CN115216410A - 一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法 - Google Patents

一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

双歧杆菌作为一种典型的益生菌，广泛存在于人体肠道和母乳样品，但其在长寿老人粪便样品中的丰度显著低于婴儿粪便样本，加上严格厌氧的属性，使得长寿老人源双歧杆菌的分离培养极其困难，相关研究开发进展缓慢。本发明给出一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，属于微生物技术领域。采用的培养基是以TPY培养基为基础进行改良的选择性培养基。所述的改良TPY包括抗生素莫匹罗星、生物调控因子A、显色剂X‑Gal和生长调控因子B。本发明的改良TPY能选择性地抑制粪便样品中的革兰氏阴性菌，且对双歧杆菌的生长具有促进作用，使得其在平板表面生长出显蓝色的典型菌落，可显著降低复杂混合样品中双歧杆菌的分离难度，对双歧杆菌的筛选培养具有实用价值。

Description

一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法。
背景技术
双歧杆菌最初由法国巴斯德研究所的Henry Tissier从母乳喂养的婴儿粪便中分离所得，自此之后，研究学者不断地从粪便和母乳样品中发现了更多的双歧杆菌菌属，并对其生理特性及功能进行了深度研究。经过长时间的发展以及肠道微生物组学技术的应用，人们越来越意识到双歧杆菌的重要性。双歧杆菌作为一种公认的益生菌，具有改善胃肠道功能、抑制病原菌、改善免疫力及抗衰老等多种重要的生理功能。
双歧杆菌分离鉴定的现有技术以MRS或TPY选择性培养基为主，其中添加的莫匹罗星是一种能抑制除双歧杆菌以外的多数乳酸菌的抗生素，并且GB4789.35-2010首次在国内采用莫匹罗星锂盐改良MRS琼脂做为双歧杆菌计数的选择性培养基。但是发明人在具体实施时，发现长寿老人粪便样品在莫匹罗星锂盐改良TPY培养基很难生长出双歧杆菌，反而是生长出大量厌氧型梭菌属及肠杆菌属等杂菌，很难从中筛选出双歧杆菌。分析发现莫匹罗星能抑制革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性菌，但是却无法抑制大多数厌氧菌(如梭状芽孢杆菌)。而长寿老人粪便菌群中梭菌属等厌氧菌占比较高，与婴儿粪便菌群相比，其双歧杆菌相对含量更低。因此，采用传统的莫匹罗星锂盐改良培养基不适用于长寿老人源双歧杆菌的筛选，所以有必要找到能够抑制这些厌氧菌但不抑制双歧杆菌的抗某种单独或者混合成分的生物调控因子，来开发出适用于长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺点，本发明提供了一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法。
一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，所述的分离鉴定方法采用的是平板稀释涂布法。
进一步的，所述的分离鉴定方法采用的是改良TPY选择性培养基。
进一步的，所述的改良TPY配方包括抗生素莫匹罗星、生物调控因子A。莫匹罗星对革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性菌抗菌活性较高，但大多数厌氧菌(如梭状芽孢杆菌)却对莫匹罗星具有抗性。经过反复筛选得到的生物调控因子A，对革兰氏阴性杆菌的抗菌活性高，且对肠杆菌科的大部分细菌具有较好的抗菌活性，如产气肠杆菌、产气荚膜梭菌和大肠埃希氏菌等。这两种添加物的共同点是对双歧杆菌的生长无抑制作用。
进一步的，所述的改良TPY配方包括显色剂X-Gal。X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。双歧杆菌在生长的过程中会产生β-半乳糖苷酶，因此其在平板表面生长出典型菌落的同时，也能在菌落背面形成蓝色底晕，便于目的菌株的筛选。
进一步的，所述的改良TPY配方包括生长因子生长调控因子B。
进一步的，所述的改良TPY培养基配方为酪蛋白10g/L、大豆蛋白胨5g/L、酵母浸粉2g/L、葡萄糖5g/L、吐温-801g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化钙0.15g/L、莫匹罗星100mg/L、生物调控因子A 100mg/L、X-Gal 60mg/L、生长调控因子B 1mg/L。
进一步的，所述的改良TPY选择性培养基配制方法为：
S1：抗生素溶液的配制：将莫匹罗星溶于无菌超纯水，配制成50mg/mL的溶液，将生物调控因子A溶于1M NaOH，配制成50mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用；
S2：显色剂和生长因子溶液的配制：将X-Gal溶于二甲基甲酰胺，配制成20mg/mL的溶液，将生长调控因子B溶于无水乙醇，配制成10mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用(避光保藏)；
S3：L-半胱氨酸的配制：将L-半胱氨酸溶解于蒸馏水，得到20％(W/V)的L-半胱氨酸溶液，过滤除菌备用；
S4：无机盐溶液的配制：将K2HPO4溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的K2HPO4溶液，将MgCL2溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的MgCL2溶液，将ZnSO4溶解于蒸馏水，得到25％(W/V)的ZnSO4溶液，将CaCL2溶解于蒸馏水，得到15％(W/V)的CaCL2溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min后备用；
S5：取酪蛋白10g，大豆蛋白胨5g，酵母浸粉2g，葡萄糖5g，吐温-80 1g，琼脂15g，定容于1L蒸馏水中，混合均匀后将其按照每个锥形瓶200mL进行分装，121℃高压蒸汽灭菌20min，待其冷却至55℃左右(摸着有一点烫手)时，随后往锥形瓶添加S1中的莫匹罗星和生物调控因子A溶液各200μL，S2中的X-gal溶液600μL和生长调控因子B溶液200μL，S3中的L-半胱氨酸溶液200μL，S4中的K2HPO4溶液800μL，MgCL2溶液、ZnSO4溶液和CaCL2溶液各200μL，添加之后将锥形瓶轻微摇晃，使之混合均匀，静置一小会待里面气泡消失，然后开始倒平板，得到改良TPY选择性培养基。
进一步的，所述的改良TPY选择性培养基的pH值是6.5。
进一步的，所述的分离鉴定培养采用的培养温度是37℃。
进一步的，所述的分离鉴定培养采用的混合气体配比为90％N2、5％H2、5％CO2。
采用本发明的技术方案，具有如下有益效果：
1、本发明的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法能够有效抑制粪便样品中的杂菌，莫匹罗星抑制革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性菌，特别是能抑制一些同样能使X-Gal显蓝色的乳酸菌。生物调控因子A抑制革兰氏阴性杆菌和大部分肠杆菌科，另外还包括莫匹罗星无法抑制的梭状芽孢杆菌和产气荚膜梭菌等，莫匹罗星和生物调节因子A的联合使用形成有效的互补作用，降低了粪便样品中双歧杆菌分离鉴定的难度，对双歧杆菌的分离鉴定和扩大培养具有重要意义。
2、采用本发明的筛选培养方法，可以使得不需采用富集培养基对双歧杆菌进行富集培养，而可以直接将粪便样品加入无菌PBS缓冲液进行梯度稀释，然后再进行平板涂布，在固体培养基的表面就能形成典型的菌落形态，并且在显色剂X-Gal的作用下，通过挑选显蓝色的菌落进行后续鉴定，能有效提高双歧杆菌的分离鉴定成功率，具有快速准确、操作简单的特点，适用于双歧杆菌的特异性筛选。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是长寿人群的肠道菌群组成结构；
图2是TPY液体培养基在不同配制方式下面的图片；其中，左边为阳性离子、磷酸盐和其它培养基组份分开灭菌，临用前无菌加入的图片，右边为所有培养基组份一起混合灭菌的图片；
图3是同一粪便样品在改良TPY和普通TPY下的平板筛选图；其中，A图为厌氧条件下改良TPY筛选平板，B图为厌氧条件下普通TPY筛选平板，C图为空气条件下含改良TPY筛选平板，D图为空气条件下普通TPY筛选平板；
图4是改良TPY选择性平板上面显蓝色的疑似双歧杆菌菌落图片；其中，A图为接触空气0h显色效果，B图为接触空气6h显色效果；
图5是本发明所分离的双歧杆菌落形态图；
图6是本发明所分离的双歧杆菌的1000倍普通光学电子显微镜下的革兰氏染色图；
图7是本发明实施例2中所分离的双歧杆菌PCR扩增分子鉴定条带图；其中，电泳道从左至右分别是分子量为2000bp的Maker，平板上面挑选的疑似菌落1-9，空白对照CK；
具体实施方式
下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行尽量清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的酪蛋白、酵母浸粉、大豆蛋白胨、L-半胱氨酸、磷酸氢二钾购自北京澳博星生物技术有限公司；莫匹罗星、生物调控因子A、X-Gal和生长调控因子B、琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司；双歧杆菌BS培养基购自青岛海博生物；粪便来自广西壮族自治区河池市某县的长寿老人。
实施例1
长寿老人的肠道菌群组成结构
选取10位长寿老人的粪便样品，进行16S rRNA测序，图1展示为10位长寿老人肠道内排名前30的菌属组成，其中以埃稀氏菌(Escherichia)、拟杆菌(Bacterodies)、阿克曼菌(Akkermansia)和罗斯菌(Roseburia)四种菌属占主导地位。益生菌类中，乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)皆有排名，分别排在第11和22位，其中双歧杆菌相对丰度占比较低。潜在益生菌类，阿克曼菌(Akkermansia)、粪杆菌属(Facelibacterium)和克里斯滕森菌(Chritensenellaceae)都排名前10，相对丰度占比较高。另一方面，一些“机会主义”致病菌，如克雷伯菌(Klebsiella)和梭菌属(Clostridium)分别排名第5位和第20位，高于双歧杆菌。
总之，从肠道菌群结构组成可以看出，长寿老人的肠道菌群具有一定的特殊性和个体差异性，加上粪便样品属于复杂环境样本，由于微生物数量多、种类复杂，想要从中特异性筛选双歧杆菌的同时，还要抑制类杆菌属、梭菌属、球菌属等多种细菌是非常困难的。因此仅仅添加莫匹罗星是不够的，还需要寻找单一或者是混合组份的生物调控因子，从而达到能够抑制莫匹罗星无法抑制的大多数厌氧菌(如类杆菌属和梭菌属)的效果。
实施例2
改良TPY选择性培养基的配制
TPY培养基在高压蒸汽灭菌过程中，其中的Ca、Mg、Fe、Zn等阳离子与培养中的可溶性磷酸盐共热产生沉淀，这些沉淀使得澄清的液体培养基变得浑浊，严重影响菌株生长的实验观察。因此，在配制改良TPY时，需将这些培养基组份分别灭菌，临用前无菌混合，一些不能耐受高温的组份则采用无菌滤膜过滤除菌。
1、抗生素溶液的配制：将莫匹罗星溶于无菌超纯水，配制成50mg/mL的溶液，将生物调控因子A溶于1M NaOH，配制成50mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用；
2、显色剂和生长因子溶液的配制：将X-Gal溶于二甲基甲酰胺，配制成20mg/mL的溶液，将生长调控因子B溶于无水乙醇，配制成10mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用(避光保藏)；
3、L-半胱氨酸的配制：将L-半胱氨酸溶解于蒸馏水，得到20％(W/V)的L-半胱氨酸溶液，过滤除菌备用；
4、无机盐溶液的配制：将K2HPO4溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的K2HPO4溶液，将MgCL2溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的MgCL2溶液，将ZnSO4溶解于蒸馏水，得到25％(WN)的ZnSO4溶液，将CaCL2溶解于蒸馏水，得到15％(W/V)的CaCL2溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min后备用；
5、取酪蛋白10g，大豆蛋白胨5g，酵母浸粉2g，葡萄糖5g，吐温-80 1g，琼脂15g，定容于1L蒸馏水中，混合均匀后将其按照每个锥形瓶200mL进行分装，121℃高压蒸汽灭菌20min，待其冷却至55℃左右(摸着有一点烫手)时，随后往锥形瓶添加S1中的莫匹罗星和生物调控因子A溶液各200μL，S2中的X-gal溶液600μL和生长调控因子B溶液200μL，S3中的L-半胱氨酸溶液200μL，S4中的K2HPO4溶液800μL，MgCL2溶液、ZnSO4溶液和CaCL2溶液各200μL，添加之后将锥形瓶轻微摇晃，使之混合均匀，静置一小会待里面气泡消失，然后开始倒平板，得到改良TPY选择性培养基。
实施例3
长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法
具体步骤如下：
1、材料来源
广西壮族自治区某县粪便样品3份，样品采集自2020年9月25号，样品分装于无菌2mL离心管中，-80℃冻存备用，样品编号为FS-01，FS-02，FS-03。
2、样品梯度稀释及平板涂布
从-80℃冰箱中取出冷冻保藏的粪便样品，室温下解冻，准备好灭菌的磷酸盐缓冲液稀释管，每个稀释管为9mL含L-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液，取1g粪便样品加入灭好菌9mL含L-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液中，斡旋混匀，记为10-1稀释梯度，然后吸取1mL混匀液到下一个9mL稀释管中，斡旋混匀，记为10-2稀释梯度，依次向下操作至10-4稀释梯度。
选取10-2、10-3、10-4三个梯度，各吸取100uL到改良TPY琼脂平板上面进行稀释涂布，每个梯度稀释涂布两个平板，将其放入厌氧工作站(90％N2、5％CO2、5％H2)中，37℃恒温厌氧培养48～96h。
3、镜检观察及菌落PCR鉴定
将生长有菌落的平板取出，在超净工作台中以X-gal的显色现象和菌落形态这两方面进行菌落挑选，①X-Gal显色：挑选在厌氧条件下就显蓝色或浅蓝色的菌落，以及在厌氧条件下显白色，但在接触空气后显蓝色的菌落；②菌落形态：圆形湿润、边缘整齐、表明隆起的菌落。将挑选菌落进行革兰氏染色，在普通光学显微镜下面观察，挑选出革兰氏阳性(呈紫色)、棒状、杆状或分叉状的菌株。
将观察到具有此特性的菌株使用双歧杆菌特异性引物Lm3/26进行菌落PCR，其中上游引物为Lm3(GATTCTGGCTCAGGATGAACG)，下游引物为Lm26(CGGGTGCTYCCCACTTTCATG)。PCR采用50uL体系，以平板上面生长的单克隆菌落为模板，加入2uL上游引物，2uL下游引物，25uL Taq酶，并用ddH2O补足至50uL。加好体系之后用移液枪反复吹吸混合液进行混匀，混匀后在小离心机上面离心。
表1 PCR反应体系
Figure BSA0000281366610000061
离心好后放入梯度PCR仪上进行PCR反应。
表2 PCR反应程序
Figure BSA0000281366610000071
取2.0g琼脂糖粉末到100mL的1×电泳缓冲液中，搅拌溶解均匀后放入微波炉中加热至沸腾，而后取出晃荡摇匀，再次放入微波炉中加热至沸腾，重复上述操作2～3次至琼脂糖完全溶解。从微波炉中取出静置在通风橱中，待其冷却至40～50℃时，加入10uLASGelRed核酸染料混匀，倒入插有梳子的水平板中，待其冷却凝固制得凝胶。将凝胶板放入电泳缓冲液中，从左到右依次加入6uL Maker、不同菌落样品的PCR反应产物、阴性对照。设置电压100V开始跑电泳，20-30min后取出凝胶板进行照胶观察，目标条带为1500bp左右的片段，根据目标片段的有无来判断该菌株是否为双歧杆菌。将获得单一明亮条带的PCR产物纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行序列比对，进一步从种水平上面鉴定筛选菌株为具体哪一株双歧杆菌。
4、划线纯化及保藏
把鉴定所得的双歧杆菌菌株在TPY固体培养基上面进行划线纯化，在划线纯化2～3代之后，获得纯化的单克隆菌株，将其接种到10mL TPY液体培养基中进行增菌培养，待其浑浊后，吸取1mL菌液与1mL40％甘油进行混匀，放置于-80℃冰箱中保藏。
实施例4
改良配方运用到不同的培养基上面的筛选效果
1、不同培养基的配制
采取三种基础培养基进行双歧杆菌筛选选择性培养基的配制，来试验在基础培养基里添加改良组份的筛选效果，三种筛选基础培养基如下：①TPY培养基：10g酪蛋白、5g大豆蛋白胨、2g酵母浸粉、5g葡萄糖、1g吐温-80、0.5g L-半胱氨酸，2g磷酸氢二钾，0.5g氯化镁，0.25g硫酸锌，0.15g氯化钙，蒸馏水定容至1L，若用固体培养基则添加1.5％琼脂。②MRS培养基：20g葡萄糖、10g胰蛋白胨、5g酵母浸粉，5g无水乙酸钠，0.1g七水硫酸镁，0.05g一水硫酸镁，2g柠檬酸氢二铵，2.6g磷酸氢二钾，10g牛肉膏，1mL吐温-80，蒸馏水定容至1L，若用固体培养基则添加1.5％琼脂。③BS培养基：68.9g双歧杆菌BS培养基(购自青岛海博生物)，1mL吐温-80，蒸馏水定容至1L，若用固体培养基则添加1.5％琼脂。上述组份均在搅拌均匀后121℃，灭菌20min，待培养基冷却至50℃左右，按量加入实施例1中的抗生素、生物调控因子、显色剂和生长调控因子溶液，摇晃均匀，在超净工作台内将培养基倒入培养皿，静置1h，使培养基完全凝固且散干水分后备用。
2、改良选择性培养基的筛选效果
(1)通过设置改良配方和普通配方的实验对照来进行涂布平板的准备，按照实施例2进行粪便样品中的双歧杆菌筛选实验。待培养皿长出菌落后，观察同一粪便样品的同一稀释度在改良选择性培养基和普通培养基上面的生长效果。
(2)通过形态学观察、革兰氏染色和PCR鉴定，计算出不同筛选平板上面的双歧杆菌阳性率。以培养基为例①，对比试验发现，改良选择性筛选平板能辅助排除掉杂菌的干扰，提高筛选成功率，其双歧杆菌筛选阳性率高达80％左右。而普通筛选平板的双歧杆菌筛选阳性率仅为20％左右。本发明方法对双歧杆菌的分离筛选效果具有显著提升。

Claims (10)

1.一种长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的分离鉴定方法采用的是平板稀释涂布法。
2.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的分离鉴定方法采用的是改良TPY选择性培养基。
3.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的改良TPY配方包括抗生素莫匹罗星和生物调控因子A。
4.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的改良TPY配方包括显色剂X-Gal。
5.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的改良TPY配方包括生长因子生长调控因子B。
6.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的改良TPY培养基配方为酪蛋白10g/L、大豆蛋白胨5g/L、酵母浸粉2g/L、葡萄糖5g/L、吐温-80 1g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、磷酸氢二钾2g/L、氯化镁0.5g/L、硫酸锌0.25g/L、氯化钙0.15g/L、莫匹罗星100mg/L、生物调控因子A 100mg/L、X-Gal 60mg/L、生长调控因子B 1mg/L。
7.如权利要求5所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的改良TPY选择性培养基的配制方法为：
S1：抗生素溶液的配制：将莫匹罗星溶于无菌超纯水，配制成50mg/mL的溶液，将生物调控因子A溶于1M NaOH，配制成50mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用；
S2：显色剂和生长因子溶液的配制：将X-Gal溶于二甲基甲酰胺，配制成20mg/mL的溶液，将生长调控因子B溶于无水乙醇，配制成10mg/mL的溶液，过滤除菌放置4℃冰箱备用(避光保藏)；
S3：L-半胱氨酸的配制：将L-半胱氨酸溶解于蒸馏水，得到20％(W/V)的L-半胱氨酸溶液，过滤除菌备用；
S4：无机盐溶液的配制：将K2HPO4溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的K2HPO4溶液，将MgCL2溶解于蒸馏水，得到50％(W/V)的MgCL2溶液，将ZnSO4溶解于蒸馏水，得到25％(W/V)的ZnSO4溶液，将CaCL2溶解于蒸馏水，得到15％(W/V)的CaCL2溶液，121℃高压蒸汽灭菌20min后备用；
S5：取酪蛋白10g，大豆蛋白胨5g，酵母浸粉2g，葡萄糖5g，吐温-80 1g，琼脂15g，定容于1L蒸馏水中，混合均匀后将其按照每个锥形瓶200mL进行分装，121℃高压蒸汽灭菌20min，待其冷却至55℃左右(摸着有一点烫手)时，随后往锥形瓶添加S1中的莫匹罗星和生物调控因子A溶液各200μL，S2中的X-gal溶液600μL和生长调控因子B溶液200μL，S3中的L-半胱氨酸溶液200μL，S4中的K2HPO4溶液800μL，MgCL2溶液、ZnSO4溶液和CaCL2溶液各200μL，添加之后将锥形瓶轻微摇晃，使之混合均匀，静置一小会待里面气泡消失，然后开始倒平板，得到改良TPY选择性培养基。
8.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的筛选培养基为pH值为6.5。
9.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的筛选培养采用的培养温度为37℃。
10.如权利要求1所述的长寿老人源双歧杆菌分离鉴定的方法，其特征在于，所述的筛选培养采用的混合气体配比为90％N2、5％H2、5％CO2。
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