CN115219479B - 一种高浓度Cl-环境下检测Ag+的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在高浓度Cl^‑存在的情况下检测Ag⁺的方法，属于Ag⁺检测技术领域。该方法包括以下步骤：（1）在玻璃毛细管表面自组装AuNPs，制备得到表面增强拉曼基底；（2）将4‑ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器；（3）将表面增强拉曼传感器浸泡到待测溶液中，检测表面增强拉曼光谱；（4）计算新的拉曼特征峰和4‑ATP本身的特征峰峰强的比值I₄₃₈/I₃₉₀，得到Ag⁺的浓度。本发明的有益之处在于：本发明制备得到了可以检测银离子的氯化络合物的表面增强拉曼传感器，解决了众多Ag⁺传感器受Cl^‑干扰大的难题，为重金属离子形态分析提供了新方法。

Description

一种高浓度Cl-环境下检测Ag+的方法

技术领域

本发明涉及一种检测Ag⁺的方法，具体涉及一种基于表面增强拉曼传感器，在高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，属于Ag⁺检测技术领域。

背景技术

银离子（Ag⁺）作为一种非常常见的抗菌剂，已广泛应用在养殖业和医院等公共场所。大量文献表明，Ag⁺可以与带负电荷的细胞膜结合，干扰细胞膜的完整性，并直接影响含巯基的酶，引起氧化应激和诱导细胞损伤。因此，实现Ag⁺的高灵敏检测具有重要意义。

目前，常用的Ag⁺检测方法有：电化学法、荧光法、比色法等。这些方法通常存在操作复杂、反应条件复杂、背景信号强、干扰因素多等问题。

由于表面增强拉曼技术具有操作简便、稳定性高、可指纹识别、灵敏度高、能实现单分子水平检测等优势，所以也被广泛应用于Ag⁺的分析检测中。

Ag⁺一旦进入环境或生物体内，就可能与周围的物质发生作用，并以其他形态形式存在。Ag⁺与氯离子（Cl^-）发生作用并且以银的氯化络合物形态存在的可能性极大。这是由于Cl^-来源广泛，众多环境样品都可能含有高浓度的Cl^-：

首先，Cl^-本身就是一种天然的、广泛存在的离子，最广为人知的是海水（约0.5M）和盐湖中都含有大量的Cl^-；

其次，Cl^-也是生活和生产过程中必要的成分，如钾肥（KCl）、融雪剂（NaCl）、食盐（NaCl）等；

最后，Cl^-是生命过程的必要离子，广泛存在于生物体内，如血清和尿液中Cl^-的正常浓度为100mM左右。

Cl^-的存在形式有以下4种：AgCl_(aq)、AgCl₂ ^-、AgCl₃ ^2-、AgCl₄ ^3-，这些络合物形态给Ag⁺的检测带来了极大的挑战。

由于常见的Ag⁺传感器只能识别游离态的Ag⁺，一旦Ag⁺与Cl^-形成络合物，Ag⁺传感器就不能识别Ag⁺。这也是Cl^-常常用作Ag⁺的常见掩蔽剂的原因。

到目前为止，很多Ag⁺传感器都明确表明在Cl^-存在时无法正常工作，能够在高浓度Cl^-存在的情况下检测Ag⁺的Ag⁺传感器几乎没有报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种能够在高浓度Cl^-环境下，简便、灵敏检测Ag⁺的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，包括以下步骤：

Step1：在玻璃毛细管表面自组装AuNPs，制备得到表面增强拉曼基底；

Step2：以4-ATP作为探针分子，将4-ATP通过S-Au键结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器；

Step3：将表面增强拉曼传感器浸泡到待测溶液中，待表面增强拉曼传感器与Ag⁺完全反应后，用780nm激光检测表面增强拉曼光谱；

Step4：计算新的拉曼特征峰和4-ATP本身的特征峰峰强的比值I₄₃₈/I₃₉₀，得到Ag⁺的浓度。

优选的，在Step1中，在玻璃毛细管表面自组装AuNPs的过程具体如下：

（1）将待组装的玻璃毛细管超声清洗干净，然后放到食人鱼刻蚀液中浸泡15～20min；

（2）从食人鱼刻蚀液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，然后放到98%APTES-H₂O混合液中浸泡30min；

（3）从98%APTES-H₂O混合液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，在玻璃培养皿中垫擦镜纸，放入待组装的玻璃毛细管，铝箔封口，将玻璃培养皿放入干燥箱中烘干，室温冷却；

（4）向冷却后的玻璃培养皿中倒入30nm AuNPs溶胶，组装22～24h，得到金纳米粒子单层膜，将自组装AuNPs后的玻璃毛细管保存在超纯水中。

优选的，在Step2中，将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面的过程具体如下：

（1）将自组装AuNPs后的玻璃毛细管从超纯水中取出，然后放到1M的KNO₃溶液中浸泡5min，取出晾干；

（2）用超纯水清洗掉玻璃毛细管表面的KNO₃，然后将玻璃毛细管放到10μM的4-ATP溶液中浸泡0.5h，将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器。

优选的，在Step3中，浸泡时间为30min。

本发明的有益之处在于：

（1）以表面自组装AuNPs的玻璃毛细管作为表面增强拉曼基底，以4-ATP作为探针分子，制备得到了可以检测银离子的氯化络合物的表面增强拉曼传感器，解决了众多Ag⁺传感器受Cl^-干扰大的难题，为重金属离子形态分析提供了新方法；

（2）采用反应后的新峰与探针分子本身特征峰的峰强比值作为Ag⁺浓度的定量依据，克服了单峰定量变量大的缺陷，有效提高了实验的重现性。

附图说明

图1是在玻璃毛细管表面自组装AuNPs的流程图；

图2是表面自组装AuNPs的玻璃毛细管的SEM图；

图3是高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的原理图；

图4是ACl₂ ^-与探针分子4-ATP的反应机理图；

图5是表面增强拉曼传感器对氯化银络合物的响应光谱图；

图6是采用密度泛函理论（DFT）和B3LYP方法对几种分子进行结构优化和频率计算示意图，其中，（A）是分子结构和振动光谱图，（B）是分子结构模型示意图；

图7是在不同浓度Cl^-环境下，1μM氯化银络合物的SERS光谱图；

图8是在不同浓度Cl^-环境下，I₄₃₈/I₃₉₀与1μM氯化银络合物的柱状图；

图9是在0.5M Cl^-环境下，不同浓度（0～3μM）氯化银络合物对应的SERS光谱图；

图10是在0.5M Cl^-环境下，SERS光谱峰比值I₄₃₈/I₃₉₀与Ag⁺浓度（0～3μM）响应曲线图；

图11是在0.5M Cl^-环境下，SERS光谱峰比值I₄₃₈/I₃₉₀与Ag⁺浓度（0.05～1μM）线性拟合图；

图12是五批次以及各批次平行样品中表面增强拉曼传感器对1μM氯化银络合物响应的SERS光谱图，其中，（a）是每个平行样品在390cm^-1处的光谱峰强度值，（b）是五批次样品在390cm^-1处光谱峰强度值的平均值，（c）是每个平行样品在438cm^-1处的光谱峰强度值，（d）是五批次样品在438cm^-1处光谱峰强度值的平均值，（e）是每个平行样品的I₄₃₈/I₃₉₀相对强度值，（f）是五批次样品的I₄₃₈/I₃₉₀相对强度的平均值；

图13是在0.5M Cl^-环境下，实际样品（河水、水库水、人工海水、人工尿）的SERS光谱图。

具体实施方式

表面增强拉曼散射（SERS）是指：吸附在金、银等贵金属粗糙基底或纳米颗粒表面的分子，其拉曼散射信号显著增强的现象。

表面增强拉曼技术具有高灵敏度，无光漂白性，能够实现多信号测定以及分子结构高特异性识别。

基于此，本发明针对常规的Ag⁺传感器不能在高浓度Cl^-环境下有效检测Ag⁺的现状，提出了一种基于表面增强拉曼传感器，在高浓度Cl^-环境下有效检测Ag⁺的方法。

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法

1、制备表面增强拉曼基底

在玻璃毛细管表面自组装金纳米颗粒（AuNPs），制备得到表面增强拉曼基底。

参照图1，在玻璃毛细管表面自组装AuNPs的过程具体如下：

（1）将待组装的玻璃毛细管超声清洗干净，去除表面杂质，然后将清洗干净的待组装的玻璃毛细管放到食人鱼刻蚀液（浓硫酸和30%过氧化氢的混合物，v/v=1：4）中浸泡15～20min，使玻璃毛细管表面羟基化；

（2）从食人鱼刻蚀液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，然后放到98％APTES-H₂O混合液（98％APTES和H₂O以体积比1：3混合）中浸泡30min，使玻璃毛细管的表面氨基化；

（3）从98%APTES-H₂O混合液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，在玻璃培养皿中垫擦镜纸，放入待组装的玻璃毛细管，铝箔封口，将玻璃培养皿放入电热恒温鼓风干燥箱中，110℃烘10min，烘干后室温冷却30min；

（4）向冷却后的玻璃培养皿中倒入30nm AuNPs溶胶，组装22～24h，待金纳米颗粒生长完毕即得到金纳米粒子单层膜，将自组装AuNPs后的玻璃毛细管保存在超纯水中。

观察制备得到的表面增强拉曼基底的实物可以看到：玻璃毛细管表面自组装AuNPs后外壁变红。

利用自组装技术制备得到的表面增强拉曼基底（表面自组装AuNPs的玻璃毛细管）的SEM图见图2。

由图2可见：该表面增强拉曼基底上的AuNPs分散均匀，说明成功制备出了致密且均匀的表面增强拉曼基底。

2、制备表面增强拉曼传感器

以4-氨基苯硫酚（pATP/4-ATP，HS-Ph-NH₂）作为探针分子，将4-ATP通过S-Au键结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器。

将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面的过程具体如下：

（1）将自组装AuNPs后的玻璃毛细管从超纯水中取出，然后放到1M的KNO₃溶液中浸泡5min，取出，晾10～15min直至玻璃毛细管外壁完全干燥，此时可以观察到玻璃毛细管自组装的AuNPs由原本的酒红色由于聚集变为紫黑色；

（2）用超纯水清洗掉玻璃毛细管表面的KNO₃，然后将已聚集完全的玻璃毛细管放到0.5mL浓度为10μM的4-ATP溶液中浸泡0.5h，巯基基团与金纳米颗粒具有强烈的亲和作用，使得4-ATP在AuNPs的表面发生化学吸附，形成牢固的S-Au键修饰在AuNPs表面，从而成功将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备出4-ATP修饰的AuNPs传感器（即表面增强拉曼传感器）。

3、高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺

参照图3，表面增强拉曼传感器在高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的原理如下：

表面增强拉曼传感器与氯化银络合物发生反应，导致探针分子4-ATP的结构发生改变（由原来的4-ATP变成了4-ATP-氯化银络合物），从而出现新的拉曼特征峰。

在高浓度Cl^-环境下，Ag⁺主要以AgCl₂ ^-的形式存在，AgCl₂ ^-与探针分子4-ATP的反应机理如图4所示。

表面增强拉曼传感器在高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法具体如下：

将表面增强拉曼传感器放入到待测溶液中，浸泡30min，使表面增强拉曼传感器与Ag⁺完全反应，用780nm激光检测表面增强拉曼光谱。

以配制半小时的银-0.5M NaCl溶液作为待测溶液，得到的表面增强拉曼传感器对氯化银络合物的响应光谱图见图5。

从图5可以看出：在高浓度Cl^-环境下，探针分子4-ATP与氯化银络合物反应前，在390cm^-1、1004cm^-1、1080cm^-1以及1590cm^-1处都有明显的谱带；探针分子4-ATP与氯化银络合物反应后，在438cm^-1附近出现明显的新峰。

采用密度泛函理论（DFT）和B3LYP方法对几种分子进行结构优化和频率计算。如图6所示，首先提出了银离子与氨基结合的模型——（Au）⁺-S^--Ph-NH₂-（Ag⁺），基于此模型，计算出了在400cm^-1、430cm^-1和433cm^-1处均有拉曼峰，其中，在400cm^-1处的拉曼峰强度太低，在模拟光谱图中几乎不显示，在430cm^-1和433cm^-1处的拉曼峰位置比较接近，重叠到一起最强峰的位置约在431cm^-1处。该理论结果基本可以解释实验过程中检测到由银离子诱导在438cm^-1处产生新峰的现象。然而，在做参考理论模拟时发现，（Au）⁺-S^--Ph-NH₂结构的模拟拉曼光谱结果在444cm^-1处也出现了一个新峰，甚至和实验结果438cm^-1更加接近。该结果说明（Au）⁺-S^--Ph-NH₂结构可能对实验438cm^-1处的峰有贡献。对此现象解释如下：（Au）⁺-S^--Ph-NH₂本质上可以看作是Au⁺与4-ATP的巯基发生反应产生的络合物，从实验角度来说，可能是Ag⁺促进光诱导电荷转移而在金表面的局域产生大量的Au⁺，从而产生类似的表面络合物。

上述采用1个Au原子模拟金属表面，不是很准确，因为一个Au原子模拟金属基底受到分子体系电荷分布影响较大。因此，又采用5个Au原子的团簇模拟表面增强拉曼基底。相比之下，（5Au）⁺-S^--Ph-NH₂中包含5个Au原子，相当于每个Au原子只有1/5的电荷，这样对体系影响较小，更接近金属表面结构。如图6，计算结果显示的（5Au）⁺-S^--Ph-NH₂结构的模拟拉曼光谱没有在400～450cm^-1范围出现新峰，该模拟结果与实验结果一致，也说明用5个Au原子模拟金表面结构更加准确。实验模型（5Au）⁺-S^--Ph-NH₂-（Ag⁺）的模拟拉曼光谱在418cm^-1处仍然有一个明显新峰，再次说明Ag⁺与氨基配位作用确实可以引起4-ATP的SERS光谱变化。

综上，推测基于4-ATP的表面增强拉曼传感器检测Ag⁺的机制主要可能是：4-ATP分子的氨基与Ag⁺发生络合反应。

由于银氨配位离子的稳定常数大于氯化银络合物的稳定常数，所以氨基与银络合的能力要强于银离子与氯离子络合的能力，氯化银络合物可能通过脱氯以银离子形式与4-ATP分子的-NH₂络合。经实验与理论计算结果推测，（5Au）⁺-S^--Ph-NH₂-（Ag⁺）在418cm^-1处的新峰可能是Ag⁺与4-ATP分子的-NH₂发生络合作用产生的。

4、计算Ag⁺的浓度

利用新的拉曼特征峰和4-ATP本身的特征峰峰强的比值（I₄₃₈/I₃₉₀）作为Ag⁺的浓度的定量指标。

二、探究检测方法的相关性能

1、适应范围

在不同浓度Cl^-环境下，1μM氯化银络合物的SERS光谱图如图7所示，I₄₃₈/I₃₉₀与1μM氯化银络合物的柱状图如图8所示。

由图7和图8可以看出：对于微量Ag⁺（1μM）的检测，改变Cl^-浓度对本发明的检测方法基本没有干扰，从而说明本发明的检测方法具有很宽的适应范围。

2、检测限

在0.5M Cl^-环境下，不同浓度（0～3μM）氯化银络合物对应的SERS光谱图见图9，SERS光谱峰比值I₄₃₈/I₃₉₀与Ag⁺浓度（0～3μM）响应曲线图见图10，SERS光谱峰比值I₄₃₈/I₃₉₀与Ag⁺浓度（0.05～1μM）线性拟合图见图11。

得到的线性方程为y=1.39238x+0.11358，其中，x为氯化银络合物浓度，y为I₄₃₈/I₃₉₀的数值，检测限约为0.07μM。该检测限明显低于国家标准0.46μM，满足检测需求。

3、稳定性

对五批次以及各批次平行样品中SERS传感器对1μM氯化银络合物响应的SERS光谱图进行数据分析。每个平行样品在390cm^-1处的光谱峰强度值见图12（a），五批次样品在390cm^-1处光谱峰强度值的平均值见图12（b）；每个平行样品在438cm^-1处的光谱峰强度值见图12（c），五批次样品在438cm^-1处光谱峰强度值的平均值见图12（d）；每个平行样品的I₄₃₈/I₃₉₀相对强度值见图12（e），五批次样品的I₄₃₈/I₃₉₀相对强度的平均值见图12（f）。

通过对五批次以及各批次平行样品检测光谱数据进行分析可以确定：本发明提供的检测方法在稳定性方面具有更为明显的优势。

三、验证检测方法检测实际样品的效果

在0.5M Cl^-环境下，用本发明提供的方法检测实际样品（河水、水库水、人工海水、人工尿）的Ag⁺浓度，得到的SERS光谱图见图13，Ag⁺浓度的计算结果见表1。

表1 在0.5M Cl-环境下，实际样品的Ag+浓度检测结果

样品	加标量（μM）	检测量（μM）	回收率（%）	RSD（%）
					河水（加Cl<sup>-</sup>）	0.6	0.718	119.6	4.43
水库水（加Cl<sup>-</sup>）	0.6	0.697	116.2	2.41
					人工海水	0.6	0.528	88.0	10.56
人工尿	0.6	0.475	79.2	5.23

由表1可知，本发明提供的检测方法对于高浓度Cl^-环境下的实际样品检测回收率能保持在79%～120%，RSD也在11%以内，说明本发明提供的检测方法同样适用于实际样品中氯化银络合物的检测，实现了对高浓度Cl^-环境下下银离子的定量分析。

四、横向比较检测方法

表2 Ag⁺检测方法的比较

由表2可知：

（1）本发明提供的检测方法其灵敏度达到了和大多数银离子传感器相媲美的水平；

（2）本发明提供的检测方法可检测氯化银络合物，而其他检测方法大多用于检测饮用水等简单的基质样品，有几种检测方法明确表明氯离子存在下无法检测；

（3）本发明提供的检测方法不仅可以检测Ag⁺，而且对高浓度Cl^-环境下的氯化银络合物同样可以灵敏检测，解决了Cl^-环境下传感器无法正常工作的难题。

需要说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.一种高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：在玻璃毛细管表面自组装AuNPs，制备得到表面增强拉曼基底；

Step2：以4-ATP作为探针分子，将4-ATP通过S-Au键结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器；

Step3：将表面增强拉曼传感器浸泡到待测溶液中，待表面增强拉曼传感器与Ag⁺完全反应后，用780nm激光检测表面增强拉曼光谱；

Step4：计算438cm^-1处的特征峰峰强I₄₃₈和4-ATP本身的特征峰峰强I₃₉₀的比值I₄₃₈/I₃₉₀，得到Ag⁺的浓度。

2.根据权利要求1所述的高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，其特征在于，在Step1中，在玻璃毛细管表面自组装AuNPs的过程具体如下：

（1）将待组装的玻璃毛细管超声清洗干净，然后放到食人鱼刻蚀液中浸泡15～20min；

（2）从食人鱼刻蚀液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，然后放到98%APTES-H₂O混合液中浸泡30min；

（3）从98%APTES-H₂O混合液中取出待组装的玻璃毛细管，用超纯水清洗5次，在玻璃培养皿中垫擦镜纸，放入待组装的玻璃毛细管，铝箔封口，将玻璃培养皿放入干燥箱中烘干，室温冷却；

（4）向冷却后的玻璃培养皿中倒入30nm AuNPs溶胶，组装22～24h，得到金纳米粒子单层膜，将自组装AuNPs后的玻璃毛细管保存在超纯水中。

3.根据权利要求1所述的高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，其特征在于，在Step2中，将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面的过程具体如下：

（1）将自组装AuNPs后的玻璃毛细管从超纯水中取出，然后放到1M的KNO₃溶液中浸泡5min，取出晾干；

（2）用超纯水清洗掉玻璃毛细管表面的KNO₃，然后将玻璃毛细管放到10μM的4-ATP溶液中浸泡0.5h，将4-ATP结合到表面增强拉曼基底的AuNPs的表面，制备得到表面增强拉曼传感器。

4.根据权利要求1所述的高浓度Cl^-环境下检测Ag⁺的方法，其特征在于，在Step3中，浸泡时间为30min。

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