CN115212296A - 蛋白组合物作为肠道病毒71型抑制剂的用途及蛋白组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白组合物在制备功能性产品的用途以及一种蛋白组合物，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；所述蛋白组合物用于抑制受试者中肠道病毒71型的生长；和/或，所述蛋白组合物用于降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险；和/或，所述蛋白组合物用于预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病。所述功能性产品可以为食品、保健品、药物等。本发明采用病毒EV71对乳铁蛋白和骨桥蛋白的抗病毒效果进行体外验证，结果发现乳铁蛋白和骨桥蛋白的抗病毒EV71活性，且其抗病毒EV71效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及蛋白组合物作为肠道病毒71型抑制剂的用途及蛋白组合物。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是单股正链的RNA病毒，属于微小病毒科，肠道病毒属，具有感染性强且致病率高的特点。EV71病毒颗粒为二十面立体对称的球形结构，直径大约在24～30nm，无包膜和突起(Lei You et al.,2020)，因此对于周遭环境的抵抗力很强，对胃酸和乙醇都具有耐受性(M
N et al.,2018)。肠道病毒71型是一种能够引起手足口病和中枢神经系统感染的病毒，主要传播途径是粪-口传播，感染后可导致低热、口痛、呕吐、腹泻等(Chee Wah Tan et al.,2014)，同时由于EV71对于中枢神经系统有极高的感染性，临床症状也包括无菌性脑膜炎、心肌炎、肌肉僵直等(Zhen Luo et al.,2019)。尽管无症状或轻微症状的病人会自然痊愈并产生抗体，但因感染EV71病毒并且转成重症的患者依旧有极高的几率死于心肺衰竭和广泛的脑干伤害(Chee Wah Tan et al.,2014)。
目前临床仍缺乏治疗EV71病毒感染的有效疗法(石斌等.,2021)。尽管我国在2015年批准了首个预防严重手足口病的EV71全病毒灭活疫苗，但对于感染严重疾病的患者，疫苗具有一定的局限性。另外。目前常用于抗EV71治疗的药物有利巴韦林、阿昔洛韦等，但是存在着治疗效果一般、副作用强的缺点(吴芳等.,2020)。
骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种分子量在44～75kDa的磷酸化酸性蛋白，富含天冬氨酸，存在于乳汁、唾液、胆汁、肾脏、大脑等体液和组织中。母乳中的骨桥蛋白能够增强新生儿的认知、肠道和免疫发育。OPN的含量随着泌乳期发展而下降，我国人母乳中OPN的中位含量为266.2毫克/升，所占母乳中总蛋白比例为2.70％，牛奶中OPN的含量较少，为18毫克/升，而以牛乳为原料生产的婴幼儿配方奶中OPN含量仅为9毫克/升。
乳铁蛋白(Bovine lactoferrin，LF)是一种分子量为80kDa的铁结合糖蛋白，由粘膜上皮细胞和中性粒细胞产生，存在于母乳、唾液、眼泪等生物液体中，是母乳中的主要蛋白成分之一，具有广泛的抗癌、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫的活性(Passali D et al.,2021)。人初乳中LF的含量约为5～13克/升，成熟乳中LF的含量为2～3克/升(HansDemmelmair et al.,2017)，牛初乳中LF含量约为0.8克/升；而牛奶只含有0.03-0.49克/升。由于婴儿不具备较强的胃肠道消化能力，并且乳铁蛋白具有一定的抗消化能力，因此其在婴儿的胃肠道中也具有生物活性。
虽然乳铁蛋白和骨桥蛋白能够对人体发挥多种正面功效，但是将乳铁蛋白和骨桥蛋白应用在抑制肠道病毒71型上却鲜有报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供蛋白组合物在制备药物中的用途。
本发明的第二个目的在于提供一种蛋白组合物，所述蛋白组合物用于制备抑制受试者中肠道病毒71型的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备预防和/或治疗由肠道病毒71型引起的疾病的药物。
本发明的第三个目的在于提供蛋白组合物在制备功能性产品中的用途。
本发明的第一个目的采取如下技术方案实现：
蛋白组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制受试者中的肠道病毒71型；和/或，所述蛋白组合物用于降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险；和/或，所述药物用于预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白(Lactoferrin)和/或骨桥蛋白(Osteopontin)；例如，所述蛋白组合物为乳铁蛋白组合物，该组合物中可以仅包含乳铁蛋白而不包含骨桥蛋白；或者，所述蛋白组合物为骨桥蛋白组合物，该组合物中可以仅包含骨桥蛋白而不包含乳铁蛋白；又或者，所述蛋白组合物为由任意配比的乳铁蛋白和骨桥蛋白形成的组合物，例如，在所述蛋白组合物中，乳铁蛋白和骨桥蛋白的重量比为2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4等等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抑制受试者中的肠道病毒71型，包括：抑制肠道病毒71型在宿主细胞上的黏附；阻碍肠道病毒71型对宿主细胞的入侵；抑制肠道病毒71型感染的入胞后过程。在本发明中，所述蛋白组合物可干预病毒EV71在宿主细胞上的吸附(包括特异性吸附/结合、非特异性吸附/结合)、抑制病毒EV71的入胞过程、抑制病毒EV71感染的入胞后过程、抑制病毒复制，包括但不限于上述抑制过程都在本发明的范围内。
在本发明的一个优选实施方式中，所述降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险，包括：手足口病、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹，严重情况下导致的肌炎、肌肉钙化及运动终板异常等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病，包括：手足口病、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹，严重情况下导致的肌炎、肌肉钙化及运动终板异常等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物可以配制成各种适合的药物制剂形式，例如，所述药物为溶液形式药物、悬浮物形式药物、乳浊液形式药物或固态形式药物。其中，固态形式药物包括粉状药物、颗粒状药物、片剂药物等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如稀释剂、粘合剂、赋形剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、润湿剂，和/或吸收剂)等混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等；又或者配制成注射给药的粉针剂、溶液剂等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物为即用型产品，例如组合物可直接口服，或蛋白组合物为粉末状，用水重构粉末状组合物后即用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物适用于经口施用，口服饮用或口服吞食。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述药物为溶液形式药物，所述蛋白组合物在所述溶液形式药物中的浓度大于等于0.02mg/mL，例如，所述蛋白组合物的浓度为0.02～10mg/mL，优选地为0.1～5mg/mL。更加具体地，所述蛋白组合的浓度为0.00030mg/mL、0.00061mg/mL、0.0012mg/mL、0.0024mg/mL、0.0049mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL或10mg/mL。
在本发明的一个优选实施方式中，所述乳铁蛋白为来源于人乳的乳铁蛋白、来源于牛乳的乳铁蛋白、来源于马乳的乳铁蛋白、来源于羊乳的乳铁蛋白和来源于骆驼乳的乳铁蛋白中的一种或任意组合；所述骨桥蛋白为来源于人乳的骨桥蛋白、来源于牛乳的骨桥蛋白、来源于马乳的骨桥蛋白、来源于羊乳的骨桥蛋白和来源于骆驼乳的骨桥蛋白中的一种或任意组合。所述乳铁蛋白和所述骨桥蛋白均优选为牛乳来源蛋白，来源广泛。
在本发明的一个优选实施方式中，所述受试者包括人、非人灵长类动物、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、野生禽类和家禽类。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述受试者为人时，所述蛋白组合物提供3mg～375mg/kg体重/天的乳铁蛋白，在此用量范围内，病毒EV71能够得到较好地抑制。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述受试者为人时，所述组合物提供12mg～375mg/kg体重/天的骨桥蛋白，在此用量范围内，病毒EV71能够得到较好地抑制。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述受试者为人时，所述组合物提供3mg～375mg/kg体重/天乳铁蛋白和12mg～375mg/kg体重/天骨桥蛋白，在此用量范围内，病毒EV71能够得到较好地抑制。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物还包括乳清蛋白(Whey protein)、乳脂球膜(Milk Fat Globule Membrane)、低聚糖、益生元和益生菌中的一种或任意组合。
在本发明的一个优选实施方式中，所述低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose)、3’-岩藻糖基乳糖(3'-Fucosyllactose)、3’-唾液酸乳糖(3'-Sialyllactose)、6’-唾液酸基乳糖(6'-Sialyllactose)、乳糖-N-四糖(Lacto-N-tetraose)、乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose)、低聚果糖(Fructooligosaccharide)、低聚半乳糖(Galactooligosaccharides)中的一种或任意组合；
在本发明的一个优选实施方式中，所述益生元包括：2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’唾液酸基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、低聚果糖和低聚半乳糖中的一种或任意组合。
在本发明的一个优选实施方式中，所述益生菌包括：长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、瑞士乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌乳亚种、副干酪乳酪杆菌和唾液乳杆菌中的一种或任意组合。优选地，所述益生菌包括长双歧杆菌婴儿亚种R0033、两歧双歧杆菌R0071、瑞士乳杆菌R0052、动物双歧杆菌乳亚种Bi07、鼠李糖乳酪杆菌HN001、动物双歧杆菌乳亚种HN019和动物双歧杆菌乳亚种BB12中的一种或任意组合。更加优选地为，所述益生菌为副干酪乳酪杆菌DG和唾液乳杆菌SGL03的组合。采取上述益生菌组合，能够增强所述蛋白组合物的抗肠道病毒71型活性。
本发明的第二个目的采取如下技术方案实现：
一种蛋白组合物，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；所述蛋白组合物用于制备抑制受试者中肠道病毒71型的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备预防和/或治疗由肠道病毒71型引起的疾病的药物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白(Lactoferrin)和/或骨桥蛋白(Osteopontin)；例如，所述蛋白组合物为乳铁蛋白组合物，该组合物中可以仅包含乳铁蛋白而不包含骨桥蛋白；或者，所述蛋白组合物为骨桥蛋白组合物，该组合物中可以仅包含骨桥蛋白而不包含乳铁蛋白；又或者，所述蛋白组合物为由任意配比的乳铁蛋白和骨桥蛋白形成的组合物，例如，在所述蛋白组合物中，乳铁蛋白和骨桥蛋白的重量比为2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4等等。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述药物为溶液形式药物，所述蛋白组合物在所述溶液形式药物中的浓度大于等于0.02mg/mL，例如，所述蛋白组合物的浓度为0.02～10mg/mL，选地为0.1～5mg/mL。更加具体地，所述蛋白组合的浓度为0.00030mg/mL、0.00061mg/mL、0.0012mg/mL、0.0024mg/mL、0.0049mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL或10mg/mL。
在本发明的一个优选实施方式中，当所述受试者为人时，所述蛋白组合物提供3mg～375mg/kg体重/天的乳铁蛋白；或者，所述组合物提供12mg～375mg/kg体重/天的骨桥蛋白；又或者，所述组合物提供3mg～375mg/kg体重/天乳铁蛋白和12mg～375mg/kg体重/天骨桥蛋白。在上述用量范围内，病毒EV71能够得到较好地抑制。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物还包括乳清蛋白(Wheyprotein)、乳脂球膜(Milk Fat Globule Membrane)、低聚糖、益生元和益生菌中的一种或任意组合。
本发明的第三个目的采取如下技术方案实现：
本发明还提供了蛋白组合物在制备功能性产品中的用途，所述功能性产品用于抑制受试者中的肠道病毒71型；和/或，所述功能性产品用于降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险；和/或，所述功能性产品用于预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病。
在本发明的一个优选实施方式中，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；例如，所述蛋白组合物为乳铁蛋白组合物，该组合物中可以仅包含乳铁蛋白而不包含骨桥蛋白；或者，所述蛋白组合物为骨桥蛋白组合物，该组合物中可以仅包含骨桥蛋白而不包含乳铁蛋白；又或者，所述蛋白组合物为由任意配比的乳铁蛋白和骨桥蛋白形成的组合物，例如，在所述蛋白组合物中，乳铁蛋白和骨桥蛋白的重量比为2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4等等。
在本发明的一个优选实施方式中，所述功能性产品为食品或保健品，食品包括但不限于婴幼儿配方奶粉、青少年配方奶粉、中老年配方奶粉、婴幼儿调制乳粉、青少年调制乳粉、中老年人调制乳粉和蛋白粉。保健品包括但不限于营养补充剂。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明提供了蛋白组合物在制备药物中的用途，采用病毒EV71对乳铁蛋白和骨桥蛋白的抗病毒效果进行体外验证，结果发现乳铁蛋白和骨桥蛋白的抗病毒EV71活性，且其抗病毒EV71效果显著。目前蛋白类物质用于抗病毒EV71鲜有报道，本发明为抗病毒EV71开辟了一条新思路，具有非常好的应用价值和前景。
附图说明
图1为本发明实施例1不同条件下细胞形态的对比图；
图2为本发明实施例1乳清蛋白、乳脂球膜、乳铁蛋白和骨桥蛋白对病毒EV71的抑制效果展示图；
图3为本发明实施例1中8种低聚糖对病毒EV71的抑制效果展示图；
图4为本发明实施例1乳铁蛋白和骨桥蛋白组合物(2：1)对病毒EV71的抑制效果展示图；
图5为本发明实施例2中EC50和CC50测定实验中的结果展示图；
图6为实施例3中抗病毒活性成分的蛋白免疫印迹试验验证的结果展示图；
图7为实施例4中抗病毒活性成分的初步抗病毒机制探究(入胞作用、入胞后作用)结果展示图；
图8为实施例4抗病毒活性成分的初步抗病毒机制探究(抑制病毒黏附细胞的作用)结果展示图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所采用的乳清蛋白(Whey protein)、乳脂球膜(Milk Fat GlobuleMembrane)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、骨桥蛋白(Osteopontin)以及2’-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose)、3’-岩藻糖基乳糖(3'-Fucosyllactose)、3’-唾液酸乳糖(3'-Sialyllactose)、6’唾液酸基乳糖(6'-Sialyllactose)、乳糖-N-四糖(Lacto-N-tetraose)、乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose)、低聚果糖(Fructooligosaccharide)、低聚半乳糖(Galactooligosaccharides)均为牛乳来源，上述4种蛋白类物质和8种低聚糖均以粉末的形式存在，且均在-20℃下避光保存，使用时配制成溶液。体外测试所用的细胞为人恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD(CCTCC)(Wuhan,China)，病毒为微小RNA病毒科肠道病毒属A组成员EV71(登陆号：No.JN230523.1)，培养条件为37℃、5％CO2。
实施例1
对上述12种物质进行抗肠道病毒EV71的体外验证
方法1：96孔细胞板中种上2.5×104个RD细胞，24h后用MOI＝0.001的EV71感染RD细胞，同时向其中分别加入终浓度为5mg/ml和2.5mg/ml的乳清蛋白、乳铁蛋白、骨桥蛋白和乳脂球膜和终浓度为10mg/ml和5mg/ml的8种低聚糖，每种成分每个浓度做两个复孔以确保结果的重复性。阴性对照组则只添加与加药组相同MOI的病毒。继续培养约48小时，直至阴性对照组在显微镜下可看出明显的病变。在加药加毒后48h通过显微镜镜下观察细胞病变。进行两次独立的重复实验以确保结果的准确性。用PBS洗涤细胞2次以去除游离的病毒，添加细胞裂解液提取细胞中的RNA，用qRT-PCR测定细胞中的病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况(引物参见表1)。
表1研究中使用的引物序列
| 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列编号 |
| EV71-F | CCCTTTAGTGGTTAGGATTT | SEQ ID NO.1 |
| EV71-R | CACCAGTTGGTTTAATGGAG | SEQ ID NO.2 |
| GAPDH-F | AGCCTCAAGATCATCAGCAATG | SEQ ID NO.3 |
| GAPDH-R | ATGGACTGTGGTCATGAGTCCTT | SEQ ID NO.4 |
结果1：如图1所示，与只加毒不加蛋白的阴性孔(A)相比，乳铁蛋白(C)和骨桥蛋白(D)表现出良好的抗病毒效果。图1B是未经处理的细胞图片，即不加药物也不加毒(EV71)的图，从图1B、1C和1D中可看出，OPN和LF可以抑制细胞病变，甚至达到与未处理组相同即肉眼看几乎没有病变。
实时荧光定量PCR(图2-3)进一步验证显微镜下观察结果，根据细胞内病毒RNA的相对表达量计算抑制率，得到在浓度为5mg/mL或2.5mg/mL时，乳铁蛋白与骨桥蛋白对于抑制RD细胞感染EV71具有明显作用，抑制率分别为LF:99.96％、99.94％和OPN:97.75％、94.24％。乳清蛋白、乳脂球膜也能在一定程度上抑制EV71的表达，在浓度为5mg/mL时抑制率分别为40.36％、23.21％，在浓度为2.5mg/mL时抑制率分别为59.14％、48.70％。
8种低聚糖在RD细胞中对EV71的抑制作用如下，在浓度为10mg/mL时抑制率分别为35.10％(2’-岩藻糖基乳糖)、77.38％(3’-岩藻糖基乳糖)、61.80％(3’-唾液酸乳糖)、42.96％(6’唾液酸基乳糖)、52.42％(乳糖-N-四糖)、55.95％(乳糖-N-新四糖)、67.73％(低聚果糖)、54.06％(低聚半乳糖)。
8种低聚糖在RD细胞中对EV71的抑制作用如下，在浓度为5mg/mL时抑制率分别为20.79％(2’-岩藻糖基乳糖)、56.42％(3’-岩藻糖基乳糖)、69.60％(3’-唾液酸乳糖)、66.20％(6’唾液酸基乳糖)、67.07％(乳糖-N-四糖)、51.10％(乳糖-N-新四糖)、67.71％(低聚果糖)、20.18％(低聚半乳糖)。
另外，如图4所示，质量浓度比为2：1的乳铁蛋白和骨桥蛋白的组合物5mg/mL(乳铁蛋白3.33mg/mL，骨桥蛋白1.67mg/mL)展示出良好的抗EV71感染的效果，抑制率达99.80％。质量浓度比为2：1的乳铁蛋白和骨桥蛋白的组合物2.5mg/mL乳铁蛋白1.67mg/mL，骨桥蛋白0.83mg/mL)也展示出良好的抗EV71感染的效果，抑制率达99.80％。
实施例2
(1)EC50值的测定
EC50是指能够有效抑制50％细胞感染病毒的药物浓度，数值越小说明对病毒的抑制效果越好。具体实验步骤如下：96孔细胞板中种上2.5×104个RD细胞，24h后用MOI＝0.001的EV71感染RD细胞，同时将乳铁蛋白和骨桥蛋白用2％培养基稀释至5mg/mL，随后使用细胞维持培养基二倍稀释药物，乳铁蛋白得到15个浓度(0.00030mg/mL、0.00061mg/mL、0.0012mg/mL、0.0024mg/mL、0.0049mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL)。骨桥蛋白得到10个浓度(0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL)每个浓度接种2孔。阴性对照组只添加病毒。病毒感染过程的步骤与条件与实施例1中相同，37℃继续培养。
在加药加毒后48h通过显微镜镜下观察细胞病变，PBS清洗2次后使用诺贝莱组织/细胞总RNA提取试剂盒(Nobelab，Flying SharkTM Tissue&CellRN A Isolation Kit，产品编号RNE11)对细胞中的RNA进行提取。用qRT-PCR测定细胞中的病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。用Graph Pad-Prism 8软件对qRT-PCR得到的Ct值结果进行数据分析，扣除细胞数目带来的影响，绘制剂量-抑制效应曲线，计算EC50。
(2)CC50的测定
CC50是使得50％的细胞发生病变时的药物浓度，数值越高说明对细胞的毒性越低。本实验使用Cell-Titer-Blue法进行CC50的检测。具体实验步骤如下：药物稀释环节与上述EC50一致，48h后，每个培养孔加入20μL Cell-Titer-Blue试剂，随后立即在BioTekSynergyTM H1多功能微孔板检测仪进行554/593nm荧光强度检测，此后每30min检测一次，共检测五次。条件为：激发波长554nm，发射波长593nm。根据读值计算细胞毒性率，记为C。每次检测完后将细胞置于37℃5％CO2细胞培养箱继续培养，最后一次检测完成后导出数据并使用GraphPad-Prism 8软件进行数据分析，绘制剂量-抑制效应曲线，计算CC50公式如下：
C活性成分＝1-(RFU成分-RFU阳性对照)×100％
根据细胞毒性率，用Graphpad8.0.2计算成分的CC50。
SI是选择性指数，为CC50与EC50的比值，数值越大说明成药的可能性越高。
结果2：根据细胞内病毒mRNA的相对表达量，用Graphpad Prism软件中非线性分析中的log(inhibitor)vs.response公式计算得到乳铁蛋白、骨桥蛋白和乳铁蛋白和骨桥蛋白的2:1组合成分的半数有效浓度EC50及半数细胞毒性CC50(图5)。实验结果显示，在RD细胞上，乳铁蛋白对EV71的EC50＝0.002744mg/mL、CC50>5mg/mL、SI>1822.16，在0.0024mg/mL、0.0049mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL等12个浓度范围内均有抗EV71的效果(54.56％～99.95％)。
在RD细胞上骨桥蛋白对EV71的EC50＝0.08382mg/mL、CC50>5mg/mL、SI>59.65，在0.15mg/mL、0.31mg/mL,0.63mg/mL,1.25mg/mL,2.5mg/mL,5mg/mL等6个浓度范围内均有抗EV71的效果(55.64％～93.86％)。
在RD细胞上乳铁蛋白和骨桥蛋白的2:1组合成分对EV71的EC50＝0.003796mg/mL、CC50>5mg/mL、SI>1317.18，0.0049mg/mL、0.010mg/mL、0.020mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.15mg/mL、0.31mg/mL、0.63mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL等11个浓度范围内均有抗EV71的效果(63.73％～99.80％)。
实施例3
抗病毒活性成分的蛋白免疫印迹试验验证。
将RD细胞接种至48孔细胞培养板，置于37℃培养，待细胞单层生长至细胞密度为70～80％(约1×105细胞/孔)时，PBS清洗待用。MOI＝0.001的EV71感染RD细胞，同时向其中加入终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的骨桥蛋白和1.25mg/ml、0.31mg/ml、0.078mg/ml、0.019mg/ml的乳铁蛋白，每种成分每个浓度做4个复孔以确保结果的重复性，其中一个用qPCR验证成分抗病毒效果。阴性对照组则只添加与加药组相同MOI的病毒。继续培养约48小时，直至阴性对照组在显微镜下可看出明显的病变。用PBS洗涤细胞2次以去除游离的病毒，每孔加200μL的RIPA裂解液，4℃裂解10分钟进行蛋白提取。使用Nanodrop测定蛋白质浓度后再用Loading buffer将蛋白样品稀释到同一浓度，100℃十分钟变性。制样完成后进行Western Blot，具体包括：制胶、SDS-PAGE凝胶电泳、湿转转膜、5％牛奶封闭、一抗及二抗(鼠源1:10000)孵育和最后的ECL化学发光检测，注意使用鼠源EV71外壳蛋白VP1(1:500)及鼠源β-actin蛋白(1:10000)的一抗分别孵育。
结果3：如图6所示，在0.019mg/mL～1.25mg/mL范围内，乳铁蛋白干预的组别中，被感染的细胞内几乎检测不到EV71 VP1的表达。在1.25mg/mL～10mg/mL范围内，骨桥蛋白干预的组别中，被感染的细胞内的EV71 VP1的产生被剂量依赖性地抑制；明显地，在骨桥蛋白浓度为10mg/mL时，细胞内几乎检测不到EV71 VP1的表达；在骨桥蛋白浓度为5mg/mL或2.5mg/mL时，细胞内仅能检测到微量的EV71 VP1的表达。图7中，VP1指代EV71外壳蛋白VP1；β-actin指代内参β-肌动蛋白。
实施例4
活性蛋白物质的初步抗病毒机制的探究
方法1：采用加药时间法初步确定抗病毒活性成分在病毒生命周期的哪个阶段发挥抑制作用。24孔细胞板中种上2.5×105个RD细胞，24h后用MOI＝0.001的EV71毒株感染RD细胞，分别在全感染周期(加病毒时和加病毒孵育2h后)、入胞前(加入病毒时)、入胞后(加病毒孵育2h后)向其中加入活性蛋白物质，在加药加毒后48h通过显微镜镜下观察细胞病变，并提取细胞中的RNA，用qRT-PCR测定细胞中病毒复制情况以及细胞内参基因GAPDH的表达情况。
结果1：如图7所示，对于仅在病毒感染细胞阶段，加入骨桥蛋白(2.5mg/mL)和乳铁蛋白的组别(0.3mg/mL)，细胞内EV71 mRNA的相对表达水平有所降低，表明骨桥蛋白和乳铁蛋白可以抑制病毒的入胞过程。在EV71感染后2小时加入骨桥蛋白(2.5mg/mL)和乳铁蛋白的组别(0.3mg/mL)，细胞和病毒共孵育48小时后，细胞内病毒mRNA的相对表达水平有不同程度的降低，表明骨桥蛋白和乳铁蛋白可抑制病毒感染的入胞后过程。其中乳铁蛋白的抗病毒效果非常显著，在浓度为0.3mg/mL的范围内，乳铁蛋白无论是在病毒入胞时添加还是在感染后2小时添加都能获得大于99％的抑制率。
方法2：采用吸附实验探究抗病毒活性成分是否能够对EV71附着至细胞起到抑制效果。将RD细胞接种到48孔板(1×105细胞/孔)中，待细胞单层生长至细胞密度为70～80％(约1×105细胞/孔)时，PBS清洗待用。
(1)取高浓度的EV71与一定浓度的活性成分乳铁蛋白和骨桥蛋白在4℃下孵育2小时，使活性成分与病毒充分作用。然后，将病毒与活性成分的混合物加至细胞中，在4℃下培养2小时。弃去培养孔中的混合物，用PBS清洗2次贴壁细胞后，收集细胞，进行后续的核酸提取和RT-qPCR分析，测定细胞内病毒mRNA的表达以表征病毒的载量。
(2)取高浓度的EV71与一定浓度的活性成分乳铁蛋白和骨桥蛋白分别混匀后，将病毒与活性成分的混合物加至细胞中在37℃下培养1小时。弃去培养孔中的混合物，用PBS清洗2次贴壁细胞后，收集细胞，进行后续的核酸提取和RT-qPCR分析，测定细胞内病毒mRNA的表达以表征病毒的载量。
结果2：如图8所示，分别对两种活性物质乳铁蛋白和骨桥蛋白进行干预病毒吸附细胞和内化细胞实验，结果重复两次以确保其可信度。结果显示，这两种成分，在5mg/mL和2.5mg/mL的浓度下，均能够有效降低EV71对细胞的附着，抑制病毒感染。
本发明实施例提供了蛋白组合物在制备药物中的用途，乳铁蛋白和骨桥蛋白具有抗病毒EV71活性，且其抗病毒EV71效果显著。目前蛋白类物质用于抗病毒EV71鲜有报道，本发明为抗病毒EV71开辟了一条新思路，具有非常好的应用价值和前景。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 合生元（广州）健康产品有限公司
<120> 蛋白组合物作为肠道病毒71型抑制剂的用途及蛋白组合物
<130> 2022
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctttagtg gttaggattt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caccagttgg tttaatggag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcctcaaga tcatcagcaa tg 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atggactgtg gtcatgagtc ctt 23
Claims (13)
1.蛋白组合物在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于抑制受试者中的肠道病毒71型；和/或，所述蛋白组合物用于降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险；和/或，所述药物用于预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；优选地，所述蛋白组合物包含骨桥蛋白；更加优选地，所述蛋白组合物为由任意配比的乳铁蛋白和骨桥蛋白形成的组合物，例如所述蛋白组合物中乳铁蛋白和骨桥蛋白的重量比为2:1。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制受试者中的肠道病毒71型，包括：抑制肠道病毒71型在宿主细胞上的黏附；阻碍肠道病毒71型对宿主细胞的入侵；抑制肠道病毒71型感染的入胞后过程。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险，包括：手足口病、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、肌炎、肌肉钙化及运动终板异常；
所述预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病，包括：手足口病、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、肌炎、肌肉钙化及运动终板异常。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为溶液形式药物、悬浮物形式药物、乳浊液形式药物或固态形式药物。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物为溶液形式药物，所述蛋白组合物在所述溶液形式药物中的浓度大于等于0.02mg/mL，优选地为0.02～10mg/mL，更加优选地为0.1～5mg/mL。
7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述乳铁蛋白为来源于人乳的乳铁蛋白、来源于牛乳的乳铁蛋白、来源于马乳的乳铁蛋白、来源于羊乳的乳铁蛋白和来源于骆驼乳的乳铁蛋白中的一种或任意组合；所述骨桥蛋白为来源于人乳的骨桥蛋白、来源于牛乳的骨桥蛋白、来源于马乳的骨桥蛋白、来源于羊乳的骨桥蛋白和来源于骆驼乳的骨桥蛋白中的一种或任意组合；
所述受试者包括人、非人灵长类动物、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、野生禽类和家禽类。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，当所述受试者为人时，所述蛋白组合物提供3mg～375mg/kg体重/天的乳铁蛋白；
或者，所述组合物提供12mg～375mg/kg体重/天的骨桥蛋白；
又或者，所述组合物提供3mg～375mg/kg体重/天乳铁蛋白和12mg～375mg/kg体重/天骨桥蛋白。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包括乳清蛋白、乳脂球膜、低聚糖、益生元和益生菌中的一种或任意组合；
所述低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’唾液酸基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、低聚果糖和低聚半乳糖中的一种或任意组合；
所述益生元包括：2’-岩藻糖基乳糖、3’-岩藻糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、6’唾液酸基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、低聚果糖和低聚半乳糖中的一种或任意组合；
所述益生菌包括：长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、瑞士乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳酪杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、动物双歧杆菌乳亚种、副干酪乳酪杆菌和唾液乳杆菌中的一种或任意组合。
10.一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；所述蛋白组合物用于制备抑制受试者中肠道病毒71型的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险的药物；和/或，所述蛋白组合物用于制备预防和/或治疗由肠道病毒71型引起的疾病的药物。
11.蛋白组合物在制备功能性产品中的用途，其特征在于，所述功能性产品用于抑制受试者中的肠道病毒71型；和/或，所述功能性产品用于降低由肠道病毒71型引起的疾病感染风险；和/或，所述功能性产品用于预防和/或治疗受试者中由肠道病毒71型引起的疾病。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述蛋白组合物包括乳铁蛋白和/或骨桥蛋白；优选地，所述蛋白组合物包含骨桥蛋白；更加优选地，所述蛋白组合物为由任意配比的乳铁蛋白和骨桥蛋白形成的组合物，例如所述蛋白组合物中乳铁蛋白和骨桥蛋白的重量比为2:1。
13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述功能性产品为食品或保健品，优选为配方奶粉、调制乳粉、蛋白粉或营养补充剂。
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