CN115227881B - 生物支架、生物支架预制品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，其中所述生物支架通过以下方法制备：(A)制备均相的聚乳酸/聚乳酸‑聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)的聚合物溶液；(B)将上述聚合物溶液倒入预热的模具中；(C)冻干得到PP支架；以及(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP支架，得到高度微孔和较高亲水性的PP‑gel支架。本发明的生物支架具有较高的亲水性和良好的生物相容性，有利于组织再生，能够应用于多种器官疾病的临床治疗。

Description

生物支架、生物支架预制品及其制备方法

技术领域

本发明涉及到生物医用材料领域，尤其涉及到一种用于管状组织的生物支架、生物支架预制品及其制备方法。

背景技术

任何输尿管疾病，如结石、肿瘤、畸形等内在因素或者损伤、感染、炎症等外在因素，均会引起输尿管梗阻，导致肾积水或肾功能损害，严重影响患者的身心健康。尤其是当输尿管有较长段异常或者病变时，对泌尿科医生来说也是一个较大的挑战，目前，如肾移植、输尿管膀胱造口术、输尿管回肠置换术和输尿管造口术，并不是一直都能成功进行，还面临着出现严重并发症、吻合口狭窄、慢性肾功能衰竭和供体组织采集等问题。总之，目前临床对长段输尿管缺损的治疗还面临各种各样的挑战。

随着技术的发展，输尿管组织工程作为一种潜在的替代自体移植已经获得了立足点。通常用于输尿管支架的有胶原蛋白、丝素蛋白、明胶、聚乳酸、聚己内酯等各种其他天然聚合物和合成聚合物，但一方面由于支架惰性导致的瘘口和狭窄形成，输尿管修复效果并不理想。另一方面，输尿管修复是一个复杂的过程，包括尿路上皮层和平滑肌层等的重建，其中尿路上皮层作为一种屏障，保护底层组织不受尿液中有毒成分的影响，可导致输尿管纤维化、收缩和狭窄。而不同的支架，会影响尿路上皮细胞的粘附和运动。

因此，对于泌尿外科和组织工程领域来说，研究更加适合的支架对于输尿管疾病的治疗具有重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，该生物支架通过聚乳酸和聚乳酸-聚己内酯共聚物先获得生物支架预制品-PP支架，然后再接枝明胶获得PP-gel支架，该PP-gel支架具有较高的韧性和良好的生物相容性，具有较大的临床应用潜力。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，通过采用热致相分离法和氨解GA交联法来制备，操作简单。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，制备的生物支架的亲水性较强，有助于泌尿上皮细胞的粘附和增生，适于作为理想支架被应用于输尿管长段缺损的临床治疗。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，该生物支架具有较强的生物相容性，可通过不同的模具制备适于多种器官应用的生物支架，可被应用于人体治疗相关器官疾病。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，其中通过热致相分离法制备的生物支架表面和内部均有理想的孔隙率和孔径，非常适合作为生物支架应用于临床。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，该生物支架表面多孔且致密，有利于上皮形成，同时可防止细胞进入支架。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，该生物支架具有高孔隙率和大孔隙，这样的物理结构，允许细胞迁移和营养循环，有利于促进组织再生。

本发明的另一目的在于提供一生物支架、生物支架预制品及其制备方法，该PP46-gel生物支架具有最佳的孔隙率和孔径，不仅有利于营养循环，而且具有抗纤维化作用，因此该生物支架能够内置于输尿管，可以显著提高泌尿道上皮层的愈合以及延缓肾功能下降，适于临床应用。

根据本发明的一方面，本发明提供了一生物支架的制备方法，包括以下步骤：

(A)以聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)为原材料制备生物

支架预制品PP支架；以及

(B)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP支架，得到PP-gel支架。

其中在步骤(A)中PLLA：PLCL的质量比范围为1:9-9:1。

其中采用以下步骤来制备PP支架：

(A1)制备均相的聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)的聚合物

溶液；

(A2)将上述聚合物溶液倒入预热的模具中；

(A3)相分离，冻干得到PP支架；

在步骤(A1)中将PLLA和PLCL分别按照1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1的质量比在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，在步骤(A3)中，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP支架。

在步骤(A1)中将PLLA和PLCL按照预定质量比在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，在步骤(A3)中，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP支架。

所述步骤(B)包括如下步骤：

通过浸泡、烘干去除杂质；

通过氨解和戊二醛交联法制备醛基化支架；和

接枝明胶得到PP-gel支架。

其中所述步骤(B)包括以下步骤：

(B1)PP支架在95％酒精中浸泡1h，然后真空烘箱中干燥，并进一步在0.06g/ml的1.6-己二胺/异丙醇溶液中浸泡10min，再用大量水冲洗，去除游离己二胺，进而得到去除杂质的支架；

(B2)将氨化PP支架在1.0wt％GA水溶液中室温浸泡3h，再用大量水冲洗，去除游离GA，得到醛基化支架；

(B3)醛基化支架在1.0wt％的明胶/PBS溶液中室温孵育24h，然后用水洗去未接枝的明胶，得到PP-gel支架。

在所述步骤(A3)中，PP支架通过相匹配的模具被制造为管状支架或圆形支架。

其中所述步骤(A1)中PLLA和PLCL的质量比为4:6。

所述PP-gel支架通过输尿管支架模具、肠道支架模具、食道支架模具、尿道支架模具、胃管支架模具或血管支架模具制得临床所需的输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架、胃管支架或血管支架。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一生物支架，包括输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架或血管支架，其中所述生物支架通过以下方法制备：

(A)制备均相的聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)的聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)将上述聚合物溶液倒入预热的模具中；

(C)相分离，冻干得到PP支架；以及

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP支架，得到高度微孔和较高亲水性的PP-gel支架。

本发明还提供一生物支架，其中所述生物支架包括输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架或血管支架，其特征在于，所述生物支架包括以下材料：聚乳酸、聚乳酸-聚己内酯共聚物和明胶。

本发明还提供一生物支架预制品，其中所述生物支架预制品通过采用输尿管支架模具、肠道支架模具、食道支架模具、尿道支架模具或血管支架模具制得临床所需的输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架或血管支架。

其中所述生物支架预制品采用以下方法制备：

(A1)制备均相的聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)的聚合物

溶液；

(A2)将上述聚合物溶液倒入预热的模具中；和

(A3)相分离，冻干得到PP支架。

附图说明

图1是根据本发明的一实施例的PP-gel支架的氨解交联反应过程。

图2是根据本发明的第四个实施例制备的PP46支架的电镜图像。

图3是根据本发明的九个实施例制备的九种PP支架的电镜(SEM)图像分析。

图4是根据本发明的多个实施例的不同比重的PP支架的孔隙、孔径和孔隙率分析图。

图5是根据本发明的第四个实施例制备的PP46及PP46-gel支架的接触角图像分析结果。

图6所示为根据本发明的第四实施例的PP46及PP46-gel的应力-应变曲线。

图7所示为根据本发明的第四实施例的PP46和PP46-gel与明胶粉的全反射红外光谱。

图8所示为根据本发明的至少一实施例和对比实施例的上皮细胞增殖结果图像。

图9所示为根据本发明的至少一实施例和对比实施例的皮下包埋动物实验结果。

图10所示为根据本发明的至少一实施例和对比实施例的支架移植后的图像。

图11所示为根据本发明的至少一实施例和对比实施例的尿路上皮细胞上皮化表型结果。

图12为根据本发明的至少一实施例和对比实施例的蛋白表达研究结果。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。

明胶是一种天然蛋白质，是胶原蛋白的部分水解产物，含有与整合素相关的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，常被用于组织工程领域。但由于明胶的力学性能较低，使手术重建输尿管困难，因此，必须接枝各种合成聚合物。聚乳酸(PLLA)是一种常用的聚合物，可以通过热致相分离法(TIPS)制成纳米纤维多孔支架，然而，PLLA是刚性和脆性的，被应用于输尿管支架时，就难以进行输尿管重塑。因此，我们将PLLA与具有良好弹性的聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLCL)相结合。然而，由于合成聚酯的疏水性和细胞粘附性较差，不能正确的调节细胞表型，因此，我们选择接枝天然明胶，增加支架的亲水性和细胞粘附性。

在本发明中，使用不同比例的聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)混合化学修饰明胶材料，并采用热致相分离法来创建具有高度微孔的拓扑结构的管状支架，也就是说本发明通过热致相分离法(TIPS)来制备聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLLA/PLCL)支架，即PP支架，然后再来研究明胶(gel)修饰的合成材料对长段输尿管异常的影响，探究明胶合成材料作为生物支架应用时伴随的通道的生物信号的传导，为输尿管支架提供一种新的支架材料及制造方法。因此，本发明中的支架可用于输尿管组织工程，并可作为未来各种小直径管状组织应用于不同的器官。

本发明采用己二胺氨解和戊二醛交联将明胶接枝到聚合酯中。附图图1为氨解GA交联法制备PP46-gel支架的实验过程。具体地，材料中的酯键被氨基打开，支架表面被过量的GA醛基化，最后，明胶上的氨基与支架表面发生席夫碱反应进行交联。

下面结合具体实施例对本发明的生物支架及其制备材料和制备方法做进一步的说明。

材料、试剂：

聚乳酸(PLLA)(MW＝20kDa)，购自宁波材料技术与工程学院；

聚乳酸-聚己内酯共聚物(PLCL)(50:50，MW＝30kDa)，购自中国济南岱罡生物工程有限公司；

1,4-二恶烷、己二胺(HMD)和戊二醛(GA)，购自阿拉丁试剂公司(中国上海)；

明胶，购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里)。

实施例一：

(A)将质量比1:9的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到生物支架预制品-PP19支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP19支架，得到PP19-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP19支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括以下步骤：

(D1)去除杂质：将PP19支架在95％酒精中浸泡1h，然后真空烘箱中干燥，进一步地在0.06g/ml的1.6-己二胺/异丙醇溶液中浸泡10min，再用大量水冲洗，去除游离己二胺；

(D2)醛基化支架：将PP19支架在1.0wt％GA水溶液中室温浸泡3h，再用大量水冲洗，去除游离GA；

(D3)接枝明胶：上述醛基化支架在1.0wt％的明胶/PBS溶液中室温培养24h，然后用水洗去未接枝的明胶，得到PP19-gel支架。

其中所述步骤(D1)是为了在接枝明胶前去除上述步骤(C)中的杂质。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP19支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP19-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例二：

(A)将质量比2:8的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP28支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP28支架，得到PP28-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP28支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP28支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP28-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例三：

(A)将质量比3:7的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP37支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP37支架，得到PP37-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP37支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP37支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP37-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例四：

(A)将质量比4:6的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP46支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP46支架，得到PP46-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP46支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP46支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP46-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例五：

(A)将质量比5:5的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP55支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP55支架，得到PP55-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP55支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP55支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP55-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例六：

(A)将质量比6:4的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP64支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP64支架，得到PP64-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP64支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP64支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP64-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例七：

(A)将质量比7:3的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP73支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP73支架，得到PP73-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP73支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP73支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP73-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例八：

(A)将质量比8:2的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP82支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP82支架，得到PP82-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP82支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP82支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP82-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

实施例九：

(A)将质量比9:1的PLLA和PLCL在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成均相聚合物溶液，浓度为10％(w/v)；

(B)倒入预热的模具中；

(C)相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP91支架；

(D)接枝明胶，采用氨解和戊二醛(GA)交联法将明胶固定到上述PP91支架，得到PP91-gel支架。

在所述步骤(C)中，所述PP91支架可为管状支架或者圆形支架，其中圆形支架在钢模具(直径60mm、高度1mm)中制作。另外，在所述步骤(C)中，采用热致相分离的方式进行相分离来制备所述生物支架预制品。

在所述步骤(D)中，所述步骤(D)包括的步骤：(D1)去除杂质；(D2)醛基化支架；和(D3)接枝明胶。所述步骤(D1)-(D3)的具体操作均参考实施例一。

在所述步骤(A)中，形成10％w/v的均相聚合物溶液。

其中所述步骤(A)(B)(C)所制得的PP91支架作为生物支架预制品，以用于后续接枝明胶。

进一步包括一步骤(E)，将所述PP91-gel支架采用相应的模具制造为生物支架应用于临床。

本领域的技术人员可以理解的是，通过本发明中的上述方法，每一个实施例均可增加一步骤(E)：将接枝明胶的支架采用相应的模具制造为能够应用于临床的生物支架。可以理解的是，采用不同的模具，可以制造出不同的器官支架，进而应用于不同的器官治疗中。例如，所述PP-gel支架通过输尿管支架模具、肠道支架模具、食道支架模具、尿道支架模具或血管支架模具制得临床所需的输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架或血管支架。

对上述实施例制得的生物支架预制品及接枝明胶的生物支架的特性进行测试。

1.孔隙度测定：采用乙醇置换法测定支架孔隙度，这是由于乙醇可以进入毛孔，但不会使支架收缩或膨胀。

2.支架形貌的观测：用扫描电镜(SEM：TM-3000，日立)观察支架的形貌。

3.孔径和壁厚的测定：用image-j软件测量支架的孔径和壁厚，每幅图像至少测量50个位置。

4.接触角的测定：用接触角仪(datphysicsoca20，Germany)测量凝胶涂膜前后的亲水性，测量前，样品在30℃真空下干燥，将去离子水在纳米纤维支架表面10秒后，通过软件进行测量，对于每个样本，至少进行三次独立的测量并取平均值。

5.生物相容性研究：采用永久化的人尿生僻细胞在含10％胎牛血清(FBS，Gibco)的F12K培养基(Gibco)、100U/ml青霉素和100g/ml链霉素(Gibco)中，在37℃、5％二氧化碳的湿化环境中培养，每两天换一次。生物相容性实验中，在PP和PP-gel支架上置入HUCs，细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测支架上细胞的增殖情况，采用激光共聚焦显微镜(CLSM，SP8，Leica，Germany)和扫描电镜(SEM)观察支架上细胞的分布和形态。

6.细胞活性和上皮化检测：用流式细胞仪检测细胞周期，采用EGF酶联免疫吸附测定试剂盒对表皮生长因子进行检测，并通过定量PCR评估上皮化水平。

7.组织再生效果的体内评价：皮下植入，实验选用雄性SD大鼠12只，分为两组，分别进行四周和八周的实验。支架切成圆形切片，用75％酒精消毒12h后植入。四周和八周后，取出支架，H&E、Masson、免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)染色对支架进行检测。

8.支架的生物相容性检测：CD68检测支架的生物相容性，将18只成年新西兰雄性家兔分为三组，供8周和12周，分别为PP组、PP-gel组和自体输尿管移植组。用戊巴比妥(30mg/kg)麻醉兔后，取腹部正中切口，沿结肠旁沟发现左侧输尿管，手术切除左侧输尿管缺损(约4cm)，切除后将移植物置于输尿管缺损处，在手术显微镜下进行缝合。自制输尿管支架置入输尿管，术后两周从膀胱切口取出支架。术后8周和12周后进行组织学观察。

9.上皮细胞的检测：用AE1/AE3检测上皮细胞，应用CT和CT尿路造影(CTU)分析各组输尿管重建后的功能。

上述实施例实验结果附图如下：附图2为PP46的SEM分析及孔径和壁厚的测定结果，其中a1和a2为截面孔径，b1和b2为截面壁厚，c1和c2为表明孔径；附图3为上述九个实施例制备的PP19至PP91及PP19-gel至PP91-gel的SEM分析及孔径和壁厚的测定结果，其中图3中A1-A9为生物支架预制品PP19-PP91的SEM分析及截面孔径测定结构，a1-a9为PP19-gel-PP91-gel的SEM分析及截面壁厚测定结果。附图4为上述实施例的生物支架预制品(PP支架)的孔隙度分析结果。附图5所示为PP46和PP46-gel支架的接触角图像及接触角分析图表。图6所示为PP46及PP46-gel的应力曲线。图7所示为PP46和PP46-gel与明胶粉的全反射红外光谱。图8所示为上皮细胞增殖结果。图9所示为皮下包埋动物实验结果。图10所示为支架移植后的图像。图11所示为尿路上皮细胞上皮化检测结果。图12为蛋白表达研究结果。

本发明主要以PP46和PP46-gel进行研究，其他比例的生物支架及生物支架预制品采用同样的方式来进行验证及结果分析。

由附图2至附图4可知，PP46支架内部孔隙结构良好，截面平均孔径为32.48±6.51μm(如附图2中a1-a2所示)，截面壁厚为613.80±175.03nm(如附图2中b1-b2所示)，PP46支架表面也是多孔的，平均孔径为3.74±1.02μm(如附图2中c1-c2所示)。

在上述实施例的所有支架比例(PP19-PP91)中，通过电镜观察内部孔径结构可以得出，PP46的内部结构和孔隙度最好，为75.48±3.90％(如附图4所示)，因此，PP46支架材料具有高孔隙率和大孔隙，这样的物理结构，允许细胞迁移和营养循环，有利于促进组织再生。

如图5所示，PP46支架的接触角为98.50±2.93°，而PP46-gel支架的接触角为48.86±5.20°，说明将明胶固定在支架上显著提高了支架的亲水性，使得PP-gel支架具有较高的亲水性。

如附图6所示为PP46和PP46-gel支架的应力应变曲线，由于氨解作用，PP46-gel支架的抗拉强度有所降低(0.78±0.02Mpa vs 0.72±0.03Mpa，p＜0.01)但最终应变没有变化(84.62±3.09Mpa vs 84.88±3.22Mpa，p＞0.05)，表明支架的韧性与之前相同，同时也说明PP46和PP46-gel支架的韧性和聚乳酸相比有所增强，更有利于应用于组织工程。

本发明中的PP46支架具有最佳的孔隙率和孔径，不仅有利于营养循环，而且具有抗纤维化作用。此外，由于支架表面的冷却快于支架内部的冷却速度，因此，可以在支架表面形成相对致密的孔隙结构，有利于上皮形成，同时可以防止细胞进入支架。

PP46和PP46-gel与明胶粉的全反射红外光谱如图7所示，明胶化支架具有明胶的两个特征吸收峰，而PP46支架没有，结果表明，明胶成功地接枝到PP46支架上。

尿路上皮层的修复对输尿管再生至关重要，因此，尿路上皮细胞能否在支架上生长是一个重要的问题。在PP46和PP46-gel支架上培养的hus增殖七天，以组织培养的聚苯乙烯(TCPS)为阳性对照。

随着时间的推移，两种支架上的hus均持续增长和增殖，说明支架可支持hus增殖而不产生毒性作用。第七天，PP46-gel支架比pp46支架有更多活细胞，说明支架更有利于明胶移植后hus的增殖，如附图8中的A所示。

通过细胞骨架的DAPI染色和共聚焦显微镜观察细胞在支架上生长三天和七天的情况，如图8中的B所示，两种支架上的细胞在三天内均出现细胞骨架紊乱，第七天，两种支架上的细胞数量均有所增加，但PP46支架上的细胞骨架仍然混乱，而PP46-gel支架上的细胞形态良好，在支架表面表达更多的肌动蛋白束。

如图8中的C的SEM分析可知，hus在两种支架表面均有生长，并覆盖率支架表面的部分气孔，在第七天，可以观察到细胞覆盖了更多的表面空隙，尤其是在PP46-gel支架上。

如图8中的D所示，EGF是促进上皮化的重要因子，可引导G0期细胞返回G1期，并进行细胞周期增殖，培养七天后，PP46-gel组GEF水平明显高于PP46组，达到818.39±68.96pg/ml。

如图8中的E和F所示，采用流式细胞仪检测尿路上皮细胞周期分布，细胞增殖指数计算公式为：增殖指数(％)＝(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)x100％。增殖指数从PP46组的(50.16±2.25)％增加到PP46-gel组的(56.04±5.06)％。

动物实验：将PP46和PP46-gel支架分别植入SD大鼠皮下4周和8周，如图9中的A所示，随着时间的延长，支架表面的血管化程度增加，与同期两种支架相比，PP46-gel支架表面血管化程度较高，支架外层血管化对输尿管再生至关重要。从HE和Masson染色来看，细胞只要迁移到支架表面，分泌胶原蛋白，有利于细胞黏附和增殖，在明胶移植支架中，细胞聚集在支架内并分泌胶原蛋白。此外，8周后，明胶支架降解明显，成纤维细胞通过支架。

炎症反映主要发生在早期，且大多表达在支架表面，如图9中的B所示，半定量分析显示，8周时，支架组织截面炎症表达明显降低。临床上，医源性输尿管损伤是最常见的病因，尤其在一些典型的外科输尿管镜手术中。本实验结果表明，4周时，两种支架表面和内部均有阳性信号，且PP46高于PP46-gel支架，说明接枝明胶后，支架的生物相容性得到改善。如图9中的C所示，8周后，支架内阳性模型明显减少，阳性面积比例无明显差异。

输尿管再生不完全可引起输尿管扩张和肾积水，从而破坏肾功能。如图10所示，自体移植组术后12周肉眼及CT/CTU照片显示输尿管有一定程度的狭窄，但PP46-gel组的狭窄程度低于PP46组。PP46组出现输尿管、肾盂明显扩张以及肾积水现象，且左肾盂未显影，提示肾功能损害严重，在PP46-gel组中，输尿管扩张的程度降低，且是可逆的，如图10中的A所示。

通过CT横断面观察肾积水，通过Cr和BUN评估支架对肾功能的影响。PP46-gel移植后，肾积水程度、Cr、BUN降低，说明PP-gel组明显减轻了肾功能损害，如图10中的B-D所示。

术后8周和12周进行组织学分析，分析结果如图10中的E所示。8周时，与PP46-gel组比较，PP46组炎症细胞浸润较多，12周时消失。Masson染色结果显示，PP46-gel支架在两个月后降解，而PP46支架没有降解，另外，正常的胶原机制在PP46-gel组中取代了支架的位置，而PP46-组表现为胶原过度增殖导致的纤维化，即形成瘢痕。用AE1/AE免疫组化染色观察尿路上皮再生情况，PP46组8周后显露表面出现一层较薄的尿路上皮细胞，而PP46-gel组尿路上皮细胞增多，细胞层数随时间增加而增加。因此，接枝明胶的支架促进了尿路上皮化，显著降低了输尿管扩张程度和肾盂积水，保护了肾功能。

三维输尿管工程是治疗输尿管狭窄疾病的一种较好的策略，其中主要目的之一是材料表面的上皮形成。本实验通过免疫荧光检测两种支架上尿路上皮细胞相关功能蛋白的表达，发现PP46-gel支架上细胞较多，且尿路上皮细胞保持上皮表型，如图11中的A所示。ZO-1和UPKIII是尿路上皮膜蛋白，与尿路上皮阻塞尿的作用密切相关，RT-qPCR检测细胞相关基因的转录水平，结果显示，UPK、ZO-1等膜蛋白表达显著增加，如图11中的B和C所示。

这些结果表明，接枝明胶的支架具有促尿路上皮能力，包括细胞增殖和上皮功能相关基因表达，此外，整合素α6、β4、K-RAS和N-RAS基因也被激活，证明FAK/RAS相关通路的激活进一步促进了细胞增殖。

图12为蛋白表达研究，其中图12中的A所示为通过Western blotting检测的几种途径蛋白的表达。与商户RT-qPCR结果一致，明胶修饰的支架细胞中p-FAK、整合素α6、β4、Ras、p-RAF和p-ERK蛋白的表达显著增加，如图12中的B所示。由此，可以发PP46-gel支架对尿路上皮体外行为和体内尿路化的综合作用，如图12中的C所示。

由此可知，整合素α6/β4感知接枝明胶支架表面的RGD序列，使FAK磷酸化并激活下游的MAPK/ERK通路，此外，其内部的多孔结构也提供了更多的EGF来促进上皮细胞的生长和增殖。尿路上皮化实现了细胞与AUM之间紧密连接的形成，从而阻断了尿液对黏膜下层的影响。因此，接枝明胶的PP多孔支架具有促进输尿管再生的作用。

本领域的技术人员可以理解的是，改变PLL和PLCL的比例可以改变PP支架的孔径和壁厚，也可以将二者调整为其他的比例，合成出更多的PP支架，再对其性能进行研究，以适应不同器官的支架需求，满足更多的临床应用。

在本发明中，将PP支架和PP-gel支架作为输尿管支架对其性能进行研究，也可以采用同样或者类似的实验方法对其作为其他器官的生物支架进行研究，以增加其临床应用范围。

通过上述研究结果可知，该PP生物支架能够内置于输尿管，可以显著提高泌尿道上皮层的愈合以及延缓肾功能下降，接枝明胶的支架能够刺激泌尿道上皮细胞的细胞膜上的整合素α6/β4，然后在粘着斑激酶的作用下磷酸化，通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶的信号通道促进上皮形成，我们发现纳米形态学和生物化学联合构建仿生支架，共同刺激输尿管再生。

总之，本发明应用己二胺氨解和戊二醛交联法将明胶接枝到聚酯，得到的多种管状多孔PP-gel支架，尤其是PP46-gel支架具有较高的亲水性和良好的生物相容性，能够促进细胞粘附和增值，而且有利于输尿管上皮化和输尿管再生，对输尿管和肾功能具有保护作用，因此PP46-gel支架可以作为构建长段输尿管异常或者缺损的理想支架。此外，随着组织工程的发展，PP-gel支架也可以作为其他组织的支架进而被应用于各种器官疾病的治疗。

本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (4)

1.一生物支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（A）以聚乳酸/聚乳酸-聚己内酯共聚物（PLLA/PLCL）为原材料制备生物支架预制品PP支架，其中PLLA：PLCL的质量比范围为1:9-9:1；以及

（B）接枝明胶，采用氨解和戊二醛（GA）交联法将明胶固定到上述PP支架，得到PP-gel支架；

其中所述步骤（A）包括以下步骤：

（A1）将PLLA和PLCL按照预定质量比在65℃下溶于1,4-二恶烷中，形成浓度为10%（w/v）的均相聚合物溶液；

（A2）将上述聚合物溶液倒入预热的模具中；和

（A3）相分离，将聚合物溶液和模具置于-80℃中放置24h，然后冻干72h，得到PP支架；

其中所述步骤（B）包括以下步骤：

（B1）PP支架在95%酒精中浸泡1h，然后真空烘箱中干燥，并进一步在0.06g/mL的1,6-己二胺/异丙醇溶液中浸泡10min，再用大量水冲洗，去除游离己二胺，进而得到去除杂质的支架；

（B2）将氨解后的PP支架在1.0wt%GA水溶液中室温浸泡3h，再用大量水冲洗，去除游离GA，得到醛基化支架；和

（B3）醛基化支架在1.0wt%的明胶/PBS溶液中室温培养24h，然后用水洗去未接枝的明胶，得到PP-gel支架。

2.根据权利要求1所述的生物支架的制备方法，其中在所述步骤（A1）中，所述PLLA所述PLCL的质量比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1。

3.根据权利要求1或2所述的生物支架的制备方法，其中所述PP-gel支架通过输尿管支架模具、肠道支架模具、食道支架模具、尿道支架模具或血管支架模具制得临床所需的输尿管支架、肠道支架、食道支架、尿道支架或血管支架，其中在所述步骤（A3）中，PP支架通过相匹配的模具被制造为管状支架或圆形支架，其中所述步骤（A1）中PLLA和PLCL的质量比为4:6。

4.一生物支架，其特征在于，包括聚乳酸和聚乳酸-聚己内酯共聚物聚合形成的支架主体和接枝于所述支架主体的明胶，其中所述生物支架根据权利要求1-3中任一项所述的方法制备。