CN1152693C - 粘附抑制组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种从越橘属植物，特别是曼越橘制得的萃取物，它的抗粘附活性成份被浓缩。与曼越橘原料相比，萃取物中的多酚和类黄酮混合物被浓缩，没有可测量的简单糖，苯甲酸含量极低，而且不含有大量花青苷。同时还揭示了萃取物的制备和使用方法。

Description

粘附抑制组合物
技术领域：本发明涉及具有治疗等用途的植物萃取物，特别是越橘属(Vac-cinium)的萃取物。
背景：许多人认为曼越橘汁及其衍生物对健康有益，其产品，包括由曼越橘果制得的粉剂或曼越橘汁，是可购得的。医生经常向患尿道感染的病人推荐曼越橘产品。但是，大多数已有制剂以及曼越橘原果实和典型的曼越橘汁产品的酸度较高。较高的酸度会导致胃部不适，且口味偏酸，对许多人来说，这是不受欢迎的。所以，需要一种曼越橘萃取物，其中包含与其已为人所知的有益作用相关的活性成份。
                         发明内容
本发明包括使用越橘萃取物干扰微生物与机体组织等表面粘附的方法。这些机体组织包括与口腔有关的组织如牙床、牙齿和口腔粘膜、喉组织，生殖组织和颈表面组织。所以，本发明包括越橘萃取物用于治疗尿道感染等各种疾病的用途。
本发明还包括各种越橘萃取物以及制取这些萃取物的方法。
在C18亲脂性柱上对萃取物进行反相HPLC分析时，可以观察到化合物在230nm，280nm和360nm处的多组特征性洗脱峰。进一步纯化时发现280nm处的一个吸收峰中含有典型的原花青素。从360nm吸收峰的洗脱液中纯化出黄酮醇葡糖苷。
在本发明的一种实施方法中，与100％取自植物材料的液汁相比，萃取物的抗细菌粘附活性浓缩了500至1500倍。萃取物中由分光法测得的类黄酮和其它多酚化合物的浓度也相同程度地被提高。
从某方面讲，萃取物的酸度和简单糖的含量很低，其苯甲酸含量通常低于0.01mg/g干粉，而且几乎测不出有游离的单糖或二糖。萃取物是由曼越橘(V.macrocarpon及变种)，V.myrtilis(覆盆子)，V.oxycoccus(欧洲曼越橘)或V.corymbosum(蓝莓)制备的。
萃取物的酸和糖含量大大降低，是取代曼越橘果或曼越橘汁的一种食物补充。低糖和低酸含量使得萃取物极适于作为口腔保健产品，而且对需要用曼越橘萃取产品进行保健的人更为有效。
本发明还包括了制造具有上述特性的萃取物的方法和使用此萃取物抑制细菌与表面粘附的方法。
制造萃取物的方法包括从植物或植物的某些部分制备初始萃取物，这些植物选自越橘属，此初始萃取物中包含带电和极性化合物以及活性组份；将萃取物浓缩至较小的体积；对活性成份和多酚及类黄酮化合物全面浓缩。此方法还可以包括从萃取物中去除大多数游离的单糖和二糖；从萃取物中去除大多数苯甲酸；以及去除单体花青苷。对利用色谱或沉淀和相萃取步骤完成各步骤的技术进行了描述。另外，在一种实施方法中，其中的方法包括了一步甘露糖亲和色谱，可选择能够竞争结合甘露糖亲合性底物的化合物。
本发明包括了通过首先用水或溶剂从植物材料中萃取活性化合物，同时留下被有效去除了抗粘附成份的果肉或残留物而制得的组合物，其中的溶剂有例如但不限于醇、丙酮、乙腈或乙酸乙酯，或者是这些溶剂的互溶混合物，优选的是水或MeOH/水或丙酮/水。或者，可以用相对非极性的有机溶剂来对植物材料进行萃取，例如(但不限于)己烷、庚烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿或具有8个以上碳原子的大分子量的醇等。这样的处理，萃取的是非活性物质，留下的是活性成份浓度提高了的果肉或残留物。可以对这种果肉或残留物用极性较大的溶剂，如(但不限于)水、少于8个碳原子的醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯或这些溶剂的互溶混合物进一步萃取以进一步浓缩活性成份。
萃取物的抗粘附性能在许多领域都是有用的。例如，可以用此萃取物来完成工业发酵设备、临床及牙科仪器、实验室培养罐等的清洗。此萃取物还可以用于抑制细菌与人和/或动物的手术植入体、牙齿表面和口腔中的口腔细胞和尿道中的细胞的粘附。
抑制细菌粘附的方法包括提供如上所述萃取物的步骤，将溶于合适介质中的萃取物施用于确信粘附有大肠杆菌(E.coli)之类细菌的表面，由此使细菌从表面脱离。此方法可用于抑制细菌与牙齿表面、与粘附牙齿的其它细菌、与人口腔上皮细胞和与人尿道上皮细胞的粘附；和清洗牙科植入体、微生物发酵罐等。
                         附图简述
图1是根据本发明制备萃取物的流程图。
图2是萃取物的红外(“IR”)吸收谱(KBr固体)。
图3是溶于甲醇中的萃取物的紫外(“UV”)/可见光吸收谱。
图4是溶于水中的萃取物的UV/可见光吸收谱。
图5A-5B描述了利用230nm，280nm，360nm和512nm波长处吸光度的萃取物高压液相色谱的比较分析。
图6A-6B描述萃取物高压液相色谱的双光谱分析和360nm有吸光度的洗脱峰分析。
图7A-7F是取自样品的选定高压液相色谱(“HPLC”)组份的完整UV-可见光光谱，其色谱示于图5A-5B。
图8描述在多种波长分析时粉碎的曼越橘第一步萃取物的色谱。
图9描述用不同于图5A-5B和图6A-6B洗脱梯度获得的萃取物的色谱。
图10是制备本发明萃取物的另一种方法的流程图。
图11A-11F是本发明方法中选定步骤的产品的HPCL色谱。
图12是图10产品的色谱，表示用于活性分析的顺序洗脱组份的收集。
图13是萃取物的另一种制备方法。
                     本发明的最佳方式
能抑制某些细菌与各种基质粘附的活性成份被高度浓缩的越橘属植物萃取物，其类黄酮化合物和多酚的浓度也高度浓缩。萃取物可以是粉末状的，也可以是溶于某种合适溶剂中的。在此所述的粉末是红棕色的，密度约为0.43±0.03g/cc，其它特性如文中所述。为方便和明白起见，后文中将称萃取物为“浓缩萃取物”，而单指某种特定种属时，如由曼越橘制备的萃取物，称为“曼越橘萃取物”。
A.方法
具有本文所述的浓缩萃取物特征的萃取物可以按图1所示的步骤来制备。除了最后一步选择性去除花青苷的 非极性溶剂萃取，这一方法与用于从植物原料中萃取花青苷的标准方法相似(参见 Official Methodsof Analysis of the As- sociation of Official Analytical Chemists，§§22.092至22.095以及pp.424-425(1984)；以及Fuleki和Francis，“Purification of Cranberry Anthocyanins”J.Food.Science，33：266-274(1966))。花青苷是与多酚密切相关且经常被共分离的类黄酮化合物。但是，用已有技术分离得到的取自曼越橘的花青苷并不明显抑制细菌与组织表面的粘附。而且，粘附抑制活性被提高了约1000倍的曼越橘萃取物中只有低浓度或没有花青苷。花青苷在512nm特征性地表现出强吸光度。根据图5A和5B的色谱，萃取物中花青苷浓度明显地远低于在360nm有吸收的多酚成份。
图1所示的方法同时从浓缩萃取物中基本去除了游离的简单糖和大部分苯甲酸。但是，已知还有其它方法可用于从植物材料浓缩和纯化多酚化合物和相关化合物，如类黄酮、花青苷和邻苯二酚(参见Puski和Francis，“Flavonol Glyco-sides in Cranberries，” J.Food Science，32：527-530(1967)；Fuleki和Francis，“Quantitative Methods for Anthocyanins：Purification of Cranberry Antho-cyanins” J.Food Science，33：266-274(1968)；P.L.Wang等，“Isolation andCharacterization of Polyphenolic Compounds in Cranberries” J.Food.Sci- ence，43：1402-1404(1978))。这些其它方法可以生产出抗粘附活性被提高但如前述的糖、苯甲酸和花青苷等边缘物质较多或较少的萃取物。
一种制备浓缩萃取物的方法如下所述。首先，从越橘属植物的植物材料中萃取包括花青苷及其它类黄酮和多酚化合物在内的极性和带电化合物(步骤100)。最好，选用的植物材料是浆果或其它水果(如曼越橘)。
还发现，替代新鲜或冷冻浆果的另一种起始材料是一种粉末状曼越橘产品的溶液(可以OCEAN SPRAY牌购得)。可用此溶液替代全浆果的酸化醇-水萃取物(图1的步骤100-102)。据信，曼越橘粉末是曼越橘原料的液体萃取物经喷雾干燥而制得的。以含10至20％(重量)曼越橘粉的溶液作为起始物，产生了良好的结果。更高的粉末含量是不可取的。在从此曼越橘溶液开始的方法中，图1中的萃取步骤100和102被省略。
步骤100包括粉碎植物材料，将该材料与大量的酸化醇混合，以及充分搅拌混合物。酸化醇宜由等比例的某种具有相当极性的醇和水以及约占1至10％(体积)的合适的酸组成。在一较好的实施方法中，配比为10∶1∶10的乙醇∶乙酸∶水。合适的醇还包括甲醇(“MeOH”)、乙醇(“EtOH”)和丙醇，合适的酸包括乙酸(“HOAc”)，盐酸(“HCl”)和磷酸(“H3PO4”)。从液体中分离出固体残留物并将其弃去。
由此步骤100产生一种主要含包括活性成份在内的极性和/或带电化合物的萃取液，和主要含非极性化合物的固体的植物材料粉碎残渣。
通过去除大部分的醇将萃取液浓缩至原萃取物体积的约4-6％(步骤102)。较好的是，萃取液被蒸发至原萃取液体积的约1-5％，然后加水将其补足至原体积的4-6％。由此制成浓缩萃取液。
在步骤104中，单糖和二糖从浓缩萃取液中被基本去除。例如，向浓缩萃取液中加入金属乙酸盐或硫酸盐，沉淀出固体，而将简单糖留在溶液中。沉淀中包含了活性成份与金属的复合物。步骤104的进行可以是向萃取液中加入足量的金属化合物(浓度约1至1.1mol)，然后向浓缩萃取液中加入约0.4体积的挥发性无机碱，充分混合。无机碱以强碱为宜(如NH4OH)。加碱后，沉淀迅速生成。
不宜使用铅化合物(如乙酸铅)作为步骤104的金属盐时，可以使用其它金属盐，如锌、镁、镍、钡和钙、钴或钠的乙酸盐，或硫酸锌。较好的是乙酸锌、乙酸镁和硫酸锌。比照利用乙酸锌(取为100％)，镍、钡和钙乙酸盐产生的浓缩率为60-80％，乙酸钠和乙酸钴的相对得率为20-40％。
沉淀出的固体可以用大量的极性醇洗涤，例如80％的EtOH水溶液，以去除过量的盐和微量的单糖和二糖(步骤106)。可用MeOH或丙醇代替乙醇。
然后将固体与正丁醇和浓盐酸混合，比例约为6∶1(步骤108)。酸性正丁醇去除金属离子而且溶解活性成份，同时认为HCl改变了活性成份的相对极性，从而使它们可溶于正丁醇中。虽然现在优选的是正丁醇，也可以使用其它中等极性的溶剂(如异丁醇、叔丁醇、戊醇或己醇)。由此产生醇液相和主要含金属氯化物的沉淀。沉淀被弃去(步骤109)。
然后利用石油醚等非极性有机溶剂的萃取从步骤108的液相中去除正丁醇(步骤110)。约向醇液相中加入3至10倍体积的有机溶剂，同时剧烈混合，然后静置分层成为含有石油醚和丁醇的疏水性第一有机相和含有活性成份的第一水相。将颜色为桔红色至红棕色(据推测是由于花青苷的存在)的第一水相与有机层分离，用约4倍的水稀释(步骤112)。
第一有机相可以用水反萃取(1/20体积)，直至第一有机相中的红色基本去除。反萃取得到的水层可以在稀释步骤112之前与步骤110的水相合并。
稀释后，再用中等极性的有机溶剂(如乙酸乙酯“EtAc”)进一步萃取第一水相(步骤104)，产生含有活性成份的第二有机相和保留了大部分花青苷的第二水相。较好的是，第一水相用约等体积的EtAc顺次萃取三次，将三次的EtAc相合并。或者，萃取步骤114可以以两步顺次萃取进行，第一步用等体积的乙醚(“Et2O”)，第二步用等体积的乙酸乙酯。
在图1所示的方法中，已发现，在EtAc萃取步骤(步骤114)中，若在酸性条件下进行萃取(如pH＜约2)可获得明显较高的质量得率和每单位质量的活性水平得率。可以通过添加盐酸或其它合适的酸进行酸化。
无论如何，在萃取步骤114之后，都需将第二有机相与第二水相分离，并蒸发成胶状物或粉末(在一种情况中，粉末具有桔红色，密度约0.43g/cm3，水中的溶解度约为8.5g/ml)。为方便起见，将此产物称为“类黄酮浓缩萃取物”，与表明含类黄酮浓缩化合物的光谱数据一致。但是，该用语无意于将萃取物的活性成份限制在类黄酮之类。花青苷被基本上选择性地保留在萃取步骤114的第二水相中，但有少量留在第二有机相中。但是，第二水相的抗粘附活性显著低于第二有机相。
由此方法制备的萃取物的活性成份被浓缩了约1000倍，能够抑制包括大肠杆菌和铜绿青霉(P.aeruginosa)在内的细菌对哺乳动物细胞和某些表面的粘附。在浓缩萃取物中，没有可测量的蛋白质，只有微量或者没有游离的单糖和二糖。萃取物的热量值通常低于每克4卡。而且，浓缩萃取物的酸含量，特别是苯甲酸含量显著低于越橘属浆果和许多其它曼越橘萃取物或粉状产品。
有多种方法可用于制取最初的水性越橘萃取液，由该萃取液可获得抗粘附活性。表VIII包含了利用各种萃取方法制得的活性的比较。
图10中描述了另一种方法。此方法包括主要用色谱分离代替沉淀和相分离等步骤来处理最初的水性萃取液。此实施方法很方便，而且减少了有机溶剂的使用。但是，色谱实施方法仍然被用于浓缩带电和极性化合物、去除单糖和二糖、去除苯甲酸及其它有机酸和去除花青苷等基本步骤，这些步骤可以通过替换先前根据图1所示的相应步骤来完成。即，将图1实施方法中的某些步骤和图10实施方法中的某些步骤合并而成的“杂合”实施方法也可产生理想的萃取物。
例如，在图10实施方法中，从萃取物(例如图1中步骤100、108、112)中去除简单糖和苯甲酸(步骤1000)是通过亲脂性柱(例如C18柱，也可用于萃取液(步骤1000)的HPLC分析)上的反相亲和色谱来完成的。
较理想的是，色谱实施方法再包含一步选择性地分离与甘露糖竞争结合甘露糖亲合性底物的化合物。这一步是通过在与载体结合的甘露糖结合底物上对萃取液进行亲合性色谱来完成的。在本文的操作实施例中，使用的是伴刀豆蛋白A(缩写为conA)柱(Sigma Chemical Co.of St.Louis，MO)。已知ConA与甘露糖结合，甘露糖与I型菌毛结合并由此干扰I型菌毛的菌毛介导粘附。在conA亲合性色谱步骤中，萃取液通过色谱柱使特定成份与conA结合，而非conA结合化合物则被从柱上洗脱。然后用含有足够过量甘露糖或甘露糖衍生物的溶液，通过竞争从柱上洗脱特定组份。
可以相同方式将其它甘露糖结合剂用于甘露糖亲合性色谱分离。其它实施方法之一包括分离出菌毛和/或菌毛的甘露糖结合区，以此代替conA用于亲和色谱。但是，conA偶合载体是可购得的，所以较方便。
甘露糖亲和色谱可以在利用其它步骤部分纯化萃取液后进行。例如，萃取液必须已经是不含简单糖的，它们会与conA结合而干扰所需的多酚和类黄酮化合物的结合。
方法中的第一步1000(图10)是为了从原初水溶性越橘萃取物中去除单糖和二糖以及苯甲酸，利用的是在亲脂性柱上对原萃取物进行反相液相色谱。原萃取物的制取可以通过制备如前所述的粉状起始物的水溶液，利用图1所示方法的步骤100-102制备酸化醇萃取液，或通过与此相当的其它方法。
在某实施方法中，步骤1000的反相色谱是在C18柱(Waters C18“Bonda-Pak”，10μm珠，购自Millipore Corp.of Milford MA，cat.#WAT038505)上进行的。50ml C18柱主要根据制造商的说明来制备的，以4-6ml/min的流速先后用100ml MeOH和200ml蒸馏水冲洗。然后以0.5至约2.0ml/min的流速将350至约500ml的水溶性原萃取液上样在C18柱上。上样过程中，如果由柱流出液体变成粉红色或红色，说明柱正在被饱和。然后用过量的水洗涤柱以去除糖(800-1000ml，或用直至洗脱液呈无色或淡粉红色的足量水)，流速约为4-6ml/min。接着，足量的MeOH，通常为约150至约300ml，通过柱以洗脱所需的化合物。MeOH洗脱液应该是深红色的；当洗脱液变成淡粉红色时，说明足量的MeOH已经通过了柱。MeOH洗脱液通常含有沉淀物，利用例如台式或略大的离心机，以1500至5000rpm离心(步骤1004)可方便地去除沉淀。
然后真空蒸发去除步骤1002的MeOH上清液中的MeOH，残留物重溶于约25ml温水中，最好加以超声振荡(步骤1004)。可以离心或用Whatman#1过滤器过滤来去除沉淀，并将其弃去。
然后在阳离子柱上对样品水溶液进行色谱分离(步骤1008)。如公知的，用阳离子在水中形成的浆状物来制备4至8ml的阳离子柱。本文中优选的阳离子材料是Waters Accell+CM Cation(Millipore Corp.of Milford MA)，它是二氧化硅珠，具有亲水性结合层，该层具有作为有效阳离子基团的羧甲基。在一典型方法中，体积约5ml的样品水溶液被细致地直接上样在阳离子柱上。此时，可观察到柱中呈绿色，并且在柱端有一种绿色很深的物质。然后用约25ml蒸馏水洗柱(步骤1008)。顶端的深绿色物质随清水很慢地洗出，并以滞留在后面为佳。
阳离子柱的最初上样溶液和水洗液中含有大量所需的抗粘附活性。通过阳离子柱从萃取液中基本去除了花青苷，正如对1006和1008A产物(还可以选择性地进行CHCl3/EtAc萃取)的分析C18色谱所揭示的。较理想的是，此时用1-2倍柱体积的1％HCl(aq)洗柱(步骤1008B)，洗出基本上全部的绿色物质。HCl洗液被发现含有的主要是花青苷。HCl洗脱之后，进行一步MeOH洗脱(步骤1008C)。MeOH洗脱液1008C在蒸发及重悬于水中后，令人惊奇地表现出高度的抗粘附活性。在230、280和360nm处观察，MeOH洗脱化合物具有明显的HPLC洗脱峰。
准备进行conA柱亲和色谱时，将空体积洗脱液1008A浓缩(例如利用蒸发)至浓度低于60mg/ml。制备3至10ml的conA结合柱材料(Sigma Chem.Co.of st.Louis MO，cat.#C-9017)并用100ml磷酸盐缓冲液(0.05M磷酸钠，用H3PO4将pH调至7)以1ml/min的流速冲洗。将含有不超过60mg/ml样品的2ml水性洗脱液调节至与conA磷酸缓冲液相同的浓度并上样在柱上。上样后，用约50ml磷酸盐缓冲液洗柱或直至洗出液变得澄清，流速仍为1ml/min。最后，用至少50-100ml含10％α-甲基吡喃甘露糖苷的磷酸缓冲液洗柱。为此目的时，吡喃甘露糖苷比甘露糖更好，因为它与conA结合更牢固，所以预计可以更有效地洗脱与conA上甘露糖亲合性位点结合的化合物。在洗脱活性组份方面，10％的α-甲基吡喃甘露糖苷浓度比2％的低浓度更有效。
得到的conA洗脱液然后在一C18柱上进行另一步分离(类似步骤1000)，以去除α-甲基吡喃甘露糖苷。但是，在此阶段，使用更纯的样品时，较小的C18柱(Waters C18Sep-Pak，1ml体积，Mill·ipore Corp.of Milford，MA；cat.#WAT051910)就够了。这一步还起着浓缩活性成份的作用。柱的制备是在用(50ml)conA洗脱液上样前，用5至10ml MeOH通过后再用5-10ml水通过。然后用10-20ml的水洗柱，活性成份被洗脱在约2ml MeOH中。可以将样品蒸干然后重悬在约150μl蒸馏水中。得到的萃取液为浅黄色至棕色(表明几乎没有或没有花青苷)。在阳离子柱分离过程中，大量的花青苷被流失。
可以在图10所示的方法中选择性地引入一步用等体积的中等极性有机溶剂(如50∶50的CHCl3/EtAc)萃取样品水溶液。进行这一步是为了从萃取液中去除某些非极性或极性较小的化合物。CHCl3-EtAc萃取即可以在步骤1004之后进行，也可以在步骤1000、1002之前进行，例如对原初水性萃取液进行。
CHCl3-EtAc萃取似乎去除了某种组份，该组份在RBC试验中遮蔽或干扰抗粘附组份的活性，因为正如试验所测得的，它的去除通常加强了活性，但不明显改变质量得率。但是，表观“遮蔽”组份的去除可能降低活性化合物的长期稳定性。所以，欲在RBC试验中对抗粘附活性定量时，可以使用CHCl3-EtAc萃取步骤，而在对萃取液的常规生产中不宜将此步骤包括在内。
在进行CHCl3-EtAc的萃取中，样品水溶液最好萃取两次(每次都用等体积的CHCl3/EtAc)。有机相被弃去，水相被蒸发浓缩至原体积的1/5(即5ml)。蒸发还去除了微量的有机溶剂。或者，样品蒸发干燥并重悬于水中。两种方法中，由此得到的样品水溶液都由步骤1008或1004进一步纯化。
表VIII显示对图1和图10所示方法中选定阶段的萃取液，在红血细胞凝集试验中测得的相对粘附抑制活性(缩写为RBC试验；参见实施例2和表VI)。活性值被标定为试验中1％甘露糖溶液的活性和g/ml物质的量，所以，100表明相当于甘露糖的活性。大于100的值表明样品在抗粘附活性方面比甘露糖更有效。被测萃取液的浓度是对蒸干的各个组份称重来确定的。
表VIII所示的结果(通常)表明，产生原初萃取液的不同方法可与用MeOH∶HOAC∶水(“MAW”)相比。就活性回收率而言，水(室温)和沸水萃取液较好。OCEAN SPRAY曼越橘粉末(“OSCP”)的10％溶液也可与之相比。为了估计果肉中的残留活性量，用MeOH萃取果肉，并将可溶于MeOH的物质制备成水溶液形式。
较好的是MAW萃取液，因为它似乎能在取自浆果的最初萃取液中产生较高的活性回收率，而在果肉中残留较低的活性。
制备具有抗粘附活性的曼越橘萃取液并进而包括了从萃取液中充分纯化活性化合物步骤的另一种方法开始于对某种已提取的植物材料水溶液(含可溶性“活性”化合物)的pH碱性调节。当该方法用于OCEAN SPRAY曼越橘粉末的水溶液时，按如下进行。在OSCP溶液中加入足量的强碱(如NaOH)，将pH调至足以将多酚的酚基团电离成酚盐基团(≥pH10)(图13；步骤1300)。将此方法用于OSCP溶液时，当达到必须pH后溶液立即转为绿色。对1L饱和(20％)的曼越橘粉末OSCP溶液，约需使用70-80ml 10N的NaOH。然后将由此生成的绿色碱性OSCP溶液与足量的简单醇一起搅拌以生成绿色沉淀(步骤1302)。使用约4倍体积(4L)的MeOH。可以使用其它的具有1至3个碳原子的醇来代替甲醇。使沉淀沉积并收集在滤纸上，然后用少量体积(在实施例中约1/5至1/3L)的“碱性”MeOH洗涤(步骤1304)。“碱性”MeOH是用每L 1-2ml 10NNaOH碱化的MeOH。将洗涤后的固体吹干，得到的浅绿色粉末可在室温下存放许多月份，后文描述的RBC凝集试验揭示，此粉末中活性成分的含量被提高。在这一步中，大多数的糖被去除。通常，每升OSCP溶液可回收到约70-80克绿色粉末。
接着，将足量的绿色粉末溶解在200ml水中，制成浓的或接近饱和的溶液(步骤1306；得自20％OSCP溶液，一般为30-40g)。然后酸化此溶液，将酚盐离子复原成酚基团，在本例中，通过加足量的浓酸(例如约13-16ml的12M HCl)将溶液调节至pH约3至4(步骤1308)。在从OSCP进行萃取时，在到达必须pH后，溶液立即变成酒红色。去除不溶性的固体(例如通过过滤或离心)，上清液被上样在C18亲脂性柱(Waters Cartidge)上，柱已用MeOH预处理并再用去离子水洗涤过(步骤1310)。取自曼越橘的溶液被上样后，C18柱用2-3倍柱体积的水洗涤并用甲醇洗脱。对上样有200ml取自曼越橘的酸化溶液的35mlC18柱来说，洗脱步骤1312需使用100ml(2-3倍柱体积)甲醇。可以使用其它与水互溶的醇来代替甲醇。可以使用其它与水相比为非极性的有机溶剂(如乙腈)代替醇。另外，可以使用如C2或C8或苯基等其它类似的反相硅胶柱来代替C18或亲脂性Sephadox LH-20或LH-60等。
B.各种萃取液
表I显示的是本发明的一种实施方法中，各种不同极性溶剂中的溶解度。
粉末溶液的折射系数在浓度为1.0mg/ml时约1.3320，浓度为8.5mg/ml(在水中的最大溶解度)时约1.3370.
                          基I
              溶剂                溶解度
             丙酮                133mg/ml
             甲醇                530mg/ml
             乙醇                450mg/ml
             丁醇                275mg/ml
             水                  8.5mg/ml
由曼越橘(V.macrocarpon的浆果)制备的萃取液具有某些可在红外光、可见光和紫外光范围的吸收光谱中观察到的特征。图2显示了萃取液的IR透射光谱，大致在以下波数(以cm-1为单位)具有明显的吸收波谷：4310、2960、1735、1610、1524、1443、1360、1285、1210、1111、1066、822、785、500，分别用以下数字表示：202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228。500cm-1处的228峰很宽。
图3显示的是溶解在MeOH中的曼越橘萃取物的吸收光谱，波长约为250nm至600nm(紫外光和可见光区)。萃取物在甲醇中的浓度约0.05mg/ml。在约200-500nm间可观察到4个吸光度最大值，吸收峰一般出现在200-210nm、275-290nm、355-375nm和440-460nm。这些最大值用箭头310、320、330、340表示。这四个峰是萃取物的特征峰。吸收峰的相对强度可能略有变化，但峰320、330、340一般约在1.8∶0.64∶0.12范围内。已知多酚(包括类黄酮化合物)具有特征相似的UV/可见光吸收光谱。曼越橘萃取物还在以280nm波长的光激发时在315nm表现出强荧光性。加入AlCl3后，荧光和吸收光谱的最大值都发生红移，此为酚类化合物的特征之一。
图4显示溶解在水中的两种不同浓度(曲线400，402)的曼越橘萃取物的吸收光谱。获取曲线402所用的样品比曲线400的样品浓缩了200倍。光谱具有以下特征性吸收峰：202、278、368和454nm，分别以数字410、420、430和440表示。各峰的大致相对强度(以(mg/ml)-1)(cm)-1为单位)分别为：0.28、0.025、0.0031和0.00085。峰420、430(分别在278nm和368nm)也是含类黄酮和多酚的化合物水溶液的光谱的特征峰。通常，280nm和360-370nm处的吸收峰表明有类黄酮存在，但多酚在200nm至280nm具有最大吸光度而在360至370nm处几乎没有或没有吸光度。
存在于萃取物中的类黄酮/多酚化合物包括具有糖苷成分的化合物。对几种类黄酮糖苷配基进行了测试并发现它们不具有抗粘附活性，其中包括杨梅黄酮、芸香苷、和五羟黄酮。
曼越橘萃取物的特征还在于萃取物MeOH溶液的HPLC过程中，在360nm处具有光吸收组份的特定洗脱时间。图5A和图6A显示了在360nm处具有光吸收组份的曼越橘萃取物的典型的吸光度对时间的色谱图。将1500μl溶液上样在制备级大小的反相C18柱(Waters C18预装柱，BONDAPAK，cat.#WAT038505，Millipore Corp，Milford MA，USA)上，溶液中每4ml甲醇(即约37.5mg)含100mg干粉。C18是与微珠结合的一种亲脂性试剂，链长为18个碳原子。为制备体积约50ml、直径25mm、长100mm制备级大小的柱，需在0至76min内以5ml/min流速进行80％A/20％B至31％A/69％B(A＝0.4％的磷酸，B＝MeOH)的双溶剂线性梯度洗脱。76分钟后，再在31％A/69％B维持恒速44分钟。利用360nm处的光检测，在约46、52、56和64分钟分别观察到约4个大的360nm吸收峰(在图6A和6B中分别以数字602、604、606、608表示)。
在一体积约5ml分析柱上(图8)上样约1.25mg溶于约1ml水或乙醇中的粉末。在0至38.3分钟内以1ml/min的流速进行80％A/20％B至31％A/69％B(A＝0.4％H3PO4，B＝MeOH)的双溶剂线性梯度洗脱。38.3分钟后，再在31％A/69％B维持恒速21.7分钟。利用360nm处的光检测，在洗脱时间约22至40分钟之间观察到约4个主要洗脱峰，和在约9至15分钟之间较早的三个洗脱峰。或者，可以使用改善基线噪声和峰对称性的改进法。在0至38.3min内以1ml/min流速进行79％A/21％B至35％A/65％B(A＝0.4％的磷酸，B＝95％的MeOH和5％的0.4％磷酸)的双溶剂线性梯度洗脱。38.3分钟后，再在35％A/65％B维持恒速21.7分钟。然后再用100％的甲醇洗柱10分钟，流速为1.0ml/min。
有时(例如图9)，在以80％A进行5分钟的50ml制备柱色谱，再在其后的38.3分钟内进行80％A至31％A的线性梯度洗脱，最后再在31％A恒速洗脱21.7分钟(总时间为70分钟)。用此梯度法，与萃取液中活性成份相关的360nm吸收洗脱峰图略有不同，但与分析柱的较接近。
曼越橘萃取物的特征还在于某些紫外-荧光组份在纸上和薄层色谱(“TLC”)中的特殊迁移格局。在硅胶柱上对曼越橘萃取液(溶剂为98∶2丙酮∶水)进行TLC时，在长波紫外光下可观察到4条特征性荧光带。特征性荧光带的特性如表II所述：
                               表II
由TLC观察到的、在丙酮∶水(98∶2)中、用UV光照射后的特征性带事相对迁移距离(Rf)和颜色
                     R f         颜色
     条带#0         0.0         淡红色
     条带#1         0.2         蓝色/蓝色-白色
     条带#2         0.6         亮黄色
     条带#3         0.7         亮黄色
     条带#4         0.97        白色
用6∶1∶2丁醇∶HOAc∶H2O溶剂系统在Whatman#3纸上进行纸色谱时，用长波长UV光(366nm)照射时，可观察到3个明显的荧光峰。这三个荧光峰如表III所述：
                               表III
用UV光照射后的、6∶1∶2丁醇∶HOAc∶H2O溶剂系统中的纸色谱的荧光条带相对迁移距离(Rf)和颜色
                   R f           颜色
      条带#5      0.44         强荧光黄
      条带#6      0.50         弱荧光黄
      条带#7      0.77         中等荧光黄
在一较好的实施方法中，浓缩萃取物基本不含游离的简单糖(如果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等单糖和二糖)。
在一实施方法中，浓缩萃取物中的总酸含量(包括苯甲酸)约低于2％。苯甲酸的含量通常低于0.005mg/g。此苯甲酸含量相同于或低于某些已有产品中的约1％，正如表IV所述。汁类产品在测试前被浓缩成粉末，酸含量的比照是所得固体的质量。降低了的苯甲酸和总酸含量使得产品的酸味较少，据信，这样就不易引起胃部不适或促进牙齿的损坏。
                            表IV
       产品                           重量％苯甲酸
      KNUDSEN曼越橘汁                   0.50
      HAINS曼越橘汁                     0.11
      JANET LEE曼越橘汁                 0.06
      OCEAN SPRAY曼越橘鸡尾酒           0.10
      OCEAN SPRAY曼越橘粉               0.12
      本申请的曼越橘萃取物              0.0002
具有以上特性(包括很低的简单糖和苯甲酸含量)的曼越橘萃取物已被发现可干扰细菌细胞与某些细胞表面及聚苯乙烯之类表面的粘附。
C.使用方法
抑制细菌与表面粘附的方法包括以下步骤：提供浓缩了抗粘附活性和在280nm和/或360nm有光吸收的多酚化合物的越橘属萃取物，将有效量的萃取物在被认可的载体中构成的组合物施用于表面，该表面被认为粘有大肠杆菌之类的细菌，由此使细菌与表面脱离。较理想的是，漂洗表面以去除已脱离的细菌。此方法可用于抑制细菌与以下表面的粘附：如牙齿、粘附在牙齿上的其它细菌、人口腔上皮细胞和人尿道上皮细胞；并可用于清洗牙科用具、微生物发酵罐等。
D.组合物
本发明涉及口腔保健产品，其中含有前文所述的取自越橘的萃取物，此萃取物具有抗微生物粘附特性。这样的口腔保健品包括但不限于牙膏、漱口液和口香糖。
本发明牙膏的制造可以通过将有效量的取自越橘的萃取物制备在常规的粉末或膏体载体中，载体由包括亲水性基质、乳化剂、调味剂、香料、防腐剂等在内的成分按常规配比构成。这种牙膏中可以含有有效量的磨料成分以机械降解/去除牙石和/或氟化物。一具体的牙膏实施例中含有与其它牙膏组份混合的约0.2％至5％(干重)的取自越橘的萃取物。
口香糖中含有常规的胶类组份、防腐剂和有效量的萃取物，后者的含量通常在约0.5％和约5％(干重)之间。
一种漱口液含有水性或水-醇溶液载体、防腐剂和有效量的萃取物，后者的体积通常是在约5％至约10％之间，或干重0.005至2％之间。
另一种使用了萃取物的产品是用于通过(例如)减少或防止有害菌与咽喉组织粘附来治疗咽喉痛的喉喷剂或锭剂。
常规地，有时将过氧化氢或其它强氧化剂包含在口腔保健品中。但是，现在认为，最好不要将过氧化氢之类的强氧化剂包含在内。
还考虑将取自越橘的萃取物制成适于定期给药的胶囊或片剂，以帮助维持尿道卫生，尤其是作为尿道感染的预防药。或者，出于相同目的，可制备浓缩了萃取物的饮料，使得不喜欢曼越橘口味的人能获益于已知的曼越橘汁的益处。萃取物在片剂中的含量须为5至500mg/片，或以提供相同剂量的含量存在于100ml至250ml饮料中。
取自越橘的萃取物还可以制成用于治疗尿道感染的组合物。如果是片剂形式，这样的组合物应包含约10至500mg取自越橘的成份(溶于合适的惰性载体中)/剂量单位，该剂量每日服用1至4次。或者，可选择性地包含一种或多种下列成份：用于缓解急性症状的非那吡啶HCl(约50至200mg/剂量单位)、抗感染剂乌洛托品(约50至500mg/剂量单位)和如二磷酸钠、马尿酸、维生素C或苯乙醇酸等尿道酸化剂(约100至500mg/剂量单位)。
本发明的一种足用粉通常包含有效量的萃取物，混以咪康唑或克霉唑、滑石粉、淀粉和香精(可能)。制成喷雾剂时，还需用到推进剂。
足用的药膏或霜剂通常包含有效量的萃取物，咪康唑或克霉唑、石油、羊毛脂、十六烷基硫酸钠、乳化剂和防腐剂。
足用溶液通常包含本发明的萃取物，咪康唑或克霉唑之类的抗真菌剂和溶剂系统(如水和乙醇)。
治疗酵母菌感染用的阴道霜剂包含萃取物、有效量的克霉唑、咪康唑或特康唑之类抗真菌剂、苄基醇、十六烷基醇和蜡或其它霜剂基质。
                           实施例
实施例1-3说明萃取物的抗粘附性。至少已知有三种细菌细胞与其它细胞及表面的粘附方式。一种方式是由细菌表面的I型菌毛介导的，其特征在于对游离甘露糖的敏感性。第二种方式是由P-型菌毛(“P型菌毛”)介导的。第三种和其它粘附方式的机制还不十分清楚。豚鼠红细胞被认为具有大肠杆菌(E.coli)I型(甘露糖敏感型)菌毛的受体，因为细菌能够在无甘露糖存在下凝集豚鼠红细胞，而在甘露糖存在下则不能。(参见Aronsen， J.Infect.Dis.139：329-332(1979)；Riegman， J.Bacter.172：1114-1120(1990)；Jann， Infect.Immun.22：247-254(1981))。
                           实施例1
根据对细菌与膀胱细胞的粘附的干扰来测定抗粘附活性：
由一健康女性志愿者的尿液中离心收集人膀胱上皮细胞。用标准柠檬酸盐溶液(SSC)洗涤细胞并重悬至需要的体积。测定细胞溶液的光密度和细胞个数。分离自尿道感染组织的大肠杆菌菌株在胰蛋白酶黄豆培养基中于37℃培养72小时，以促进菌毛生长。同样离心法收集细菌，并重悬在所需体积的SSC中，并测定大致的细胞数目。
准备一试管，其中含有0.667ml有待测定抗粘附性的物质的特定稀释度稀释液，加入0.334ml细菌悬浮液。细菌与待测物质(由图1所示的方法，步骤116产生的浓缩萃取液)在37℃一起孵育15分钟。然后，在每支试管中加入1.0ml膀胱细胞悬浮液，再孵育15分钟。曼越橘以8.5mg/ml的溶液形式使用。对未进行分离的曼越橘汁也进行了测试。
孵育后，将试管中的内容物滤过8微米的聚碳酸酯滤膜，用2体积(2ml＝1体积)SSC漂洗滤膜，以洗去所有未与膀胱细胞粘附的游离细菌。将滤膜面朝下放在显微镜上，将细胞热固定在载玻片上。去除滤膜，将载玻片染色以看见细胞，对每块载玻片上的20个细胞，计数每个细胞的粘附细菌数/细胞。
进行两个对照测试。第一个，只将膀胱细胞培养在SSC中，不加细菌悬浮液和待测物质，测定尿样中原有多少细菌已与上皮细胞粘附。第二个，用待测物质液代替SSC，测定不加抑制剂时与细胞粘附的最大细菌数量。
                             实施例2
以下测试是改进后的，并被用于测定萃取物抑制大肠杆菌造成的豚鼠红细胞(“RBC”)凝集的能力：
RBC，取自豚鼠(Microbio Products of Tempe，AZ)，悬浮于Alsevers溶液中，在SSC中洗涤并重悬在SSC中。在SSC中洗涤并重悬来制备通过标准方法取得的志愿者的RBC。人RBC被认为具有抗甘露糖大肠杆菌菌毛的受体。
大肠杆菌，其培养与制备如实施例1所述，如下对其进行测试。将一系列含有用SSC顺序稀释的被测物质的点，外加一个只含有SSC的点点样在聚苯乙烯试验板上。点样体积为10μl。在每一点中混有等体积的细菌悬浮液，然后混入1/2体积的RBC。这样，每点(初始体积为10μl)的总体积是25μl。充分混合每点中的内容物，将凝集程度计为0-4级，0代表不凝集。将所有稀释度的分值加和并从32中减去该值，得到凝集干扰活性的活性指数。
图5A，5B和6A，6B显示的是高压液相色谱(制备柱，25ml/100ml)的吸光度色谱图。图5A中，显示了4种不同波长的吸光度：230，280，360和512nm。已知类黄酮和多酚在约280nm具有强吸收，类黄酮还在360nm具有吸收峰。已知花青苷在512nm有强吸收。图5B是图5A中512nm处色谱的放大复制。比较图5A和图5B，可以看见，对应于花青苷吸光度的峰高是对应于多酚(280nm)吸光度的峰高的1/10或更低。
分别收集了12份洗脱液进行进一步的分析：502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524。510、514、518、522份洗脱液包含350nm至370nm的强吸收峰，此为类黄酮和多酚组份的特征波段。504和506份洗脱液跨越了花青苷吸收峰的保留时间，它在512nm有吸收。
表V对502至524份洗脱液的抗粘附活性与全萃取物(未分离)的进行了比较。后者样品的色谱图展示在图9中(利用50ml柱，用变梯度法获得)。510、514、518、522、504和506份洗脱液的吸光度色谱图分别展示在图7A至7F中。
根据这些光谱，很明显，510、514、518和522份洗脱液都含有相对较多的在350-360nm具有吸光度的物质。另外，如表V所示，在504、506洗脱液中发现有明显的抗粘附活性，其中不含可测量的360nm吸光物质。洗脱液540、506含有少量在512nm有吸光度的化合物(据信是花青苷)，以及大量在230至280nm处有吸光度的物质。但是，对曼越橘花青苷制剂进行分析，发现不具有可测量的抗粘附活性(参见表VI)。这样，在230至280nm处具有光吸收的化合物中似乎至少具有部分曼越橘抗粘附活性。
                 表V
     豚鼠RBC凝集试验中HPLC洗脱液组分的比较
洗脱液组分#                    活性指数
510                                6
512                                4
514                                5
516                                2
518                                1
520                                0
522                                0
524                                0
526                                4
504                                18
506                                18
508                                6
500                                0
502                                5
步骤116的萃取液                    9
重结晶后的116萃取液*               33
*由水、醇(例如甲醇或乙醇)或它们的混合物中制取的针状晶体(熔点＞280℃)。
用于测试与人膀胱细胞粘附的大肠杆菌菌株是从人的活性膀胱感染组织中分离得到的。标识为#3B的该菌株似乎具有I型和P型两种菌毛。
各种被测物质和两种大肠杆菌株的凝集测试结果显示于表VI。“Gp”表示豚鼠细胞试验，“HU”表示人细胞试验。在豚鼠细胞试验中，25μl测试点中最终萃取物(图1中的步骤116)的最高浓度是0.056mg/25μl；样点中花青苷的最高浓度为0.063mg/25μl；甘露糖的最高浓度为0.10mg/25μl。同时显示对酸化醇萃取液(步骤102)进行的相同测试的结果，样点中萃取物的最高浓度为0.4mg/25μl。表VI所示试验所用的花青苷是用图10所示方法从曼越橘中制取的。步骤1008B中，收集了空体积洗脱液和水性洗液(步骤1008A)后，1％HCl洗脱的阳离子柱洗脱液被发现选择性地回收了大量或全部曼越橘中的花青苷含量。花青苷制剂中不含大量的其它物质。
                         表VI
          利用萃取物和利用已知物质的粘附抑制性比较
        样品名称   血样    活性指数
       1％甘露糖    Gp        24
       组份(116)    Gp        10
       EXPT.1       Hu        13
       组份(116)    Gp        9
       EXPT.2       Hu        11
       醇萃取液     Gp        10
       花青苷       Hu        0
       花青苷       Gp        0
根据表V和VI的结果，很明显，曼越橘萃取物抑制I型和P型菌毛介导的大肠杆菌对豚鼠RBC的粘附。由于萃取物中几乎不含游离的单糖或二糖，两种类型的粘附抑制都与这些糖无关。有趣的是，P型介导的粘附被认为高发于尿道感染的大肠杆菌中。
萃取物也降低铜绿青霉与膀胱上皮细胞的粘附，但是降低程度低于用大肠杆菌所观察到的。萃取物对几种乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)菌株与人膀胱细胞的粘附没有明显的作用。
此外，大肠杆菌在有萃取物存在时不粘附于聚苯乙烯塑料。但是，必须指出的是，通常，大肠杆菌不易于粘附聚苯乙烯。
                           实施例3
在步骤104(图1)中使用不同金属化合物的萃取得率的比较：
力420ml酸化醇粉碎420g曼越橘，使混合物静置过夜。离心混合物，分离并保存上清液1，再加1200ml酸化醇粉碎固体沉淀1。离心粉碎后的固体沉淀1混合物，保存上清液2，再力1000ml酸化醇(HCl/MeOH)粉碎沉淀2。再离心粉碎后的沉淀混合物2，并将上清液3与上清液1和2合并。
合并后的上清液蒸发至450ml，pH约的1.7。将混合物分成6份，每份75ml。每份75ml中，加入20ml的15M NH4OH，调节pH至8.5至8.8。各份样品分别与100ml 1.1M的以下溶液混合：乙酸锌、硫酸锌、乙酸钙、乙酸钡、乙酸铜和乙酸钴。离心样品，弃去上清液，沉淀都用100ml 80％乙醇水溶液洗涤3次。弃去洗涤上清液(含糖)(步骤103，106)。
接着，每份沉淀中加20ml正丁醇，和足以将pH调至2.5或2.5以下的浓盐酸(步骤110)，如表VII所示，通常约0.75ml 12N HCl，但有例外。用硫酸锌处理后的样品产生较大的沉淀，必须另加0.8ml HCl充分溶解这些沉淀。对于乙酸钡样品，需要另加0.25ml HCl来处理沉淀。全部样品的pH在约0.8至2.5之间。
六份样品再一次离心并弃去沉淀。对六份样品的丁醇上清液进行石油醚萃取(步骤112)，用水进行足够次数的反萃取，将红色基本上全部从有机相转移至水相。表VII概括了6份样品的石油醚萃取(步骤112)结果。
每份样品的水层然后用50ml EtAc萃取3次(步骤114)。用乙酸锌处理的样品产生约150ml桔红色的乙酸乙酯相。硫酸锌处理的样品生成约150ml暗红色溶液。乙酸钙处理的样品产生约150ml桔黄色溶液。乙酸钡处理的样品产生约150ml亮黄色溶液，乙酸铜处理的样品产生约150ml深黄色溶液，钴盐处理的样品产生约150ml黄色溶液。
将分离得到的每份样品的EtAc相蒸干(硫酸锌处理的样品除外，它并不完全干燥)，生成红色粉末状残留物。干燥萃取物的回收重量如下：乙酸锌，63mg；硫酸锌，2980mg；乙酸钙，31mg；乙酸钡，113mg；乙酸铜，14mg；乙酸钴，26mg。
                           实施例4
以相同于实施例3的方式，再次比较在步骤104中使用不同的金属混合物后的得率。结果包括在表VII中。干重得率为：乙酸锌，46mg；乙酸镍，14mg；乙酸镁，17mg；乙酸钠，18mg；乙酸铵，1mg。
                     表VII
样品     石油醚量     反萃取次数      水溶液的最终体积
实施例3
乙酸锌    100ml            2                30ml
硫酸锌    300ml            1                25ml
乙酸钙    100ml            2                30ml
乙酸钡    300ml            3                50ml
乙酸铜    100ml            2                30ml
乙酸钴    100ml            2                30ml
实施例4
乙酸锌    100ml            3                40ml
乙酸镍    100ml            3                30ml
乙酸镁    100ml            3                30ml
乙酸钠    100ml            3                25ml
乙酸铵    100ml            3                20ml
                          实施例5
图8显示由步骤102从曼越橘制得的最初萃取液的色谱图。萃取液(去除醇后的水性上清液)的体积与曼越橘起始物体积大致相同(参见实施例3)。该色谱图与图5A，5B，6A和6B的不同在于柱的大小不同，装柱所用的是4μm颗粒，所用的方法略有不同。为了获得此色谱图，使用的是直径8mm，长100mm和体积5ml的C18柱。物质在萃取液中的质量浓度约200mg/ml(取一小份萃取液蒸干后测得)。将50μl 200mg/ml的溶液(总质量为100mg)注入柱中，流速为1ml/min。在这样的条件下，在360nm有光吸收的最主要的洗脱峰802、804、806的保留时间分别是33，36和38分钟。
                          实施例6
图9显示步骤116产生的曼越橘萃取物的色谱图，是在制备级(50ml)C18柱上用另一方法洗脱的。此方法中，50μl 50mg/ml的曼越橘萃取物溶液(总质量为2.5mg)注射上柱。在图9中也可以看见三个360nm吸收峰902、904和906，它们的保留时间分别是34，39和43分钟。可以发现，360nm吸收峰的保留时间与图5和图6中的略有不同，这些吸收峰也是用直径25mm、长100mm、体积50ml、同样用C18型颗粒的制备级柱获得的。这些峰比图8中的略有漂移，漂移量与图8柱和另一(缩短的)制备柱法之间5分钟的梯度洗脱时间差异一致。
以下计算提供了对最终曼越橘萃取物中360nm吸光化合物(类黄酮)相对浓缩率的粗略估计。图9中360nm吸收峰下的面积约2.6A.U.(吸光度单位)，图8中的360nm吸收峰下的面积约0.21A.U.。2.6除以0.12，结果乘以4(上样在柱上的质量的差异因数(图8的上样量为图9的4倍))，360nm吸光化合物在步骤116萃取物中比最初萃取液中浓缩了约87倍。根据此粗略计算和对其它样品类似的粗略估计，最终曼越橘萃取物中360nm吸光化合物(本文认为是多酚)的浓缩程度与抗粘附活性的浓缩率相同。
                          实施例7
图11A-F是特定制剂(包括表VIII中的某些)在C18柱上的色谱图。图11A是表VIII中样品18的色谱，这是10％的OCEAN SPRAY粉末溶液。图11B和图11C是步骤1000的C18柱的水洗液的色谱，对应于表VIII中的样品19和20。图11D是步骤1000(图10)的甲醇洗脱液的色谱，其中含有活性成份，对应于表VIII中的样品21。在图11D中可以看见一组在30至42分钟之间洗出的360nm吸收峰1100。这组峰在图11B或11C中并没有测到，这些峰中的洗脱物质相对量比在起始物(图11A)中的少得多。在图11D中还可以看见一组在512nm出有光吸收的洗脱峰1102，此为花青苷的特征峰。
图11E是进一步进行了阳离子色谱(步骤1008)的样品的色谱图，对应于表VIII中的样品23。峰1100的含量与图11D中的相似，但峰1102(花青苷)含量明显减少。另外，测得一组在23至27分钟洗脱的小峰1104。图11F是阳离子柱HCl洗脱液的色谱图，对应于样品24。峰1102是大量的，而峰1100几乎消失。
                        表VIII
      萃取物制备过程中特定产物的抗粘附活性
样品                                    标定活性 1
1.MAW最初萃取液                           14.9
2.最初萃取液的沉淀                        1.2
3.EtAc萃取前(图1步骤110)                  5.7
4.步骤114，水相                     8.4(16.8，0.0)
5.步骤116(蒸发有机相)               33.8(117.7，0.0)
6.EtAcEt210∶1∶5最初萃取液              4.3
7.最初萃取液的沉淀                        3.9
8.EtAcEt5∶1∶10最初萃取液                0.0
9.最初萃取液的沉淀                        7.7
10.EtAc最初萃取液                         3.3
11.最初萃取液的沉淀                       6.4
12.沸水                                   6.1
13.最初萃取液的沉淀                       5.3
14.步骤1002产物                           23.9
15.回流水                                 4.1
16.最初萃取液的沉淀                       6.6
17.步骤1002产物                           39.4
18.10％OCEAN SPRAY粉末                    4.6
19.步骤1001的水洗液                       4.1
20.步骤1001的第二次水洗液                 0.0
21.步骤1002的产物                         34.5
22.步骤1002的产物CHCl3/EtAc萃取液        22.7
23.步骤1008A的产物                        45.1
24.步骤1008B的HCl洗脱液                   0.0
25.步骤1008C的甲醇洗脱液                  92.1
11％的甘露糖水溶液＝100
2EtAcEt＝乙酸乙酯/乙酸/乙醇
RBC试验值和图11A-11F样品色谱的的比较表明，RBC试验中的明显活性正比于峰1100。
                          实施例8
图10方法中步骤1006产物样品在-50ml的C18柱上进行HPLC(图12)。收集组份1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214并进行RBC试验分析(表IX)，不同的洗脱时间以分钟为单位标明在X轴上。由于1200-1208洗脱液都具有明显的活性，似乎萃取液中含有多种与抗粘附活性有关的组份。根据此数据，似乎多酚与萃取液的抗粘附活性有关。多酚对紫外光具有强吸收(在230nm和280nm)。几乎不含360nm吸光物质的洗脱液1200，1202和1204具有明显的230nm和280nm吸光物质的洗脱峰，该波段预计为多酚。已知多酚可能在与C18柱相似的亲脂性柱上被保留。所以，可以预计用此方法制得的萃取物中含有多酚。
                           表IX
                特定HPLC洗脱液组分的活性比较
                    样品          标定活性 *
                   1200          10.5
                   1202          25.1
                   1204          37.8
                   1206          45.1
                   1208          41.6
                   1210          0.0
                   1212          0.0
                   1214          0.0
*＝1％甘露糖水溶液＝100
本发明参考具体的实施方法，植物种类和组织，缓冲液和化学方法等进行了描述。但是，本领域熟练技术人员应当认识到，可以进行多种化学方面的替换，这并不背离本发明的精神和范围。

Claims (13)

1.一种植物萃取物，其特征在于，具有能抑制细菌与表面粘附的活性成份，其制取的方法包括：
提供越橘属植物原料均质物，其中包含植物原料抗粘附性多酚化合物所在的的天然活性成份；
在所述的均质物中加入足量的碱，将所述均质物碱化成pH大于约pH10，使得多酚混合物的酚基团电离成酚盐离子；
向所述的碱化后的均质物中加入足量的醇，生成所述的具有酚盐离子的多酚混合物的沉淀，并分离沉淀。
2.根据权利要求1所述的植物萃取物，其特征在于，所述的方法还包括：
通过用水互溶性有机溶剂在亲脂性柱上洗脱来分离所述的沉淀；
分离并鉴定出主要含所述的抗粘附活性成份的洗脱液之一。
3.根据权利要求1所述的植物萃取物，其特征在于，所述方法还包括去除植物原料中的单糖和二糖。
4.一种制备提取物的方法，该提取物的活性组分抑制细菌与细胞表面的粘附，该方法包括：
提供越橘属植物原料，其中包含抗粘附性多酚化合物所在的的天然活性成份；
用pH高于10的水性碱溶液将植物原料碱化至pH10以上，使得其中的多酚化合物离子化成酚盐离子；
向所述的碱化后的均质物中加入足量的醇，以产生具有酚盐基离子的多酚化合物的沉淀；
分离所述的沉淀；
将所述沉淀重溶于水；
酸化所述的溶液；
对所述溶液进行柱分离，以有机溶剂梯度水溶液洗柱，所述柱分离选自阳离子交换柱或亲脂性柱分离；
用水互溶性有机溶剂洗脱；
分离并鉴定出主要含所述的抗粘附活性成份的洗脱液。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括采用阳离子交换柱，在用水互溶性有机溶剂洗脱之前先用水性酸溶液洗柱。
6.一种组合物，其特征在于，它包含：权利要求1所述的萃取物，其含量足以干扰细菌与表面的粘附；和合适的载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的表面是生物表面。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，它是口腔保健品，而且其中所述的载体是局部载体，选自牙膏、粉末、凝胶基质组合物、水溶液、水-醇溶液，它们适用于漱口液、牙棉、人工唾液和口香糖。
9.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，其中所述的载体是片剂，而其中所述组合物的含量为约0.5mg至约500mg。
10.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，其中所述的载体与生殖和颈粘膜组织相适应，选自灌注剂、栓剂、霜剂和凝胶。
11.权利要求1所述萃取物用于制备干扰微生物与所述机体组织粘附的药物的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，其中所述的机体组织选自牙床、牙齿表面、口腔粘膜组织、咽喉粘膜组织、生殖粘膜组织和颈表面组织。
13.权利要求1所述萃取物用于制备干扰细菌与尿道组织粘附的药物的用途。
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