施例提供的薄荷醇半抗原既最大程度保留了薄荷醇特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用本申请的薄荷醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的薄荷醇人工抗原，能更好制备特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立薄荷醇的各种免疫分析方法提供基础；同时，采用本申请的薄荷醇人工抗原得到的薄荷醇抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好，为建立快速、简便、价廉、灵敏的薄荷醇检测方法提供了新手段，并可应用于食品特别是烟草制品中薄荷醇的免疫检测。
附图说明
图1为本申请实施例提供的薄荷醇包被抗原的紫外吸收图；
图2为本申请实施例提供的薄荷醇人工抗原的紫外吸收图；
图3为本申请实施例提供的薄荷醇ELISA标准曲线。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
以抗原抗体特异性识别反应为核心的免疫学方法，具有操作简便、检测快速、准确性高、灵敏度高、检测成本低、对操作者的要求低等优势，逐渐成为农药、兽药、抗生素、食品添加剂等物质大批量样本初步筛查的有力工具。而目前尚未有应用免疫分析方法进行薄荷醇检测的报道。因此，利用免疫分析原理，制备薄荷醇半抗原、人工抗原和抗体，并开展应用，实现薄荷醇的快速、灵敏、简单易操作检测，对加强食品安全监管、保障食品安全具有重要意义。
在本申请实施例中，所述薄荷醇半抗原的结构式如下所示：
Figure BDA0003750655480000041
本申请提供的薄荷醇半抗原保留了薄荷醇所有的特征基团和结构，同时引入羧基基团，可与载体蛋白偶联，为后续动物免疫应答和高特异性灵敏度抗体制备奠定了基础。
本申请实施例还提供了一种上述薄荷醇半抗原的制备方法，包括：
步骤S1，薄荷醇与琥珀酸酐溶解于溶剂吡啶中，进行反应。
步骤S2，向步骤S1中反应后的溶液中再次加入琥珀酸酐，进行搅拌，得到薄荷醇半抗原。
在一些实施例中，所述步骤S1中薄荷醇和琥珀酸酐的摩尔比为1：1～1.1，优选1:1.1。
在一些实施例中，所述步骤S1中反应温度为40～70℃，所述反应的时间为12～24h，优选在70℃下反应24h。
在一些实施例中，所述步骤S2中，琥珀酸酐与薄荷醇的摩尔比为0.1～0.2:1，优选0.1:1。
在一些实施例中，所述步骤S2中搅拌时间为6～12h。
在一些实施例中，所述步骤S2中搅拌结束后于通风橱中氮吹，形成褐色结晶，无须纯化。
本申请中薄荷醇半抗原的制备方法，反应步骤及操作简单，反应条件温和并易于控制，制备的薄荷醇半抗原的纯度和产率较高。
本申请实施例还提供了一种薄荷醇人工抗原，所述薄荷醇人工抗原为上述的薄荷醇半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。所述薄荷醇人工抗原可以作为薄荷醇免疫抗原，也可以作为薄荷醇包被抗原。
其中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和钥孔血蓝蛋白中任几种，优选载体蛋白为BSA和OVA。
其中，所述薄荷醇半抗原与所述载体蛋白的偶联摩尔比约为10：1。
其中，薄荷醇半抗原和载体蛋白的偶联方法可采用活泼酯法或混合酸酐法。具体的，薄荷醇半抗原与-牛血清白蛋白(BSA)通过碳二亚胺法偶联制备薄荷醇免疫抗原，薄荷醇半抗原与-卵清蛋白(OVA)通过混合酸酐法形成薄荷醇包被抗原。
上述薄荷醇半抗原分子量小于一千，虽然具有免疫反应性，但不具有免疫原性。通过薄荷醇半抗原与载体蛋白偶联结合，能制备具有免疫原性的薄荷醇人工抗原。用薄荷醇半抗原与载体蛋白偶联后得到的薄荷醇人工抗原，能更好制备特异性强、灵敏度高的抗体，为后续建立薄荷醇的各种免疫分析方法提供基础。
本申请实施例还提供了一种薄荷醇人工抗原的制备方法，包括：
将薄荷醇半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺分别溶解于N,N-二甲基甲酰胺中进行搅拌活化处理，得到溶液I；
将钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白分别溶解于PBS缓冲液中，经预冷后进行搅拌处理，得到溶液II；
将所述溶液I缓慢滴加至所述溶液II中，经搅拌、透析处理，得到薄荷醇人工抗原。
本申请实施例还提供了一种一种薄荷醇抗体，它是由上述薄荷醇人工抗原制备，其能与薄荷醇人工抗原发生特异性免疫反应。具体的，所述的薄荷醇抗体为本领域免疫抗体常规方法制备的单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。所述薄荷醇的抗体可用于制备薄荷醇检测试剂或试剂盒。
在一个具体的实施方案中，所述薄荷醇抗体为特异性针对上述薄荷醇半抗原和人工抗原的鼠源单克隆抗体。
经验证，采用本申请的薄荷醇人工抗原得到的薄荷醇抗体的效价、灵敏度、亲和力都较好，为建立快速、简便、价廉、灵敏的薄荷醇检测方法提供了新手段，并可应用于食品特别是烟草制品中薄荷醇的免疫检测。
本申请实施例还提供了上述薄荷醇人工抗原、抗体的应用，如用于薄荷醇的免疫检测；用于薄荷醇免疫试剂盒、胶体金免疫层析试纸条、时间分辨荧光试纸条的制备。
下面结合具体实施例进一步详细说明本申请，但实施例仅是本申请的优选实施方式，并不是对本申请的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
下述实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。
下述实施例中，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写，DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写，牛血清白蛋白(Albumin frombovine serum,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)、卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)。
实施例1
本实施例提供了薄荷醇半抗原的制备方法，步骤如下：
1eq薄荷醇标准品与1.1eq琥珀酸酐混合溶解于吡啶中，溶解于5mL圆底烧瓶中，置于70℃油浴中回流并磁力搅拌24h。
向反应液中再添加0.1eq琥珀酸酐，600r/min搅拌6h后，氮吹除去大部分吡啶后静置使其自然挥发，形成褐色结晶，无须纯化。
实施例2
本实施例提供了薄荷醇人工抗原(免疫抗原)的制备方法，步骤如下：
以薄荷醇半抗原与BSA投料比1：100计算，然后按照半抗原：EDC：NHS＝2:3:3的摩尔质量比精确称取半抗原、EDC、NHS分别溶解于1mL DMF中，磁力搅拌活化16h，得到溶液I。
将20mg KLH、BSA、OVA分别溶解于10mL PBS中，放入-20℃冰箱中预冷后置于磁力搅拌器上搅拌，即为溶液II。
将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在PBS中4℃透析72h(中间换水6次)，得到薄荷醇人工抗原，-20℃保存。
经计算得出免疫抗原中BSA与半抗原的结合比约为10:1，即一个BSA分子上平均偶联约10个半抗原。包被抗原中OVA与半抗原的结合比约为9:1，即一个OVA分子上平均偶联约9个半抗原。薄荷醇包被抗原和人工抗原紫外吸收图如图1-2所示。
实施例3
本实施例提供了薄荷醇单克隆抗体的制备方法，步骤如下：
取健康的6～8周雌性BALB/c小鼠5只，采用腹腔注射免疫方法进行免疫，共免疫6次。初次免疫用PBS缓冲溶液(0.15mol/L,pH7.4)稀释实施例2中薄荷醇免疫抗原至1mg/mL，随后加入等体积的弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL。初次免疫后两周，取与初次免疫相同的剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL进行加强免疫。此后，每隔两周加强免疫一次。在细胞融合实验前3天，取薄荷醇免疫抗原直接进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射200μL。选择抗血清效价与抑制均良好的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过三次单细胞团亚克隆后，进行定株及扩大培养，采取体内诱生的方式获得抗体。采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化，制备薄荷醇单克隆抗体。抗体经冷冻干燥后，分装，-20℃保存。
表1五只小鼠免疫后尾血效价
Figure BDA0003750655480000081
表2薄荷醇各细胞株分泌抗体的灵敏度
Figure BDA0003750655480000082
实施例4
本实施例提供了薄荷醇间接竞争ELISA检测方法
1.间接竞争ELISA检测步骤
(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释实施例3中制备的薄荷醇包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干。
(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS缓冲液200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干。
(3)加抗体和薄荷醇样品或标准液：每孔加入50μL经含10％甲醇的PBS缓冲液稀释2000倍的单克隆抗体(实施例3制备)，空白对照中只加入含10％甲醇的PBS缓冲液。随后每孔加入50μL经10％甲醇PBS缓冲液稀释的薄荷醇标准溶液或提取液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。
(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；
(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。
(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。
(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。
2.间接竞争ELISA检测方法检测性能
采用线性方程对薄荷醇浓度对数和吸光值抑制率进行拟合，得到线性方程为Y＝-38.537X+49.513，如图3所示。经过计算，得到薄荷醇间接竞争ELISA方法的抑制中浓度IC50为0.97μg/L，最低检测限IC10为0.09μg/L，线性范围(IC10-90)为0.09-10.6μg/L。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种薄荷醇半抗原，其特征在于，所述薄荷醇半抗原的结构式如下所示：
Figure FDA0003750655470000011
2.一种权利要求1所述的薄荷醇半抗原的制备方法，其特征在于，包括：
将薄荷醇与第一琥珀酸酐溶解于吡啶中进行反应，得混合液；
向所述混合液中加入第二琥珀酸酐进行搅拌，得到薄荷醇半抗原。
3.根据权利要求2所述的薄荷醇半抗原的制备方法，其特征在于，所述薄荷醇与第一琥珀酸酐的摩尔比为1:(1～1.1)；所述薄荷醇与第二琥珀酸酐的摩尔比为(0.1～0.2):1。
4.根据权利要求2所述的薄荷醇半抗原的制备方法，其特征在于，所述的将薄荷醇与第一琥珀酸酐溶解于吡啶中进行反应，得混合液的步骤，包括：
将薄荷醇与第一琥珀酸酐溶解于吡啶中，于反应温度为40～70℃的条件下进行反应12～24h，得混合液。
5.根据权利要求2所述的薄荷醇半抗原的制备方法，其特征在于，所述向所述混合液中加入第二琥珀酸酐进行搅拌，得到薄荷醇半抗原的步骤，包括：
向所述混合液中加入第二琥珀酸酐进行搅拌6～12h，得到薄荷醇半抗原。
6.一种薄荷醇人工抗原，其特征在于，所述薄荷醇人工抗原是由权利要求1所述的薄荷醇半抗原或者权利要求2-5任一所述的薄荷醇半抗原的制备方法制备得到的薄荷醇半抗原与载体蛋白进行偶联反应得到的偶联物。
7.根据权利要求6所述的薄荷醇人工抗原，其特征在于，所述薄荷醇人工抗原是由权利要求1所述的薄荷醇半抗原或者权利要求2-5任一所述的薄荷醇半抗原的制备方法制备得到的薄荷醇半抗原与牛血清白蛋白通过碳二亚胺法偶联制备得到；或者
由权利要求1所述的薄荷醇半抗原或者权利要求2-5任一所述的薄荷醇半抗原的制备方法制备得到的薄荷醇半抗原与卵清蛋白通过混合酸酐法制备得到。
8.一种薄荷醇人工抗原的制备方法，其特征在于，包括：
将薄荷醇半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺分别溶解于N,N-二甲基甲酰胺中进行搅拌活化处理，得到溶液I；
将钥孔血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白分别溶解于PBS缓冲液中，经预冷后进行搅拌处理，得到溶液II；
将所述溶液I缓慢滴加至所述溶液II中，经搅拌、透析处理，得到薄荷醇人工抗原。
9.一种薄荷醇抗体，其特征在于，所述薄荷醇抗体是由权利要求6或7所述的薄荷醇人工抗原或由权利要求8所述的薄荷醇人工抗原的制备方法制备得到的薄荷醇人工抗原经动物免疫得到。
10.一种根据权利要求6或7所述的薄荷醇人工抗原或者根据权利要求8所述的薄荷醇人工抗原的制备方法制备得到的薄荷醇人工抗原或者根据权利要求9所述的薄荷醇抗体在薄荷醇免疫检测中的应用或者在制备薄荷醇免疫试剂盒、或胶体金免疫层析试纸条、或时间分辨荧光试纸条中的应用。
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