CN115282323A - 一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用，将海洋源抗菌肽Epinecidin‑1通过微流控芯片技术负载于海藻酸盐微球中，将负载抗菌肽的海藻酸盐微球与温敏壳聚糖混合，形成抗菌肽水凝胶；通过该方法制备出的抗菌肽水凝胶，具有较好的生物相容性和抗菌性，可应用于海水浸润伤口，达到抑菌以及促进伤口愈合的效果。

Description

一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用水凝胶敷料领域，尤其涉及一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
上世纪70年代，欧美国家逐渐开始研究水凝胶抗菌敷料。相比于传统敷料，水凝胶敷料可保证创面在愈合早期具有一定的湿润程度，使得伤口不易结痂，愈合更快。目前水凝胶敷料种类繁多，有机高分子材料较为常见，其中海藻酸盐和壳聚糖因具备良好的理化性能和生物学性能而被广泛用于创面敷料的研究。
抗菌肽是生物体内产生的具有生物活性的小分子多肽，分子量约为2000-7000，一般由20-60个氨基酸残基组成。按抗菌肽的来源可分为微生物抗菌肽、植物抗菌肽、动物抗菌肽及人源性抗菌肽等。海水中的细菌与陆地不同，因此如果能寻找到一种针对海水浸润感染的抗菌肽，制成的抗菌敷料将具有更佳的针对海水浸润伤口的抑菌效果。微流控芯片技术制备微球，生产效率高，粒径易控制，适用于制备单分散系的凝胶微球。
本发明运用的抗菌肽为从一种海鱼，即石斑鱼体内提取出的抗菌肽Epinecidin-1(22-51)，对各类细菌病毒包括海水中常见的各类弧菌等具有良好的抑菌效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种载抗菌肽的水凝胶，所述水凝胶由壳聚糖、海藻酸盐以及抗菌肽Epinecidin-1制得。
优选地，所述壳聚糖的分子量为20KDa-40KDa。
优选地，所述抗菌肽Epinecidin-1的氨基酸序列为GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEE。
本发明的第二方面是提供一种上述水凝胶的制备方法，步骤包括：
S1、将壳聚糖溶解于PBS溶剂中，制得质量浓度为2％的壳聚糖溶液；将抗菌肽溶解于质量浓度为1％的海藻酸钠溶液中，再加入钙-EDTA，制得含抗菌肽的海藻酸盐溶液；
S2、将步骤S1制得的含抗菌肽的海藻酸盐溶液泵入微流控芯片，使用微流控芯片技术生产负载抗菌肽的海藻酸钙微球；将所述负载抗菌肽的海藻酸钙微球与步骤S1中制得的壳聚糖溶液混合，制得壳聚糖水凝胶，低温保存。
优选地，所述钙-EDTA的浓度为100mM。
更优选地，所述钙-EDTA的制备步骤包括：将4mL的1M CaCl2与8mL的0.5M EDTA混合并加水到35mL，滴加1M的NaOH调整溶液的pH至7.2后定容至40mL。
优选地，步骤S1中所述抗菌肽与所述海藻酸钠溶液的添加比例为1:3-1:2。
优选地，步骤S3中所述壳聚糖溶液与所述海藻酸钙微球的添加比例为1:1-3:1。
本发明的第三方面是提供一种上述水凝胶在制备医用敷料中的应用，所述医用敷料为载抗菌肽温敏水凝胶敷料，所述医用敷料用于预防海水引起的伤口感染。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供了一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用，将海洋源抗菌肽EPI-1通过微流控芯片技术负载于海藻酸盐微球中，将负载抗菌肽的海藻酸盐微球与温敏壳聚糖混合，形成抗菌肽水凝胶；通过该方法制备出的抗菌肽水凝胶，具有较好的生物相容性和抗菌性，可应用于海水浸润伤口，达到抑菌以及促进伤口愈合的效果。
附图说明
图1A为抗菌肽EPI-1的高效液相色谱(HPLC)分析结果；图1B为抗菌肽EPI-1的质谱(MS)分析结果；
图2为抗菌肽水凝胶的制备工艺流程；
图3为微流控芯片技术制备单分散系海藻酸钙微球；
图4为抗菌肽的抑菌圈试验结果(菌种：金黄色葡萄球菌；A：200μg/mL抗菌肽EPI-1；B：40μg/mL抗菌肽EPI-1；C：8μg/mL抗菌肽EPI-1；阳：阳性对照组，氧氟沙星(10μg/mL)；阴：阴性对照组，生理盐水)；
图5为大鼠背部伤口经人造海水浸泡后抗菌肽水凝胶处理与普通纱布处理的创面愈合情况对比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例
1、试剂的制备及处理
100mM钙-EDTA：将4mL的1M CaCl2与8mL的0.5M EDTA混合并加水到35mL，滴加1M的NaOH调整溶液的pH至7.2后定容至40mL；
0.2％乙酸：将100μL乙酸与50mL ddH2O混合，制得0.2％乙酸；
油：使用0.45μm PTFE微孔膜过滤含3％Span80的矿物油；
疏水剂：使用0.45μm PTFE微孔膜过滤疏水剂；
2、水凝胶的制备
将抗菌肽以1:2的添加比例溶解于1％的海藻酸钠溶液中，加入钙-EDTA，制得含抗菌肽的海藻酸盐溶液；将壳聚糖溶解于PBS溶剂中制得浓度为2％的壳聚糖溶液；
使用微流控芯片技术生产负载抗菌肽的海藻酸钙微球；将含3％Span80的矿物油以及疏水剂灌入微流控芯片，去除气泡；气泡排出后，用止流夹夹住Tygon软管，将所述含抗菌肽的海藻酸盐溶液泵入微流控芯片；凝胶过程中加入乙酸促进释放钙离子；凝胶完成后加入破滴剂去除表面活性剂，释放微球；
将所述负载抗菌肽的海藻酸钙微球与所述壳聚糖溶液混合，制得壳聚糖水凝胶，低温保存。
检测实施例1
菌种：金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)
培养基：
(1)细菌培养液：LB(配置：胰蛋白胨(Tryptone)10.0g，酵母提取物(Yeastextract)5.0g，氯化钠(NaCl)10.0g，蒸馏水定容至1.0L，用NaOH调节培养基的pH，使其达到7.4。
(2)固体LB培养基，在上述细菌培养液中加入15.0g琼脂糖/L。
器材：培养皿、滤纸、三角耙、接种环、试管、麦氏比浊管、微量移液枪等。
1、菌种接种
将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，将细菌置37℃的温箱中培养1d。
2、菌悬液制备
在超净台里，将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，用接种环轻刮菌落，摇晃，并置旋涡混合器混匀。根据麦氏比浊法，调成0.5麦氏单位的标准菌液浓度。
3、倒平
在超净台里，将培养基倒入平板，每板约15mL，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中培养2d。
4、抑菌液的配置
将抗菌肽粉末溶解于PBS中，得到浓度为200μg/mL的待测抑菌液A；取适量抑菌液A用PBS稀释5倍得到抑菌液B；取适量抑菌液B用PBS稀释5倍得到抑菌液C。
5、涂布
在超净台里，用枪取0.1mL菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
6、贴片
在超净台里，将平板平均分为至少5个区(150mm培养皿，如果培养皿较小如100mm直径，可划分为4个区)，同时用无菌水做阴性对照组，氧氟沙星(10μg/mL)作阳性对照，其他3个区域分别用抑菌液A、抑菌液B和抑菌液C作为实验组。选用抑菌圈试验专用的滤纸片。用移液枪分别定量吸取20μL抑菌液A、抑菌液B、抑菌液C、氧氟沙星(10μg/mL)以及无菌水，加到滤纸上使其充分润湿，将滤纸片贴在平板上，轻摁一下使滤纸片牢固，放置于4℃冰箱中24h。
7、培养
24h后，将平板放入培养箱中培养，培养24h后观察结果。每个培养皿拍照留存图像，使用游标卡尺测量抑菌圈大小并记录。测量抑菌圈时应选择均匀并完全无菌生长的抑菌圈进行，测量其直径应以抑菌圈外沿为界。
表1抑菌圈直径
组别 直径(mm)
抑菌液A 12
抑菌液B 9
抑菌液C 0
阳性对照组 13
阴性对照组 0
结果如表1所示，本发明使用的抗菌肽具有良好的抑菌效果。
检测实施例2
水凝胶对模拟海水浸润伤口的治疗和愈合效果测试
使用戊巴比妥钠溶液对大鼠进行麻醉，麻醉后，在大鼠背部备皮、消毒后使用环钻造出直径为12mm的全厚层皮肤缺损创面，将大鼠背部持续浸泡于人造海水中1小时，期间使用烤灯维持大鼠体温。分别使用普通纱布和抗菌肽水凝胶对各创面进行处理，定期给大鼠背部创面拍照。
结果如图5所示，与普通纱布组相比，经过本发明抗菌肽水凝胶处理后的大鼠创面面积明显缩小，相比普通纱布的愈合速度具有显著提升。
综上所述，本发明提供了一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用，将海洋源抗菌肽EPI-1通过微流控芯片技术负载于海藻酸盐微球中，将负载抗菌肽的海藻酸盐微球与温敏壳聚糖混合，形成抗菌肽水凝胶；通过该方法制备出的抗菌肽水凝胶，具有较好的生物相容性和抗菌性，可应用于海水浸润伤口，达到抑菌以及促进伤口愈合的效果。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海市第六人民医院
<120> 一种载抗菌肽的水凝胶及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Ile Phe His Ile Ile Lys Gly Leu Phe His Ala Gly Lys Met
1 5 10 15
Ile His Gly Leu Val Thr Arg Arg Arg His Gly Val Glu Glu
20 25 30

Claims (9)

1.一种载抗菌肽的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由壳聚糖、海藻酸盐以及抗菌肽Epinecidin-1制得。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为20KDa-40KDa。
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽Epinecidin-1的氨基酸序列为GFIFHIIKGLFHAGKMIHGLVTRRRHGVEE。
4.一种如权利要求1-3任一项所述水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤包括：
S1、将壳聚糖溶解于PBS溶剂中，制得质量浓度为2％的壳聚糖溶液；将抗菌肽溶解于质量浓度为1％的海藻酸钠溶液中，再加入钙-EDTA，制得含抗菌肽的海藻酸盐溶液；
S2、将步骤S1中制得的含抗菌肽的海藻酸盐溶液泵入微流控芯片，使用微流控芯片技术生产负载抗菌肽的海藻酸钙微球；将所制得的负载抗菌肽的海藻酸钙微球与步骤S1中制得的壳聚糖溶液混合，即得所述水凝胶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述钙-EDTA的浓度为100mM。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述钙-EDTA的制备步骤包括：将4mL的1M CaCl2与8mL的0.5M EDTA混合并加水到35mL，滴加1M的NaOH调整溶液的pH至7.2后定容至40mL。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述抗菌肽与所述海藻酸钠溶液的添加比例为1:3-1:2。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述壳聚糖溶液与所述海藻酸钙微球的添加比例为1:1-3:1。
9.一种如权利要求1-3任一项所述水凝胶在制备医用敷料中的应用，其特征在于，所述医用敷料用于预防海水引起的伤口感染。
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