CN115280153A

CN115280153A - 用于诊断或治疗抗癌药物耐药性的组合物

Info

Publication number: CN115280153A
Application number: CN202180018845.1A
Authority: CN
Inventors: 林钟伯; 崔载一; 郑惠媛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2022-11-01
Also published as: KR102534098B1; KR20210111176A; WO2021177691A1

Abstract

本发明涉及一种用于诊断对用于治疗胃癌的ECF组合疗法(表柔比星、顺铂和5‑氟尿嘧啶；ECF)具有耐药性的组合物，以及使用该组合物的诊断试剂盒。为了解决复发和耐药的问题，可以通过早期发现耐药的出现来抑制NINJ2，从而抑制胃癌的复发和治疗耐药。

Description

用于诊断或治疗抗癌药物耐药性的组合物

技术领域

本发明涉及一种能够诊断和治疗抗癌药物耐药性的组合物。

背景技术

癌症是人类需要解决的不治之症之一，在全球范围内，为了治愈癌症，已经投入了巨大的资金进行开发。在韩国，癌症是疾病死亡的第一大原因，每年有超过100,000人被诊断为癌症，超过60,000人死于癌症。特别是，胃癌是2018年全球诊断频率第五的疾病。过去十年来，各种用于癌症诊断和治疗的抗癌疗法发展迅速，但是癌症的死亡率仍然很高。此外，各种抗癌药物和各种抗癌疗法的尝试仍然伴随着副作用。为了减轻这些副作用，已经进行了积极的研究。

与单纯手术相比，胃癌患者术前化疗或化疗和放疗的联合可提高存活率。2017年版的国家综合癌症网络(NCNN)指南建议了三种药物联合治疗(表柔比星、顺铂和5-氟脲嘧啶；ECF)作为胃癌一线化疗方案之一，该方案于1991年由英国皇家马斯登医院(RoyalMarsden Hospital,England)首次开发。经证实，与单纯手术治疗组相比，术前联合ECF治疗组的5年存活率有利地提高了约15％或更高。尽管有这样的优势，但耐药性是拮抗成功的抗癌治疗的有效性，并使胃癌预后恶化的主要因素。癌症细胞的耐药性(化学耐药)分为已有的耐药介导因素和由给药引起的新获得的药物耐药性(癌症药物耐药性：一个不断发展的范式。《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》，2013年10月，13(10):714-26)。

获得性药物耐药性的原因可能包括，例如，药物外流增加、药物靶点的突变、DNA损伤的修复、替代信号通路的激活或避免由耐药性引起的细胞死亡。即使对耐药患者进行药物治疗，治疗效果也不能得到保证，因此有可能给医生和患者带来不必要的时间和费用负担。因此，在开始进行抗癌治疗时，应根据治疗方案的不同，考虑患者的个人特点来确定治疗方案。此外，现实需要的不是盲目地进行治疗，而是有一个标准，通过特定的生物标志物提前估计治疗效率，以便有选择地使用为患者量身定制的药物。如上所述，很少有药物耐药性相关的研究，因此，本发明人发现了一种标志物，使预先选择对ECF耐药的患者成为可能，从而完成本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种用于诊断抗癌药物耐药性的组合物。

本发明的另一目的是提供一种用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒。

本发明的又一个目的是提供一种提供抗癌药物耐药性信息的方法。

本发明的又一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物和用于预防或治疗癌症的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗抗癌药物耐药性的药物组合物和用于治疗抗癌药物耐药性的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强抗癌药物敏感性的药物组合物和用于增强抗癌药物敏感性的方法。

本发明的另一个进一步的目的是提供一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的药物组合物和用于预防或治疗抗癌耐药癌症的方法。

本发明的另一个进一步的目的是提供一种抗癌药物耐药的癌症类器官。

本发明的另一个进一步的目的是提供一种筛选用于克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或增强抗癌药物敏感性的药物的方法。

然而，本发明所要实现的目标并不局限于上述所述的目标，从以下描述中，那些本领域普通技术人员将清楚地理解到其他在此未提及的目标。

技术方案

以下，将参照附图描述本发明所述的各种实施方案。在下面的描述中，为了提供对本发明的全面了解，阐述了许多具体的细节，如具体的配置、组成和工艺等。然而，某些实施方案可以在没有一个或多个这些特定细节的情况下实施，或者与其他已知的方法和配置组合实施。在其他情况下，以免不必要地掩盖本发明，已知的工艺和制备技术没有被特别详细地描述。在本说明书中对“一个实施方案”或“一实施方案”的引用意味着与该实施方案相关的特定特征、配置、组合或特点包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“一个实施方案”在整个说明书中不同地方的出现不一定指本发明的同一个实施方案。此外，可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合所述特定特征、配置、组合或特点。

除非本说明书另有规定，本说明书中所有的科学技术术语与本发明所涉及的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

1.用于诊断抗癌药物耐药性的用途

本发明的一个实施方案涉及一种用于诊断抗癌药物耐药性的组合物。

在本发明中，所述的诊断组合物可以包含用于测量NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白或编码该蛋白基因的表达水平的试剂。

在本发明中，由所述“NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)”基因编码的蛋白属于Ninjurin家族，其能诱导神经损伤。所述NINJ2蛋白指的是一种细胞表面黏附蛋白，该蛋白在损伤神经远端段周围的施旺细胞中上调，通过促进神经突生长，在神经损伤后的神经再生中发挥作用。关于NINJ2蛋白和基因的信息可以从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得(基因编号：4815)。NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因有各种各样的变体，包括亚型-1、亚型-2和亚型-3。本发明所使用的NINJ2亚型-1和亚型-3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID:2所示，以及编码NINJ2亚型-1和亚型-3蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3和4所示。在本发明中，所述NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因源于人类，但其起源不限于人类，可能包括任何物种。

在本发明中，所述“NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因”可能由SEQ ID NO:1所示的NINJ2亚型1的氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示的NINJ2亚型3的氨基酸序列、SEQ ID NO:3所示的NINJ2亚型1的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的NINJ2亚型3的核苷酸序列组成，但不限于此。其非限制性示例可能包括与NINJ2序列具有99％至小于100％、95％至小于99％、90％至小于95％、85％至小于90％或80％至小于85％的同源性的序列，但不限于此，并可能包括所有序列，只要对本领域技术人员来说，这些序列明显地发挥了本发明的预期效果。

在本发明中，术语“药物”或“抗癌治疗药物”可以与术语“抗癌药物”互换使用，且术语“抗癌药物”是指通过杀死癌细胞和癌症干细胞而表现出抗癌作用的药物，更优选地是指治疗胃癌有效的药物。

在本发明中，所述“抗癌药物”指具有杀死癌细胞机制的药物，并且可以是包含至少一种选自下组的药物：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼(nitrotinib)、西马沙尼(semasanib)、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼(lestaurtinib)、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生(viscumalbum)、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗(ibritumomab tusetan)、七铂(heptaplatin)、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷(doxyfluridine)、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星(gimeracin)、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨(enocitabine)、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗(carmofur)、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司(temsirolimus)、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰(melphalan)、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派(thiotepa)、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁(tretonine)、依西美坦、氨鲁特米特(aminoglutethimide)、阿那格列德(anagrelide)、纳韦滨(navelbine)、法拉佐(fadrazol)、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑(vorozole)、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。优选地，所述抗癌药物可以是包含至少一种选自下组的药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶，更优选地，可以是包含表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF组合。此外，抗癌药物不限于此，可以包括与ECF属于同一家族的任何药物。

在本发明中，所述“表柔比星”是一种被归类为蒽环类家族成员的抗癌药物，已知其通过与DNA结合抑制DNA和RNA合成，并通过DNA拓扑异构酶2诱导DNA裂解抑制癌细胞。此外，表柔比星可通过产生自由基来损伤DNA，且与表柔比星同家族的药物的例子包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧柔红霉素等。

在本发明中，所述“顺铂”是指一种被归类为铂家族成员的抗癌药物，其通过DNA交联抑制DNA修复和RNA合成。属于铂家族的抗癌药物的例子包括卡铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂、菲啶(phenanthriplatin)、沙铂(satraplatin)、吡铂(picoplatin)等。

在本发明中，所述“5-氟尿嘧啶(5-FU)”是一种被归类为抗代谢物家族成员的抗癌药物，并且已知其可通过抑制代谢物来抑制细胞分裂和肿瘤生长。属于抗代谢物家族的抗癌药物的例子包括6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、光蝶呤(phototrexate)等。

本发明中的“ECF组合”对应于2017年国家综合癌症网络(NCCN)指南中提出的作为胃癌一线化疗方案之一的一种药物。所述ECF组合是1991年由英国皇家马斯登医院最先开发的一种药物，且已知术前ECF组合治疗组的5年生存率提高。然而，ECF组合存在问题，如治疗后肿瘤起始细胞(TIC)增加导致癌症复发，以及产生对ECF组合的耐药性。因此，对ECF组合的各种作用机制的研究正在进行中。

在本发明中，与ECF(表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶)同属一个家族的抗癌药物对应的是通过同一机制抑制癌细胞的药物，因此ECF耐药细胞所显示的结果不仅限于ECF组合所显示的结果，而且同样适用于从蒽环类、铂类以及抗代谢物家族中选择的一种或多种抗癌药物所显示的结果。因此，具有相同作用机制的药物并不仅限于上述药物。

在本发明中，术语“抗癌药物耐药性”指的是当定量和反复使用所述抗癌药物时，抗癌药物的效果降低，并且指的是需要增加使用抗癌药物的频率或使用的抗癌药物数量，以获得与对所述抗癌药物有耐药性的患者先前体验到的相同效果的情况，或者出现即使给药相同剂量的抗癌药物，也无法获得与以前相同的效果的情况。在本发明中，当样本与正常对照组相比，NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平的变化增加时，样本被诊断为具有抗癌药物耐药性。

在本发明中，所述的“诊断”为广义定义，包括：确定受试者对抗癌药物的敏感性；确定目前所发展的疾病是否具有抗癌药物耐药性；确定抗癌耐药癌症的预后(例如，确定癌症对抗癌药物的反应性；或提供诊断信息)。

如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的过程和死亡或生存结果的行为。术语“预后”或“预后诊断”可解释为：在治疗前/治疗后，通过综合考虑患者的病程和病情，预测疾病的进程的任何行为，而病程和病情可能因患者的生理或环境状况而有所不同。就本发明的目的而言，术语“预后”可以解释为使用抗癌药物治疗(优选地使用可视为与ECF中的每种药物属于同一家族的药物治疗，更优选地使用ECF组合治疗)后预测治疗反应性的行为，，或基于治疗反应性的预测结果，适当选择是否使用ECF组合的行为。

如本文所用，术语“肿瘤”或“癌症”是指一种细胞周期不受调控，细胞持续分裂的疾病，并根据发生的部位分为癌和肉瘤。术语“癌”是指发生在粘膜细胞或皮肤细胞等上皮细胞中的恶性肿瘤，术语“肉瘤”是指发生在肌肉、结缔组织、骨、软骨或血管细胞等非上皮细胞中的恶性肿瘤。

在本发明中，可以使用选自表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶中的一种或多种对癌症患者进行抗癌治疗，更优选地是含有表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF(表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶)的组合。此外，可被视为与ECF中每一种同属一个家族的任何抗癌药物都可以无限制地使用。

在本发明中，预后的预测可以是对癌症患者使用所述抗癌药物治疗后的治疗反应性的预测，也可以是对是否发生对所述抗癌药物的耐药性的预测。

如本文所用，术语“癌症”作为一种需要治疗的疾病，是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征是不受控制的细胞生长。所述癌症可能是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。然而，所述癌症不限于此，并且可以是任何类型的癌症进展(如肿瘤分化和/或增殖)依赖于本发明中所述的癌细胞和/或癌症干细胞的癌症。

本发明的用于诊断抗癌药物耐药性的组合物还可以含有用于测量骨膜素(periostin)和CD44蛋白中至少一种、或编码至少一种蛋白的基因的表达水平的试剂。

如本文所用，术语“骨膜素”也被称为POSTN、PN或成骨细胞特异性因子OSF-2，并且指的是人类中由POSTN基因编码的一种蛋白。此外，已知骨膜素蛋白作为α-V/β-3和α-V/β-5整合素的配体，使上皮细胞能够粘附和迁移。骨膜素蛋白是Gla域维生素K依赖因子，在许多癌症中，通过与癌细胞的整合素结合，激活Akt/PKB和FAK介导的信号通路，从而增加细胞存活、侵袭、血管生成、转移和上皮-间质转化。

在本发明中，有关骨膜素蛋白和基因的信息可从国家生物技术信息中心(NCBI)获得(基因编号：10631)，本发明中使用的骨膜素的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。在本发明中，所述骨膜素蛋白或编码该蛋白的基因起源于人类，但其起源不限于人类，可以包括任何物种。其非限制性示例可以包括与骨膜素序列具有99％至小于100％、95％至小于99％、90％至小于95％、85％至小于90％或80％至小于85％的同源性的序列，但不限于此，并且可以包括所有序列，只要本领域技术人员能够明显地看到这些序列发挥本发明所期望的效果。

如本文所用，术语“CD44”是指在细胞或癌症干细胞(如耐药癌细胞)的质膜上表达的标记物。更具体地说，CD44抗原是一种参与细胞与细胞相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。众所周知，CD44在肿瘤发生、癌症干细胞的可塑性和化学抗性中发挥着关键作用。

在本发明中，有关CD44蛋白和基因的信息可从国家生物技术信息中心(NCBI)获得(基因编号:960)，本发明中使用的CD44的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在本发明中，所述CD44蛋白或编码该蛋白的基因起源于人类，但其起源不限于人类，可以包括任何物种。其非限制性示例可以包括与CD44序列具有99％至小于100％、95％至于小于99％、90％至于小于95％、85％至于小于90％或80％至于小于85％的同源性的序列，但不限于此，并且可以包括所有序列，只要本领域技术人员能够明显地看到这些序列发挥本发明所期望的效果。

在根据本发明用于诊断抗癌药物耐药性的组合物中，用于测量蛋白表达水平的制剂可以包括选自下组的至少一种：特异性结合所述蛋白的抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)和适配体，但不限于此。

如本文所用，所述“抗体”指的是一种特异性结合抗原从而引起抗原-抗体反应的物质。就本发明的目的而言，所述抗体是指特异性地与蛋白质结合的抗体。本发明所述的抗体包括所有的多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。所述抗体可以很容易地使用本领域已知的技术制备。例如，所述多克隆抗体可采用本领域已知的方法制备，所述方法包括将蛋白抗原注射到动物体内、从动物身上采集血液和分离含有所述抗体的血清的过程。这种多克隆抗体可从任何动物物种(如山羊、兔子、绵羊、猴子、马、猪、牛或狗)制备。此外，所述单克隆抗体可以使用本领域已知的杂交瘤法(见Kohler和Milstein(1976)，欧洲免疫学杂志,6:511-519)或噬菌体抗体库技术(见Clackson等人，自然,352:624-628,1991；Marks等人，分子生物学杂志，222:58,1-597,1991)。上述方法制备的抗体可以通过凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等方法进行分离纯化。此外，本发明所述的抗体包括抗体分子的功能片段以及具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式。所述“抗体分子的功能片段”的表达是指保留至少一种抗原结合功能的片段，功能片段的例子包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2和Fv。

在本发明中，所述“寡肽”是一种由2至20个氨基酸组成的肽，其示例包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。

在本发明中，所述“肽核酸(PNA)”指的是一种类似于DNA或RNA的人工合成聚合物，由Nielsen、Egholm、Berg和Buchardt教授(哥本哈根大学，丹麦)于1991年首次引入。DNA有一个磷酸核糖骨架，而PNA有一个由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸重复单元组成的骨架。正是由于这种结构，PNA与DNA或RNA的结合亲和力显著增加，稳定性显著提高，因此被用于分子生物学、诊断分析和反义治疗。PNA详细披露在Nielsen PE,Egholm M,Berg RH,Buchardt O(1991年12月)，“通过胸腺胺取代聚酰胺的链置换对DNA的序列选择性识别(Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide)”，科学，254(5037):1497-1500。

在本发明中，所述“适配体”是一种寡核苷酸或肽分子，适配体的总体内容在BockLC等人，自然，355(6360):564-6(1992)；Hoppe-Seyler F,Butz K，“肽适配体：分子医学的强大新工具(Peptide aptamers:powerful new tools for molecular medicine)”，分子医学杂志，78(8):42630(2000)；Cohen BA,Colas P,Brent R，“从组合文库中分离的人工细胞周期抑制剂(An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatoriallibrary)”，美国国家科学院。95(24):142727(1998)中详细披露。

在根据本发明用于诊断抗癌药物耐药性的组合物中，用于测量编码所述蛋白质的基因表达水平的试剂可以包含选自下组的至少一种：特异性地结合到编码所述蛋白质的基因上的引物、探针和反义核苷酸，而不限于此。

在本发明中，所述“引物”是识别目标基因序列的片段，并包括一对正向和反向引物。优选地，所述引物是提供具有特异性和敏感性的分析结果的引物对。由于引物的核苷酸序列与样品中的非靶向序列不匹配，当引物只扩增含有互补引物结合位点的靶基因序列而不引起非特异性扩增时，可表现出较高的特异性。

在本发明中，所述“探针”是指能够与样品中待检测的靶向物质特异性结合，并可通过结合特异性识别样品中靶向物质存在的物质。探针的种类没有特别的限制，只要其是通常用于本领域的物质即可。优选地，探针可以是肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、肽、多肽、蛋白质、RNA或DNA。最优选地，探针是PNA。更具体地说，探针可以是来自有机体、其类似物或体外产生的材料的生物材料，其示例包括酶、蛋白质、抗体、微生物、动物/植物细胞和器官、神经细胞、DNA和RNA。DNA的例子包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸，RNA的例子包括基因组RNA、mRNA和寡核苷酸，蛋白质的例子包括抗体、抗原、酶和肽。

在本发明中，所述“锁核酸(LNA)”是指含有2'-O或4'-C亚甲基桥的核酸类似物[JWeiler,J Hunziker和J Hall Gene Therapy(2006)13,496.502]。LNA核苷包括DNA和RNA的常见核酸碱基，可以根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对规则形成碱基对。然而，由于亚甲基桥导致的分子“锁定”，LNA在沃森-克里克键中未能形成理想形状。当LNA被整合到DNA或RNA寡核苷酸中时，它可以更快地与互补的核苷酸链配对，从而增加双链的稳定性。

在本发明中，所述“反义”指具有核苷酸碱基序列和亚单位对亚单位骨架的寡聚体，该寡聚体允许反义寡聚体通过沃森-克里克碱基配对与RNA中的目标序列杂交，在目标序列中形成RNA：寡聚体异源双链核酸分子，通常与mRNA相结合。所述寡聚体可能与靶序列有精确的序列互补或接近互补。

根据本发明的有关NINJ2、骨膜素或CD44蛋白或编码这些蛋白的基因的信息是已知的。因此，基于这些信息，本领域技术人员可以很容易地设计出特异性结合编码所述蛋白质的基因的引物、探针或反义核苷酸。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒，所述试剂盒含有根据本发明的诊断抗癌药物耐药性的组合物。

在本发明中，所述“试剂盒”指的是一种能够通过使用可检测标签标记特异性结合到生物标志物组件的探针或抗体来评估生物标志物表达水平的工具。就探针或抗体而言，术语“标记”旨在包括通过将可检测物质偶联到探针或抗体上的直接标记，以及通过与另一种直接标记的试剂的反应性对探针或抗体的间接标记。所述试剂盒可包括显色底物溶液，以诱导与所述标签的显色反应；一个洗涤溶液和其他溶液，并可配制为包含所要使用的试剂组分。在本发明中，所述试剂盒可能是包含进行RT-PCR所必需的基本元件的试剂盒，除每个标记基因特异性引物对外，还可能包括试管、反应缓冲液、脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶、逆转录酶、DNase、RNase抑制剂、无菌水等。此外，所述试剂盒可能是用于检测预测HPD预后的基因的试剂盒，其包含进行DNA芯片分析所需的基本元件。所述DNA芯片试剂盒可以包括将对应于基因或其片段的cDNA作为探针附着的底物，并且所述底物可以包括与定量控制基因或其片段相对应的cDNA。本发明的试剂盒不限于此，而且可以是本领域已知的任何试剂盒。

在本发明中，所述试剂盒可以是，但不限于，RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或多反应监测(MRM)试剂盒。

本发明所述的试剂盒还可以包括一种或多种适用于分析方法的其他组分组合物、溶液或装置。例如，根据本发明所述的试剂盒还包括进行逆转录聚合酶反应所需的基本元件。所述逆转录聚合酶反应试剂盒包括一对特异性针对编码标记蛋白的基因的引物。每条引物都是一条具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸，其长度可约为7bp～50bp，更优地约为10bp～30bp。此外，所述试剂盒可包括特异性针对对照基因核酸序列的引物。此外，所述反转录聚合酶反应试剂盒可包括试管或其他合适的容器、缓冲液(具有不同的pH和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTPs)、酶(如Taq-聚合酶和逆转录酶)、DNAse和RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水等。

此外，根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒可包括进行DNA芯片分析所需的基本元件。所述DNA芯片试剂盒可包括附着有与所述片段相对应的基因或cDNA或寡核苷酸的底物，以及用于构建荧光标记探针的试剂、制剂和酶。此外，所述底物可以包括一个控制基因或与其片段相对应的cDNA或寡核苷酸。

此外，根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒可以包括进行ELISA所需的基本元件。所述ELISA试剂盒可包括对所述蛋白具有特异性的抗体。所述抗体对标记蛋白具有很高的特异性和亲和力，其与其他蛋白无交叉反应性，可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包括对对照蛋白具有特异性的抗体。此外，所述ELISA试剂盒还可包括能够检测结合抗体的试剂，例如，标记的二抗、生色团、酶(例如，与抗体结合)及其底物，或能够与抗体结合的其他物质。

在根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒中，用于抗原-抗体结合反应的固定装置可以是由硝化纤维膜、PVDF膜、聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂或玻璃制成的玻片合成的孔板，但不限于此。

在根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒中，用于二抗的标签优选用于显色的常规显色剂，所述标签的示例包括但不限于荧光素(如HRP(辣根过氧化物酶))、碱性磷酸酶、胶体金、FITC(聚L-赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯)、RITC(罗丹明-B-异硫氰酸酯)和染料。

在根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒中，根据显色标记优选诱导显色反应的显色底物，其可以是TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)、ABTS[2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]或OPD(邻苯二胺)。在这种情况下，所述显色底物更优选地以溶解在缓冲液(0.1M NaAc,pH 5.5)中的形式提供。显色底物(如TMB)被作为二抗偶联物的标记的HRP降解，形成显色剂，通过目视检查显色剂的沉积程度来检测标记蛋白的存在。

根据本发明所述的用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒中的洗涤液优选包括磷酸盐缓冲液、NaCl和吐温20。更优选地，所述洗涤液为由0.02M磷酸盐缓冲液、0.13M NaCl和0.05％吐温20组成的缓冲液(PBST)。抗原-抗体结合反应后，所述二抗能够与所述抗原-抗体复合物发生反应，然后将适量的洗涤液加入固定装置中洗涤所述得到的偶联物3-6次。作为反应停止溶液，可以优选使用硫酸(H₂SO₄)溶液。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于提供用于诊断抗癌药物耐药性的信息的方法。

本发明所述的方法可以包括从感兴趣的受试者分离的生物样本中测量NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平的步骤。

本发明所述的方法可能旨在筛选从所述感兴趣的受试者分离的生物样本中抗癌药物耐药性的存在或不存在。

在本发明中，所述的“感兴趣的受试者”指患有或可能患癌症的受试者，并且可以是包括人类在内的哺乳动物。例如，感兴趣的受试者可以选自下组：人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猴子、狗、猫、牛、马、猪、绵羊和山羊。优选地，感兴趣的受试者可以是人，但不限于此。

在本发明中，所述“生物样本”是指从所述受试者中获得或衍生而来的任何材料、生物液体、组织或细胞。例如，所述生物样本可以是选自下组的至少一种：全血、白细胞、外周血单个核细胞、白细胞层、血浆、血清、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻吸液、呼吸的空气、尿液、精液、唾液、腹膜洗液、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、胰液、淋巴液、胸膜液、乳头吸液、支气管吸液、滑膜液、关节吸液、器官分泌物、细胞、细胞提取物或脑脊液，但不限于此。

在本发明中，所述方法可以进一步包括测量选自骨膜素和CD44中的至少一个蛋白的表达水平或编码至少一个蛋白的基因的步骤。

在本发明中，所述的用于测量蛋白表达水平的试剂可以包括选自下组的至少一种：抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)和适配体，所述抗体、寡肽、配体和适配体特异性结合于所述蛋白。

在本发明中，可以通过蛋白芯片分析、免疫分析、配体结合分析、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)分析、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)分析、放射免疫分析、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体固定分析、双向电泳分析、液相色谱-质谱(LC-MS)、LC-MS/MS(液相色谱-质谱/质谱)、蛋白免疫印迹(Western blotting)或ELISA(酶联免疫吸附分析)测量所述蛋白表达水平。

此外，在本发明中，可以通过多反应监测(MRM)方法来测量所述蛋白的表达水平。

在本发明中，通过用同位素取代靶肽的特定氨基酸而获得的合成肽或大肠杆菌β-半乳糖苷酶，都可作为多反应监测方法中的内标物质。

在本发明中，所述NINJ2蛋白可以由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，但不限于此。

在本发明中，所述骨膜素蛋白可以由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成，但不限于此。

在本发明中，所述CD44蛋白可以由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成，但不限于此。

在本发明中，所述的用于测量编码所述蛋白质的基因表达水平的试剂可以包括选自下组的至少一种：引物、探针和反义核苷酸，所述引物、探针和反义核苷酸特异性结合到编码所述蛋白质的基因。

在本发明中，可以通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNase保护试验(RPA)、RNA印迹法(Northern blotting)或DNA芯片试验来测量编码所述蛋白的基因表达水平。

在本发明中，所述的编码NINJ2蛋白的基因可以由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成，但不限于此。

在根据本发明所述的提供信息的方法中，所述抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)、适配体、引物、探针等与上述重叠，因此将省略对其的详细描述，以避免本说明书过于复杂。

在本发明中，当从感兴趣的受试者分离的生物样本中检测到的NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因表达水平高于对照时，就可以预测感兴趣的受试者具有抗癌药物耐药性或产生抗癌药物耐药性的可能性较大，由此可以预测受试者对所述抗癌药物的治疗反应性较低或受试者的癌症治疗预后较差。

在本发明中，除了在所感兴趣的受试者分离的生物样本中检测到的NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平高于对照，当选自骨膜素和CD44蛋白中的至少一个蛋白或编码至少一个蛋白的基因的表达水平高于对照时，可以预测感兴趣的受试者具有抗癌药物耐药性或产生抗癌药物耐药性的可能性较大，从而可以预测受试者对所述抗癌药物的治疗反应性较低或受试者的癌症治疗预后较差。

在本发明中，所述“对照”可以是未发生抗癌药物耐药性的正常对照，或者是抗癌药物敏感细胞中NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因表达水平的平均值或中位数。可以将对照中标记蛋白或编码该蛋白的核酸分子的表达水平与待分析的癌症患者来源的生物样本中标记蛋白或编码该蛋白的核酸分子的表达水平进行比较，判断其表达水平的变化是否显著，从而诊断抗癌药物耐药性的存在或不存在。所述正常对照样本的范围还包括来自确认的对所述感兴趣的抗癌药物没有获得耐药性的癌症患者的细胞、细胞培养物以及来自所述癌症患者的血液、血清、血浆和组织。

在本发明中，所述抗癌药物可以是包含选自下组的至少一种的药物：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。优选地，所述抗癌药物可以是包含选自下组的任何一种的药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶，更优选地，可以是包含表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF组合。此外，抗癌药物不限于此，可以包括与ECF属于同一家族的任何药物。

在本发明中，所述癌症可能是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。然而，所述癌症不限于此，并且可以是任何类型的癌症进展(如肿瘤分化和/或增殖)依赖于本发明中所述的癌细胞和/或癌症干细胞的癌症。

2.用于癌症治疗和抗癌药物耐药性的治疗的用途

本发明的另一个实施方案涉及一种用于预防或治疗癌症的药物组合物。

在本发明的组合物中，所述癌症是在感兴趣的受试者中已经发生或可能发生的癌症。优选地，所述癌症可以是NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因的表达水平高于对照的癌症，但不受其限制。其中，对照可以是正常个体相应组织中NINJ2蛋白或编码该蛋白基因的表达水平，或其平均值或中值，或在癌症或相应癌症中NINJ2蛋白或编码该蛋白基因的表达水平，或其平均值或中值，但不受其限制。

在本发明中，所述癌症可以是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。然而，所述癌症不限于此，并且可以是任何类型的癌症进展(如肿瘤分化和/或增殖)依赖于本发明中所述的癌细胞和/或癌症干细胞的癌症。

如本文所用，术语“预防”可以包括但不限于，通过使用本发明所述的组合物阻断由癌细胞不受控制的生长引起的症状或抑制或延迟所述症状的任何行动。

如本文所用，术语“治疗”可以包括但不限于，通过使用本发明所述的组合物减轻或有益地改变由癌症细胞不受控制的生长引起的症状的任何行动。

本发明所述的组合物可以包含作为活性成分的：用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂；或者是降低编码所述蛋白质的基因表达水平的制剂。

在本发明中，所述的NINJ2蛋白可以由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，以及编码所述的NINJ2蛋白的基因可以由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列组成，但不受限于此。

本发明所述的组合物可以进一步包含用于降低选自骨膜素和CD44中的至少一种蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码至少一种蛋白的基因的表达水平的制剂。

在本发明中，所述骨膜素蛋白可以由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列组成，但不受限于此。

在本发明中，所述CD44蛋白可以由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成，但不受限于此。

根据本发明所述的用于降低所述蛋白质的活性或表达水平的制剂可以包括选自下组的一种或多种：特异性结合所述蛋白质或其部分的化合物、肽、模拟肽、适配体、抗体和天然产物，而不限于此。然而，所述的用于降低所述蛋白的活性或表达水平的制剂不限于此，并且可以包括通过对目标NINJ2蛋白直接或间接作用而表现出抑制其活性或表达效果，且可以很容易地通过使用本领域常用的方法的已知技术获得的任何制剂。

在本发明中，所述“模拟肽”是一种抑制所述NINJ2蛋白结合结构域从而抑制NINJ2活性的肽或非肽。不可水解肽类似物的主要残基可以使用β-转二肽核(Nagai等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett)26:6 47,1985)，酮亚甲基伪肽(Ewenson等人，医学化学期刊(JMed Chem)，29:295,1986；和Ewenson等人的《肽：结构与功能》(第九届美国肽研讨会论文集)，皮尔斯化工有限公司，罗克兰，以色列，1985年)、氮杂卓(Huffman等人的《肽：化学与生物学》，G.R.Marshall主编，EScOM出版社：莱顿，荷兰，1988年)、苯二氮卓(Freidinger等人的《肽；化学和生物学》，G.R.Marshall主编，EScOM出版社：莱顿，荷兰，1988年)、β-氨基醇(Gordon等人，生化生物物理研究通讯期刊(Biochem Biophys Res commun)，126:419，1985)和取代的γ-内酰胺环(Garvey等人的《肽：化学和生物学》，G.R.Marshell主编，EScOM出版社：莱顿，荷兰，1988年)。

在本发明中，所述“适配体”是一种具有自身稳定的三级结构的单链核酸(DNA、RNA或修饰过的核酸)，其能够以高亲和力和特异性与靶分子结合。自从被称为SELEX(通过指数富集的配体的系统进化)的适配体发现技术被首次开发以来(Ellington,AD和Szostak,JW，自然，346:818-822,1990)，许多可以与各种靶分子(包括有机小分子、肽和膜蛋白等)结合的适配体不断被发现。所述适配体可与单克隆抗体相媲美，因为其具有能够以独特的高亲和力(通常为pM水平)和特异性与靶分子结合的特点，并具有作为替代抗体尤其是“化学抗体”的高潜力。

在本发明中，所述“抗体”可以通过注射所述蛋白质制备或可在市场上获得。此外，所述抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和能够与表位结合的片段。

其中，可以通过将所述蛋白质注射到动物中并从相应的动物体内采集血液来获得含有所述抗体的血清的常规方法来制备所述的多克隆抗体。这种多克隆抗体可以用本领域任何已知的方法纯化，并从任何动物物种宿主(如山羊、兔子、绵羊、猴子、马、猪、牛、狗等)中制成。

所述单克隆抗体可以使用任何通过培养连续细胞系来提供抗体分子技术生产。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术。

此外，还可以产生含有所述蛋白特异结合位点的抗体片段。例如，F(ab')2片段可以通过用胃蛋白酶降解抗体分子而产生，而Fab片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫键而产生，但不限于此。另外，通过减少Fab表达文库，可以快速、容易地鉴定出具有期望特异性的单克隆Fab片段。

在本发明中，所述抗体可与固体底物结合，以促进后续的洗涤或分离复合物等步骤。固体底物的示例包括合成树脂、硝化纤维素、玻璃基板、金属基板、玻璃纤维、微球、微珠等。此外，合成树脂的示例包括聚酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、PVDF、尼龙等。

在本发明中，用于降低所述蛋白活性或表达水平的制剂可以特异性结合SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的NINJ2蛋白多肽。优选地，本发明组合物可能包含对NINJ2蛋白具有特异性的抗体，其中所述抗体可以特异地结合SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽，而不限于此。

根据本发明，所述的用于降低编码所述蛋白质的基因表达水平的试剂可以包括选自下组的一种或多种：与编码所述蛋白质的基因(优选为该基因或其一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶，而不限于此。然而，所述的用于降低所述基因表达水平的制剂不限于此，并且可以包括任何通过对编码靶向NINJ2蛋白的基因直接或间接作用而表现出抑制其表达效果，并且可以很容易地通过已知的技术，使用本领域中常用的方法获得的制剂。

在本发明的一个实施例中，根据本发明所述的用于降低编码NINJ2蛋白的基因表达水平的试剂可以包括选自下组的一种或多种：与SEQ ID NO 5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸(这是编码NINJ2蛋白的基因的一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶，，而且不限于此。

在本发明中，所述的反义核苷酸如沃森-克里克碱基对所定义的与DNA、未成熟mRNA或成熟mRNA的互补核苷酸序列结合(杂交)，从而中断DNA中蛋白质的遗传信息传递。所述反义核苷酸对靶序列的特异性的性质，使它们具有多用途。由于反义核苷酸是长链的单体单位，相对于靶向RNA序列，所述的反义核苷酸很容易合成。近年来许多研究证实了反义核苷酸作为研究靶蛋白的生化手段的效用。由于寡核苷酸化学和核苷酸合成在细胞系吸附、靶标结合亲和力和核酸酶抗性等方面取得了很大的进展，反义核苷酸的使用可以被认为是一种新型的抑制剂。

在本发明中，所述的“shRNA”和“siRNA”是能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子，可以抑制目的基因的表达，因此被用作一种高效的基因敲除方法或基因治疗方法。shRNA具有发夹结构，由单链寡核苷酸内的互补序列结合形成。在体内，所述的shRNA可能被dicer酶切割成双链寡核苷酸siRNA，这是一个长度为21～25个核苷酸的短RNA片段，可以与具有互补序列的mRNA特异性结合，抑制mRNA的表达。此外，siRNA是一种长度为21～25个核苷酸的短双链RNA(dsRNA)片段，通过修饰目标mRNA来诱导RNA干扰(RNAi)。

在本发明中，使用哪一种shRNA和siRNA可以由本领域技术人员来确定，如果它们所针对的mRNA序列相同，则可以预期类似的表达减少效果。就本发明的目的而言，siRNA可以特异性作用于NINJ2编码基因以切割NINJ2基因(例如，mRNA分子)和RNA干扰(RNAi)，从而抑制NINJ2蛋白的表达。siRNA可以通过化学或酶的方式合成。所述的生产siRNA的方法并没有特别的限制，目前本领域已知的方法可以用于生产siRNA。所述的生产siRNA的方法的例子包括但不限于：直接化学合成siRNA的方法、使用体外转录合成siRNA的方法、酶切体外转录合成的长双链RNA的方法、通过细胞内传递shRNA表达质粒或病毒载体的表达方法，以及通过细胞内传递PCR(聚合酶链反应)诱导的siRNA表达盒的表达方法。

在本发明的一个实施例中，所述的用于降低编码NINJ2蛋白的基因表达水平的制剂可以是由SEQ ID NO:9或10所示的核苷酸序列组成的shRNA，但不限于此。

在本发明的另一个实施例中，所述的用于降低编码NINJ2蛋白的基因表达水平的制剂可以是由SEQ ID NOs:11和12所示的核苷酸序列组成的siRNA，但不限于此。

在本发明中，所述的“核糖酶”指具有催化活性的RNA分子。已知有各种活性的核糖酶，NINJ2基因的核糖酶包括已知的核糖酶或人工产生的核糖酶。另外，具有目标特异性RNA裂解活性的核糖酶可以用已知的标准技术生产。

本发明的另一个实施方案还涉及用于治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的药物组合物。

根据本发明所述的用于治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的药物组合物可以包含作为活性成分的用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白的基因的表达水平的制剂。

在本发明的一个实施例中，所述的用于降低编码所述NINJ2蛋白的基因表达水平的制剂可以含有选自下组的任何一种或多种：与SEQ ID NO 5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸(这是编码NINJ2蛋白的基因的一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA和核糖酶，而且不限于此。

本发明所述的组合物还包含用于降低选自骨膜素和CD44中的至少一种蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码至少一种蛋白的基因的表达水平的制剂。

在本发明中，术语“抗癌药物耐药性”是指抗癌药物在定量和反复使用时，其效果降低，并且是指需要增加使用抗癌药的频率或使用的抗癌药数量，以获得与对该抗癌药有耐药性的患者先前体验到的相同效果的情况，或者出现即使给药相同剂量的抗癌药物，也无法获得与以前相同的效果的情况。

在本发明中，术语“抗癌药物耐药性治疗”是指从抗癌药物在定量反复使用时效果下降的状态中恢复，或从需要增加使用抗癌药物的频率或使用抗癌药物的数量，以获得与对该抗癌药物有耐药性的患者先前经历的相同效果的状态中恢复，或者从即使服用相同剂量的抗癌药物，也无法获得与以前相同的效果的情况中恢复。更具体地说，术语“抗癌药物耐药性治疗”指的是创造一种条件，在这种条件下，即使使用频率较低或剂量较低的抗癌药物也能产生相同的抗癌效果，或者在抗癌药物出现耐药性之前，即使使用相同剂量或较先前低剂量的抗癌药物也能获得相同的效果。

在本发明中，所述抗癌药物可以是包含选自下组的至少一种的药物：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。优选地，所述抗癌药物可以是包含至少一种选自下组的药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶，更优选地，可以是包含表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF组合。此外，抗癌药物不限于此，可以包括与ECF属于同一家族的任何药物。

在根据本发明所述的治疗抗癌药物耐药性的药物组合物和用于增强抗癌药物敏感性的组合物中，每种蛋白质或编码该蛋白质的基因、用于降低所述蛋白质的活性或表达水平的制剂或用于降低编码所述蛋白质的基因表达水平的制剂，与上述用于预防或治疗癌症的药物组合物中所述相同，因此，为了避免本说明书过于复杂，将省略对其的详细描述。

本发明的进一步实施方案涉及用于预防或治疗抗癌药物耐药癌症的药物组合物。

本发明所述的组合物可以包含作为活性成分的用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白的基因的表达水平的制剂。

在本发明的一个实施例中，所述的用于降低编码所述的NINJ2蛋白的基因表达水平的制剂可能含有选自下组的任何一种或多种：与SEQ ID NO 5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸(这是编码NINJ2蛋白的基因的一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA和核糖酶，而且不限于此。

本发明所述的组合物能够非常有效地治疗具有抗癌药物耐药性的抗癌耐药癌症。本发明所述的组合物可以通过降低具有抗癌药物耐药性的癌症的抗癌药物耐药性，同时增强癌症的抗癌药物敏感性，非常有效地用于预防、缓解或治疗癌症。

在本发明中，所述抗癌药物可能是包含选自下组的至少一种的药物：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。优选地，所述抗癌药物可以包含至少一种选自下组的药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶，更优选地，可以是包含表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF组合。此外，抗癌药物不限于此，可以包括与ECF属于同一家族的任何药物。

在根据本发明的用于预防或治疗抗癌耐药癌症的药物组合物中，每一种蛋白质或编码该蛋白质的基因、用于降低所述蛋白质的活性或表达水平的制剂、或用于降低编码所述蛋白质的基因表达水平的制剂，与上述用于预防或治疗癌症的药物组合物中所述相同，因此，为了避免本说明书过于复杂，将省略对其的详细描述。

在本发明中，所述药物组合物可以是胶囊、片剂、颗粒剂、注射溶液、软膏、粉末或饮料的形式。所述药物组合物可用于向人给药。

为了使用，本发明所述的药物组合物可以按照常规方法配制为口服制剂，包括粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、水悬浮液等、皮肤外部制剂、栓剂和无菌注射溶液，而不限于此。本发明所述的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。可用于本发明的药学上可接受的载体的示例包括：可用于口服给药的粘结剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料等；可用于注射的缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等；以及可用于局部给药的基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明所述的药物组合物可以通过将其与如上所述的药学上可接受的载体混合以配制成各种形式。例如，对于口服给药，本发明所述的药物组合物可以配制为片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、硅片或类似物，对于注射，可以配制为单位剂量安瓿或多剂量小瓶。此外，本发明所述的药物组合物可以配制为溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂或类似物。

同时，适合配制的载体、赋形剂和稀释剂的示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯醇吡啶酮、水、羟甲基苯甲酸酯、羟丙基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，本发明所述的药物组合物还可以包含填料、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香精、乳化剂、防腐剂或类似物。

根据本发明所述的药物组合物的给药途径包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔、鼻内、胃肠、局部、舌下和直肠内。首选口服或肠外给药。

如本文所用，术语“肠外”是指包括皮下、经皮、静脉、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、硬膜内、病灶内和颅内注射或输液技术。优选地，本发明所述的药物组合物也可以配制为直肠内给药栓剂，而不限于此。

本发明所述的药物组合物可以根据各种因素而变化，包括使用的特定化合物的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时期、给药途径、排泄率、药物含量以及要预防或治疗的特定疾病的严重程度。所述药物组合物的剂量可由本领域技术人员根据病人的病情和体重、疾病的严重程度、药物形式以及给药途径和时间适当选择，剂量可为0.0001-50mg/kg/天或0.001-50mg/kg/天。所述药物组合物可每天给药一次或多次。所述剂量不以任何方式限制本发明的范围。根据本发明所述的药物组合物可以配制成药丸、糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液或悬浮液。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗癌症的方法。

本发明所述的方法可以包括步骤：向有需要的受试者施用有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或者是用于降低编码所述蛋白基因表达水平的制剂。

在本发明的一个实施例中，所述方法包括步骤：施用有效量的选自下组的任意一种或多种：与SEQ ID NO 5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸(这是编码NINJ2蛋白的基因的一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA和核糖酶，，而且不限于此。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的方法。

在本发明的一个实施例中，所述方法包括步骤：施用有效量的选自下组的任意一种或多种：与SEQ ID NO 5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸(这是编码NINJ2蛋白的基因的一部分)互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA和核糖酶，而且不限于此。

本发明的另一个进一步实施例涉及一种用于治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的方法。

在所述的用于预防或治疗癌症的方法，预防或治疗抗癌耐药癌症的方法，增强抗癌药物敏感性的方法，以及治疗抗癌药物耐药的方法中，根据本发明，每种蛋白质或编码该蛋白质的基因，用于降低所述蛋白质的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因表达水平的制剂，以及与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶，与上述用于预防或治疗癌症的药物组合物相同，因此为避免本说明书过于复杂，将省略对其的详细描述。

如本文所用，术语“给药”是通过任何合适的方法向受试者提供提供本发明所述的某种组合物。

在本发明中，有需要给药的“受试者”可以包括哺乳动物和非哺乳动物。其中，所述的哺乳动物的示例包括但不限于人类、非人类灵长类动物，如黑猩猩、其他猿类或猴子物种；家畜动物，如牛、马、绵羊、山羊或猪；家养动物，如兔子、狗或猫；实验动物，如啮齿类动物，例如大鼠，小鼠或豚鼠。此外，在本发明中，所述的非哺乳动物的示例包括但不限于鸟类或鱼类。

在本发明中，如上文所述给药的组合物的配制不受特别限制。所述组合物可以作为固体剂型制剂、液体剂型制剂或用于吸入的气溶胶制剂给药。具体地说，所述组合物可以作为固体剂型给药，其目的是在使用前不久转化为液体剂型供口服或肠外给药。例如，所述组合物可以配制和使用为口服制剂，如粉末、颗粒、胶囊、片剂或水悬液，以及外用制剂、栓剂或无菌注射溶液，但不限于此。

此外，在本发明中，药学上可接受的载体可以与本发明所述的组合物一起附加给药。可用于本发明的药学上可接受的载体包括可用于口服给药的粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料等；可用于注射的缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等；以及可用于局部给药的基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明所述的组合物可以通过将其与上述所述的药学上可接受的载体混合以配制成各种形式。例如，对于口服给药，本发明的组合物可以配制为片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、硅片或类似物，对于注射，可以配制为单位剂量安瓿或多剂量小瓶。此外，本发明所述的组合物可以配制为溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂或类似物。

如本文所用，所述“药物有效量”是指提供所需生物结果的足够数量的制剂。所述结果可能是某种疾病的体征、症状或原因的减少和/或减轻，或任何其他所需的生物系统的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是此处所公开的组合物在临床上显著减少疾病所需的量。在任何个别情况下，适当的有效剂量可以由本领域技术人员通过常规实验来决定。因此，表达“有效量”一般指活性物质具有治疗作用的量。在本发明的情况下，所述活性物质是用于预防、改善或治疗癌症的制剂，同时又是一种用于预防、改善或治疗抗癌耐药癌症的制剂。

本发明所述的组合物可以根据各种因素而变化，包括使用的活性物质的活性、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时期、给药途径、排泄率、药物含量以及要预防或治疗的特定疾病的严重程度。所述活性物质的剂量可由本领域技术人员根据患者的病情和体重、疾病的严重程度、药物形式以及给药途径和时间适当选择，剂量可为0.0001-100mg/kg/天或0.001-100mg/kg/天。所述组合物可以每天给药一次或几次。所述剂量不以任何方式限制本发明的范围。根据本发明所述的组合物可以配制成药丸、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液或悬浮液。

本发明所述的活性物质可以单独使用或与手术、放疗、激素治疗、化疗和使用生物反应修饰剂的方法联合使用。

此外，本发明所述的组合物还可与其他抗癌药物组合使用。其中，所述抗癌药物可能是选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、卡培他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内脂、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、伏立诺他、恩替诺特、苯乙双胍、二甲双胍、他拉唑帕尼和卡莫司汀，但不限于此。

3.抗癌耐药癌症类器官

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种抗癌耐药癌症类器官。

在本发明中，所述癌症类器官包括表达NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因的癌细胞。

在本发明中，所述NINJ2蛋白可以是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的NINJ2亚型1和由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的NINJ2亚型3中的至少一个。

在本发明中，所述编码NINJ2蛋白的基因可以是由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列组成的NINJ2亚型1基因和由SEQ ID NO:4所示核苷酸序列组成的NINJ2亚型3基因中的至少一个。

在本发明中，所述癌细胞可以额外表达选自骨膜素和CD44中的至少一种蛋白质，或编码至少一种蛋白质的基因。

在本发明中，可对所述癌细胞进行工程改造成以过表达所述蛋白质或编码所述蛋白质的基因，并且优选地，可以通过将包含编码所述蛋白质的基因的重组载体引入到所述癌细胞中来转染所述癌细胞。

如本文所用，术语“载体”指的是在宿主细胞中表达感兴趣的基因的手段。所述载体可以包括用于表达感兴趣基因的元件，包括复制起点、启动子、操作子、转录终止子等，还可以进一步包括用于导入宿主细胞基因组的适当酶位点(例如，限制性内切酶位点)和/或用于识别成功导入宿主细胞的选择标记，和/或核糖体结合位点(RBS)、内部核糖体入口位点(IRES)等，用于翻译成蛋白质。所述载体可以通过传统的基因工程方法进行改造，从而使上述融合多核苷酸(融合启动子)作为启动子。所述载体还可以包括除启动子之外的转录控制序列(例如，增强子等)。

在本发明中，所述重组载体可以是病毒载体或非病毒载体。所述病毒载体可以是腺病毒载体、包括慢病毒的逆转录病毒载体、腺相关病毒载体或单纯疱疹病毒载体，但不限于此。此外，所述非病毒载体可以是质粒载体、噬菌体载体、脂质体、细菌人工染色体、人工酵母染色体等，但不限于此。

在本发明中，所述重组载体中感兴趣的基因可以操作地连接到融合多核苷酸。术语“操作连接”是指一个基因表达控制序列和另一个核苷酸序列之间的功能连接。所述基因表达控制序列可以通过“操作连接”来控制其他核苷酸序列的转录和/或翻译。在重组载体中，所述的融合多核苷酸可以连接到感兴趣基因的5'端，从而将融合多核苷酸与感兴趣基因操作连接。当编码所述的要表达的感兴趣的蛋白的基因被可操作地连接时，本发明的重组载体可以用作目标蛋白表达载体，并能够在适当的宿主细胞中高效地表达感兴趣的蛋白。

本发明所述的重组载体可以进一步包括转录控制序列。所述的转录控制序列可以选自下组的至少一种：转录终止序列(如多聚腺苷化序列(pA))和复制起始点(如f1复制起始点、SV40复制起始点、pMB1复制起始点、腺病毒复制起始点、AAV复制起始点和BBV复制起始点)，但不限于此。

此外，在本发明中，所述的重组载体可进一步包括选择标记。所述选择标记是用于确认重组载体是否成功导入宿主细胞或构建稳定细胞系的基因。例如，所述选择标记可以选自下组的至少一种：耐药性基因(如抗生素)、代谢相关基因、基因扩增基因等。

在本发明中，可以使用本领域已知的递送方法将重组载体递送(引入)到癌细胞中。所述递送方法可以是，例如，微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、超声穿孔、磁感染、脂质体介导转染、基因轰击或使用树枝状聚合物和无机纳米颗粒的方法，但不限于此。

在本发明中，所述抗癌药物可能是一种药物，其包含选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。优选地，所述抗癌药物可以包含至少一种选自下组的药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶，更优选地，可以是包含表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶的ECF组合。此外，抗癌药物不限于此，可以包括与ECF属于同一家族的任何药物。

在本发明中，表达所述NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因的癌细胞可能表现出对抗癌药物的耐药性。因此，就本发明的目的而言，所述癌细胞可形成可用于筛选用于克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或能够增强抗癌药物敏感性的药物的类癌症器官。

如本文所用，术语“类器官”是指具有3D结构的细胞，并意指通过人工培养工艺制备的组织样模型，该模型不是从动物身上收集或获得的。与2D培养不同，3D细胞培养可以让细胞在体外向各个方向生长。

4.用于克服或治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的药物筛选方法

本发明的进一步实施方案还涉及用于筛选用于克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或用于增强抗癌药物敏感性的药物的方法。

根据本发明所述的筛选方法可以包括以下步骤：在体外用候选物质处理表达NINJ2蛋白或编码该蛋白的基因的癌细胞或本发明提供的癌症类器官；以及在用候选物质治疗后的癌细胞或癌症类器官中检测所述NINJ2蛋白的活性或表达水平，或检测编码所述蛋白的基因的表达水平。

在本发明中，术语“筛选”是指通过特定的操作或评价方法从由几种物质组成的候选组中选择具有任何所需的特定性质的物质。

在本发明中，所述癌细胞可以从感兴趣的受试者(优选具有或可能具有抗癌药物耐药性的受试者)中分离出，或可经过改造以过表达NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因。优选地，可以通过将含有编码所述NINJ2蛋白的基因的重组载体引入到癌细胞中来转染癌细胞。

此外，在本发明中，所述癌细胞可进一步表达选自CD44和骨膜素蛋白的至少一种或编码至少一种蛋白的基因，或可以经过改造以过表达选自CD44和骨膜素蛋白的至少一种或编码至少一种蛋白的基因。优选地，可以通过将含有编码选自CD44和骨膜素蛋白的至少一种的基因的重组载体引入到癌细胞中转染癌细胞。

在本发明中，所述候选物质可以选自下组的至少一种：天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、酶、蛋白质、配体、抗体、抗原、细菌或真菌代谢物以及生物活性分子，但不限于此。

在本发明中，除了在用候选物质处理后测量所述NINJ2蛋白的活性或表达水平或测量编码所述蛋白的基因的表达水平的步骤外，还可以额外进行测量选自CD44和骨膜素蛋白的至少一种的活性或表达水平或测量编码至少一种蛋白的基因的表达水平的步骤。

在本发明中，所述的用于测量所述蛋白的活性或表达水平的试剂并不受特别限制。然而，例如，所述制剂可以包括选自下组的至少一种：特异性结合蛋白质的抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)和适配体。

在本发明中，所述的用于测量或比较分析蛋白质活性或表达水平的方法示例包括但不限于，蛋白芯片分析、免疫分析、配体结合分析、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)分析、SELDI-TOF(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)分析、放射免疫分析、放射免疫扩散、双向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体固定试验、双向电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、蛋白免疫印迹(Westernblotting)和ELISA(酶联免疫吸附试验)。

在本发明中，所述的用于测量编码所述蛋白质的基因表达水平的制剂可以包括选自下组的至少一种：引物、探针和反义核苷酸，所述引物、探针和反义核苷酸与所述基因特异性结合。

根据本发明所述蛋白质或编码所述蛋白质的基因的信息是已知的。因此，基于这些信息，那些本领域技术人员可以很容易地设计出与编码所述蛋白质的基因特异性结合的引物、探针或反义核苷酸。

在本发明中，用于分析所述基因存在或缺失及表达水平的方法的示例包括但不限于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNase保护试验(RPA)、RNA印迹法和DNA芯片试验。

本发明的方法还可以包括步骤：当用候选物质处理后，所述癌细胞或癌症类器官中所测NINJ2蛋白的活性或表达水平或所测编码所述蛋白的基因的表达水平降低时，确定所测候选物质为克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或增强抗癌药物敏感性的药物。

此外，本发明的方法还可以包括步骤：在使用候选物质处理后，除了当癌细胞或癌症类器官中所测NINJ2蛋白的活性或表达水平或所测编码所述蛋白的基因的表达水平降低时，当CD44和骨膜素蛋白的至少一个活性或表达水平或编码至少一个蛋白的基因的表达水平下降时，确定所测候选物质为克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或增强抗癌药物敏感性的药物。

在本发明中，所述癌症可能是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。然而，所述癌症不限于此，并且可以是任何类型的癌症进展中(如肿瘤分化和/或增殖)依赖于本发明中所述的癌细胞和/或癌症干细胞的癌症。

在本发明所述的筛选方法中，所述的重组载体及其导入与上文抗癌耐药癌症类器官中所述相同，因此将省略对其的详细描述，以避免本说明书过于复杂。

有利效果

当使用本发明时，可以诊断用于抗癌治疗的抗癌药物的耐药性，如表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶。因此，在未来为癌症患者制定治疗计划时，临床医生可以在给药前预测上述抗癌药物的使用适宜性，从而使用合适的替代抗癌药物。因此，有望减轻患者的身体、精神和经济负担，最终有望进一步提高患者的癌症治疗效果。

此外，当使用本发明时，有可能克服对抗癌药物的耐药性，而且有效地预防、改善或治疗抗癌剂耐药的癌症。

附图简要说明

图1a显示了根据本发明的一个实施例，给每个细胞系给药给ECF药物的过程。

图1b显示了根据本发明的一个实施例，非ECF耐药亲本细胞和ECF耐药细胞的代表性IC₅₀值。

图1c显示了根据本发明的一个实施例，非ECF耐药亲本细胞和ECF耐药细胞的代表性IC₅₀值。

图1d显示了根据本发明的一个实施例，将ECF分别注射到异种移植有非ECF耐药亲本细胞和ECF耐药细胞(ECF-R)的肿瘤小鼠模型后，检查肿瘤体积变化的结果。

图2显示了根据本发明的一个实施例，使用热图来选择基因的过程，这些基因通常出现在ECF耐药细胞系中。

图3a显示了根据本发明的一个实施例，对非ECF耐药亲本细胞和ECF耐药细胞(ECF-R)中NINJ2蛋白表达水平的定量qRT-PCR分析结果。

图3b显示了根据本发明的一个实施例，对非ECF耐药亲本细胞和ECF耐药细胞(ECF-R)中NINJ2蛋白表达水平的蛋白印迹法(Western blot)分析结果。

图4a显示了根据本发明的一个实施例，用FACS分析NINJ2在野生型细胞和来自MKN-74细胞系的ECF耐药细胞(ECF-R)表面表达的结果。

图4b显示了根据本发明的一个实施例，用FACS分析CD44在野生型细胞和源自MKN-74细胞系的ECF耐药细胞(ECF-R)表面表达的结果。

图4c显示了根据本发明的一个实施例，用FACS分析来自MKN-74细胞系的ECF耐药细胞(ECF-R)中分类的NINJ2(-)和NINJ2(+)群体上CD44表达的结果。

图4d描绘根据本发明的一个实施例，显示在野生型细胞和源自MKN-74细胞系的ECF耐药细胞(ECF-R)中每个标记物(CD44和NINJ2)的表达水平的免疫荧光图像。

图4e显示了根据本发明的一个实施例的蛋白质印迹分析结果，显示了来自MKN-74细胞系的肿瘤球中每种标志物(CD44和hNINJ2)的表达水平。

图4f描述了根据本发明的一个实施例的免疫荧光图像，显示了来自MKN-74细胞系的肿瘤球中每个标记物(CD44和hNINJ2)的表达水平。

图5a显示了根据本发明的一个实施例，经ECF处理的NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系的代表性IC₅₀值。

图5b显示了根据本发明的一个实施例，利用qRT-PCR分析NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系中CD44 mRNA的表达水平。

图5c显示了根据本发明的一个实施例，利用流式细胞术分析了NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系中CD44高的细胞比例。

图5d显示了根据本发明的一个实施例，对NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系进行的体外限制性稀释分析结果。

图5e显示了根据本发明的一个实施例，由NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系形成的肿瘤球数量的分析结果。

图6显示了根据本发明的一个实施例，流式细胞仪分析的NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系中细胞周期变化的结果。

图7a显示了根据本发明的一个实施例，使用HaloTag下拉(pull-down)系统(G6504,普洛麦格(Promega))进行免疫印迹分析的(共免疫沉淀；co-IP)从稳定的NINJ2-HaloTag MKN-74癌细胞中检测NINJ2/骨膜素的相互作用的结果。

图7b显示了根据本发明的一个实施例，从ECF耐药的MKN-74癌细胞中分离出mRNA后，通过qRT-PCR检测骨膜素mRNA表达水平的结果。

图7c显示了根据本发明的一个实施例，在NINJ2亚型-1和亚型-3过表达MKN-74细胞系中高表达蛋白的蛋白质印迹分析结果。

图8显示了根据本发明的一个实施例，将靶向人NINJ2的shRNA慢病毒颗粒(Clone-1和Clone-2)引入到ECF耐药的MKN-74细胞系中，然后给药ECF给细胞系后，通过结晶紫染色和WST-1测试分析细胞活力的结果。

图9a和9b显示了根据本发明的一个实施例，将来自MKN-28/74细胞系的野生型或打乱的siRNA RES和siNINJ2 RES癌细胞系移植到裸鼠，然后在肿瘤体积达到100mm³时给裸鼠注射ECF和siRNA后，测量肿瘤体积和重量的变化的结果。

图10a显示了根据本发明的一个实施例，亲本类器官和耐ECF的人胃癌类器官的形态以及ECF治疗后的代表性IC₅₀值。

图10b显示了根据本发明的一个实施例，比较人类NINJ2和CD44在亲本类器官和耐ECF的人类胃癌类器官中的mRNA表达水平的结果。

图10c显示了根据本发明的一个实施例，通过对具有部分反应(PR)、稳定疾病(SD)和进展疾病(PD)的胃癌患者进行组织学分析，从而进行NINJ2评分分析的结果。

图10d显示了根据本发明的一个实施例，通过公开数据获得的胃癌患者总生存期(OS)Kaplan-Meier曲线。

最佳方式

本发明的一个实施方案涉及用于诊断抗癌药物耐药性的组合物，所述组合物包含用于测量NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白或编码所述蛋白质的基因的试剂。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于诊断抗癌药物耐药性的试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明所述的诊断抗癌药物耐药性的组合物。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于提供用于诊断抗癌药物耐药性的信息的方法，所述方法包括测量从感兴趣的受试者分离的生物样本中NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平的步骤。

本发明的另一个实施方案涉及用于治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂或用于降低编码所述蛋白的基因表达水平的制剂。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于治疗抗癌药物耐药性或增强抗癌药物敏感性的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂或降低编码所述蛋白的基因表达水平的制剂。

本发明的进一步实施方案涉及用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白的基因的表达水平的制剂。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：给有需要的受试者施用有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin2)蛋白活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白的基因表达水平的制剂。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：给有需要的受试者施用有效量的选自下组的任意一种或多种：与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种预防或治疗抗癌耐药癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的用于降低NINJ2蛋白的活性或表达水平的制剂或用于降低编码所述蛋白的基因表达水平的制剂。

本发明的另一个进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的方法，所述方法包括步骤：给有需要的受试者施用有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或一种降低编码所述蛋白的基因表达水平的制剂。

本发明的进一步实施方案涉及一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的方法，所述方法包括步骤：给有需要的受试者施用有效量的选自下组的任意一种或多种：与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合的反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶。

本发明的又一进一步实施方案涉及一种抗癌耐药癌症类器官，所述类器官包括表达NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因的癌细胞。

本发明的另一个实施方案涉及一种用于筛选用于克服或治疗抗癌药物耐药性的药物或用于增强抗癌药物敏感性的药物的方法，所述方法包括以下步骤：在体外用候选物质处理表达NINJ2蛋白的癌细胞或编码所述蛋白的基因或本发明提供的癌症类器官；以及在用候选物质处理后的癌细胞或癌症类器官中检测所述NINJ2蛋白的活性或表达水平，或检测编码所述蛋白的基因的表达水平。

发明方式

在下文中，本发明将参照实施例进行更详细地描述。这些实施例只是为了更详细地说明本发明，而且对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的，根据本发明的主题，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1抗癌药物(表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶；ECF)耐药细胞的制备

为了获得含有表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶(ECF)的联合ECF耐药的胃癌细胞，首先制备了原发性人类胃癌细胞株(SNU-488和SNU-520)和转移性人类胃癌细胞株(MKN-28/74、MKN-74、MKN-45和SNU-668)。随后，如图1所示，每个胃癌细胞株依次用ECF IC₅₀、ECFIC₇₀和ECF IC₈₀处理，然后分别给予按时的药物治疗(3天)和停药(1～3周)，疗程超过2个月。为了确定是否创建了ECF耐药胃癌细胞系，在体外和异种移植动物模型中评估药物反应性。结果显示，可以证实ECF耐药胃癌细胞株的IC₅₀值在原发性和转移性胃癌细胞株中明显高于亲本细胞(图1b和1c)。在异种移植动物模型中，可以证实ECF耐药胃癌细胞株产生的肿瘤体积逐渐增大，而对照组肿瘤体积减小(图1d)。

实施例2抗癌药物(表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶；ECF)耐药基因的选择以及NINJ2生物标记物诊断ECF耐药的潜力的验证

2.1NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)的选择

从实施例1中获得ECF耐药胃癌细胞，并使用热图选择ECF耐药细胞系中较野生型细胞常见的基因(见图2)。对于一个涉及ECF耐药的新基因，按照常规程序提取mRNA，然后使用affymetrix HG-U133A、HG-U133 Plus 2.0和HG-U133A 2.0平台检测mRNA表达。将测得的基因表达量设为一个基因表达值，然后进一步进行相关性分析，并通过RNA测序进行转录组分析来评估结果。本发明通过重点研究RES和WT(野生型)中与质膜和细胞粘附蛋白组成部分相关的基因变化，最终可以筛选出NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)生物标志物。通过热图的结果，证实了NINJ2基因在RES细胞系中呈高表达，与已知的干细胞标记物CD44一样，并表现出与CD44相同的趋势(见图2)。利用该标记物，可以只选择RES细胞系，即对药物具有耐药性的细胞。

2.2NINJ2标记物诊断抗癌药物(ECF)耐药潜力的验证

为了验证所选标记物中的NINJ2标记物是否能诊断抗癌药物(ECF)耐药，在细胞水平和组织水平进行了额外的实验。首先，通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测耐ECF原发胃癌细胞株(SNU-488和SNU-520)和转移性胃癌细胞株(MKN-28/74、MKN-74、MKN-45和SNU-668)中NINJ2 mRNA和蛋白的表达水平。结果，如图3a和3b所示，可以证实NINJ2 mRNA和蛋白在ECF耐药胃癌细胞系中的表达水平明显高于亲本细胞。

实施例3NINJ2与CD44标记物在ECF耐药胃癌细胞系中的相关性研究

在胃癌起始细胞中，表达CD133、CD44、醛脱氢酶1(ALDH1)和ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)。众所周知，就癌症干细胞而言，抗癌治疗的效果较低，复发的风险也高于常规癌细胞。CD44也是癌症干细胞中表达的标志物之一，经证实，CD44标志物在NINJ2高表达的耐ECF细胞系中表达水平较高(图4b和4c)。同时，在ECF耐药的MKN-74细胞中，表面NINJ2阳性细胞比例为9.6％±1.3％，而亲代细胞中比例为0.8％±0.09％；在ECF耐药的MKN-74细胞中，表面NINJ2蛋白表达细胞比例为13.4％±2.7％，而亲代细胞中比例仅为1.4％±0.7％(图4a和4b)。为了分析NINJ2与CD44的相关性，分析了ECF耐药细胞中NINJ2(+)或(-)细胞中CD44的表达水平。结果，如图4c和4d所示，可以证实在ECF耐药细胞中，NINJ2(+)细胞群以CD44高表达细胞为主，而NINJ2(-)细胞群以CD44(-)细胞为主。由此可以证实，NINJ2(+)CD44hi胃癌起始细胞在ECF耐药的胃癌细胞中显著增加。

接下来，为了评估NINJ2在被称为抗癌耐药群体的癌症干细胞中的表达，通过在添加生长因子的无血清培养基中培养MKN-74细胞系制备癌症球体。通过qRT-PCR检测MKN-74源性肿瘤球中CD44和NINJ2 mRNA的表达水平，通过蛋白质印迹分析NINJ2蛋白的表达水平，结果如图4e所示，证实在MKN-74源性肿瘤微球中，CD44和NINJ2 mRNA的表达水平以及NINJ2蛋白的表达水平明显升高。此外，将培养后的球体置于载玻片上，用1％(w/v)多聚甲醛(PFA)固定细胞，孵育30分钟，用PBS洗涤3次。用阻断缓冲液(1％BSA,0.05％Triton X-100)孵育细胞30分钟。用NINJ2抗体(R&D Systems)处理细胞，4℃孵育16小时。用PBS冲洗细胞三次。将Alexa-488标记的二抗(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))加入细胞中，然后孵育1小时。PBS洗涤3次，用CD44抗体处理细胞，4℃孵育16小时，PBS洗涤3次，20分钟。将Alexa-555标记的二抗(赛默飞世尔科技)加入细胞中，随后孵育1小时。PBS冲洗3次20分钟后用DAPI染色，使用共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光图像。通过检查免疫荧光图像，结果如图4f所示，证实了NINJ2和CD44共定位于球内，NINJ2(+)CD44hi胃癌起始细胞位于球外。由此可见，ECF耐药胃癌细胞中的NINJ2(+)细胞群主要与CD44高表达的胃癌起始细胞相对应。

实施例4通过NINJ2过表达增加癌症干细胞(癌症起始细胞)

为了在MKN-74细胞系中过表达NINJ2，将NINJ2亚型-1(Iso-1)(NP_057617.3)和亚型-3(Iso-3)(NP_001281275.1)分别克隆到pHTC

CMV-neo载体(普洛麦格,G7711)中。然后用ViaFectTM转染试剂将NINJ2 Iso-1和Iso-3载体转染MKN-74细胞。选择用含有G-418(普洛麦格)的生长介质转染的细胞。通过对NINJ2 Iso-1和Iso-3过表达胃癌细胞系经ECF处理后的细胞活力进行测定，结果如图5a所示，证实了过表达NINJ2 Iso-1和Iso-3的胃癌细胞株的细胞活力明显高于亲本细胞。此外，可以证实NINJ2 Iso-1和Iso-3过表达胃癌细胞株(FIGS)中CD44 mRNA表达水平和CD44表达细胞数量显著增加(图5b和5c)。

接下来，为了检测胃癌起始细胞诱导肿瘤特性的频率，采用体外限制性稀释法评估其成球能力。更具体地说，NINJ2 Iso-1和Iso-3过表达细胞系分别稀释2倍后，以1000-8细胞/孔的密度置于96孔板中。在添加20ng/ml rhEGF、20ng/ml rhbFGF和5μg/ml胰岛素的DMEM-F12中培养细胞，并采用极限值稀释法(ELDA)进行定量。结果如图5d所示，证实了过表达NINJ2 Iso-1和Iso-3的胃癌细胞中存在大量的胃癌起始细胞。

将1000个过表达NINJ2 Iso-1或Iso-3的细胞置于24孔板中，按照上述方法在添加20ng/ml rhEGF、20ng/ml rhbFGF和5μg/ml胰岛素的DMEM-F12中培养细胞。10天后计数肿瘤球的数量。在这种情况下，只计算尺寸为5000μm²或更大的球。结果，可以证实过表达NINJ2Iso-1和Iso-3后，肿瘤球的数量有所增加(见图5e)。

实施例5通过NINJ2过表达增加细胞周期阻滞

静默的癌细胞被认为是许多抗癌药物产生耐药性的主要因素。因此，本发明人研究了NINJ2诱导的细胞周期变化。将溴脱氧尿苷(BrdU)加入到来自胃癌细胞系MKN-74的过表达NINJ2 Iso-1和Iso-3的细胞中，细胞再培养1小时。用抗溴脱氧尿苷和双苯甲酰胺(Hoeschest 33342)染色后，利用流式细胞仪分析细胞周期。结果证实，在NINJ2 Iso-1和Iso-3过表达胃癌细胞中，通过抑制G0/G1期到S期诱导抗增殖活性的进程，细胞周期阻滞显著增加(见图6)。

实施例6ECF耐药诱导机制的鉴定

为了研究NINJ2诱导耐药性的机制，本发明人选择了与NINJ2相互作用的候选蛋白。为此，根据制造商的说明书，使用HaloTag下拉系统(G6504,普洛麦格)将NINJ2复合物下拉，然后用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行分析。鉴定到与NINJ2相互作用的蛋白有：骨膜素、PTPRk(蛋白酪氨酸磷酸酶受体K型)、RNA结合蛋白28和纤维蛋白原γ链。在候选蛋白中，已知骨膜素和PTPRk参与耐药，只有骨膜素参与诱导ECF耐药。下拉后通过免疫印迹分析可以证实NINJ2与骨膜素相互作用诱导ECF耐药(见图7a)。此外，还检测了骨膜素在ECF耐药MKN74细胞系中的表达水平。由此可以证实，骨膜素在ECF耐药细胞株中的表达水平与NINJ2一样高(图7b)。同时，利用过表达NINJ2的胃癌细胞系进行磷酸化抗体阵列，鉴定出4个上调1.5倍以上的磷酸化蛋白VE-Cadherin(Phospho-Tyr731)、VAV2(Phospho-Tyr142)、JunD(Phospho-Ser255)和ATF2(Phospho-Ser112/94)。通过蛋白质印迹分析得到了一致的结果(见图7c)。从以上结果可以看出，NINJ2通过VE-cadherin激活在VAV2、JunD和ATF2通路诱导ECF耐药。综合以上结果，提示不仅NINJ2标记物可用于ECF耐药的诊断，而且与NINJ2相互作用的骨膜素标记物也可额外用于ECF耐药的诊断。

实施例7利用ECF耐药胃癌细胞系评价shNINJ2的耐药治疗潜力

为了评估NINJ2是否参与耐药，使用shRNA慢病毒颗粒和嘌呤霉素制备了稳定的NINJ2敲除(K/D)ECF耐药癌细胞系。更具体地说，为了在ECF耐药的MKN-74细胞中稳定敲除NINJ2，使用了如下表1所示的靶向NINJ2基因(亚型-1、亚型-2和亚型-3)的不同部分区域的两个shRNA(TRCN0000063773(克隆-1)和TRCN0000063775(克隆-2))，以及作为阴性对照的非靶向pLKO.1-puro shRNA对照(SHC002)。shRNA克隆(TRCN0000063773、TRCN0000063775和SHC002)分别包含pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G质粒，按照说明书用Fugene HD(普洛麦格)将其转染至293T细胞。48小时后，收集每个上清并过滤，并将ECF耐药的MKN-74细胞转染慢病毒颗粒，在含嘌呤霉素的培养基中培养。用qRT-PCR方法确认在慢病毒转染的MKN-74细胞中NINJ2基因被敲除后，用ECF处理细胞，检测阴性对照(Mock)和shNINJ2组(克隆1和克隆2)的癌细胞是否再生。

表1

如图8所示，ECF处理3周后进行结晶紫染色和WST-1分析，可以证实，在NINJ2敲低(K/D)耐药癌细胞(克隆-1和克隆-2)的情况下，与阴性对照(Mock)相比，癌细胞的复发和再生明显受到抑制。这表明，通过在细胞水平敲除NINJ2克服了耐ECF药物。

实施例8利用ECF耐药胃癌细胞系移植的动物模型评价siNINJ2的耐药治疗潜力

8.1ECF耐药胃癌细胞系移植动物模型的制备

将采用实施例3所述的方法从MKN-28/74细胞系制备的球状体异种移植Balb/c裸鼠，建立小鼠模型。具体而言，将10⁷个ECF耐药癌细胞(ECF-R癌细胞)和亲本癌细胞分别经皮下注射到Balb/c裸鼠体内，观察体外建立的ECF耐药癌细胞异种移植动物模型(RES)是否具有ECF耐药。随后，为了利用制备的ECF耐药动物模型评估NINJ2抑制的耐药治疗效果，利用如下表2所示的siNINJ2引物(如SEQ ID NOs:11和12所示)和对照引物抑制NINJ2的表达，然后进行额外给药实验。为此，将5.7mg/kg表柔比星、6.67mg/kg顺铂、22mg/kg 5-FU给药于肿瘤大小为100mm³的异种移植瘤模型小鼠，每周1次，持续15天，每3天用数字卡尺测量肿瘤重量和肿瘤体积。如上所述，分别对对照组、NINJ2敲除的RES细胞系组和NINJ2高表达的RES细胞系组进行ECF给药实验，时间约为1个月。

表2

8.2siNINJ2耐药治疗效果的评价

参照图9a，证实了各组细胞系异种移植动物模型给予ECF药物后，肿瘤体积发生变化。图9b为量化肿瘤体积和重量的变化结果的图。经证实，与RES组相比，NINJ2mRNA表达被抑制的NINJ2敲除RES细胞系中，肿瘤体积和重量显著降低。随着时间的推移，肿瘤体积出现较大差异，提示对ECF药物的耐药性已被克服。

实施例9NINJ2在ECF耐药胃癌类器官中的表达增加的鉴定及其对癌症进展的临床意义

患者源性人类胃癌肿瘤类器官(HCM-BROD-0115-C16、PDM-135)购自美国模式培养物保藏所(ATCC)，按照ATCC指南进行继代培养，并用于实验。用IC₅₀浓度的ECF处理类器官，72小时后，用无药物培养基替换培养基，并进行2次额外传代。然后，将类器官暴露于适当的IC₇₀和IC₈₀浓度下，然后重复上述步骤。为了防止类器官恢复到ECF药物敏感状态，每3周用IC₈₀浓度的ECF处理类器官，从而构建ECF耐药类器官。图10a为亲本胃癌类器官和ECF耐药的胃癌类器官的显微观察照片，并显示了每个类器官ECF的IC₅₀测定结果。通过qRT-PCR定量分析了NINJ2和CD44mRNA在亲本胃癌类器官和ECF耐药胃癌类器官中的表达水平，如图10b所示，可以证实NINJ2和CD44 mRNA在ECF耐药胃癌类器官中的表达水平显著高于亲本胃癌类器官，与在细胞系中得到的结果一样。

接下来，为了检验NINJ2表达水平与药物反应的临床相关性，两位病理学家通过对部分缓解期(PR)、稳定期(SD)和进展期(PD)胃癌患者的组织学分析，分析了NINJ2的表达强度和广泛程度。结果如图10c所示，证实了NINJ2在PD中的广泛表达明显高于PR/SD。其次，为了确定NINJ2表达水平与生存率之间的临床相关性，利用胃癌患者的危险比(HR)和公开资料进行Kaplan-Meier分析和log-rank检验。结果，可以看到在胃癌患者中NINJ2表达组的生存率非常低，特别是，与Her2阳性组相比，Her2阴性组中的NINJ2高表达组总生存率较有提高(见图10d)。

综述上述实施例1-9的结果可以看出，利用NINJ标记物和骨膜素标记物诊断ECF耐药是有可能的，并且有可能通过抑制NINJ的表达来克服ECF耐药。因此，通过对ECF治疗后出现抗癌药物耐药的患者进行治疗，有望提高其抗癌效果。

虽然本发明已经参照具体特征进行了详细描述，但是对于本领域的技术人员来说，显然这些详细描述仅是本发明的优选实施例，而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等价物来定义。

工业适用性

根据本发明所述的组合物不仅可以诊断抗癌药物耐药性，而且可以非常有效地治疗癌症。此外，所述组合物可非常有效地用于克服抗癌药物耐药性，进而有效地预防、改善或治疗抗癌耐药癌症。

序列表自由文本

SEQ ID NO 1:mesarenidl qpgssdprsq pinlnhyatk ksvaesmldv alfmsnamrlkavleqgpss hyyttlvtli slslllqvvi gvllvviarl nlnevekqwr lnqlnnaati lvfftvvinvfitafgahkt gflaarasrn pl

SEQ ID NO 2:mldvalfmsn amrlkavleq gpsshyyttl vtlislslll qvvigvllvviarlnlneve kqwrlnqlnn aatilvfftv vinvfitafg ahktgflaar asrnpl

SEQ ID NO 3:agagactcag acggcggagc ctggaggagc ccacgcagtc tgttcccggcacccggtgcg tgtgaaggga cttgagggca gcgagatgga atcagcaaga gaaaacatcg accttcaacctggaagctcc gaccccagga gccagcccat caacctgaac cattacgcca ccaagaagag cgtggcggagagcatgctgg acgtggccct gttcatgtcc aacgccatgc ggctgaaggc ggtgctggag cagggaccatcctctcacta ctacaccacc ctggtcaccc tcatcagcct ctctctgctc ctgcaggtgg tcatcggtgtcctgctcgtg gtcattgcac ggctgaacct gaatgaggta gaaaagcagt ggcgactcaa ccagctcaacaacgcagcca ccatcttggt cttcttcact gtggtcatca atgttttcat tacagccttc ggggcacataaaacagggtt cctggctgcc agggcctcaa ggaatcctct ctgaatgcag cctgggaccc aggttctgggcctggaactt ctgcctcctt cctccgtgat ctgccaggct cgtgggcact ttccacagcc caggagagcttctgaaagga cagtatagct gcccttgctc cctacccaca gcacctgagt taaaaagtga tttttatgttattggtctaa gggacttcca tcttggtctg aagtcctgag ctcagacgca ggtactgcca gccataccttcctggtagca tctgctggac ctaagtaagg catgtctgtc taaggccaag tctgcccggc ttaaggatgctggttctgac tctaccccac tgcttccttc tgctccaggc ctcaattttc ccttcttgta aaatggaatctatatctata aaggtttctt caaatcca

SEQ ID NO 4:gttgcaaagc agccgctcgg tggccgtaca acgcttcatc tctccgagcctcggtttcct catctccagc cctaaaatga cgacacgccc cacaggtctt gggaggatta agtgaggggacatgagcctg gaagctccga ccccaggagc cagcccatca acctgaacca ttacgccacc aagaagagcgtggcggagag catgctggac gtggccctgt tcatgtccaa cgccatgcgg ctgaaggcgg tgctggagcagggaccatcc tctcactact acaccaccct ggtcaccctc atcagcctct ctctgctcct gcaggtggtcatcggtgtcc tgctcgtggt cattgcacgg ctgaacctga atgaggtaga aaagcagtgg cgactcaaccagctcaacaa cgcagccacc atcttggtct tcttcactgt ggtcatcaat gttttcatta cagccttcggggcacataaa acagggttcc tggctgccag ggcctcaagg aatcctctct gaatgcagcc tgggacccaggttctgggcc tggaacttct gcctccttcc tccgtgatct gccaggctcg tgggcacttt ccacagcccaggagagcttc tgaaaggaca gtatagctgc ccttgctccc tacccacagc acctgagtta aaaagtgatttttatgttat tggtctaagg gacttccatc ttggtctgaa gtcctgagct cagacgcagg tactgccagccataccttcc tggtagcatc tgctggacct aagtaaggca tgtctgtcta aggccaagtc tgcccggcttaaggatgctg gttctgactc taccccactg cttccttctg ctccaggcct caattttccc ttcttgtaaaatggaatcta tatctataaa ggtttcttca aatcca

SEQ ID NO 5:CGTGGTCATTGCACGGCTGAA

SEQ ID NO 6:CTGAACCTGAATGAGGTAGAA

SEQ ID NO 7:mipflpmfsl llllivnpin annhydkila hsrirgrdqg pnvcalqqilgtkkkyfstc knwykksicg qkttvlyecc pgymrmegmk gcpavlpidh vygtlgivga tttqrysdasklreeiegkg sftyfapsne awdnldsdir rglesnvnve llnalhshmi nkrmltkdlk ngmiipsmynnlglfinhyp ngvvtvncar iihgnqiatn gvvhvidrvl tqigtsiqdf ieaeddlssf raaaitsdilealgrdghft lfaptneafe klprgvleri mgdkvaseal mkyhilntlq csesimggav fetlegntieigcdgdsitv ngikmvnkkd ivtnngvihl idqvlipdsa kqvielagkq qttftdlvaq lglasalrpdgeytllapvn nafsddtlsm dqrllklilq nhilkvkvgl nelyngqile tiggkqlrvf vyrtavcienscmekgskqg rngaihifre iikpaekslh eklkqdkrfs tflslleaad lkelltqpgd wtlfvptndafkgmtseeke ilirdknalq niilyhltpg vfigkgfepg vtnilkttqg skiflkevnd tllvnelkskesdimttngv ihvvdkllyp adtpvgndql leilnkliky iqikfvrgst fkeipvtvyk piikkytkiidgvpveitek etreeriitg peikytrist gggeteetlk kllqeevtkv tkfieggdgh lfedeeikrllqgdtpvrkl qankkvqgsr rrlregrsq

SEQ ID NO 8:mdkfwwhaaw glclvplsla qidlnitcrf agvfhvekng rysisrteaadlckafnstl ptmaqmekal sigfetcryg fieghvvipr ihpnsicaan ntgvyiltsn tsqydtycfnasappeedct svtdlpnafd gpititivnr dgtryvqkge yrtnpediyp snptdddvss gsssersstsggyifytfst vhpipdedsp witdstdrip atrhshgsqe gganttsgpi rtpqipewli ilasllalalilavciavns rrrcgqkkkl vinsgngave drkpsglnge asksqemvhl vnkessetpd qfmtadetrnlqnvdmkigv

SEQ ID NO 9:

CCGG-CGTGGTCATTGCACGGCTGAA-CTCGAG-TTCAGCCGTGCAATGACCACG-TTTTTG

SEQ ID NO 10:

CCGG-CTGAACCTGAATGAGGTAGAA-CTCGAG-TTCTACCTCATTCAGGTTCAG-TTTTTG

SEQ ID NO 11:GUAAGGCAUGUCUGUCUAAGGCC

SEQ ID NO 12:GGCCUUAGACAGACAUGCCUUAC

<110> 产学合作基金会, 延世大学

<120> 用于诊断或治疗药物耐药性癌症的组合物

<130> POPB212163PCT

<150> KR 10-2020-0025872

<151> 2020-03-02

<160> 12

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Glu Ser Ala Arg Glu Asn Ile Asp Leu Gln Pro Gly Ser Ser Asp

1 5 10 15

Pro Arg Ser Gln Pro Ile Asn Leu Asn His Tyr Ala Thr Lys Lys Ser

20 25 30

Val Ala Glu Ser Met Leu Asp Val Ala Leu Phe Met Ser Asn Ala Met

35 40 45

Arg Leu Lys Ala Val Leu Glu Gln Gly Pro Ser Ser His Tyr Tyr Thr

50 55 60

Thr Leu Val Thr Leu Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Gln Val Val Ile

65 70 75 80

Gly Val Leu Leu Val Val Ile Ala Arg Leu Asn Leu Asn Glu Val Glu

85 90 95

Lys Gln Trp Arg Leu Asn Gln Leu Asn Asn Ala Ala Thr Ile Leu Val

100 105 110

Phe Phe Thr Val Val Ile Asn Val Phe Ile Thr Ala Phe Gly Ala His

115 120 125

Lys Thr Gly Phe Leu Ala Ala Arg Ala Ser Arg Asn Pro Leu

130 135 140

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Leu Asp Val Ala Leu Phe Met Ser Asn Ala Met Arg Leu Lys Ala

1 5 10 15

Val Leu Glu Gln Gly Pro Ser Ser His Tyr Tyr Thr Thr Leu Val Thr

20 25 30

Leu Ile Ser Leu Ser Leu Leu Leu Gln Val Val Ile Gly Val Leu Leu

35 40 45

Val Val Ile Ala Arg Leu Asn Leu Asn Glu Val Glu Lys Gln Trp Arg

50 55 60

Leu Asn Gln Leu Asn Asn Ala Ala Thr Ile Leu Val Phe Phe Thr Val

65 70 75 80

Val Ile Asn Val Phe Ile Thr Ala Phe Gly Ala His Lys Thr Gly Phe

85 90 95

Leu Ala Ala Arg Ala Ser Arg Asn Pro Leu

100 105

<210> 3

<211> 918

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

agagactcag acggcggagc ctggaggagc ccacgcagtc tgttcccggc acccggtgcg 60

tgtgaaggga cttgagggca gcgagatgga atcagcaaga gaaaacatcg accttcaacc 120

tggaagctcc gaccccagga gccagcccat caacctgaac cattacgcca ccaagaagag 180

cgtggcggag agcatgctgg acgtggccct gttcatgtcc aacgccatgc ggctgaaggc 240

ggtgctggag cagggaccat cctctcacta ctacaccacc ctggtcaccc tcatcagcct 300

ctctctgctc ctgcaggtgg tcatcggtgt cctgctcgtg gtcattgcac ggctgaacct 360

gaatgaggta gaaaagcagt ggcgactcaa ccagctcaac aacgcagcca ccatcttggt 420

cttcttcact gtggtcatca atgttttcat tacagccttc ggggcacata aaacagggtt 480

cctggctgcc agggcctcaa ggaatcctct ctgaatgcag cctgggaccc aggttctggg 540

cctggaactt ctgcctcctt cctccgtgat ctgccaggct cgtgggcact ttccacagcc 600

caggagagct tctgaaagga cagtatagct gcccttgctc cctacccaca gcacctgagt 660

taaaaagtga tttttatgtt attggtctaa gggacttcca tcttggtctg aagtcctgag 720

ctcagacgca ggtactgcca gccatacctt cctggtagca tctgctggac ctaagtaagg 780

catgtctgtc taaggccaag tctgcccggc ttaaggatgc tggttctgac tctaccccac 840

tgcttccttc tgctccaggc ctcaattttc ccttcttgta aaatggaatc tatatctata 900

aaggtttctt caaatcca 918

<210> 4

<211> 926

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

gttgcaaagc agccgctcgg tggccgtaca acgcttcatc tctccgagcc tcggtttcct 60

catctccagc cctaaaatga cgacacgccc cacaggtctt gggaggatta agtgagggga 120

catgagcctg gaagctccga ccccaggagc cagcccatca acctgaacca ttacgccacc 180

aagaagagcg tggcggagag catgctggac gtggccctgt tcatgtccaa cgccatgcgg 240

ctgaaggcgg tgctggagca gggaccatcc tctcactact acaccaccct ggtcaccctc 300

atcagcctct ctctgctcct gcaggtggtc atcggtgtcc tgctcgtggt cattgcacgg 360

ctgaacctga atgaggtaga aaagcagtgg cgactcaacc agctcaacaa cgcagccacc 420

atcttggtct tcttcactgt ggtcatcaat gttttcatta cagccttcgg ggcacataaa 480

acagggttcc tggctgccag ggcctcaagg aatcctctct gaatgcagcc tgggacccag 540

gttctgggcc tggaacttct gcctccttcc tccgtgatct gccaggctcg tgggcacttt 600

ccacagccca ggagagcttc tgaaaggaca gtatagctgc ccttgctccc tacccacagc 660

acctgagtta aaaagtgatt tttatgttat tggtctaagg gacttccatc ttggtctgaa 720

gtcctgagct cagacgcagg tactgccagc cataccttcc tggtagcatc tgctggacct 780

aagtaaggca tgtctgtcta aggccaagtc tgcccggctt aaggatgctg gttctgactc 840

taccccactg cttccttctg ctccaggcct caattttccc ttcttgtaaa atggaatcta 900

tatctataaa ggtttcttca aatcca 926

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

cgtggtcatt gcacggctga a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

ctgaacctga atgaggtaga a 21

<210> 7

<211> 779

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val

1 5 10 15

Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser

20 25 30

Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln

35 40 45

Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr

50 55 60

Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu

85 90 95

Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr

100 105 110

Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly

115 120 125

Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn

130 135 140

Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu

145 150 155 160

Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr

165 170 175

Lys Asp Leu Lys Asn Gly Met Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu

180 185 190

Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys

195 200 205

Ala Arg Ile Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His

210 215 220

Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe

225 230 235 240

Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr

245 250 255

Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe

260 265 270

Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu

275 280 285

Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His

290 295 300

Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val

305 310 315 320

Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp

325 330 335

Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val

340 345 350

Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp

355 360 365

Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe

370 375 380

Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp

385 390 395 400

Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp

405 410 415

Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His

420 425 430

Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile

435 440 445

Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr

450 455 460

Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly

465 470 475 480

Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu

485 490 495

Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe

500 505 510

Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro

515 520 525

Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met

530 535 540

Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln

545 550 555 560

Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly

565 570 575

Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys

580 585 590

Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys

595 600 605

Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val

610 615 620

Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu

625 630 635 640

Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val

645 650 655

Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Lys Pro Ile

660 665 670

Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr

675 680 685

Glu Lys Glu Thr Arg Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys

690 695 700

Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys

705 710 715 720

Lys Leu Leu Gln Glu Glu Val Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly

725 730 735

Gly Asp Gly His Leu Phe Glu Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln

740 745 750

Gly Asp Thr Pro Val Arg Lys Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly

755 760 765

Ser Arg Arg Arg Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gln

770 775

<210> 8

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro

1 5 10 15

Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly

20 25 30

Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu

35 40 45

Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala

50 55 60

Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly

65 70 75 80

Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile

85 90 95

Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser

100 105 110

Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp

115 120 125

Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr

130 135 140

Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu

145 150 155 160

Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp

165 170 175

Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Gly

180 185 190

Tyr Ile Phe Tyr Thr Phe Ser Thr Val His Pro Ile Pro Asp Glu Asp

195 200 205

Ser Pro Trp Ile Thr Asp Ser Thr Asp Arg Ile Pro Ala Thr Arg His

210 215 220

Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser Gly Pro Ile

225 230 235 240

Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu

245 250 255

Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg

260 265 270

Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala

275 280 285

Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala Ser Lys Ser

290 295 300

Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu Thr Pro Asp

305 310 315 320

Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn Val Asp Met

325 330 335

Lys Ile Gly Val

340

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> shNINJ2 克隆 1

<400> 9

ccggcgtggt cattgcacgg ctgaactcga gttcagccgt gcaatgacca cgtttttg 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> shNINJ2 克隆 2

<400> 10

ccggctgaac ctgaatgagg tagaactcga gttctacctc attcaggttc agtttttg 58

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正义 siNINJ2

<400> 11

guaaggcaug ucugucuaag gcc 23

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反义 siNINJ2

<400> 12

ggccuuagac agacaugccu uac 23

Claims

1.一种用于诊断抗癌药物耐药性的组合物，其特征在于，所述组合物含有用于测量NINJ2(神经损伤诱导蛋白2，Ninjurin 2)蛋白或编码所述蛋白的基因的制剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，用于测量所述蛋白表达水平的制剂包括选自下组的至少一种：抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)和适配体，所述抗体、寡肽、配体、肽核酸(PNA)和适配体特异性结合所述蛋白质。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，用于测量所述基因表达水平的制剂包括选自下组的至少一种：引物、探针和反义核苷酸，所述引物、探针和反义核苷酸与所述基因特异性结合。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药物包含选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、西地尼布、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药物包含选自下组的任何一种或多种药物：表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗癌药物用于治疗癌症，所述癌症是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括用于测量选自骨膜素和CD44中的至少一种蛋白质或编码至少一种蛋白质的基因的表达水平的制剂。

8.一种诊断抗癌药物耐药性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-7中任一所述的组合物。

9.一种提供用于诊断抗癌药物耐药性信息的方法，其特征在于，包括步骤：测量从感兴趣的受试者中分离的生物样本中NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白或编码所述蛋白质的基因表达水平。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，当生物样本中检测到的NINJ2蛋白或编码所述蛋白的基因的表达水平高于对照时，预测感兴趣的受试者具有抗癌药物耐药性或极有可能发生抗癌药物耐药性。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤：测量选自骨膜素和CD44中至少一种蛋白质或编码至少一种蛋白质的基因的表达水平。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，当检测到选自骨膜素和CD44中至少一种蛋白质或编码至少一种蛋白质的基因的表达水平高于对照时，预测感兴趣的受试者具有抗癌药物耐药性或极有可能发生抗癌药物耐药性。

13.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的用于降低NINJ(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，用于降低所述蛋白质活性或表达水平的制剂选自下组的任何一种或多种：化合物、肽、肽模拟物、适配体、抗体和自然产物，所述化合物、肽、肽模拟物、适配体、抗体和自然产物与NINJ2蛋白或其部分特异性结合。

15.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，用于降低所述基因的表达水平的制剂选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶与NINJ2蛋白或其部分互补结合。

16.如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，其中所述癌症是甲状腺癌、甲状旁腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胆囊癌、胆道癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、血癌、膀胱癌、肾癌、黑色素瘤、结肠癌、骨癌、皮肤癌、头癌、子宫癌、直肠癌、脑瘤、肛周癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盆腔癌、CNS中枢神经系统肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、或垂体腺瘤。

17.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合。

18.一种用于治疗抗癌药物耐药性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，用于降低所述蛋白质活性或表达水平的制剂选自下组的任何一种或多种：化合物、肽、肽模拟物、适配体、抗体和自然产物，所述化合物、肽、肽模拟物、适配体、抗体和自然产物与NINJ2蛋白或其部分特异性结合。

20.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，用于降低所述基因的表达水平的制剂选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶与NINJ2基因或其部分互补结合。

21.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，其中所述抗癌药物包含选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、那拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼罗替尼、西马沙尼、博苏替尼、阿西替尼、塞迪尼、勒沙替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、贝伐珠单抗、顺铂、西妥昔单抗、白果槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥佐米星、伊布莫单抗、七铂、甲氨基酮戊酸、安吖啶、阿来珠单抗、丙卡嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉星、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟加滨、依西他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫弗、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、多柔比星、伊达柔比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法兰、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、曲拓宁、依西美坦、氨鲁特米特、阿那格列德、纳韦滨、法拉佐、他莫西芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、沃罗唑、比卡鲁他胺、洛莫司汀和卡莫司汀。

22.一种用于增强抗癌药物敏感性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

23.一种用于增强抗癌药物敏感性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合。

24.一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白的活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

25.一种用于预防或治疗抗癌耐药癌症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有作为活性成分的选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(iRNA)、短发夹RNA和核糖酶与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合。

26.一种抗癌耐药癌症类器官，其特征在于，含有表达NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白或编码所述蛋白质的基因的癌症细胞。

27.如权利要求26所述的抗癌耐药癌症类器官，其特征在于，所述癌细胞过表达选自NINJ2亚型1和亚型3的至少一种蛋白质或编码至少一种蛋白质的基因。

28.一种用于筛选用于治疗抗癌药物耐药性的药物的方法，其特征在于，包括步骤：

用候选物质体外处理过表达NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白或编码所述所述蛋白质的基因的癌症细胞、或如权利要求26或27所述的癌症类器官；和

测量用候选物质处理后，癌症细胞或癌症类器官中所述NINJ2蛋白的活性或表达水平或编码所述蛋白质的基因的表达水平。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤：测量选自CD44和骨膜素蛋白中至少一种蛋白质的活性或表达水平，或测量编码至少一种蛋白质的基因表达水平。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤：当用候选物质处理后所测的NINJ2蛋白活性或表达水平降低时，或用候选物质处理后所测的编码所述蛋白质的基因的表达水平降低时，确定候选物质是用于治疗癌症药物耐药性的药物。

31.一种用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

32.一种用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合。

33.一种预防或治疗抗癌耐药癌症的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

34.一种预防或治疗抗癌耐药癌症的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的选自下组的任何一种或多种：反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶，所述反义核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA和核糖酶与SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸互补结合。

35.一种增强抗癌药物敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。

36.一种治疗抗癌药物耐药性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：向有需要的受试者给药有效量的用于降低NINJ2(神经损伤诱导蛋白2；Ninjurin 2)蛋白活性或表达水平的制剂，或用于降低编码所述蛋白质的基因的表达水平的制剂。