CN113413491B - 基于PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法 - Google Patents

基于PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于PTMC‑b‑PEG‑b‑PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法，选用生物相容性可降解高分子医用材料PTMC和PEG，采用静电纺丝方法制备，该吻合管的尺寸可以根据人体管腔的大小进行调整，设计成不仅适合小肠、大肠的吻合器，还可以适合食管、动脉、静脉等吻合、前期支撑的管腔吻合器，本发明制备的吻合管管壁薄、弹性优异，在临床手术缝合时为了方便医生缝合，创新性地将本吻合管无缝隙套嵌于硬度大的植物纤维素管外部。

Description

基于PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支 架及制备方法
技术领域
本发明具体涉及高分子材料技术领域，具体涉及一种基于 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法。
背景技术
胃肠道重建吻合术是腹部外科中最常见的手术操作之一，在消化道外科发展的近一个世纪来，吻合口瘘的发生率并未明显下降，一直成为困扰胃肠外科手术成功率的世界性难题之一。消化道良恶性肿瘤、消化道穿孔、消化道梗阻、出血、缺血等肠道病变，往往需要切除部分病变肠道后再进行吻合，传统方法多以手工缝合吻合，近几十年来多以管状吻合器进行端端或端侧吻合、或直线切割闭合器进行侧侧吻合。无论何种吻合方式，均无法防治吻合口瘘这一致死性并发症。
目前，国内外结直肠外科医师普遍接受和实践的，是暂时性改道转流手术，诸如暂时性回肠造口或结肠造口，此类附加手术可确切地避免因为吻合口瘘所导致的并发症，但尚无文献支持是否可以减少吻合口瘘的发生概率。然而，改道手术需要计划性二次手术行回纳，再次回纳同时也意味着再次的消化道重建与吻合，同样存在着吻合口瘘、吻合口狭窄等相关并发症的发生概率，但发生相比首次手术概率较低。在吻合口两端血供良好、对合无张力的情况下，实现肠道内容物，尤其是粪性内容物的在吻合口区域的隔离，实现相对隔绝、清洁的局部环境，是预防吻合口瘘以及诸如腹膜炎，腹腔脓肿等并发症的有效策略。其策略实现的关键技术瓶颈是理想辅助吻合材料的突破。
肠道吻合的目的是为了恢复吻合口两端肠道的物理学、组织学和生理学功能。目前，传统的吻合器存在的主要问题包括：(1)金属吻合器不可生物降解，导致体内永久性滞留；(2)可降解高分子材料吻合器，缺乏与创面组织之间的力学匹配性；(3)吻合器不具有组织修复调控功能，无法对肠道正常功能的恢复进行合理调控。如发明专利 CN 111449707A提出一种肛肠吻合器，包括手柄座、传动组件、击发组件和吻切组件；传动组件包括设置于手柄座内部的丝杆以及设置于手柄座尾端并与所述丝杆尾端相连的调节机构；丝杆前端固定安装有抵钉座；击发组件包括设置于手柄座上的活动手柄以及套设于丝杆上的直推杆；吻切组件包括推钉片、钉仓套、钉仓和环形刀。该发明中推钉片、钉仓套和钉仓均采用金属材质制成，零件无法在体内降解，只能选择永久性滞留体内或者二次手术取出。专利CN109480943A由可降解材料制成，采用钉体穿孔固定的方式，并在钉体后端设计了支撑架，但是吻合环硬度大、无弹性，不能很好地适应肠道蠕动，异物感明显。类似的还有发明专利CN103230265A，其选用了可降解材料聚乙交酯、聚丙交酯为原料，应用于胃肠道吻合。该吻合器具有易碎解的功能，但是同样缺乏与肠道组织的力学匹配性。理想的吻合器应具备以下特点：(1)有效隔离肠道内容物；(2)吻合器植入操作对吻合口肠壁破坏小；(3)操作简便易行。目前市场上的吻合装置均无法同时满足上述要求。
从生产的角度来看，支架必须易于制造成各种不同的长度和直径以适应不同的个体，并且不需要任何复杂的储存过程。所有这些都必须符合要求，同时保持支架的经济性和可承受性。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种基于 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法，具有与肠道弹性相匹配的、具有组织修复调控功能，可以明显降低肠道吻合口瘘及其它并发症的发生概率。
本发明采用的技术解决方案是：一种基于PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架所述的肠吻合支架整体采用PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料制成，所述的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物为高分子医用材料PTMC和PEG采用开环聚合的方法合成的三嵌段PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物，所述的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物中 PEG含量为10％～20％，所述的肠吻合支架的厚度为0.05-0.3mm。
所述的生物柔性弹性体肠吻合支架的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料负载三氯生(triclosan，TCS)。
所述的肠吻合支架内还设有植物纤维素管套，所述的肠吻合支架是无间隙套嵌式结构，内部为植物纤维素材料的管，外部为 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料。
一种生物柔性弹性体肠吻合支架的制备方法,通过以下步骤制备:
(1)PTMC-b-PEG-b-PTMC的开环聚合：将PEG和TMC单体转移到反应容器中，在N2氛围下将催化剂Sn(Oct)2溶解在无水甲苯溶液中，用移液器取100ppm加入到反应容器中共聚反应，保证整个过程无水无氧，24h后将产物溶解，待完全溶解，将聚合物溶液进行提纯，重复多次，纯化后的共聚物真空干燥箱中干燥48h，然后储存在干燥柜中；
(2)静电纺丝制备吻合支架：将干燥后的样品溶解于 DMF/THF混合溶液中，配置的溶液浓度为5-10.0％，加入混合溶液 0.1～1.0wt％的抗菌剂，混合后37℃置于摇床待样品充分溶解，以获得均匀的共溶解纺丝原液，将原液装入2.5毫升的注射器，该注射器包括一根内径为0.5毫米的金属针，纺丝后样品厚度为0.2±0.01mm，所得纤维在真空干燥箱中室温进一步干燥，以除去残留的有机溶剂和水分。
所述的步骤(1)中TMC单体为70～90wt％、PEG为5～29wt％以及催化剂Sn(Oct)2溶液为1～5wt％。
所述的步骤(1)中共聚反应的条件为温度100～150℃，反应时间24～48h。
所述的步骤(1)中产物溶解条件为用CHCl3或DMF或THF进行溶解，置于摇床，摇床温度设定为37℃。
所述的步骤(1)中提纯条件用正己烷或乙醇进行提纯，并且用玻璃棒不断搅拌。
所述的步骤(2)DMF/THF混合溶液中的DMF:THF＝1:1。
所述的步骤(2)的纺丝步骤具体为：将一定尺寸的植物纤维素管套在静电纺丝接收器上进行纺丝，控制参数可得到相应尺寸的管，所述的针头推速V＝1.0～5.0ml/h，辊轮转速V＝100～500RMP，温度 T＝25～35℃；湿度WET＝20～40％。。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种基于 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架及制备方法，选用生物相容性可降解高分子医用材料PTMC和PEG，采用静电纺丝方法制备，该吻合管的尺寸可以根据人体管腔的大小进行调整，设计成不仅适合小肠、大肠的吻合器，还可以适合食管、动脉、静脉等吻合、前期支撑的管腔吻合器，本发明制备的吻合管管壁薄、弹性优异，在临床手术缝合时为了方便医生缝合，创新性地将本吻合管无缝隙套嵌于硬度大的植物纤维素管外部。该植物纤维素为市售，缝合时可起支撑作用，方便操作，在肠道环境中15～30min便可完全分解而排出体外，不会影响后续吻合管的性能，同时通过负载抗菌、消炎、调控成纤维细胞增殖与迁移的不同功能因子，赋予可降解肠道吻合管具有组织微环境调控功能，对吻合口部位微环境进行调节，达到降低吻合口瘘概率的目的。该支架一般在体内2-3周发生降解，并经过肠道排出体外，能够弥补金属装置不可降解的缺点；具有优秀的组织顺应性，弥补了可降解吻合装置缺乏组织顺应性的不足；后续表征也证明了该可降解吻合管的在减少患者术后吻合口出血、降低患者术后肛门不适感，胃肠道功能紊乱，以及降低医疗成本方面都具有一定的优势，特别是在吻合口无异物残留方面。
附图说明
图1为体内实验过程；(1)盲肠切口；(2)吻合支架的植入；(3)间断法全层缝合。
图2为本发明三嵌段共聚物合成工艺示意图。
图3为PTMC、PEG和共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的红外光谱图。
图4为是嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的1H-NMR谱。
图5为PEG-b-PTMC-b-PEG复合纤维的SEM图像，图中相对于PTMC含量，PEG百分比为0.5％，10％，20％，30％，40％和50％。
图6为PEG-b-PTMC-b-PEG纤维的纤维直径分布，其中PEG相对于PTMC 含量的重量百分比为(A)0.5％，(B)10％，(C)20％，(D)30％， (E)40％和(F)50％。
图7为三嵌段共聚物(A)不同样品的接触角值随时间的变化，(B) 置于PBS溶液中24小时的样品的吸水率。
图8为不同PEG含量的静电纺丝肠吻合支架置于PBS溶液中前后的力学性能；(A)弹性模量，(B)拉伸强度和(C)断裂伸长率，(D) 力学性能的变化趋势。
图9为(A)PTMC-b-PEG-b-PTMC体外酶促降解的重量损失与降解时间的关系，(B)PTMC-b-PEG-b-PTMC膜酶促降解后脂肪酶溶液的pH 曲线具有不同的分子量，(C)在不同时间体内降解情况，(D)植入前后吻合支架的比较，(E)重量减轻和(F)在相应时间从大鼠身上取出的吻合支架的长度损失。
图10为不含三氯生的样品(上图)和含三氯生的样品(下图)的抗菌效果，A为金黄色葡萄球菌，B为大肠杆菌，比例尺，1厘米。
图11为不同材料的溶血速率(A)PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物实验组，(B)TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物实验组。
图12为样品的细胞毒性作用图，A为PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物基团，B为TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物基团。
图13为肠吻合术后不同时间的腹部粘连评分。
图14为术后7天，不同样品组的吻合口破裂压力，A为 PTMC-b-PEG-b-PTMC组，B为TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC组。
图15为吻合口附近肠壁组织进行H&E和Masson染色图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料
Poly(ethylene glycol)(PEG,Mn＝5000),辛酸亚锡((Sn(Oct)2)，四氢呋喃(THF),N,-二甲基甲酰胺(DMF),三氯甲烷(CHCl3),三氯生 (TCS)，甲苯，正己烷，脂肪酶(Lipase from Aspergillus oryzae； solution,≥100,000U/g)were purchased fromSigma-Aldrich Co. LLC.Polymer grade 1,3-trimethylene carbonate(TMC,DaigangBiology,China)。所有试剂和化学品均为分析级，无需进一步纯化即可使用。
小鼠成纤维细胞系L929由中国科学院典型培养物保藏中心(中国上海)提供。培养皿购自康宁公司(纽约，美国)。在Dulbecco’s 改良Eagle培养基(DMEM，Gibco)中添加10％胎牛血清(FBS，Gibco)， 100IU/ml青霉素和100mg/ml硫酸链霉素进行培养。所有细胞均培养在37℃、5％CO2、完全湿化条件下的培养箱中。
温州医科大学(中国温州)实验动物中心提供的雄性 Sprague-Dawley大鼠(200±20g)，在25℃和湿度55％的条件养殖。所有动物实验均按照伦理学委员会评估并批准的指南进行。
PTMC-b-PEG-b-PTMC为基材的肠道吻合支架的制备步骤
PTMC-b-PEG-b-PTMC的开环聚合
采用开环聚合的方法合成了三嵌段PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物 [49]。简而言之，将计量好的PEG和TMC转移到带有磁力搅拌棒的完全干燥的玻璃反应器中。在N2氛围下将Sn(Oct)2溶解在无水甲苯溶液中，用移液器取100ppm加入到反应容器中。共聚反应在130±2℃下反应24h，保证整个过程无水无氧。24h后将产物溶解于三氯甲烷中，待完全溶解，将聚合物溶液用过量的正己烷来提纯产品，重复3 次。纯化后的共聚物在40℃的真空干燥箱中干燥48h，然后储存在干燥柜中。
静电纺丝制备吻合支架
将干燥后的样品溶解于DMF/THF(1/1,V/V)混合溶液中，制备的溶液浓度为10.0％，37℃置于摇床36h待样品充分溶解，以获得均匀的共溶解纺丝原液。将原液装入2.5毫升的注射器，该注射器包括一根内径为0.5毫米的金属针。具体纺丝条件根据实验室之前经验[50]，详见支撑材料表1。纺丝后样品厚度为0.2±0.01mm。所得纤维在真空干燥箱中室温进一步干燥24小时，以除去残留的有机溶剂和水分。使用纺丝后的样品进行力学性能测试以及体外降解测试。
具体制备方法如下：
1.mPEG-PTMC的合成：合成过程需要在无水无氧的环境下进行操作，将70～90wt％TMC单体、5～29wt％PEG5000以及1～5wt％催化剂 Sn(Oct)2溶液加到反应管中，反应管中放入磁子，保证反应管内无水无氧之后，管口用硅脂密封，最后再用封口膜将管口密封确保不会有氧气和水分进入。将反应管放入油浴锅反应，温度为100～150℃，反应时间24～48h，反应结束后，取出待用。
2.mPEG-PTMC的溶解：按1:5的固液比，将合成材料用CHCl3或 DMF或THF来溶解。先用CHCl3或DMF或THF清洗几遍内壁，洗去硅脂和未反应的单体，然后加入过量CHCl3或DMF或THF，置于摇床，摇床温度设定为37℃，等待溶液完全溶解。
3.mPEG-PTMC的提纯：将溶解好的溶液缓慢倒入装有正己烷或乙醇的烧杯中进行提纯，缓慢倒入并且用玻璃棒不断搅拌。将得到的絮状物mPEG-PTMC进行抽滤，之后放置于真空干燥箱内干燥48h。
4.静电纺丝溶液的配制：将合成材料mPEG-PTMC溶于溶剂 DMF/THF(DMF:THF＝1:1)，该溶液质量分数为5～10wt％。抗菌剂添加的质量以材料添加量的0.1～1.0wt％为准。将聚合物mPEG-PTMC、抗菌剂以及两种溶剂混合，将配制好的溶液放在37℃恒温摇床24h直至完全溶解。待溶解完全后进行纺丝操作。
5.静电纺丝制备吻合管：在型号为TL-Pro-BM的静电纺丝上进行纺丝。将一定尺寸的植物纤维素管套在静电纺丝接收器上进行纺丝，控制参数可得到相应尺寸的管。静电纺丝得到的吻合管是两部分无间隙套嵌式结构，内部为植物纤维素材料的管，外部为合成聚合物材料的管。参数设置范围如下：电压(-5，30)V；针头推速V＝1.0～5.0ml/h；辊轮转速V＝100～500RMP；温度T＝25～35℃；湿度WET＝20～40％。
Table1.静电纺丝条件
Figure GDA0003195900270000091
表征
理化表征
用配备ATR附件的Nicolet Magna-560光谱仪测定了聚合物PTMC、PEG和嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的FTIR-ATR光谱。用Bruker 谱仪测定了PTMC和嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的1H-NMR光谱，所有的1H-NMR均以四甲基硅烷(TMS)为内参比，以氘代氯仿(CDCl3) 为溶剂，以ppm为单位记录了样品的化学位移。
使用日立冷场发射电镜SU8010场发射扫描电子显微镜拍摄了样品静电纺丝之后的微观形貌、以及植入动物体内降解之后的微观形貌。
使用DSC8000(美国PerkinElmer)进行DSC分析，以10℃/min 的升温速率记录了聚合物PTMC、PEG和嵌段共聚物 PTMC-b-PEG-b-PTMC的热性能。
使用百欧林Theta型动态接触角分析仪，在37℃下测得了不同 PEG含量的样品的动态接触角，每隔5min记录一次接触角大小直至稳定。
使用乌氏粘度计在25℃恒温水浴中测定PTMC-b-PEG-b-PTMC的特性粘数，溶剂是苯酚/1,1,2,2-四氯乙烷(2/3，W/W)，测试结果为三次实验的平均值。通过Mark-Houwink方程计算聚合物的粘均分子量：
Figure GDA0003195900270000101
其中，K＝7.9×10-2cm3/g,α＝0.63。
机械性能在电子万能材料试验机(Instron5944)上进行，静电纺丝后的样品处理为尺寸为45.0mm×25.0mm×0.2mm的片状材料，SD 大鼠盲肠尺寸为45.0mm×25.0mm×0.3mm，用生理盐水冲洗干净，擦拭掉表面多余水分。
支架的纤维直径和孔隙率
在一幅扫描电镜图像中测量至少20根纤维和50个片段以得到纤维的平均直径和直径分布，支架的孔隙率使用以下等式[51]计算:
Figure GDA0003195900270000111
其中P是支架的孔隙率，ρ′是支架的表观密度，ρ0是共聚物的体积密度。
吸水率
初始重量约为40mg(W0)的样品在PBS(37℃)中膨胀。24小时后，用滤纸除去多余的表面水分，并重新称重膨胀的样品质量(Ws)。样品的吸水率由以下方程式确定：
Water absorption＝(Ws－W0)/W0×100％
生物降解性
取尺寸为10.0×10.0×0.2mm的PTMC-b-PEG-b-PTMC膜，置于 1mL脂肪酶溶液，放置于37℃空气浴中，每天振荡8h，振幅为65次 /分。酶溶液每3天更换一次以保持酶的活性，分别在第1、5、10、 15、20天后取出样品，随机抽取3个平行样条。样品用蒸馏水充分洗涤后，滤纸吸干表面水分，37℃真空干燥12h至恒质量。记录干燥样品的质量以及含有降解产物的介质的酸碱度。
体内生物降解行为，通过记录吻合支架植入前后的质量以及尺寸得到。吻合支架取出后使用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干表面水分。失重率通过以下公式计算
Weight loss(％)＝(W0－Wt)/W0×100％
其中W0和Wt分别表示样品降解前和降解后的干重。
生物学表征
共聚物的溶血性研究
溶血率被用来评价血红蛋白膜的血液相容性。根据先前报告的方法[52]，通过将20毫克样品浸入9毫升生理盐水中并培养(37℃)24 小时，获得PHMs的浸出液。将200微升新鲜抗凝血剂血液注射到1 毫升浸出液中并充分混合。孵育(37℃)1小时后，将抗凝血剂血液和浸提液的混合物离心(3000转/分，10分钟)。最后，使用混合多模式酶标仪(SynergyNEO2，BioTek，美国)测量上清液的吸光度(545纳米)。超纯水和生理盐水分别作为阴性对照和阳性对照。血液相容性用溶血率(％)表示如下:
样品材料事先用蒸馏水冲洗干净，擦拭净表明多余水分，使用人类全血。实验组：取静电纺丝样品15mg置于EP管，加入1mL生理盐水和0.1mL全血，阴性对照组：EP管中加入1mL生理盐水和0.1mL 全血，阳性对照组：EP管中加入1mL超纯水和0.1mL全血。以上所有样品37℃孵育2h，进行溶血反应试验。
所有试样3000rpm离心10分钟，若上清液尚未清亮则再重复离心一次。拍照后吸取上清液移入孔板中，每个样品的上清液制三个平行样，每个样品移取200μL，用721分光光度计在540nm波长处测定吸光度(OD)并记录结果。
数据处理：分别取样品组和对照组3个试样OD的均值。依公式计算样品的溶血率。
Figure GDA0003195900270000131
其中H％是溶血率，ODt样品的吸光度，ODnc阴性对照样品的吸光度， ODpc阳性对照样品的吸光度。按照GB/T1423.2-1993标准，通过对材料与血红细胞在体外接触过程中，所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定，评价材料的体外溶血性，大于5％溶血反应为阳性。
细胞毒性研究
首先，将密度为5×104个细胞的细胞悬液(100μL)加入96孔板的每个孔中，并在37℃、5％CO2的空气环境中孵育24小时，用于细胞附着。然后用样品浸提液(100mL)替换培养基，并孵育24小时和 48小时。之后，通过向每个孔中加入CCK-8溶液(10毫升，10％in完全培养基)进行CCK-8测定，在37℃和5％CO2下再孵育2小时。吸光度在450纳米处用微孔板读数器测量。未经任何处理的细胞用作空白对照。
采用CCK-8法进行实验样品的毒理性研究，实验步骤如下：
细胞培养液配制：RPMI1640培养基500mL+胎牛血清50mL+青霉素/链霉素双抗5mL。
实验组浸提液的制备：样品事先使用75％酒精杀菌消毒，然后超净台紫外线反正面各照30min。静电纺丝样品分别裁成边长为1.82cm 的正方形薄膜，加入2mL完全培养基，在37℃的环境下共浴24小时，获得纺丝样品浸提液。
细胞准备：用细胞培养液体外培养L929细胞(贴壁细胞)，增殖三代以上，待到长满培养瓶。PBS冲洗三遍(不要对着细胞，以防冲掉细胞)。之后用0.25％胰蛋白酶50μL将其消化30s(37℃)，使其变成细胞悬液。马上加入3-5mL完全培养基并转移到离心管， 1000rpm离心5min，倒掉上层废液，向离心管中加入5mLPBS，移液管吹洗使细胞混散均匀。取1μL滴加到计数板上进行细胞计数，将细胞浓度调整至5×104个/mL。
共培养：将稀释后的L929细胞接种于96孔板中，每孔100μL，每孔需要5000-8000个细胞；在37℃、5％CO2的环境中培养24小时，细胞完全贴壁后弃去培养液；分别将实验组浸提液以及阳性溶液(阳性对照组为10％DMSO(200μL))各100μL加入孔中，每组6个复孔，在37℃培养箱中孵育24h。
CCK-8检测：分别在预设时间点(24h、48h)取出96孔板，将原液吸出加到样品孔周围，于各孔中分别加入10μL的CCK-8试剂和100μL的完全培养基(先将两种溶液混合)，在37℃培养箱中孵育2h后，用多功能酶标仪(吸光度450nm)检测吸光度(OD)值。
细胞相对增殖率计算：取每组6孔OD值的平均值，按照如下公式计算各组的细胞相对增殖率(RGR)：
Figure GDA0003195900270000141
式中：As为实验孔的吸光度(有聚合物提取液、有细胞培养基、有CCK-8)；Ac为对照孔的吸光度(无聚合物提取液、有细胞培养基、有CCK-8)；
Ab为实验孔的吸光度(无聚合物提取液、无细胞培养基、有CCK-8)。
抗菌性研究
分别将冻存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细菌原液取50μL加到装有5mL细菌培养液的离心管中，细菌培养箱孵育24h待用。材料裁剪为直径是1.0cm的圆形片状材料，75％酒精冲洗干净后擦拭净表面多余水分，紫外消毒30min。分别取稀释后的细菌100μL均匀涂在培养基上，将圆形片状材料放在涂有细菌的培养基上，37℃细菌培养箱孵育24h。
体内生物相容性研究
SD大鼠体内实验
实验前，将样品用75％酒精浸泡10min，紫外线杀菌消毒30min。通级别Sprague-Dawley雄性大鼠180只，体重200±10g，根据体重使用10％的水合氯醛进行腹腔注射麻醉。实验共设置三组， PTMC-b-PEG-b-PTMC组，TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC组和空白对照组，每组设置四个时间点，分别为7天、14天、21天、28天，设置平行组为5只大鼠。老鼠腹部剃去毛发，剖开腹部，暴露大鼠盲肠，盲肠中上处进行切口，尺寸为10±1mm，将盲肠内容物清理干净，PTMC-b-PEG-b-PTMC组，TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC组放入实验样品随后缝合，空白组不放材料直接进行缝合。吻合口处的缝合均采用4针单纯间断法全层缝合，以盲肠横截面为对象，分别在对应时钟位置的3、6、9、12各个位置全层间断缝合，针距约为0.4cm，间距约为0.5cm。术后两组大鼠麻醉清醒后即刻予以自由进食、饮水。
术后一鼠一笼独立饲养，密切观察老鼠的进食、排便以及行为活动情况。记录三组术后一般情况及死亡情况。各组大鼠分别在到达相应时间点后麻醉剖腹，观察并记录腹腔黏连情况，是否有腹腔感染以及有无吻合口瘘现象。
腹腔黏连评分(Adhesion score)
对术后SD大鼠腹腔黏连进行分级评定，得到量化结果。评分标准为(0-3分)：
0分：无黏连；
1分：轻度黏连，仅仅在吻合口附近有上存在组织覆盖，易分离；
2分：中度黏连，吻合部位与腹腔内组织发生黏连，难以分离，但尚能分离；
3分：重度黏连，吻合口被腹腔内组织或其它脏器组织黏连包裹黏连。
吻合口爆破压
吻合口组织爆破压是检测吻合口愈合强度的重要的力学指标，它反映了肠道所能承受压力的大小，普遍被用来检测吻合口的愈合强度。
术后第7天进行吻合口肠段爆破压试验，采用体外测压法。切取吻合口及其周围约5cm肠管用生理盐水冲洗出肠内容物。适当分离腹腔粘连，暴露各个吻合口部位肠段，将肠管一端连接压力计 (YB-150A精密压力表)，用两道丝线捆扎固定，跨过吻合口的另一端同样用两道丝线结扎封闭肠腔，并使肠管与压力计处于同一水平面。用蠕动泵以10mL/min的速度向肠管内匀速注入亚甲蓝稀释液 (0.16mg/mL)，注意观察吻合口，并记录吻合口有蓝色液体溢出(或压力突然下降)时压力计上的读数，为吻合口爆破压。
H&E染色
吻合口组织经4％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4μm切片，切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，沥干玻片然后置入苏木素溶液中进行染色，时间为4min。1％盐酸乙醇分化，弱碱性水中返蓝约30min，流水冲洗5-10s后放入无水乙醇玻璃缸中搅动震荡30s，然后沥干玻片放入伊红染色液中。染色后的切片通过光学显微镜观察。
Masson染色
组织固定于10％中性福尔马林溶液，流水冲洗，常规脱水包埋。铁苏木素(铁苏木素A、B液等比例混合液)染色10min。1％盐酸乙醇分化液分化后用丽春红酸性品红染液染色10min，磷钼酸溶液处理约5min，不用水洗直接使用苯胺蓝染液复染5min，最后使用乙醇脱水三次，二甲苯透明三次。
免疫组化染色
石蜡切片脱蜡至水,随后组织切片置于盛有柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的高压锅内进行抗原修复。用3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1:9)阻断内源性过氧化物酶，加入加用3％BSA进行封闭，然后在4℃与一抗一起孵育过夜。加入与一抗相应种属的二抗室温孵育50min，细胞核用苏木素染色。每次孵育后，将细胞用PBS洗涤两次。用荧光显微镜(NIKON ECLIPSE TI-SR)对染色的细胞照相。
利用图像分析系统自动读取切片组织测量区域，分别分析计算出测量区域内弱中强阳性细胞数(阴性无着色，计0分；弱阳性淡黄色，计1分；中阳性棕黄色，计2分；强阳性棕褐色计3分)。计算 Histochemistry score(H-score)以反映阳性强弱程度。
H-score＝∑(Pi×i)＝(percentage of weak intensity cells ×1)+(percentage of moderate intensity cells ×2)+(percentage of strong intensitycells×3)，式中Pi表示阳性细胞比率；i代表着色强度)。
PTMC-b-PEG-b-PTMC的合成及其表征结果
通过聚乙二醇羟基引发的三亚甲基碳酸酯开环聚合，合成了 PTMC-b-PEG-b-PTMC三嵌段共聚物(图2)。在Sn(Oct)2催化下，TMC 与PEG共聚合成了PTMC-b-PEG-b-PTMC嵌段共聚物。不同PEG嵌段比例的共聚反应以及产物部分物理性质如表1所示。
不同分子量的嵌段共聚物其降解速率和力学性能差异很大，而不同投料比对嵌段共聚物的分子量影响显著，植入肠道中要求产品具有合适的降解速度和优异的力学性能，因而本实验重点探讨了原料中TMC单体与PEG的不同比例对嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC分子量以及性能的影响。研究了原料中TMC单体与PEG不同质量比这一因素，控制反应时间为24h，结果见表1。数据表明，随着原料中PEG比例的减少，PTMC-b-PEG-b-PTMC的特性粘度增大，分子量提高。
PTMC、PEG和共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的红外光谱如图3所示。共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC与PTMC在1735cm-1和1218cm-1处特征吸收峰重叠，该峰分别是碳酸酯羰基与醚键的特征峰。PEG在1099cm-1处的特征吸收峰与PTMC在1092cm-1的特征吸收峰是C-O的特征吸收峰，共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC在1108cm-1处的峰的相对强度比1092 cm-1的高。
图4是嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC的1H-NMR谱。它清楚地显示出化学位移δ在4.25ppm(a)属于PTMC块中氧旁边的亚甲基质子，δ在2.06ppm(b)属于PTMC块中的其他亚甲基质子，δ在3.68ppm(c) 属于PEG主链中的亚甲基质子。
DSC数据列于表1。玻璃化转变温度与共聚物的组成有关，PEG 在共聚物中的摩尔分数由50％降到0.5％，玻璃化转变温度则从-30.88℃升到-19.48℃。结果表明，共聚物在生理温度下都处于橡胶态，适合体内植入。
表2 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的组成和分子量
Figure GDA0003195900270000191
Figure GDA0003195900270000201
a.Determined by[η]＝KMα，K＝1.986×10-4，α＝0.789
静电纺丝纤维
静电纺丝纤维的形态取决于各种参数，包括电压、纺丝流速、纺丝距离和溶液性质(如粘度、电导率和表面张力)。为了了解PEG嵌段含量对样品微观形态的影响，在不同放大倍数下获得了二次电子扫描电镜显微照片(图5)。当PEG嵌段含量从0.4％增加到50％时，观察到纤维直径逐渐变粗。当PEG含量超过30％时，纤维黏连现象增加，纤维开始呈现不均匀的状态。图6显示了电纺膜的平均纤维直径和直径分布。当PEG含量不高于20％时，检测到相似的平均纤维直径。当PEG 含量进一步增加到时，平均纤维直径增加，纤维直径的差异也变大，特别是PEG含量在50％时，纤维的平均直径达到了3.36μm。20％和 30％样品的纤维黏连现象变化可归因于静电纺丝过程中射流的不稳定性，静电纺丝射流稳定性受纺丝溶液性质(如粘度和电导率)的影响[58]，PEG的添加改变了溶液的粘度和张力。为了实现稳定的静电纺丝射流，粘度和张力之间的平衡是必要的。表3总结了电纺纤维膜的孔隙率。获得的电纺膜具有从72％±2％到98％±2％的孔隙率，PEG0.5％具有最高的孔隙率，因为它们具有相对较大的孔径(图5)和窄且均匀的纤维直径分布(图6)。
表3不同PEG含量的PTMC-b-PEG-b-PTMC纤维的孔隙率
Figure GDA0003195900270000202
Figure GDA0003195900270000211
共聚物的亲疏水性
材料良好的亲水性使其具有更好的生物相容性，因此为了评估 PTMC-b-PEG-b-PTMC的亲疏水性，通过动态接触角实验测量样品表面的水接触角，并在表4中列出。结果清楚地表明，随着共聚物中PEG 含量的减少，动态接触角增大，这说明共聚物的亲水性与共聚物中 PEG的含量成正比。每隔五分钟测量样品表面的水接触角(图7(A))，所有样品随着时间增加接触角变小，包括疏水的样品，说明静电纺丝的疏松多孔结构使材料有好的吸水性，且PEG含量的增高，接触角变化速率增大。
从吸水率(图7(B))也可以验证纤维支架的高孔隙率和亲水性 PEG的添加大大提高了支架的吸水率。PEG含量超过20％时，其吸水率增加明显。
表4.PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物上的前进接触角
Figure GDA0003195900270000212
静电纺丝样品力学性能评价
PEG嵌段的比例不同，对材料的机械性能也有很大的影响。用 PTMC-b-PEG-b-PTMC静电纺丝制备的吻合支架的机械性能列于表5。随着PEG嵌段比例的减少，共聚物的弹性模量分别从29.76±0.47MPa 减少到16.27±0.08MPa，同时拉伸强度和断裂伸长率均减少，这是因为PEG为半结晶微相状态，对支架有塑化和硬化的效果，随着PEG 的增加，材料的结晶度增大，断裂伸长率减小。
支架材料在生理条件下力学性能是作为植入材料的一个重要指标，为了观测材料在生理条件下的力学性能，在测试前，将样品浸泡在PBS溶液中24h，然后测试了样品PEG含量超过20％时，对支架的拉伸强度和弹性模量有了显著降低的影响。样品在PBS浸泡24h后支架的断裂伸长率都有一定程度的增加(图8(C))，这是因为支架亲水性进一步增加所导致。PEG添加量在20％以上时，支架吸水后，其弹性模量和断裂伸长率变化差值较大(图8(A),(B))，这说明生理条件下，其力学性能不稳定，这是我们所不希望的。PEG含量越少，干态和湿态下力学性能差值越小，然而在PEG含量0.5％时，支架几乎没有亲水性，这也不符合设计肠道吻合支架的初衷。综合上述，添加 PEG会对材料力学性能有所改变，为了宏观上了解这种趋势，我们从图8(D)中可以直观的看到其影响和变化趋势，结合目的，我们认为 PEG含量在10％～20％时，其力学性能与亲水性符合植入的要求。该范围内，吻合支架具备一定的亲水性，且在干湿态下机械性能都很稳定，保持一定力学强度且还具有优异的柔顺性，这保证它满足强度的同时不会有异物感和不适感，在肠道创伤时可以作为一种很好地承载修复组织。
表5：PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的力学行为
Figure GDA0003195900270000221
Figure GDA0003195900270000231
a。吸水率，b。弹性模量(原样)，c。弹性模量(预湿24h)，d。拉伸强度(原样)，e。拉伸强度(预湿24h)，f。伸长率断裂伸长率(成品)，g。断裂伸长率(预湿24h)
基于亲水性、力学性能、体外酶溶液降解综合因素，我们认为 PEG含量在10％～20％内，支架的综合性能是符合我们的预期的。本实验选取PEG含量为15％的样品作为吻合支架植入老鼠盲肠，来观测后续体内降解与促愈合的作用。因此，我们选取该PEG含量的样品进行电纺，研究在不同电纺参数下所得到的不同厚度样品对力学性能的影响研究。
同电纺参数下所得到的不同厚度样品对力学性能的影响研究
基于亲水性、力学性能、体外酶溶液降解综合因素，我们认为 PEG含量在10％～20％内，支架的综合性能是符合我们的预期的。本实验选取PEG含量为15％的样品作为吻合支架植入老鼠盲肠，来观测后续体内降解与促愈合的作用。因此，我们选取该PEG含量的样品进行电纺，研究在不同电纺参数下所得到的不同厚度样品对力学性能的影响研究。
将干燥后的样品溶解于chloroform/DMF(9/1,V/V)混合溶液中，制备的溶液浓度为5.5％，37℃置于摇床36h待样品充分溶解，以获得均匀的共溶解纺丝原液。将原液装入2.5毫升的注射器，该注射器包括一根内径为0.5毫米的金属针。具体的静电纺丝条件详见表1。纺丝后样品厚度由具体电纺时间决定。所得纤维在真空干燥箱中室温进一步干燥24小时，以除去残留的有机溶剂和水分。使用纺丝后的样品进行力学性能测试以及体外降解测试。
静电纺丝条件
Figure GDA0003195900270000241
Figure GDA0003195900270000242
Figure GDA0003195900270000251
体外生物降解评价
聚合物的亲水性对其降解行为和生物相容性有重要影响。由于PTMC均聚物的降解速度很慢，TMC与PEG、内酯、乳酸的共聚已成为改善PTMC降解性能的有效途径，这大大拓展了PTMC作为医用材料的应用范围。在疏水主链上引入亲水嵌段可以加速H2O向基体的渗透，是提高降解率的一种简单有效的方法。本文合成的含亲水PEG嵌段的 PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物有比PTMC均聚物具有更好的降解性能。
有文献报道，PTMC主要通过体外酶解和体内表面侵蚀降解，PTMC 在PBS溶液中呈惰性，质量和相对分子质量的变化微乎其微，PTMC 在酶溶液中的失重率远远大于水解失重率。PTMC在PBS溶液中的稳定性和在脂肪酶溶液中的快速降解表明了脂肪酶参与了降解反应。 Zhang等和Yang等均认为酶起到了界面活化作用，酶可以加速降解的产物流失到溶液的速度。基于脂肪酶在降解产物扩散中的表面活性剂作用，PTMC具有较高的体外酶解降解率，因此体外重点关注酶促降解。之前有大量报道，共聚物形状对降解影响很大，作为肠道支架，我们研究了静电纺丝后膜状材料的降解性质。
研究了酶对失重率的影响(图9(A))，实验结果表明，随着PEG 比例的增加，嵌段共聚物PTMC-b-PEG-b-PTMC亲水性增加，降解加快。脂肪酶溶液的pH为6.08，观测降解过程溶液的pH变化，基本没有变化(图9(B))。
作为肠道吻合支架，我们认为在满足其力学性能的前提下，具有良好的亲水性和适当的降解速率是适合的。高PEG含量的支架亲水性好，但降解速率过快，且结晶区显著影响了支架的力学性能，吸水后力学性能变得不稳定。在PEG含量为10％～20％区间，支架有优秀且稳定的力学性能，满足复杂肠道环境的要求，且其降解速率适中，两周可达到40％～50％的降解，一定的亲水性也使其具有好的生物相容性。
本次动物实验的对象是雄性SD大鼠，大鼠肠道愈合周期为14天左右，因而植入肠道的吻合支架需满足至少持续两周的力学性能强度，以及三周左右降解的要求。基于肠道环境与体外酶溶液的差异，生理环境下材料降解速率低于酶溶液，二者降解速率的关系目前还没有定量的数据，根据我们前期的实验，体外酶降解速率会比体内降解稍快。基于亲水性、力学性能、体外酶溶液降解综合因素，我们认为PEG含量在10％～20％内，支架的综合性能是符合我们的预期的。本实验选取PEG含量为15％的样品作为吻合支架植入老鼠盲肠，来观测后续体内降解与促愈合的作用。
体内吻合支架于相应时间点取出后观测微观形貌(图9(C))。吻合支架的质量和长度均有不同程度的减小(图9(E),(F))，21天之后质量减少40％以上，而长度则减少了70％，造成这种长度减少率比质量损失率大很多的原因，可能是材料吸水。体内降解后其形貌已经开始碎裂，但是宏观整体保持较好(图9(D))，仍具有一定的支撑性。28 天后解剖大鼠盲肠，已经发现找不到吻合支架了，猜测是在21天之后支架崩解加速随肠道废物代谢排出，或者力学性能不足以支撑肠道而脱离手术缝合线进而排出。但是无论是哪种方式，支架达到了至少体内两周保护吻合口的要求，因此我们认为在降解方面PEG含量为 15％的材料是优秀的。
体外生物评价
抗菌
众所周知，伤口愈合过程可能会受到细菌感染，这将延迟伤口愈合。肠道中微生物与细菌数不胜数，细菌数量级别达到1014，种类超过1000种[63,64]，与其他上皮相比，肠道愈合面临的致病菌具有更高的密度，它们会扰乱正常的伤口愈合生理过程。由于手术部位的特殊性，肠道吻合口保持一个相对干净的环境很难，这时吻合支架的抗菌与隔菌效果便起到了十分重要的作用。
为了解决这个问题，将抗菌剂三氯生以一定比例添加到样品中，使材料具备抗菌性，保证伤口处的相对清洁。如图10所示，不含三氯生的样品没有抵抗细菌的能力，添加了三氯生的样品对铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制区。由于 PTMC-b-PEG-b-PTMC降解是表面溶蚀降解，是一个由表面渐渐深入内部降解的过程，这使得三氯生可以缓慢释放出来并一直起到杀菌的作用。
溶血率
由于吻合支架直接接触肠吻合口部位，如果材料导致红细胞破裂，往往会导致二磷酸腺苷被释放，加速血小板聚集，从而引发血栓。通过体外材料直接接触血液，对吻合支架的溶血性进行评估，实验结果如图11所示，其溶血率为不到0.1％，远低于植入型医疗器械5％的上限值。引入PEG作为亲水性部分，材料与水分接触后能形成一层“水膜”。这样的水层，能够有效防止红细胞直接与疏水基材直接接触，从而可以最大程度减弱材料本身引起的红细胞破裂问题。
细胞毒性
L929细胞用于细胞毒性和细胞相容性的体外实验，以评估纯 PTMC-b-PEG-b-PTMC与添加三氯生PTMC-b-PEG-b-PTMC的细胞相容性 (图12)。L929细胞与样品一起孵育24小时、48h，且添加三氯生的样品细胞毒性数值与单纯嵌段共聚物相差不大，细胞存活率均保持在 90％以上，这表明三氯生的添加量是有效可行的，能够在起到杀菌作用的同时不会对组织细胞产生伤害。
伤口恢复情况评价
腹腔黏连评分以及吻合口爆破压
肠道吻合口处的愈合主要经过炎症反应、细胞增殖、肠壁结构重组等阶段，实现力学、组织学和功能学三方面的修复才能达到最终愈合。其中功能学方面的修复是一个相当漫长的过程，其中涉及消化吸收、内外分泌、神经修复及移行复合运动方面，因而力学和组织学必须达到指标，我们才认为吻合口完成愈合。结合手术的操作，在动物实验阶段需要达到以下指标：爆破压实验——力学愈合的指标；腹腔黏连评分——吻合口附近局部炎症情况的反应；吻合口组织HE染色、 Masson染色以及免疫组化染色——评估炎症细胞浸润程度，胶原沉积情况。
分别于术后第7、14、21、28天剖腹，对于腹腔黏连情况做评分，结果详见图13。当腹腔由于损伤刺激或者感染时，局部会产生一种纤维蛋白原的胶状液，它很快会转变成纤维蛋白的凝结物并覆盖在创伤的黏膜表面，起到修复保护作用。纤维蛋白具有较大的粘附性，会使得相互贴近的腹腔粘膜连在一起。创伤愈合后，如果机体能很好地吸收掉这些纤维蛋白，就不会有痕迹。如果吸收不全，黏连则会持续存在，严重的情况会成为粘连性肠梗阻，影响肠道正常生理活动。吻合支架辅助愈合组黏连情况明显少于空白对照组，这是因为吻合支架有效阻隔了伤口与肠道内容物的直接接触，减少了感染的发生，使得吻合口具有更好的修复愈合速度。
吻合口爆破压能够有效反映肠道吻合口术一段时间后，吻合口部位愈合的牢固度，通过该力学指标，能够定量地揭示吻合口所能承受的张力大小。在肠道愈合的过程中，粘膜下层胶原合成的沉积和重塑速率之间的平衡是关键的因素。组织修复不足和过度都会影响正常的肠道功能，修复不足会造成溃疡和瘘，过度修复则会导致纤维化和狭窄。术后前4天，胶原的重塑速率远高于沉积速率，术后第5天开始，胶原沉积占主导地位，最终在第7天达到增殖期峰值。达到增殖期峰值的延迟或损伤可导致吻合口裂开。胶原蛋白的过渡沉积和炎症会导致吻合口的狭窄。因而选择术后第7天，在不影响吻合口局部的情况下，分离黏连，然后取得手术操作段盲肠，行吻合口盲肠段爆破压试验(图13)。对照组存活20只的大鼠的爆破压为183mmHg，低于吻合支架组存活的20只大鼠197.6mmHg(PTMC-b-PEG-b-PTMC组)，217.3mmHg(TCS/PTMC-b-PEG-b-PTMC组)。吻合支架明显对伤口愈合起到了促进作用，且三氯生的加入使伤口处细菌减少，有利于伤口愈合。三组存在统计学差异(P<0.001)。
组织学分析
在急性和慢性肠道炎症期间，巨噬细胞和中性粒细胞通过分泌活性氧自由基和组织降解酶诱导局部组织损伤。如果组织损伤严重，肌成纤维细胞会迁移到缺损部位。炎症与免疫细胞的浸润有关，如T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，它也经常对发生炎症的组织造成严重损害。这种持续的炎症可能因此导致纤维化和狭窄的形成。
术后相应时间点，我们将吻合口附近肠壁组织进行H&E和Masson 染色(图15)。按照时间顺序，组织的愈合过程可以分为炎症期、增生期和重塑期，三个过程没有严格的界定。一般而言，第七天是炎症期和增生期的节点，14天是增生期和重塑期的节点。炎症期表现为以中性粒细胞为主的炎性细胞的聚集和浸润；增生期表现为成纤维细胞数量增加、产生大量无序排列的弱胶原纤维重塑期急性炎症明显减少，取而代之的是慢性炎症的标志——多核巨细胞的产生，并且胶原纤维明显增多。HE染色可以放映炎性细胞浸润程度。在术后对应时间点，对照组炎症细胞浸润明显高于吻合支架辅助组，添加三氯生的吻合支架组的炎症细胞明显比没有添加三氯生的吻合支架组少。Masson染色也验证了上述规律，支架组因为隔绝细菌减少了炎症反应，有利于纤维的再生，而三氯生的添加进一步促进了伤口愈合。
免疫组化分析
伤口的修复由细胞分泌的生长因子完成，如转化生长因子-β (TGF-β)。TGF-β是α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)最有效和最重要的诱导因子。在实验性小肠结肠炎和克罗恩病患者的纤维化部位的肌成纤维细胞中，TGF-β增加。转化生长因子能诱导i型胶原的表达，并且能有效地刺激α-SMA的表达。伤口形成初期，TGF-β大量产生，然而TGF-β水平一直很高则会导致伤口处过度聚集胶原纤维形成纤维化，因而随着伤口的愈合，TGF-β的水平逐渐下降。对伤口处TGF- β水平做检测，可以直观了解伤口恢复程度的快慢与好坏。
由于伤口感染是受伤患者死亡的主要原因之一，因此选择肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为监测指标，通过免疫组织化学分析来测试吻合支架在预防感染方面的功效。TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，也就是说它可以促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生。如果组织有大量炎症现象，TNF-α则会被检测到较高的水平。
结论
吻合后肠道的愈合是一个复杂而漫长的生理学过程。实际上，肠道吻合包括物理愈合、组织学愈合及生理学愈合三个过程。物理学愈合是指吻合后的肠道能够肠腔的封闭，肠道内容物不能进入腹腔，肠壁可以承受一定的压力。组织学愈合是指吻合口粘膜层在组织学上完成结合。吻合口两端的肠道恢复原有的神经支配，实现一体化有序地肠道舒缩和蠕动，这个过程称为生理学愈合。7周爆破压结果证实吻合支架的植入促进了吻合口的物理愈合，Masson染色结果显示吻合支架组具有更好的胶原形成，能够促进吻合口组织学方面的愈合。
吻合处的张力是导致愈合不良的主要原因。这种张力可能来自于组织，也可能是因为持续紧绷的血管供血不足所导致。本实验制备的肠道吻合支架具备组织柔顺性，在很大程度上可以缓解这种张力，因而吻合口会有一个更好的愈合效果。其次，吻合支架可以有效隔绝细菌病毒等不利因素，为伤口创造一个相对清洁干净的环境，这对吻合口的愈合至关重要，H&E染色、TGF-β以及TNF-α均证明了以上结论。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物的生物柔性弹性体肠吻合支架,其特征在于,所述的肠吻合支架整体采用PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料制成，所述的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物为高分子医用材料PTMC和PEG采用开环聚合的方法合成的三嵌段PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物，所述的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物中PEG含量为10%~20%，所述的肠吻合支架的厚度为0.05-0.3mm，所述的肠吻合支架内还设有植物纤维素管套，所述的肠吻合支架是无间隙套嵌式结构，内部为植物纤维素材料的管，外部为PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料。
2.根据权利要求1所述的生物柔性弹性体肠吻合支架，其特征在于，所述的生物柔性弹性体肠吻合支架的PTMC-b-PEG-b-PTMC共聚物材料负载三氯生（triclosan，TCS）。
3.一种权利要求1所述的生物柔性弹性体肠吻合支架的制备方法,其特征在于,通过以下步骤制备:
（1）PTMC-b-PEG-b-PTMC的开环聚合：将PEG和TMC单体转移到反应容器中，在N2氛围下将催化剂Sn(Oct)2溶解在无水甲苯溶液中，用移液器取100ppm加入到反应容器中共聚反应，保证整个过程无水无氧，24h后将产物溶解，待完全溶解，将聚合物溶液进行提纯，重复多次，纯化后的共聚物真空干燥箱中干燥48h，然后储存在干燥柜中；
（2）静电纺丝制备吻合支架：将干燥后的样品溶解于DMF/THF混合溶液中，配置的溶液浓度为5-10.0%，加入混合溶液0.1~1.0wt%的抗菌剂，混合后37℃置于摇床待样品充分溶解，以获得均匀的共溶解纺丝原液，将原液装入2.5毫升的注射器，该注射器包括一根内径为0.5毫米的金属针，纺丝后样品厚度为0.2±0.01mm，所得纤维在真空干燥箱中室温进一步干燥，以除去残留的有机溶剂和水分。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中TMC单体为70~90wt%、PEG为 5~29wt%以及催化剂Sn(Oct)2溶液为1~5wt% 。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中共聚反应的条件为温度100~150℃，反应时间24~48h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中产物溶解条件为用CHCl3或DMF或THF进行溶解，置于摇床，摇床温度设定为37℃。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中提纯条件用正己烷或乙醇进行提纯，并且用玻璃棒不断搅拌。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）DMF/THF混合溶液中的DMF:THF=1:1。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的纺丝步骤具体为：将一定尺寸的植物纤维素管套在静电纺丝接收器上进行纺丝，控制参数可得到相应尺寸的管，所述的针头推速 V=1.0~5.0ml/h，辊轮转速 V=100~500RMP，温度 T=25~35℃；湿度WET=20~40%。
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