CN115232867A - 一种快速的二代基因测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速的二代基因测序方法。该测序方法包括以下步骤：聚合：将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上，检测复合物上修饰有荧光基团和阻断基团；采集：激发荧光基团产生荧光信号，通过光学成像系统获取成像光斑，识别成像光斑得到碱基类型；切除：切除阻断基团和荧光基团；重复聚合‑采集‑切除的循环；其中，采集在聚合的步骤开始后启动，和/或，切除在采集的步骤开始后启动。根据本申请的测序方法，至少具有以下有益效果：利用需要消耗较长时间的信号采集期间进行未完成的合成反应以及切除反应的准备工作，通过这种方式压缩单个循环的时间，最终可以将整个测序流程的时间大大缩短。

Description

一种快速的二代基因测序方法

技术领域

本发明属于基因测序领域，具体涉及一种快速的二代基因测序方法。

背景技术

为了克服第一代测序技术成本高、通量低的缺点，基于边合成边测序(sequencingby synthesis，SBS)原理的二代基因测序技术(NGS)应运而生。现有的二代测序技术以Illumina公司的桥式扩增技术以及华大基因的DNBSEQ技术为代表，通过检测荧光信号来实现DNA序列中4种碱基(A、C、G和T/U)的鉴定和区分。具体来说，这种方法使用了带荧光标记和阻断基团的dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，并且dATP、dCTP、dGTP、dTTP携带的荧光标记基团各不相同。由于阻断基团的存在，在每一轮次的DNA聚合反应中，每个DNA模板上都只会添加一种互补的dNTP，通过相应波段的激发光激发后便能检测出本轮次添加的dNTP类型，随后用合适的化学试剂将阻断基团和荧光标记基团切除，使得测序反应能够正常进入下一个轮次。然而，现有的测序流程周期较长，有必要提供一种能够在保证测序质量的前提下，测序时间大大缩短的测序方法。

发明内容

本申请旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种快速的二代基因测序方法，采用该方法进行测序可以在保证测序质量的前提下，有效缩短测序时间。

根据本申请的一个方面，提出了一种测序方法，包括以下步骤：

聚合：将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上，检测复合物上修饰有荧光基团和阻断基团；

采集：激发荧光基团产生荧光信号，识别荧光信号得到碱基类型；

切除：切除阻断基团和荧光基团；

重复聚合-采集-切除的循环；

其中，采集在聚合的步骤开始后启动，和/或，切除在采集的步骤开始后启动。

根据本申请的测序方法，至少具有以下有益效果：

参考图1的A，现有的二代测序通用流程是首先进行聚合反应，待其结束后进行采集信号，信号采集结束后再进行切除反应，然后进入下一个循环。而在本申请中，参考图1的B，为了充分利用信号采集过程的时间，在这一阶段中进行至少部分的聚合和切除过程。在其中部分检测复合物送入反应体系并与引物连接后，即开启信号采集过程；和/或，在信号采集过程中，对于特定位置上已完成信号采集工作的待测核酸分子，开始切除过程的预处理，从而利用需要消耗较长时间的信号采集期间进行未完成的合成反应以及切除反应的准备工作，通过这种方式压缩单个循环的时间，最终可以将整个测序流程的时间大大缩短。

可以理解的是，上述以及下文中在某一步骤开始后启动通常也是指某一步骤开始后并且尚未结束前启动。对于上述记载的方法，即是在聚合的步骤结束前开始采集，和/或，在采集的步骤结束前开始切除。

其中，检测复合物是指包含任选的基于边合成边测序原理所采用的可逆终止子的物质，从而完成单碱基添加和识别。其具体的实例包括但不限于单独修饰有阻断基团和荧光基团的脱氧核糖核苷酸，这种方式会造成合成伤疤(scar)，进而累积影响聚合及切除效率，因而为解决该问题也可以是分别修饰有阻断基团和荧光基团的多个脱氧核苷核苷酸的复合物，或者脱氧核糖核苷酸与其它物质复合后形成的修饰有荧光基团和阻断基团的复合物等等。荧光基团的具体实例包括但不限于FAM、HEX、TAMRA、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Texas、ROX、JOE、R6G、EDANS、IFluor、Alexa Fluor、FITC等。阻断基团的具体实例包括但不限于叠氮甲基、氨基、烯丙基、磷酸基团、3′-O-(2-氰乙基)等。

在本申请的一些实施方式中，将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上包括：

将检测复合物和聚合酶送入固相载体的表面，表面固定有待测核酸分子，引物杂交于待测核酸分子；

在聚合酶的作用下，检测复合物连接到引物并发生阻断。

聚合酶可以是细菌来源的野生或突变型的聚合酶，为了保证检测复合物中可逆终止子核苷酸能够以较高的效率连接到引物，可以选择具有较高掺入修饰底物能力的聚合酶，例如聚合酶9N等。

在本申请的一些实施方式中，检测复合物包括第一核苷酸类似物，将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上包括：

将第一核苷酸类似物和聚合酶送入固相载体的表面；

在聚合酶的作用下，第一核苷酸类似物连接到引物并发生阻断，形成检测复合物。

在本申请的一些实施方式中，采集在将第一核苷酸类似物和聚合酶送入固相载体的表面的步骤开始后启动。

在本申请的一些实施方式中，聚合步骤中，在形成检测复合物后还包括：

将第二核苷酸类似物和聚合酶送入固相载体的表面；

在聚合酶的作用下，第二核苷酸类似物连接到未与第一核苷酸类似物连接的引物上并发生阻断。在第一核苷酸类似物引入到大量引物链的过程中，可能存在部分引物没有及时引入第一核苷酸类似物，从而错过其中一轮碱基信号采集的问题，从而使每一轮的聚合和采集都更加充分完全，避免因本轮反应不充分而对下一轮反应造成的影响。

此外，由于第二核苷酸类似物仅仅对第一核苷酸类似物的结合起到补漏的作用，而不影响第一核苷酸类似物本身与引物的结合以及荧光信号的采集，所以信号采集步骤可以在第二核苷酸类似物和聚合酶送入固相载体的表面的同时甚至是第一核苷酸类似物和聚合酶送入固相载体的表面完成后或者第一核苷酸类似物和聚合酶开始送入固相载体的表面后的设定时间(例如0～n s)，n例如可以是60s、90s、120s、180s等，只要满足加入的试剂使其中至少一部分引物已经结合了第一核苷酸类似物后能够检测荧光信号即可开始。

在本申请的一些实施方式中，第二核苷酸类似物修饰有阻断基团。进一步的，第二核苷酸类似物仅修饰有阻断基团。例如，在第二核苷酸类似物的核糖的3号位羟基修饰有阻断基团。

在本申请的一些实施方式中，第一核苷酸类似物修饰有荧光基团和阻断基团。例如，在第一核苷酸类似物的碱基上修饰有荧光基团，在核糖的3号位羟基修饰有阻断基团。

在本申请的一些实施方式中，采集在将第二核苷酸类似物送入固相载体的表面的步骤开始后启动。

在本申请的一些实施方式中，固相载体可以是流动槽。可以理解的是，固相载体也可以是其它能够提供发生聚合、切除反应环境的任何载体。

在本申请的一些实施方式中，切除阻断基团和荧光基团包括：

将切除试剂送入固相载体的表面，去除检测复合物中的阻断基团和荧光基团。

在本申请的一些实施方式中，在切除之前，将洗脱试剂送入固相载体的表面，去除表面的残留试剂。

在本申请的一些实施方式中，将洗脱试剂送入固相载体的表面，去除表面的残留试剂的步骤在采集的步骤开始后启动。

在本申请的一些实施方式中，采集在聚合的步骤开始后启动为采集在聚合的步骤开始0～60s后启动。通过这种方式在聚合反应的过程中开始信号采集，从而可以在其中部分DNA扩增簇完成聚合后立即进行信号的采集，避免前期在全部完成聚合后才开始信号采集所导致的时间延长。例如，可以是在聚合的步骤开始第1s、2s、3s、5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、60s后启动。

在本申请的一些实施方式中，切除在采集的步骤开始后启动为切除在采集的步骤开始0～10min后启动。对于部分已经采集到碱基信号的DNA扩增簇，在全部完成采集前即开始后续切除反应的工序或其预处理的工序，从而避免了后期在全部完成采集后才开始切除而导致的时间延长。例如，可以是在采集的步骤开始第0s、10s、15s、30s、45s、60s、2min、3min、5min、8min后启动切除反应。根据不同信号采集系统所需时间以及后续切除试剂的进液速度等因素，可以在采集步骤开始后开始切除反应。

在本申请的一些实施方式中，开始切除反应是指先向固相载体的表面送入切除反应的清洗试剂，例如可以是洗脱试剂，从而将固相载体表面的其余残留试剂清洗以为后续的切除反应提供合适的反应条件。

在本申请的一些实施方式中，测序方法包括以下步骤：

聚合：

将预洗缓冲液送入固相载体的表面，冲洗掉建库扩增等过程中可能的残余试剂；

将聚合反应液1送入固相载体的表面，所述表面固定有待测核酸分子，所述聚合反应液1包含第一核苷酸类似物、聚合酶等，所述第一核苷酸类似物上修饰有阻断基团和荧光基团，在设定温度以及聚合酶等的作用下，第一核苷酸类似物连接到所述引物并发生阻断；

将聚合反应液2送入固相载体的表面，所述聚合反应液2包含第二核苷酸类似物和聚合酶等，所述第二核苷酸类似物上修饰有阻断基团，在设定温度以及聚合酶等的作用下，第二核苷酸类似物连接到未结合第一核苷酸类似物的引物上并发生阻断；

采集：

激发荧光基团产生荧光信号，识别荧光信号得到碱基类型；

切除：

将洗脱缓冲液送入固相载体的表面，去除表面的残留试剂；

将切除反应液送入固相载体的表面，切除反应液中含有能够将阻断基团和荧光基团分别或同时由检测复合物或第一核苷酸类似物上切除的试剂，在设定温度下反应，然后重新送入洗脱缓冲液，将切除后残留的试剂去除。

重复以上循环，实现测序。

其中，在聚合的步骤结束前开始采集的步骤，和/或，在采集的步骤结束前开始切除的步骤。

可以理解的是，预洗缓冲液、洗脱缓冲液等的具体组成属于本领域的常规组成，在此不再赘述。

可以理解的是，基于上述构思，检测复合物也可以是本领域所知的其它二代基因测序所用的包含核苷酸类似物的检测物。例如，检测复合物包括第二核苷酸类似物和第二检测分子，第二检测分子包括第三核苷酸类似物、第一核苷酸类似物特异性抗体中的至少一种。例如，聚合的步骤包括通过带有阻断基团的第二核苷酸类似物引入引物链先行进行阻断，随后通过修饰有荧光基团的第三核苷酸类似物通过诸如分子间作用力(例如静电力、氢键、范德华力、疏水作用力中的至少一种)的方式结合到第二核苷酸类似物上形成检测复合物进行信号采集。在此过程中，采集可以在聚合的步骤开始后启动，例如在至少一部分第三核苷酸类似物结合到第二核苷酸类似物上形成带有荧光基团的检测复合物后开始采集步骤，激发荧光基团产生荧光信号。在上述方式中，第三核苷酸类似物也可以采用诸如第二核苷酸类似物的特异性抗体进行替代，这些特异性抗体能够特异性结合不同碱基类型的第二核苷酸类似物，并且修饰有不同的荧光基团。因而，聚合的步骤包括通过带有阻断基团的第二核苷酸类似物引入引物链先行进行阻断，随后通过修饰有荧光基团的第二核苷酸类似物的特异性抗体通过抗原-抗体结合的方式结合到第二核苷酸类似物上形成检测复合物进行信号采集。在此过程中，采集可以在聚合的步骤开始后启动，例如在至少一部分特异性抗体结合到第二核苷酸类似物上形成带有荧光基团的检测复合物后开始采集步骤，激发荧光基团产生荧光信号。

在本申请的一些实施方式中，由于不需要单独的信号采集试剂，因而可以减少测序试剂盒的试剂种类，从而降低测序成本。

基于以上两点，在实际的测序过程中，根据所使用的聚合酶的聚合效率、聚合试剂的反应效率、送入聚合反应液、缓冲液的泵液系统的输液效率，以及光学成像系统获取荧光信号图像并识别其碱基类型的效率等因素，采集过程与聚合、切除反应的重叠包含关系可以各有不同。在其中一些具体的实施方式中，可以将其重叠的时间段尽可能拉长从而最大程度缩短除固定的信号采集时间外的其它工序所需的时间。

综上可以看到，相比于现有的测序过中信号采集时不泵液的情况，在本申请实施例所提供的测序方法中，信号采集过程中同样进行聚合和/或切除反应的泵液过程，这样，在测序合成的反应步骤就开始捕获信号，而捕获信号的过程中也可以开始后续的切除。另外在其中一些测序方式中，整个测序过程能够在较小的温度波动范围下进行，减少了升降温时间，通过以上两种方式缩短了测序所需要的时间。

附图说明

图1为本发明的实施例和现有的正常测序方法的流程示意图。

图2为本发明的实施例1和对比例1的单次循环的时间和不同循环次数下测序质量的比较。其中，A为实施例1和对比例1的单次循环中除去信号采集外的时长，B为实施例1和对比例1在1～100的不同循环次数(横轴)下，测序质量Q30的值。

图3为本发明的实施例2和对比例2的单次循环的时间和不同循环次数下测序质量的比较。其中，A为实施例2和对比例2的单次循环中除去信号采集外的时长，B为实施例2和对比例2在1～100的不同循环次数(横轴)下，测序质量Q30的值。

图4为本发明的实施例3和对比例3的单次循环的时间和不同循环次数下测序质量的比较。其中，A为实施例3和对比例3的单次循环中除去信号采集外的时长，B为实施例3和对比例3在1～100的不同循环次数(横轴)下，测序质量Q30的值。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。在以下描述中，虽然在流程图中示出了逻辑顺序，但是在某些情况下，可以以不同于流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。

除非另有定义，本申请中所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述本申请实施例的目的，不是旨在限制本申请。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

本实施例提供一种人类基因组的测序方法，包括以下步骤：

1.测序文库构建

(1)核酸提取，使用快速DNA提取试剂盒(TIANGEN，KG203)完成样本的基因组DNA的提取纯化工作，具体操作见其操作说明。

(2)文库构建，使用诺唯赞VAHTS Universal Plus DNALibrary Prep Kit forIllumina(货号：ND617-02)通用建库试剂盒构建文库，具体操作见其操作说明。

(3)文库质控，将富集好的文库进行浓度检测和片断长度质控。

经过以上操作，得到约50nM的长度约为1-1000bp的文库样品。

2.上机测序芯片制备

使用Illumina公司的Miseq测序仪及其配套的测序试剂盒(MiSeq Reagent Kitv3)进行文库变性、文库装载以及芯片表面扩增，从而得到DNA扩增簇，并加入测序引物ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC(SEQ ID No.1)，杂交完成后，测序芯片流动槽中固定了杂交有测序引物的DNA扩增簇，等待下一步测序反应。

3.测序

(1)测序试剂准备

聚合反应液1：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/ml聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，1mM EDTA，带有阻断基团和荧光染料的第一核苷酸类似物dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1μM；

聚合反应液2：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/ml聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，3mM CuCl₂，仅带有阻断基团的第二核苷酸类似物dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1μM；

洗脱缓冲液：5×SSC，Tween20 0.05％；

预洗缓冲液：50mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，10mM EDTA，Tween20 0.05％；

切除反应液：20mM THPP，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 9.0，Tween200.05％。

其中，带有阻断基团和荧光基团的第一核苷酸类似物dATP、dCTP、dGTP和dTTP(或仅带有阻断基团的第二核苷酸类似物dATP、dCTP、dGTP和dTTP)以dCTP为例如下所示，阻断基团为叠氮基团，dATP、dCTP、dGTP和dTTP的荧光基团分别为Cy5、ROX、AF-532、IF-700：

(2)测序反应循环

a)聚合反应：在扩增好的芯片中，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl预洗缓冲液到测序芯片流动槽内，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl聚合反应液1到测序芯片流动槽内，将温度设置为55℃，反应60s；之后加入注射泵以800μl/min的速度泵入200μl聚合反应液2，将温度设置为50℃。

b)信号采集：当聚合反应液2已经完全泵入到测序芯片流动槽内、开始反应的同时进行整张测序芯片的信号采集，确定每个扩增簇上引物链结合的碱基的类型。

c)切除反应：在信号采集结束后，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl洗脱缓冲液，之后注射泵以800μl/min的速度泵入200μl切除反应液，将温度设置为60℃，反应90s，之后以同样的速度再次泵入洗脱缓冲液200μl，重复清洗一次。

重复a)-c)步骤，进行下一个循环测序。总共进行100个测序循环。

同时设置按照正常流程的对比例1，具体步骤如下：

a)聚合：在扩增好的芯片中，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl预洗缓冲液到测序芯片流动槽内，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl聚合反应液1到测序芯片流动槽内，将温度设置为55℃，反应90s；之后加入注射泵以800μl/min的速度泵入200μl聚合反应液2，将温度设置为50℃，反应90s。

b)信号采集：当聚合反应液2反应完成后，进行整张测序芯片的信号采集，确定每个扩增簇上引物链结合的碱基的类型。

c)切除反应：在信号采集结束后，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl洗脱缓冲液，之后注射泵以800μl/min的速度泵入200μl切除反应液，将温度设置为60℃，反应90s，之后以同样的速度再次泵入洗脱缓冲液200μl，重复清洗一次。

重复a)-c)步骤，进行下一个循环测序。总共进行100个测序循环。

对上述的反应过程进一步说明如下：

在a)聚合步骤中，首先泵入预洗缓冲液将先前扩增和杂交过程中可能残留的试剂清洗，然后泵入的聚合反应液1中同时携带有阻断基团和荧光基团的dNTPs在聚合酶的作用下按照互补配对原则连接到引物链上，同时由于叠氮基团的存在，聚合过程被阻断，因而仅能结合一个dNTP，然后泵入的聚合反应液2中仅携带有阻断基团的dNTPs以类似的方式被结合到引物链上。

在b)采集步骤中，激光器发出的激光照射到芯片流动槽上，从而使得结合在引物链上的dNTP所修饰的荧光基团被激发，从而发出表征碱基类型的荧光，通过光学成像系统识别荧光成像的光斑，获取被结合的碱基类型。

在c)切除过程中，利用洗脱缓冲液洗掉前面步骤中试剂的残留，为切除反应营造适合的化学反应条件。利用切除反应液将同时携带有阻断基团和荧光基团的dNTPs上的阻断基团和荧光基团切除，暴露3′端的羟基，从而开启下一轮的循环。

3.测序结果

测序结果如图2所示，根据图2的A，在每个循环中，信号采集的时间(拍照时间)是固定的，由于减少了聚合反应液1的反应时间，同时将聚合反应液2的反应时间整合到了信号采集过程中，除信号采集的时间外，单次循环的时间由360s下降到240s，每个循环的时间减少了30％左右。从图2的B可以看出，改进流程后的测序质量Q30基本上与对比例1中的正常流程一致。说明实施例1所提供的改进的测序工艺能够在保证测序质量前提的情况下，大大缩短测序时间，效果显著。

实施例2

本实施例提供一种人类基因组的测序方法，包括以下步骤：

1.测序文库构建

(1)核酸提取，使用快速DNA提取试剂盒(TIANGEN，KG203)完成样本的基因组DNA的提取纯化工作，具体操作见其操作说明。

(2)文库构建，使用诺唯赞VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit forIllumina(货号：ND617-02)通用建库试剂盒，具体操作见其操作说明。

(3)文库质控，将富集好的文库进行浓度检测和片断长度质控。

经过以上操作，得到约50nM的长度约为1-1000bp的文库样品。

2.上机测序芯片制备

使用Illumina公司的Miseq测序仪及其配套的测序试剂盒(MiSeq Reagent Kitv3)进行文库变性、文库装载以及芯片表面扩增，从而得到DNA扩增簇，并加入测序引物ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，杂交完成后，测序芯片流动槽中固定了杂交有测序引物的DNA扩增簇，等待下一步测序反应。

3.测序

(1)测序试剂准备

聚合反应液1：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/ml聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，1mM EDTA，带有阻断基团和荧光染料的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1μM；

聚合反应液2：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/ml聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，1mM EDTA，仅带有阻断基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1μM；

洗脱缓冲液：5×SSC，Tween20 0.05％；

预洗缓冲液：50mM Tris-HCl，0.5mM Nacl，10mM EDTA,Tween20 0.05％；

切除反应液：20mM THPP，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 9.0，0.05％tween20。

其中，带有阻断基团和荧光基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(或仅带有阻断基团)与实施例1相同。

(2)测序反应循环

a)聚合反应：在扩增好的芯片中，注射泵以1200μl/min的速度泵入200μl预洗缓冲液到测序芯片流动槽内，注射泵以1200μl/min的速度泵入200μl聚合反应液1到测序芯片流动槽内，将温度设置为55℃。

b)信号采集：当聚合反应液1已经完全泵入到测序芯片流动槽内、开始反应的同时进行整张测序芯片的信号采集，确定每个扩增簇上引物链结合的碱基的类型。于此同时，注射泵以400μl/min的速度泵入200μl聚合反应液2，将温度保持为55℃，反应时间为2min；2min后，注射泵以300μl/min的速度泵入200μl洗脱缓冲液，待注射泵完成抽液时，恰好整个信号采集过程结束(或者即将结束)。

c)切除反应：在信号采集结束后，注射泵立即以1200μl/min的速度泵入200μl切除反应液，将温度仍就保持在55℃，反应50s，之后注射泵以1200μl/min的速度泵入洗脱缓冲液200ul。

重复a-c步骤，进行下一个循环测序。总共进行100个测序循环。

对比例2与对比例1类似，但其信号采集中具体采用的拍照程序和实施例2相同，而与实施例1和对比例1中存在差异。

3.测序结果

测序结果如图3所示，根据图3的A，在尽可能地优化流程的情况下，实施例2中所提出的测序流程中除信号采集所需的固定时间外，单次循环的时间缩短到了90s，相对了对比例2正常流程的360s，缩短了75％。其中，对比例2采用的信号采集(拍照程序)等与实施例1中的对比例1存在不同导致系统误差，使两者Q30的实验结果不完全一致。比较对比例2和实施例2的测序质量，虽然Q30的数值有所降低，但对整体的测序质量影响不大。因此，可以在保持恒温55℃的情况下，通过控制聚合反应液2的泵入速度和洗脱缓冲液的泵入速度，从而使其与信号采集的进度相匹配，以此方式将其整合到信号采集的过程中，从而大幅降低整体的测序时间。

实施例3

本实施例提供一种测序方法，包括以下步骤：

1.测序文库构建

(1)核酸提取，使用快速DNA提取试剂盒(TIANGEN，KG203)完成样本的基因组DNA的提取纯化工作，具体操作见其操作说明。

(2)文库构建，使用诺唯赞VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit forIllumina(货号：ND617-02)通用建库试剂盒构建文库，具体操作见其操作说明。

(3)文库质控，将富集好的文库进行浓度检测和片断长度质控。

经过以上操作，得到约50nM的长度约为1-1000bp的文库样品。

2.上机测序芯片制备

使用Illumina公司的Miseq测序仪及其配套的测序试剂盒(MiSeq Reagent Kitv3)进行文库变性、文库装载以及芯片表面扩增，从而得到DNA扩增簇，并加入测序引物ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，杂交完成后，测序芯片流动槽中固定了杂交有测序引物的DNA扩增簇，等待下一步测序反应。

3.测序

(1)测序试剂准备

聚合反应液1：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/mL聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，1mM EDTA，仅带有阻断基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(第二核苷酸类似物)各1μM；

聚合反应液2：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.02mg/mL聚合酶9N(Salus-bio)，3mM MgSO₄，3mM CuCl₂，仅带有荧光基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP(第三核苷酸类似物)各1μM；

洗脱缓冲液：5×SSC，Tween-20 0.05％；

预洗缓冲液：50mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，10mM EDTA，Tween-20 0.05％；

切除缓冲液：20mM THPP，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 9.0，Tween-200.05％；

成像反应液：1mM Tris-HCl，40mM L-抗坏血酸钠，50mM NaCl，Tween-20 0.05％。

仅带有阻断基团或仅带有荧光基团的dATP、dCTP、dGTP和dTTP参考实施例1。

(2)测序反应循环

a)聚合反应：在扩增好的芯片中，注射泵以800μl/min的速度泵入200μl预洗缓冲液到测序芯片流动槽内，注射泵以800μl/min的速度泵入400μl聚合反应液1到测序芯片流动槽内，将温度设置为55℃，反应20s；然后注射泵以800μl/min的速度泵入200μl洗脱缓冲液到测序芯片流动槽内，冲洗掉未反应完全的第二核苷酸类似物；之后注射泵以800μl/min的速度泵入400μl聚合反应液2，将温度设置为55℃，反应70s，使得在聚合酶9N及金属离子Mg²⁺和Cu²⁺的作用下，聚合反应液2与待测核酸分子、第二核苷酸类似物形成稳定的络合物，使第三核苷酸类似物稳定地螯合在上一步聚合反应的下一个核苷酸的位置。之后注射泵以800μl/min的速度泵入加入200μL洗脱缓冲液，冲洗掉未结合的第三核苷酸类似物。

b)信号采集：当聚合反应液2完成泵入，即开始进行整张测序芯片的信号采集，确定每个扩增簇上引物链结合的碱基的类型。

c)切除反应：在信号采集结束后，注射泵以900μl/min的速度泵入600μL预洗缓冲液，反应1min。注射泵以800μl/min的速度泵入200μl切除反应液，将温度设置为60℃，反应30s，之后以同样的速度再次泵入洗脱缓冲液200μl清洗。

重复a)-c)步骤，进行下一个循环测序。总共进行100个测序循环。

对比例3，与上述实施例3仅在于测序反应循环的步骤存在区别，具体如下：

实施例3在包含第三核苷酸类似物的聚合反应液2完成泵入、开始反应程序的70s计时时即开始进行信号采集步骤，在信号采集步骤结束前完成未结合的第三核苷酸类似物。而对比例3在聚合反应液2反应结束并泵入洗脱缓冲液冲洗结束后开始信号采集。

结果如图4所示，相比于对比例3在聚合反应液2反应完全后开始信号采集，以及信号采集结束后再泵入预洗缓冲液，该实施例在聚合反应液2开始反应后即开始信号采集，同时在信号采集过程中即对部分完成采集的泵入预洗缓冲液，优化了操作流程，缩短了拍照之外的测序时长，同时测序质量也没有明显下降。

综合以上实施例可以看出，本申请实施例所提供的测序方法并不局限于特定的二代测序方法，凡是基于SBS的二代测序技术都可以采用上述方式对测序进行优化。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

聚合：将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上，所述检测复合物上修饰有荧光基团和阻断基团；

采集：激发所述荧光基团产生荧光信号，识别所述荧光信号得到碱基类型；

切除：切除所述阻断基团和荧光基团；

重复所述聚合-所述采集-所述切除的循环；

其中，所述采集在所述聚合的步骤开始后启动，和/或，所述切除在所述采集的步骤开始后启动。

2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上包括：

将检测复合物和聚合酶送入固相载体的表面，所述表面固定有所述待测核酸分子，所述引物杂交于所述待测核酸分子；

在所述聚合酶的作用下，所述检测复合物连接到所述引物并发生阻断。

3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述检测复合物包括第一核苷酸类似物，所述将检测复合物连接到杂交于待测核酸分子的引物上包括：

将所述第一核苷酸类似物和所述聚合酶送入所述固相载体的所述表面；

在所述聚合酶的作用下，所述第一核苷酸类似物连接到所述引物并发生阻断，形成检测复合物；

优选地，所述采集在所述将第一核苷酸类似物和聚合酶送入所述固相载体的所述表面的步骤开始后启动。

4.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，所述聚合步骤中，在形成所述检测复合物后还包括：

将所述第二核苷酸类似物和所述聚合酶送入所述固相载体的所述表面；

在所述聚合酶的作用下，所述第二核苷酸类似物连接到未与第一核苷酸类似物连接的所述引物上并发生阻断；

优选地，所述采集在所述将所述第二核苷酸类似物和所述聚合酶送入所述固相载体的表面的步骤开始后启动。

5.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第二核苷酸类似物修饰有阻断基团。

6.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第一核苷酸类似物修饰有荧光基团和阻断基团。

7.根据权利要求2所述的测序方法，其特征在于，所述固相载体为流动槽。

8.根据权利要求2所述的测序方法，其特征在于，所述切除所述阻断基团和荧光基团包括：

将切除试剂送入所述固相载体的表面，切除所述检测复合物中的阻断基团和荧光基团；

优选地，在切除之前，将洗脱试剂送入所述固相载体的表面，去除所述表面的残留试剂；

优选地，所述将洗脱试剂送入所述固相载体的表面，去除所述表面的残留试剂的步骤在所述采集的步骤开始后启动。

9.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述采集在所述聚合的步骤开始后启动为所述采集在所述聚合的步骤开始0～60s后启动。

10.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述切除在所述采集的步骤开始后启动为所述切除在所述采集的步骤开始0～10min后启动。

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