CN105777887A - 一种石斑鱼Epinecidin-1多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石斑鱼Epinecidin‑1多肽及其应用。本发明的石斑鱼Epinecidin‑1多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明的石斑鱼Epinecidin‑1多肽是一种具有抗细菌和抗病毒活性的抗菌肽，该石斑鱼Epinecidin‑1多肽具有抗鱼类病毒的特点，可以用于制备抗病毒药物，该石斑鱼Epinecidin‑1多肽的研究将对进一步研究和开发抗病功能基因制品具有重要的科学价值和应用价值。

Description

一种石斑鱼Epinecidin-1多肽及其应用
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种石斑鱼Epinecidin-1多肽及其应用。
背景技术：
石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国南方重要的海水养殖经济种类，价值极高。近年来，随着养殖规模的扩大，爆发性死亡现象常有发生，给水产养殖业造成重大的经济损失。病毒病是危害石斑鱼健康养殖的常见病原，主要包括石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)和神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)等。目前对鱼类病害的防治，传统方式采用抗生素和化学药物，造成了药物残留、耐药性及环境污染等严重问题。为此，开展鱼类免疫抗病的基础研究及研制新型抗病基因工程产品已经成为当务之急。
抗菌肽(Antimicrobial Peptide,AMP)是一类内源性的具有广谱抗菌活性的天然生物小分子肽，广泛存在于动物、植物和真菌中，参与多种生物学过程，具有多种生物学功能，如抗菌、抗病毒、抗凋亡等，应用潜力很大。目前石斑鱼中已经发现了多种抗菌肽，Epinecidin-1是其中的一种。石斑鱼Epinecidin-1是一个编码67个氨基酸的小肽，人工合成的Epinecidin-1具有抑制副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、巴氏德杆菌(Pasteurella multocida)、摩根菌(Morganellamorganii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobrio)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、脑膜炎脓杆菌(Flavobacterium meningosepticum)和大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α的作用，但是，在抗鱼类病毒方面的作用还未见报道。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供具有抗鱼类病毒活性的石斑鱼Epinecidin-1多肽。
本发明的石斑鱼Epinecidin-1多肽是通过以下方法获得的，将石斑鱼Epinecidin-1的氨基酸序列与其他物种的Epinecidin-1氨基酸序列同源对比后，确定石斑鱼Epinecidin-1的成熟肽区域，然后通过人工合成的方法获得石斑鱼Epinecidin-1多肽，其序列为：FIFHIIKGLFHAGKMIHGLV(如SEQ ID NO.3所示)。
本发明的第二个目的是提供编码上述的石斑鱼Epinecidin-1多肽的编码基因。
本发明还提供了石斑鱼Epinecidin-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还进一步提供了编码上述石斑鱼Epinecidin-1的编码基因，优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明通过实验发现，在石斑鱼Epinecidin-1多肽的浓度为50-800μg/mL时，作用96h后对GS细胞和GB细胞无明显细胞毒性，且能够有效抑制虹彩病毒(SGIV)和神经坏死病毒(NNV)复制，有望研发成为新的抗病毒药物。
本发明的第三个目的是提供石斑鱼Epinecidin-1多肽或上述石斑鱼Epinecidin-1在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的抗病毒药物为抗虹彩病毒药物或抗神经坏死病毒药物。
一种抗病毒药物，其含有上述石斑鱼Epinecidin-1多肽或上述石斑鱼Epinecidin-1作为活性成分。
本发明的有益效果是：本发明的石斑鱼Epinecidin-1多肽是一种具有抗细菌和抗病毒活性的抗菌肽，该石斑鱼Epinecidin-1多肽具有抗鱼类病毒的特点，可以用于制备抗病毒药物，该石斑鱼Epinecidin-1多肽的研究将对进一步研究和开发抗病功能基因制品具有重要的科学价值和应用价值。
附图说明：
图1是石斑鱼Epinecidin-1多肽质谱检测图；
图2是石斑鱼Epinecidin-1多肽用HPLC高效液相色谱纯化图；
图3是不同浓度石斑鱼Epinecidin-1多肽对石斑鱼GS细胞的细胞存活率的影响；
图4是不同浓度石斑鱼Epinecidin-1多肽对石斑鱼GB细胞的细胞存活率的影响；
图5是石斑鱼Epinecidin-1多肽(图中的Epinecidin-1)对SGIV病毒滴度的影响，对照组和实验组显著性差异，用one-way ANOVA分析，用**表示(p<0.01)(N＝3)；
图6是石斑鱼Epinecidin-1多肽(图中的Epinecidin-1)对SGIV病毒基因ORF072表达的影响，对照组和实验组显著性差异，用one-way ANOVA分析，用**表示(p<0.01)(N＝3)。
图7是石斑鱼Epinecidin-1多肽(图中的Epinecidin-1)对神经坏死病毒(NNV)滴度的影响，对照组和实验组显著性差异，用one-way ANOVA分析，用**表示(p<0.01)(N＝3)；
图8是石斑鱼Epinecidin-1多肽(图中的Epinecidin-1)对神经坏死病毒(NNV)基因CP表达的影响，对照组和实验组显著性差异，用one-way ANOVA分析，用**表示(p<0.01)(N＝3)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂。新生牛血清、L15培养基、胰酶购自英淮捷基(上海)贸易有限公司；RNA提取试剂购自Promega公司，反转录酶和荧光定量PCR试剂购自Toyobo公司，其余试剂均为国产分析纯；PCR仪购自Eppendorf公司；生化培养箱购自上海博迅实业有限公司；台式高速离心机购自Beckman公司。
本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：
1.石斑鱼Epinecidin-1多肽的人工合成
将石斑鱼Epinecidin-1的氨基酸序列(具体如SEQ ID NO.1所示)与其他物种的Epinecidin-1氨基酸序列同源比对后，确定石斑鱼Epinecidin-1的成熟肽区域，然后通过化学合成的方法获得石斑鱼Epinecidin-1多肽，其序列为：FIFHIIKGLFHAGKMIHGLV(具体如SEQ ID NO.3所示)。人工合成的石斑鱼Epinecidin-1多肽用质谱检测其质量(图1)，用HPLC高效液相色谱纯化后(图2)。将检测正确的石斑鱼Epinecidin-1多肽真空干燥为粉末，分装为每管10mg的量，并用氮气作保护气以防止合成多肽的氧化变性，储存于-80℃的超低温冰箱。
2.石斑鱼Epinecidin-1多肽对虹彩病毒(SGIV)和神经坏死病毒(NNV)复制的抑制作用
(1)石斑鱼脾脏细胞(GS)和石斑鱼脑细胞(GB)培养
石斑鱼GS和GB细胞株保存于液氮之中，在使用之前，从液氮中取出，并且将其转移到培养液中培养。培养的细胞生长到一定密度之后，进行传代。
(2)石斑鱼Epinecidin-1多肽对细胞的毒性试验
传代三到四次后达到细胞达到良好的状态的时候，将消化液和培养液从冰箱中取出，常温解冻和预热；吸出培养液，缓缓加入约1.0mL的消化液；消化2-5min，期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可加入两吸管消化液终止消化，防止消化过度；加入约2mL培养液，吹打均匀，吸取10μL到细胞计数板上，在显微镜下计数，并且计算细胞的密度；按照约1×105个细胞/孔的细胞密度接种于24孔板中，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养16-24h后，吸出培养基，分别将600μL含有浓度为50，100，200，400，800，1600，3200μg/mL的石斑鱼Epinecidin-1多肽的培养基加入孔中，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养96h后，通过MTS法验证石斑鱼Epinecidin-1多肽对GS和GB细胞的毒性，试验结果如图3和图4所示。
试验结果表明，在石斑鱼Epinecidin-1多肽的浓度为50-800μg/mL时，作用96h后对GS细胞和GB细胞无明显细胞毒性。
(3)石斑鱼Epinecidin-1对虹彩病毒(SGIV)复制的影响实验
将GS细胞接种至24孔板，每孔接种约1×105个细胞，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养16-24h至细胞长满单层。在病毒感染前，实验组于培养细胞的不含血清的细胞培养基L15中加入石斑鱼Epinecidin-1多肽(终浓度为50μg/mL)，28℃预处理细胞1h，然后感染虹彩病毒(SGIV)，同时在24孔板的GS细胞中加入500μL含10％FBS的培养基至终体积600μL；对照组加加入与石斑鱼Epinecidin-1多肽相同体积的无菌水，其他操作与实验组一致，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养24h，取感染后的细胞培养物，-20℃冰箱反复冻融三次，每个实验组和对照组分别收取三个重复孔，TCID50方法测定病毒滴度，试验结果如图5所示；同时，收集平行样品，提取总RNA，检测虹彩病毒基因ORF72的表达，试验结果如图6所示。
试验结果表明，石斑鱼Epinecidin-1多肽能够降低虹彩病毒(SGIV)对细胞的感染力(图5)，有效地抑制虹彩病毒(SGIV)基因ORF72的表达(图6)，因此，石斑鱼Epinecidin-1多肽能够有效抑制虹彩病毒(SGIV)复制，具有较好的抗虹彩病毒(SGIV)活性。
(4)石斑鱼Epinecidin-1对神经坏死病毒(NNV)复制的影响实验
将GB细胞接种至24孔板，每孔接种约1×105个细胞，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养16-24h至细胞长满单层。在病毒感染前，实验组于培养细胞的不含血清的细胞培养基L15中加入石斑鱼Epinecidin-1多肽(终浓度50μg/mL)，28℃预处理细胞1h，然后感染神经坏死病毒(NNV)，同时在24孔板的细胞中加入500μL含10％FBS的培养基至终体积600μL。对照组加入与石斑鱼Epinecidin-1多肽相同体积的无菌水，其他操作与实验组一致，置于28℃、5％CO2培养箱中静置培养24h，取感染后的细胞培养物，-20℃冰箱反复冻融三次，每个实验组和对照组分别收取三个重复孔，TCID50方法测定病毒滴度，试验结果如图7所示；同时，收集平行样品，提取总RNA，检测神经坏死病毒基因CP的表达，试验结果如图8所示。
试验结果表明，石斑鱼Epinecidin-1多肽能够降低神经坏死病毒(NNV)对细胞的感染力(图7)，有效地抑制神经坏死病毒(NNV)基因CP的表达(图8)，因此，石斑鱼Epinecidin-1多肽能够有效抑制神经坏死病毒(NNV)复制，具有较好的抗神经坏死病毒(NNV)活性。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种石斑鱼Epinecidin-1多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述的石斑鱼Epinecidin-1多肽的编码基因。
3.一种石斑鱼Epinecidin-1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种编码权利要求3所述的石斑鱼Epinecidin-1的编码基因。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
6.权利要求1所述的石斑鱼Epinecidin-1多肽或权利要求3所述的石斑鱼Epinecidin-1在制备抗病毒药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物为抗虹彩病毒药物或抗神经坏死病毒药物。
8.一种抗病毒药物，其特征在于，含有权利要求1所述的石斑鱼Epinecidin-1多肽或权利要求3所述的石斑鱼Epinecidin-1作为活性成分。
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