CN115227878B - 一种载银i型胶原复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及再生医学领域，具体公开了一种载银I型胶原复合材料及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：将纯化I型胶原与含银溶液混匀；避光、水浴反应；冻干：冻干过程包括以下阶段：第一阶段：（‑8）‑（‑3）℃、常压条件；第二阶段：（‑45）‑（‑35）℃、常压条件；第三阶段：（‑8）‑（‑3）℃、真空度0.2‑0.3mbar；第四阶段：（‑8）‑（‑3）℃、真空度0mbar；灭菌，得到载银I型胶原复合材料；本申请还公开了采用上述制备方法制得的载银I型胶原复合材料以及载银I型胶原复合材料应用。本申请具有得到具有抑菌性能的载银I型胶原复合材料，改善I型胶原材料自身抗菌性能的特点。

Description

一种载银I型胶原复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及再生医学的技术领域，更具体地说，它涉及一种载银I型胶原复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，它广泛存在于动物的皮、骨、肌间、韧带以及血管等部位中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。
胶原蛋白作为一种纤维蛋白，具有高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性、低细胞毒性和良好的生物相容性，以及作为人工器官骨架或创伤敷料时诱导细胞粘附、促进细胞增殖生长、与新生细胞和组织协同修复创伤等特性，让胶原蛋白成为一种理想的生物医用辅料，在药物释放和组织工程领域得到广泛应用。
如申请公布号为CN103800941A的中国专利公开了一种I型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法和应用，该I型胶原纤维结构保持自身特有的三螺旋结构，最终应用于硬脑脊膜替代物、人工真皮、止血材料等，经过大量临床使用验证在组织修复方面安全有效，具有广阔的应用前景。
但是由于I型胶原本身并不具有抑菌作用，因此所有的I型胶原材料的医疗产品都必须经过规范严格的灭菌后才能使用，如何改善I型胶原自身的抗菌性对于其应用具有重要意义。
发明内容
为了提高I型胶原自身的抑菌效果，本申请提供一种载银I型胶原复合材料及其制备方法和应用。
第一方面，本申请提供的一种载银I型胶原复合材料的制备方法采用如下的技术方案：一种载银I型胶原复合材料的制备方法，包括以下步骤：
混合：将纯化I型胶原与含银溶液避光振荡混匀，得到混合溶液；
水浴反应：将混匀后的混合溶液通过避光、水浴反应，水浴反应温度为40-60℃；
冻干：将水浴反应后的混合溶液进行冻干，得到固态孔隙复合材料，冻干过程包括以下阶段：第一阶段：(-8)-(-3)℃、常压条件；第二阶段：(-45)-(-35)℃、常压条件；第三阶段：(-8)-(-3)℃、真空度0.2-0.3mbar；第四阶段：(-8)-(-3)℃、真空度0mbar；灭菌，将冻干后的固态孔隙复合材料灭菌，得到载银I型胶原复合材料。
通过采用上述技术方案，本申请中首先将纯化I型胶原与含银溶液混匀，并且在避光条件下进行，防止含银溶液光分解，从而将银离子分散在I型胶原内，然后进行水浴反应，通过对于水浴反应温度的控制，既不会破坏I型胶原的三维结构，同时能够将银离子很好的均匀负载在I型胶原上，后续再进行冻干，通过对于冻干条件的摸索，构建负载银I型胶原的孔隙化结构，由于最终复合材料中孔隙结构影响负载银离子弥散通过孔隙结构渗出作用于受体上，对于最终抑菌效果具有显著的影响，因此本申请中对于冻干参数进行摸索，发现采用上述冻干过程的时候，使得最终得到的载银I型胶原复合材料中银粒子可以很好的弥散，从而作用于受体上，起到优异的抗菌性能，最终制得的I型胶原复合材料具有三维孔隙结构，应用于硬脑脊膜替代物形成、人工真皮以及止血材料，具有良好的组织修复作用的同时，还具有优异的抗菌性能。
可选的，冻干步骤中，第一阶段时长为1.5-2h；第二阶段时长为2-3h；第三阶段时长为18-22h；第四阶段时长为1.5-2.5h。
可选的，冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：(-5)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-40)℃、常压条件，时长2.5h；第三阶段：(-5)℃、真空度0.3mbar，时长20h；第四阶段：(-5)℃、真空度0mbar，时长2h。
通过采用上述技术方案，采用上述冻干条件时最终对于复合材料孔隙结构构建更适合，最终负载的银粒子的弥散作用更佳，最终抗菌性能更优。
可选的，混合步骤中，I型胶原为液相形式或固相形式。
通过采用上述技术方案，I型胶原按照液相形式添加或固相形式添加时，最终复合材料的抑菌效果相当，两种形式添加均可。
可选的，混合步骤中，I型胶原选用固相I型胶原时，I型胶原与含银溶液的重量与体积比为：0.05g：(1-2)ml；
I型胶原选用液相I型胶原时，I型胶原与含银溶液的体积与体积比为6ml：(1-2)ml。
通过采用上述技术方案，I型胶原与含银溶液按照上述比例混合的时候，既可以起到优异的抗菌作用，而且银粒子处于较低有效浓度，毒性较小，当银溶液含量过低时，无法起到优良的抗菌作用，银溶液过大的时候，其抗菌性能无明显增大，反而银离子浓度过大，毒性较大。
可选的，混合步骤中I型胶原为固相形式添加时，冻干步骤中的冻干过程进行一次；混合步骤中I型胶原以液相形式添加时，冻干步骤中的冻干过程进行两次。
通过采用上述技术方案，I型胶原固相形式中水分较少，冻干过程进行一次即可，而I型胶原液相形式中的水分较多，冻干过程进行两次。
可选的，灭菌步骤中，采用辐照25-38kGy灭菌方式。
可选的，所述纯化I型胶原为自牛跟腱中提取纯化得到。
第二方面，本申请提供一种载银I型胶原复合材料，采用如下的技术方案：
一种载银I型胶原复合材料，通过采用所述制备方法制得。
通过采用上述技术方案，通过本申请制备方法制得的载银I型胶原复合材料，在混合水浴反应步骤中，对于步骤参数的控制，既防止含银溶液光分解无法起到抗菌效果，而且将银均匀负载于I型胶原上的同时，防止破坏I型胶原的三维螺旋结构，使得最终复合材料既保持了I型胶原的三维螺旋结构，而且负载有银，再对于冻干过程参数的控制，构建载银I型胶原孔隙结构，使得复合材料中银离子可以通过孔隙结构弥散作用于受体上，起到优异的抗菌作用，还不会破坏I型胶原的三维螺旋结构，保留其生物作用特性，最终得到的复合材料具有抑菌功能同时兼具组织修复支架作用。
第二方面，本申请提供一种载银I型胶原复合材料的应用，采用如下的技术方案：所述一种载银I型胶原复合材料在医疗器械，和/或医疗辅料和/或植入体中的应用。
通过采用上述技术方案，将本申请中制得的载银I型胶原复合材料应用于硬脑脊膜替代物、人工真皮以及止血材料等医疗产品中，具有良好的组织修复作用的同时还具有优良的抑菌效果，医疗产品无需灭菌就可以应用，使用更加方便。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中首先将纯化I型胶原与含银溶液混匀，并且在避光条件下进行，防止银见光氧化，从而将银离子分散在I型胶原内，然后进行水浴反应，通过对于水浴反应温度的控制，既不会破坏I型胶原的三维结构，同时能够将银离子很好的均匀负载在I型胶原上，得到的载银I型胶原具有抑菌功能的同时兼具组织修复支架作用；
2、本申请中通过对于冻干条件的摸索，构建负载银I型胶原的孔隙化结构，使得最终得到的载银I型胶原复合材料中银粒子可以通过孔隙结构，弥散作用于受体上，起到优异的抗菌性能；
3、将本申请中制得的载银I型胶原复合材料应用于硬脑脊膜替代物、人工真皮以及止血材料等医疗产品中，具有良好的组织修复作用的同时还具有优良的抑菌效果，医疗产品无需灭菌就可以应用，使用更加方便。
附图说明
图1是本申请实施例1中载银I型胶原复合材料SEM图；
图2是单纯金黄色葡萄球菌培养后抑菌圈试验结果观察图；
图3是金黄色葡萄球菌培养皿加入未载银固相纯化I型胶原后抑菌圈试验结果观察图；
图4是金黄色葡萄球菌培养皿加入实施例1中载银固相I型胶原复合材料后抑菌圈试验结果观察图；
图5是大肠杆菌培养皿加入实施例1中载银固相I型胶原复合材料后抑菌圈试验结果观察图；
图6是金黄色葡萄球菌培养皿加入实施例2中载银液相I型胶原复合材料后抑菌圈试验结果观察图；
图7是大肠杆菌培养皿加入实施例2中载银液相I型胶原复合材料后抑菌圈试验结果观察图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明，予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
以下制备例为纯化I型胶原的制备例，其中制备例1为液相纯化I型胶原的制备例，制备例2为固相纯化I型胶原的制备例。
制备例1
牛跟腱中提取I型胶原然后进行纯化，具体步骤如下：
S1、提取：将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块(块的大小可以为0.5cm×0.5cm)，加入质量分数为10％的碳酸氢钠水溶液浸泡16h(碳酸氢钠水溶液没过牛肉即可)，取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；
将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的质量分数为5％的肉豆蔻酸溶液中浸泡2h，取出后去离子水清洗，晾干；每1L肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.15g；
在液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后将牛跟腱研磨成粉末，得牛跟腱粉末；
取20g牛跟腱粉末，加入1000mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.6％的胃蛋白酶，占牛跟腱粉末重量的0.2％的角鲨烯，搅拌均匀后，在36℃下搅拌，并酶解45h；然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，二疏基乙酸乙二醇酯和牛跟腱粉末的质量比为0.5：1，在30℃下，振荡反应2.5h，最终得酶解液；
将酶解液盐析透析后，得牛跟腱Ⅰ型胶原；
S2、纯化：将得到的牛跟腱Ⅰ型胶原按照2％(重量mg/体积ml)溶于0.5mol/L的盐酸中，然后在pH为4-5的环境下进行均质搅拌2h，搅拌速度为5000r/min；在上述搅拌过程中加入氢氧化钠溶液使pH逐步提升为pH＝10-11的碱性环境；提升至碱性环境后搅拌30min，搅拌速度为15000r/min，在上述搅拌过程中再加入盐酸调节酸碱度，使得pH下调至5-6的环境，然后在10℃温度下快速搅拌2h，搅拌速度为22000r/min，得到均质液；
过滤均质液，滤液即为液相纯化I型胶原。
制备例2
本制备例中步骤S1中牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法与制备例1中相同，不同之处在于，步骤S2中纯化步骤中过滤均质液后，将滤液冷冻干燥制得固相纯化I型胶原，冷冻参数为：首先在4℃、真空度为300毫托(mTorr)下持续30min；然后在(-60)℃、真空度为300毫托(mTorr)下持续10min，再在(-60)℃、真空度为300毫托(mTorr)下持续240min，然后进行干燥，干燥参数为：先在0℃下保持20h，然后升温至20℃，干燥1h，得到固相纯化I型胶原。
实施例
实施例1
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，包括以下步骤：
混合：将制备例2中制得的固相纯化I型胶原与0.1mol/L的硝酸银溶液按照重量：体积比例为0.05g:1ml振荡混匀，振荡混匀在避光条件下进行，得到混合溶液；
水浴反应：将混匀后的混合溶液避光、水浴反应，水浴反应温度为50℃，时间为3h；
冻干：将水浴反应后的混合溶液进行冻干，冻干过程包括以下阶段：第一阶段：(-5)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-40)℃、常压条件，时长2.5h；第三阶段：(-5)℃、真空度0.3mbar，时长20h；第四阶段：(-5)℃、真空度0mbar，时长2h，得到固态孔隙复合材料；
灭菌，将冻干后的固态孔隙复合材料进行辐照30kGy灭菌，得到载银I型胶原复合材料。
实施例2
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，混合步骤中，将制备例1中得到的液相纯化I型胶原与0.1mol/L的硝酸银溶液按照体积：体积比为6ml：1ml振荡混匀，振荡混匀在避光条件下进行，得到混合溶液；
冻干步骤中的冻干过程进行两次循环。
实施例3
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例2中方法进行，不同之处在于，冻干步骤中的冻干过程只进行一次。
实施例4
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中的方法进行，不同之处在于，混合：将制备例2中制得的固相纯化I型胶原与0.1mol/L的硝酸银溶液按照重量：体积比例为0.05g:2ml振荡混匀，振荡混匀在避光条件下进行，得到混合溶液；
水浴反应：将混匀后的混合溶液避光、水浴反应，水浴反应温度为40℃，时间为6h；
冻干：将水浴反应后的混合溶液进行冻干，冻干过程包括以下阶段：第一阶段：(-3)℃、常压条件，时长1.5h；第二阶段：(-35)℃、常压条件，时长2h；第三阶段：(-3)℃、真空度0.2mbar，时长18h；第四阶段：(-3)℃、真空度0mbar，时长1.5h，得到固态孔隙复合材料；
灭菌，将冻干后的固态孔隙复合材料进行辐照25kGy灭菌，得到载银I型胶原复合材料。
实施例5
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中的方法进行，不同之处在于，混合：将制备例2中制得的固相纯化I型胶原与0.1mol/L的硝酸银溶液按照重量：体积比例为0.05g:2ml振荡混匀，振荡混匀在避光条件下进行，得到混合溶液；
水浴反应：将混匀后的混合溶液避光、水浴反应，水浴反应温度为60℃，时间为1h；
冻干：将水浴反应后的混合溶液进行冻干，冻干过程包括以下阶段：第一阶段：(-8)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-45)℃、常压条件，时长3h；第三阶段：(-8)℃、真空度0.3mbar，时长22h；第四阶段：(-8)℃、真空度0mbar，时长2.5h，得到固态孔隙复合材料；
灭菌，将冻干后的固态孔隙复合材料进行辐照38kGy灭菌，得到载银I型胶原复合材料。
实施例6
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，混合步骤中，固相I型胶原与硝酸银溶液的重量与体积比为：0.05g：1.2ml。
实施例7
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，混合步骤中，固相I型胶原与硝酸银溶液的重量与体积比为：0.05g：0.8ml。
对比例
对比例1
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，水浴反应步骤中，水浴反应温度为65℃。
对比例2
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，水浴反应步骤中，水浴反应温度为35℃。
对比例3
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：4℃、真空度为300毫托，时长30min；第二阶段：(-60)℃、真空度为300毫托，时长10min；第三阶段：(-60)℃、真空度为300毫托，时长4h；第四阶段：0℃、真空度0mbar，时长20h，得到固态孔隙复合材料。
对比例4
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：(-5)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-40)℃、常压条件，时长2.5h；第三阶段：(-5)℃、真空度0.3mbar，时长20h，得到固态孔隙复合材料。
对比例5
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：(-5)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-40)℃、常压条件，时长2.5h；第三阶段：(-5)℃、真空度0mbar，时长2h，得到固态孔隙复合材料。
对比例6
一种载银I型胶原复合材料的制备方法，按照实施例1中方法进行，不同之处在于，冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：(-5)℃、常压条件，时长2h；第二阶段：(-5)℃、真空度0.3mbar，时长20h；第三阶段：(-5)℃、真空度0mbar，时长2h，得到固态孔隙复合材料。
性能检测
对本申请实施例1中制得的载银I型胶原复合材料进行电镜扫描，得到的SEM图如图1所示，可以看到，本申请中制得的载银I型胶原复合材料具有孔隙结构。
为了检测本申请实施例中制得复合材料的抑菌性能，采用牛津杯法设置金黄色葡萄球菌和产肠毒素性大肠杆菌培养平皿中心部位置灭菌后的复合材料共培养，图2为单纯金黄色葡萄球菌菌种培养后现象，为空白对照组，可以看到菌落覆盖布满平皿，未出现菌种生长受抑现象；图3为金黄色葡萄球菌培养平皿上加入制备例2中制得的未载银固相纯化I型胶原后生长状况，可以看到图3中也未出现菌落生长受抑现象；可以看到，未载银纯化I型胶原无抑菌性。
图4为在金黄色葡萄球菌培养平皿中心加入本申请实施例1中制得的载银固相I型胶原复合材料后菌落分布图，可以看到图4中出现以复合材料为中心向四周辐射的圆形无菌晕环，本申请实施例中在固相I型胶原上载银后制得的复合材料对于金黄色葡萄球菌具有抑菌性能；
图5为在大肠杆菌培养平皿中心加入本申请实施例1中制得的载银固相I型胶原复合材料的菌落分布图，可以看到图5中也出现以复合材料为中心向四周辐射的圆形无菌晕环，本申请实施例中在固相I型胶原上载银后制得的复合材料对于大肠杆菌具有抑菌性能；
图6在金黄色葡萄球菌培养平皿中心加入本申请实施例2中制得的载银液相I型胶原复合材料后菌落分布图，可以看到图6中出现以复合材料为中心向四周辐射的圆形无菌晕环，本申请实施例中在液相I型胶原上载银后制得的复合材料对于金黄色葡萄球菌具有抑菌性能；图7为在大肠杆菌培养平皿中心加入本申请实施例2中制得的载银液相I型胶原复合材料的菌落分布图，可以看到图7中也出现以复合材料为中心向四周辐射的圆形无菌晕环，本申请实施例中在液相I型胶原上载银后制得的复合材料对于大肠杆菌具有抑菌性能；
综上，可以看到，本申请中制得的载银I型胶原复合材料对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌性能。
同时，对本申请其余实施例和对比例中制得的复合材料按照上述方法测定对于产肠毒素性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性试验，计算抑菌圈直径平均值，实施例检测结果如下表1所示，对比例检测结果如下表2所示：
表1：实施例复合材料抑菌性能
由上表1可以看出，本申请实施例中制得的载银I型胶原复合材料具有良好的抑菌性能，再结合实施例1和实施例2的检测结果，可以看出，液相I型胶原载银后且冻干循环两次后得到的复合材料的抑菌性能稍好于固相I型胶原复合材料，再结合实施例3的检测结果，液相I型胶原载银后只冻干循环一次后的复合材料抑菌性能有所降低，这与液相I型胶原中水分含量有关，实施例2中循环两次后冻干孔隙结构构建更好，银粒子通过孔隙作用于受体作用更好。
再结合实施例1和实施例6-7的检测结果，可以看出，固相I型胶原与硝酸银溶液混合的时候，银离子浓度过低的时候，其抑菌性能低，而银离子浓度继续增大的时候，其抑菌性能增长较小，反而增加其毒性。
表2：对比例复合材料抑菌性能
结合上表2，参照对比例1与实施例1的检测结果，可以看出，I型胶原与硝酸银混合后水浴反应温度过高的时候，得到复合材料的抑菌性能显著降低，这可能是由于水浴反应过高的时候对于I型胶原三维螺旋结构有所破坏，影响最终孔隙结构搭建，银粒子释放作用受到影响；再结合对比例2的检测结果，水浴温度过低的时候，抑菌性能稍有所降低，这是由于影响了I型胶原上负载银粒子的数量，最终抑菌性能有所降低；再结合对比例3-对比例6的检测结果，可以看出，冻干工艺参数影响复合材料孔隙结构搭建，采用本申请中冻干参数时得到复合材料有适合的孔隙参数，银粒子可以通过孔隙扩散至受体上进行作用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (5)

1.一种载银I型胶原复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
混合：将纯化I型胶原与含银溶液避光振荡混匀，得到混合溶液；
水浴反应：将混匀后的混合溶液通过避光、水浴反应，水浴反应温度为40-60℃；
冻干：将水浴反应后的混合溶液进行冻干，得到固态孔隙复合材料，冻干过程包括以下阶段：第一阶段：（-8） -（-3）℃、常压条件；第二阶段：（-45）-（-35）℃、常压条件；第三阶段：（-8） -（-3）℃、真空度0.2-0.3mbar；第四阶段：（-8） -（-3）℃、真空度0mbar；
灭菌，将冻干后的固态孔隙复合材料灭菌，得到载银I型胶原复合材料；
冻干步骤中，第一阶段时长为1.5-2h；第二阶段时长为2-3h；第三阶段时长为18-22h；第四阶段时长为1.5-2.5h；
混合步骤中，I型胶原为液相形式或固相形式；
混合步骤中，I型胶原选用固相I型胶原时，I型胶原与含银溶液的重量与体积比为：0.05g：（1-2）ml；
I型胶原选用液相I型胶原时，I型胶原与含银溶液的体积与体积比为6ml：（1-2）ml；
混合步骤中I型胶原为固相形式添加时，冻干步骤中的冻干过程进行一次；
混合步骤中I型胶原以液相形式添加时，冻干步骤中的冻干过程进行两次；
所述纯化I型胶原为自牛跟腱中提取纯化得到。
2.根据权利要求1所述的一种载银I型胶原复合材料的制备方法，其特征在于：冻干步骤中，冻干过程包括以下阶段：
第一阶段：（-5）℃、常压条件，时长2h；第二阶段：（-40）℃、常压条件，时长2.5h；第三阶段：（-5）℃、真空度0.3mbar，时长20h；第四阶段：（-5）℃、真空度0mbar，时长2h。
3.根据权利要求1所述的一种载银I型胶原复合材料的制备方法，其特征在于：灭菌步骤中，采用辐照25-38kGy灭菌方式。
4.一种载银I型胶原复合材料，其特征在于：通过如权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制得。
5.一种如权利要求4所述的一种载银I型胶原复合材料在医疗器械，和/或医疗辅料的应用。
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