CN115215926A

CN115215926A - 达巴万星母核及其纯化方法、达巴万星及其合成方法

Info

Publication number: CN115215926A
Application number: CN202210966419.7A
Authority: CN
Inventors: 吴淑英; 陈鑫耀; 张宏宽; 周凌宇; 关永芳
Original assignee: LIVZON GROUP FUZHOU FUXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: LIVZON GROUP FUZHOU FUXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2022-10-21

Abstract

本发明属于医药分析技术领域，特别涉及一种达巴万星母核及其纯化方法、达巴万星及其合成方法，所述达巴万星母核的纯化方法包括如下步骤：S1、将达巴万星母核发酵液碱化，获得含有达巴万星母核的发酵处理液；S2、将所述发酵处理液过HZ806柱，并以乙醇进行梯度洗脱，收集目标峰值的洗脱液并汇总；S3、将汇总的洗脱液进行浓缩、丙酮结晶、过滤、低温烘干，获得达巴万星母核干粉。本发明所提供的达巴万星母核的纯化方法高效获得高纯度的达巴万星母核干粉，纯化步骤简单方便，可有提高纯化效率。

Description

达巴万星母核及其纯化方法、达巴万星及其合成方法

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，特别涉及一种达巴万星母核及其纯化方法、达巴万星及其合成方法。

背景技术

达巴万星母核是由野野村放线菌(Nonomuraeasp.)ATCC39727产生的天然糖肽类抗生素，其主要生物活性物质为A40926，为达巴万星(Dalbavancin)的前体。A40926经过氨基葡萄糖醛酸上的羧基酯化、38位羧基酰胺化、酯水解得到的达巴万星，具有优良的体内抗菌活性和安全性，是理想的第二代糖肽类抗生素。达巴万星母核A40926的结构式如下：

目前达巴万星母核的生产主要依靠生物发酵，而微生物发酵存在成分复杂、目标产物浓度较低、结构复杂、稳定性差等特点。如不对达巴万星母核进行纯化，会造成达巴万星的合成反应时间延长，合成反应收率降低，部分杂质会引入至达巴万星成品，造成达巴万星成品质量降低，因此，为了保障达巴万星合成反应的顺利进行，为了保障达巴万星成品质量，有必要针对达巴万星母核的开发一种便捷、稳定的纯化方法。

中国专利CN107365357B公开了一种糖肽类抗生素达巴万星中间体A40926的纯化制备方法。其纯化产物纯度最高可达到95.13％，回收率最高可达到94.4％。但是其操作过程复杂，需要在上柱解析前进行过滤、在梯度洗脱过程中流动相复杂且需要双重层析，严重增加纯化成本的同时增加药剂管理压力。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种可高效获得高纯度达巴万星母核的纯化方法，以及由该纯化方法所纯化得到的达巴万星母核；

进一步提供可有效缩短反应时间的达巴万星合成方法，以及由该合成方法所合成得到的达巴万星。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：1、达巴万星母核的纯化方法，包括如下步骤：

S1、将达巴万星母核发酵液碱化，获得含有达巴万星母核的发酵处理液；

S2、将所述发酵处理液过HZ806柱，并以乙醇进行梯度洗脱，收集目标峰值的洗脱液并汇总；

S3、将汇总的洗脱液进行浓缩、丙酮结晶、过滤、低温烘干，获得达巴万星母核干粉。

达巴万星母核，由前述纯化方法纯化得到。

达巴万星的合成方法，包括将前述达巴万星母核进行酯化的步骤，所述酯化的步骤包括如下步骤：

S1、将5～10℃正丁醇中加入浓盐酸调节pH为1.0～1.4，获得反应液；

S2、向所述反应液中加入所述达巴万星母核，在5～10℃下搅拌5～10h；

S3、反应结束后加入三乙胺调节pH至4.5～6.0并出现沉淀，过滤并收集沉淀物，在30～40℃下真空干燥，获得达巴万星母核的酯化产物。

达巴万星，由前述合成方法所合成得到。

本发明的有益效果在于：本发明所提供的达巴万星母核的纯化方法所纯化得到的达巴万星母核纯度可达到88％，收率可达到80％。由该纯化获得的达巴万星母核合成达巴万星成品，在酯化过程中可有效缩短反应时间以及提高反应收率，同时可有效减少在各个反应步骤中杂质的生成。

附图说明

图1所示为本发明在检测例1中达巴万星母核发酵处理液的色谱图；

图2所示为本发明在检测例1中实施例1所制备得到的达巴万星母核干粉的色谱图；

图3所示为本发明在检测例2中对比例1所制备得到酯化产物的色谱图；

图4所示为本发明在检测例2中实施例2所制备得到的酯化产物的色谱图；

图5所示为本发明在检测例3中对比例2所制备得到的达巴万星成品溶液的色谱图；

图6所示为本发明在检测例3中实施例3所制备得到的达巴万星成品溶液的色谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

达巴万星母核的纯化方法，包括如下步骤：

其中，对所述达巴万星母核发酵液的碱化是必须的，通过碱化反应可有效促进达巴万星母核(A40926)从发酵菌中释放。在一种实施方式中，所述碱化为利用碱性试剂调节达巴万星母核发酵液至pH为10.5～11.5，优选pH为11，在10～40℃下搅拌1～3h，优选在30℃下搅拌2h，获得含有达巴万星母核的发酵处理液。

当然，在发酵处理液进行过柱前可对其进行过滤，以除去多余的发酵菌组分。

HZ806柱购于常州市华润不饱和树脂有限公司，其为大孔吸附树脂HZ806作为层析柱填料的色谱柱。大孔吸附树脂的孔径和比表面积都比较大，且树脂内部具有三维空间的立体孔结构，具有物理化学稳定性高、选择性好、吸附速度快、解析条件温和、再生处理方便、使用周期长、适用于工业大批量生产等优势。而HZ806树脂作为层析柱填料对达巴万星母核具有很好的针对性，能够较好地契合达巴万星母核的分子大小和结构。因此，装填有HZ806树脂的HZ806柱对达巴万星母核的发酵处理液进行纯化，具有除杂和除色素的双重效果。

而对于丙酮结晶，可进一步提高达巴万星母核干粉的纯度。丙酮结晶可采用现有工艺，比如：将洗脱液进行离心浓缩后，将沉淀物用碱性试剂调节pH至7.0～7.2，加入丙酮进行结晶，室温条件冷却至20℃并结晶至少2h。

在一种实施方式中，所述梯度洗脱为：10％乙醇洗3BV；15％乙醇洗6BV；20％乙醇洗3BV。其中，第一步洗脱主要用于洗去前杂和部分色素，第二步洗脱主要用于洗脱目标产物，第三步洗脱主要用于洗脱后杂和部分色素。分段收集含有目标产物峰值的洗脱液。

优选地，在S2中，流速为1～3BV/h。

其中，所述碱性成分为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。

达巴万星母核，其由前述纯化方法纯化得到。

达巴万星的合成方法，包括前述达巴万星母核进行酯化的步骤，所述酯化的步骤包括如下步骤：

优选地，所述酯化的步骤包括如下步骤：

S1、将5℃正丁醇中加入浓盐酸调节pH为1.2，获得反应液；

S2、向所述反应液中加入所述达巴万星母核，在5℃下搅拌8h；

S3、反应结束后加入三乙胺调节pH至5.5并出现沉淀，过滤并收集沉淀物，在35℃下真空干燥，获得达巴万星母核的酯化产物。

当然，所述合成方法还包括在酯化后的酰胺化步骤和水解步骤等，其为现有技术，如CN202210842449.7和CN109467592B，因此以引用的方式将酰胺化和水解的步骤引入本发明中。而发明人在实验中发现，使用经本发明所提供的纯化方法可有效缩短酯化反应的反应时间，因此本文着重在此，具体参见下文。

达巴万星，由前述合成方法所合成得到。

需要说明，在本文中过滤均采用0.45μm滤膜过滤。

实施例1

达巴万星母核的纯化方法，包括如下步骤：

S1、取达巴万星母核发酵液(800mg/L，纯度72％)中加入氢氧化钠，调节pH至11，在30℃下搅拌2h，获得发酵处理液；

S2、将HZ806树脂进行装柱，柱体积为2L，装柱体积为1.5L，获得HZ806柱。

S3、用70％乙醇对HZ806柱进行预洗除杂，再用10％乙醇进行平衡；

S4、将发酵处理液过平衡后的HZ806柱，以3BV/h的流速按如下洗脱程序依次进行洗脱：

10％乙醇洗3BV；

15％乙醇洗6BV；

20％乙醇洗3BV；

S5、分段收集含有目标产物(达巴万星母核)峰值的溶液，并汇总，获得混合液；

S6、将混合液进行离心浓缩，向沉淀物中加入氨水溶解至形成饱和溶液，并使所述饱和溶液pH至7.0后，向所述饱和溶液中加入所述饱和溶液5倍体积的丙酮，室温条件冷却至20℃后接近2h，过滤后获得结晶产物；

S7、将结晶产物用丙酮洗2次后，将结晶产物在40℃下烘干20h，获得达巴万星母核干粉。

检测例1

将达巴万星母核发酵处理液和实施例1所制备得到的达巴万星母核干粉分别进行高效液相色谱测定，结果分别为图1和图2。其中，图1为达巴万星母核发酵处理液的色谱图，即未进行纯化的色谱图，图2为纯化后的色谱图。从图中可以看出，未纯化的达巴万星母核发酵处理液中可见杂质含量多且杂，而按本发明所提供的纯化方法纯化得到的达巴万星母核干粉可见杂质小且含量小。

实施例2

达巴万星的合成方法，包括如下步骤：

S1、将100mL 5℃正丁醇中加入浓盐酸调节pH为1.2，获得反应液；

S2、向所述反应液中加入实施例1所制备的达巴万星母核干粉10g(5.77mmol)，在5℃下搅拌8h；

S3、反应结束后加入三乙胺调节pH至5.5并出现沉淀，过滤并收集沉淀物，在35℃下真空干燥20h，获得达巴万星母核的酯化产物，酯化产物纯度为79％，收率为70％。

对比例1

达巴万星的合成方法，与实施例2的区别在于：将实施例1所制备的达巴万星母核干粉替换为等摩尔量的达巴万星母核发酵处理液，获得达巴万星母核的酯化产物，酯化产物的纯度为68％，收率为65％。

检测例2

将实施例2和对比例1所制备得到的酯化产物分别进行高效液相色谱分析，结果如图3和图4所示。其中图3对比例1所制备得到的酯化产物的色谱图，图4为实施例2所制备得到的酯化产物的色谱图。从图中可以看出，对比例1所制备得到的酯化产物中杂质含量多且杂，而实施例2所制备得到的酯化产物可见杂质少且含量低。

同时，按面积归一化法计当反应底物＜5％时所需的反应时间，结果显示，实施例2所需反应时间为17h，对比例1所需反应时间为23h。由此可以看出，通过本发明所提供的纯化方法所纯化得到的达巴万星母核，对其进行合成反应，至少在酯化反应阶段可有效缩短反应时间，提高反应收率和降低杂质的生成。

实施例3

达巴万星的合成方法，在实施例2的基础上，还包括如下步骤：

S1、将9.5g(5.28mmol)实施例2所得酯化产物在25℃下溶于150mL DMSO中，并加入3,3-二甲氨基-1-丙胺(0.65g，6.36mmol)和DCC(1.30g，6.35mmol)，在20℃下搅拌反应8小时，加入170mL甲基叔丁基醚沉淀，过滤，在35℃真空干燥20h，获得酰胺化产物；

S2、将所得酰胺化产物(8.70g，4.83mmol)溶于10mL乙腈和水的混合溶液中，在5℃条件下缓慢滴加1mol/L LiOH溶液至pH为10，继续在此温度条件下搅拌反应6小时；然后缓慢滴加1N盐酸溶液调节pH为6，获得达巴万星成品溶液，纯度为84％，杂质3％(按面积归一化法计)，收率为50％。

对比例2

达巴万星的合成方法，与实施例3的区别在于，其酯化产物由对比例1所制备得到，获得达巴万星成品溶液，纯度为62％，杂质19％(按面积归一化法计)，收率为41％。

检测例3

分别将实施例3和对比例2所制备得到的达巴万星成品溶液分别进行高效液相色谱分析，结果如图5和图6所示。其中，图5为对比例2所制备得到的达巴万星成品溶液的色谱图，图6为实施例3所制备得到的达巴万星成品溶液的色谱图。从图中可以看出，按本发明所提供的纯化方法所纯化得到的达巴万星母核干粉，并以此为基础进行合成反应所合成得到的达巴万星成品纯度高、杂质含量低，成品质量易于控制。

综上所述，本发明所提供的达巴万星母核的纯化方法所纯化得到的达巴万星母核纯度可达到88％，收率可达到80％。由该纯化获得的达巴万星母核合成达巴万星成品，在酯化过程中可有效缩短反应时间以及提高反应收率，同时可有效减少在各个反应步骤中杂质的生成。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.达巴万星母核的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱为：

10％乙醇洗3BV；

15％乙醇洗6BV；

20％乙醇洗3BV。

3.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，在S2中，流速为1～3BV/h。

4.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，在所述碱化的过程中，所述达巴万星母核发酵液pH为10.5～11.5。

5.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，所述碱化为向所述达巴万星母核发酵液中加入碱性成分，在10～40℃下，搅拌1～3h。

6.根据权利要求5所述纯化方法，其特征在于，所述碱性成分为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水。

7.达巴万星母核，其特征在于，由权利要求1至6任一项所述纯化方法纯化得到。

8.达巴万星的合成方法，其特征在于，包括将如权利要求7所述达巴万星母核进行酯化的步骤，所述酯化的步骤包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述合成方法，其特征在于，所述酯化的步骤包括如下步骤：

S1、将5℃正丁醇中加入浓盐酸调节pH为1.2，获得反应液；

10.达巴万星，其特征在于，由权利要求8或9所述合成方法所合成得到。