CN115211555A - 一种紫苏蛋白-多酚共价复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫苏蛋白‑多酚共价复合物及其制备方法和应用，属于食品加工技术领域，本发明以紫苏蛋白为基底物，植物多酚为外源添加物经过相互作用生成五种不同的紫苏蛋白‑多酚共价复合物；发明通过多酚对紫苏蛋白进行改性处理，并将改性产物应用于功能因子β‑胡萝卜素的稳态传递；本发明制备的紫苏蛋白‑多酚共价复合物的抗氧化活性、乳化活性和乳化稳定性均显著提高，且本发明制备的紫苏蛋白‑多酚共价复合物作为乳化剂制备的β‑胡萝卜素乳液储存能力和β‑胡萝卜素保留率显著强于紫苏蛋白作乳化剂的β‑胡萝卜素乳液，可用于功能性乳化产品等，在稳定功能因子的运载体材料方面有着广泛的发展前景。

Description

一种紫苏蛋白-多酚共价复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体是一种紫苏蛋白-多酚共价复合物及其制备方法和应用。
背景技术
β-胡萝卜素作为一种功能因子是维生素A的前体，是一种天然的抗氧化剂和色素也是一类食品强化剂，并且β-胡萝卜素可以转化为维生素A用于夜盲症等维生素A缺乏症。这些特殊的功能性质使得β-胡萝卜素常被用于食品加工中，但其稳定性较差，对环境因子如pH、光、热、金属离子等耐受力差，有些还具有水溶性差等问题，导致其生物利用率低，有效人体摄入量低，这都限制了β-胡萝卜素的应用。为解决此问题，目前最常见的方法便是将β-胡萝卜素包埋在稳定的水包油乳液中进行运输传递以防止其自身氧化和提高吸收率。
目前蛋白质乳液体系在食品中具有广泛的应用，同时也可作为β-胡萝卜素等食品功能因子的载体，可提高其水溶性、稳定性和生物利用率等。但是由于蛋白质的表面亲水性较差而不能稳定存在并发生聚集，而且单一蛋白颗粒的抗氧化性较弱，冻干后溶解性、乳化性和再分散性都较差，不利于构建乳液体系。
多酚可根据其碳架结构的不同分为酚酸类、类黄酮类、单宁酸类等，其中酚酸类是一类苯环上具有功能性羧基基团的分子，而类黄酮类则是基于苯并吡喃这一基本骨架而衍生出的一类化合物。植物多酚是一种植物中大量存在的次级代谢产物，大量研究表明其具有较好的抗氧化性能，以及明显的抗炎、抑菌、抗衰老、强化血管壁等保健医疗功效。将多酚类物质引入到蛋白质分子上，对蛋白进行改性研究，使得其相互作用产物兼具蛋白质的乳化性和多酚的抗氧化性，可以作为稳态运输食品功能因子的抗氧化性载体材料，因此本发明提出了一种紫苏蛋白-多酚共价复合物及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫苏蛋白-多酚共价复合物及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，是由蛋白溶液、多酚溶液等比例混合均匀，接触空气连续搅拌得到紫苏蛋白-多酚复合物溶液，然后进行透析，最后进行干燥进行的；
所述蛋白溶液是由紫苏蛋白溶解于水中调节pH，搅拌过夜直至蛋白全部溶解制备得到的；
所述多酚溶液是由植物多酚溶解于水中调节pH搅拌直至完全溶解制备得到的。
作为本发明进一步的方案：所述蛋白溶液中紫苏蛋白的浓度为10-30mg/mL，初始溶液pH调节至8-10并在搅拌过夜后重新调节pH至8-10。
作为本发明进一步的方案：所述蛋白溶液中紫苏蛋白的浓度为20mg/mL，初始溶液pH调节至9并在搅拌过夜后重新调节pH至9。
作为本发明进一步的方案：所述多酚溶液中植物多酚的浓度为0.1-0.5％(w/v)，且多酚溶液pH调节至8-10。
作为本发明进一步的方案：所述多酚溶液中植物多酚的浓度为0.5％(w/v)，且多酚溶液pH调节至9。
作为本发明进一步的方案：所述植物多酚为：没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芹菜素和木犀草素。
作为本发明进一步的方案：所述透析时间为36-72h，并每隔5-7h换水一次。
作为本发明进一步的方案：所述干燥采用的方法为冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥中的一种。
作为本发明进一步的方案：所述干燥采用的方法为冷冻干燥。
上述紫苏蛋白-多酚共价复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、制备蛋白溶液：将紫苏蛋白溶解于水中，调节pH，搅拌过夜直至蛋白全部溶解；
S2、制备多酚溶液：将植物多酚溶解于水中，调节pH，搅拌直至完全溶解；
S3、将S1和S2所得蛋白溶液和多酚溶液等比例混合均匀，接触空气连续搅拌24h，得紫苏蛋白-多酚复合物溶液；
S4、将S3搅拌溶解所得样品混合溶液在透析袋中透析；
S5、将透析后的样品混合溶液进行干燥得到样品粉末。
上述紫苏蛋白-多酚共价复合物作为乳化剂在制备β-胡萝卜素乳液中的应用，所述应用方法如下：
将β-胡萝卜素用MCT油进行溶解并作为油相，将紫苏蛋白和五种不同的紫苏蛋白-多酚共价复合物用磷酸盐缓冲液溶解，以此为水相；
按照水相：油相＝(3：1)-(5：1)的体积比混合，混合均匀后在高速分散机下分散均质；
再将一次均质后的乳液于超声波细胞粉碎机中进行二次均质，制备好的β-胡萝卜素乳液快速转移到棕色避光瓶中，冲入氮气并避光保存。
作为本发明进一步的方案：所述的油相中β-胡萝卜素浓度为8-12％wt(w/v)；水相中的紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物的浓度为1-5％wt(w/v)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过多酚对紫苏蛋白进行改性处理，并将改性产物应用于功能因子β-胡萝卜素的稳态传递，不仅加强对紫苏蛋白的开发和利用也为其在食品和工业应用方面做出一些探索，并进一步为植物蛋白用于稳态传递系统的构建奠定基础，提高利用价值；本发明制备的紫苏蛋白-多酚共价复合物与未经修饰的紫苏蛋白进行比较，其抗氧化活性、乳化活性和乳化稳定性均显著提高；本发明制备所得紫苏蛋白-多酚共价复合物同未经修饰的紫苏蛋白用作制备β-胡萝卜素乳液其贮存效果相较之下更强。
附图说明
图1为紫苏蛋白与紫苏蛋白-多酚共价复合物的荧光光谱图。
图2为紫苏蛋白与紫苏蛋白-多酚共价复合物的傅里叶红外光谱图。
图3为紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂制备β-胡萝卜素乳液的粒径分布图。
图4为37℃储存条件下，紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂所制备β-胡萝卜素乳液中β-胡萝卜素保留率随时间的变化图。
图5为55℃储存条件下，紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂所制备β-胡萝卜素乳液中β-胡萝卜素保留率随时间变化图。
图6为光照条件下，紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂所制备β-胡萝卜素乳液中β-胡萝卜素保留率随时间变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
本发明所使用的碱法诱导蛋白-多酚相互作用方法利用碱性条件下多酚类物质的酚羟基易被氧化成醌类物质，而醌类物质又可与蛋白质氨基酸残基进行反应也可进一步发生氧化继而与蛋白质发生反应。且本方法无任何有害物质添加，并且过程绿色环保也不会有任何副产物产生而造成浪费。以紫苏蛋白-多酚共价复合物作为乳化剂制备的β-胡萝卜素乳液具有较高的抗氧化性和稳定性，同时提高了生物利用率，可以进一步应用于食品工业、生物医疗和卫生保健等方面。
实施例1
称取1g紫苏蛋白溶解于50mL去离子水中，用0.5moL/L的NaOH溶液调节溶液pH值至9，充分搅拌使其溶解，置于4℃过夜；以0.1％wt(w/v)配制多酚溶液并同样使用0.5moL/L的NaOH溶液将此溶液和过夜的紫苏蛋白溶液pH调节为9；以1：1的体积比混合两种溶液并且接触空气连续搅拌24h以达到充分水合；将充分水合反应后的溶液进行48h透析，期间每隔6h换一次水以保证未反应的游离多酚被完全除去，后将溶液进行冷冻干燥，最终得到五种紫苏蛋白-多酚共价复合物。
采用荧光分光光度计对紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物进行荧光光谱的测定，结果如图1所示。由图1可知，由于紫苏蛋白含有色氨酸和酪氨酸等发色基团，在经过与多酚相互作用后生成的不同紫苏蛋白-多酚共价复合物与紫苏蛋白相比荧光强度发生显著降低。说明紫苏蛋白-多酚共价复合物与紫苏蛋白相比其三级结构发生了变化。
实施例2
称取实施例1中的紫苏蛋白和五种紫苏蛋白-多酚共价复合物固体与溴化钾混合均匀研磨成片，用傅里叶红外光谱仪(赛默飞Nicolet iN10)在400-4000cm-1范围内记录光谱，分辨率为4cm-1。对光谱图进行傅里叶去卷积和用Peakfit进行高斯函数拟合之后分析各二级结构含量，结果如图2和表1所示。
表1紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物二级结构含量
Figure BDA0003742740150000051
由表1结合图2可知红外光谱显示紫苏蛋白-多酚共价复合物较紫苏蛋白其酰胺I带吸收峰出现了偏移，说明多酚与蛋白质的羧基和C-O键发生反应。且由高斯函数拟合所计算得紫苏蛋白-多酚共价复合物的各二级结构含量与紫苏蛋白相比均发生了变化，说明紫苏蛋白-多酚共价复合物二级结构发生了明显变化也证明了蛋白与多酚之间的共价反应。
实施例3：
取实施例1中制备而得的紫苏蛋白和五种紫苏蛋白-多酚共价复合物，以10mM(pH＝7.0)的磷酸盐缓冲液配制成0.5mg/mL的蛋白溶液；取4mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)于无水乙醇中定容至100ml，棕色瓶中暗处待用，实验时以母液：无水乙醇＝3：2配置成吸光度值为0.7±0.02的工作液。取300μL样品溶液加入到2.7mL配制好的DPPH工作液中,室温下避光处理30min，之后检测其在517nm处吸光值。比较样品清除自由基的能力与VC清除自由基的能力，以VC当量表示样品清除自由基的能力。所用公式如下所示：
Figure BDA0003742740150000061
测定结果如表2所示。
实施例4：
称取实例1所得五种紫苏蛋白-多酚共价复合物以及紫苏蛋白并以10mM的磷酸缓冲液(pH＝7.0)为溶剂配制成0.1mg/mL的样品溶液。分别配制7mM ABTS溶液和2.45mM过硫酸钾溶液并将两者等体积混合,暗反应12-16h以产生丰富ABTS自由基。实验时将混合溶液用70％乙醇溶液稀释至734nm处吸光度值为0.7±0.02，取300μl各配制好的样品溶液加入到4.7mL配制好的ABTS溶液中,室温下避光处理60min，之后检测其在734nm处吸光值。比较样品清除自由基的能力与VC清除自由基的能力，以VC当量表示样品清除自由基的能力，测定结果如表2所示。
实施例5：
将0.3M醋酸缓冲液、10mM TPTZ溶液和20mM FeCl3溶液以10:1:1的比例进行混合配制得FRAR工作液。取实施例3所制备相同浓度蛋白样品300μL样品溶液加入到4.7mL配制好的FRAR溶液中,混合均匀，37℃水浴反应30min，反应结束检测其在593nm处吸光值。以此作VC标准曲线比较样品铁还原能力与VC铁还原能力，以VC当量表示样品铁还原能力，测定结果如表2所示。
表2紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物抗氧化活性的比较
Figure BDA0003742740150000062
Figure BDA0003742740150000071
由表2可知，各紫苏蛋白-多酚共价复合物的DPPH清除能力、ABTS清除能力以及还原能力都显著强于未经处理的紫苏蛋白。
实施例6：
配制含10％wt(w/v)β-胡萝卜素的MCT油,40℃超声波处理20min彻底溶解后作为油相，准确称量蛋白样品以pH＝7.0 10mM磷酸盐缓冲液为溶剂溶解，配制为0.2％wt(w/v)样品溶液。各样品溶液加入纳他霉素0.02％wt(w/v)以防微生物生长，为保溶解彻底将各溶液冰箱内储存过夜，得到水相。取各样品溶液8mL分别加入2mL含β-胡萝卜素的MCT油，混合均匀后在高速分散机下分散均质(13600rmp)，每一次1min共三次，期间使用冰水浴进行冷却以防温度过高破坏乳化程度。再将一次均质后的乳液于超声波细胞粉碎机中进行二次均质，设置参数超声输出功率480W，每运行2s间隔3s共5min。制备好的β-胡萝卜素乳液快速转移到棕色避光瓶中，冲入氮气并避光保存。
将各含β-胡萝卜素的乳液用pH＝7.0的10mM磷酸盐缓冲液稀释100倍后，用马尔文zs90(nm，zeta)设置参数油相折射率：1.45和水相折射率：1.33，测定乳液的液滴尺寸和ζ电位。测定结果如图3和表3所示。
表3紫苏蛋白、紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂所制备乳液的平均粒径、PdI和ζ电位
Figure BDA0003742740150000072
Figure BDA0003742740150000081
由表3可知，不同紫苏蛋白-多酚共价复合物与紫苏蛋白相比PdI值显著减小，并且除紫苏蛋白-PCA共价复合物外其他复合物PdI值均小于0.2，则可证明由紫苏蛋白-多酚共价复合物作乳化剂所制备的乳液具有较强的稳定性；并且相较之下紫苏蛋白-多酚共价复合物的ζ电位绝对值也由未相互作用改性前的13.33±1.69mV分别增加到了30.10±0.74、30.4±0.86、30.47±0.83、30.33±0.69和31.87±0.45mV，此时的ζ电位绝对值已经远大于20mV，说明紫苏蛋白-多酚共价复合物能够有效的防止由于油滴分散体系中的静电排斥而造成的聚集。而由图3可知平均粒径在多酚物质加入改性后粒径有所增大，可能是由于在反应过程中蛋白溶度过高导致蛋白质与蛋白质之间进行交联吸附层加厚使得粒径变大，界面张力降低，有效提供空间位阻进一步阻止油滴聚集。
实施例7
将实施例6中以紫苏蛋白和五种紫苏蛋白-多酚共价复合物分别为乳化剂所制备的β-胡萝卜素乳液用pH＝7.0的10mM磷酸盐缓冲液稀释4倍之后，放入棕色避光瓶充入保护气体氮气并且旋紧螺旋盖。将样品置于温度为37℃和55℃的环境中避光处理，期间每隔2d测乳液β-胡萝卜素含量一次，以此衡量乳液的热稳定性。以无水乙醇：正己烷＝2：3配制萃取液，并将萃取液和乳液体积比为1:1进行萃取，重复萃取三次后合并上层萃取液。并将合并滤液用紫外分光光度计测其在450nm处的吸光度值，测定结果如图4和图5所示。
实施例8
将实施例6中的乳液同实施例7相同方式稀释5倍后，置于透明样品内并冲入氮气作为保护气体之后旋紧瓶盖。之后将样品放置于45℃培养箱内用30μW/的紫外灯照射，并且每隔2h以实施例7中相同方法进行萃取测定β-胡萝卜素含量，并以β-胡萝卜素保留率(％)来表示乳液对于紫外光的稳定情况。
由图4、5和图6可知，β-胡萝卜素在单独的紫苏蛋白作为乳化剂所制备的乳液中比在其他乳液中降解速度更快，而结合之前的抗氧化活性结果表明，多酚在乳液中起到了一定抗氧化作用，减缓了β-胡萝卜素的分解。而不同的多酚抗氧化能力不同从而出现了减缓降解的程度不同。

Claims (10)

1.一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，是由蛋白溶液、多酚溶液等比例混合均匀，接触空气连续搅拌得到紫苏蛋白-多酚复合物溶液，然后进行透析，最后进行干燥进行的；
所述蛋白溶液是由紫苏蛋白溶解于水中调节pH，搅拌过夜直至蛋白全部溶解制备得到的；
所述多酚溶液是由植物多酚溶解于水中调节pH搅拌直至完全溶解制备得到的。
2.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述蛋白溶液中紫苏蛋白的浓度为10-30mg/mL，初始溶液pH调节至8-10并在搅拌过夜后重新调节pH至8-10。
3.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述多酚溶液中植物多酚的浓度为0.1-0.5％(w/v)，且多酚溶液pH调节至8-10。
4.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述多酚溶液中植物多酚的浓度为0.5％(w/v)，且多酚溶液pH调节至9。
5.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述植物多酚为：没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、芹菜素和木犀草素。
6.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述透析时间为36-72h，并每隔5-7h换水一次。
7.根据权利要求1所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物，其特征在于，所述干燥采用的方法为冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥中的一种。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备蛋白溶液：将紫苏蛋白溶解于水中，调节pH，搅拌过夜直至蛋白全部溶解；
S2、制备多酚溶液：将植物多酚溶解于水中，调节pH，搅拌直至完全溶解；
S3、将S1和S2所得蛋白溶液和多酚溶液等比例混合均匀，接触空气连续搅拌24h，得紫苏蛋白-多酚复合物溶液；
S4、将S3搅拌溶解所得样品混合溶液在透析袋中透析；
S5、将透析后的样品混合溶液进行干燥得到样品粉末。
9.一种根据权利要求1-7所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物作为乳化剂在制备β-胡萝卜素乳液中的应用，其特征在于，所述应用方法如下：
将β-胡萝卜素用MCT油进行溶解并作为油相，将紫苏蛋白和五种不同的紫苏蛋白-多酚共价复合物用磷酸盐缓冲液溶解，以此为水相；
按照水相：油相＝(3：1)-(5：1)的体积比混合，混合均匀后在高速分散机下分散均质；
再将一次均质后的乳液于超声波细胞粉碎机中进行二次均质，制备好的β-胡萝卜素乳液快速转移到棕色避光瓶中，冲入氮气并避光保存。
10.根据权利要求9所述的一种紫苏蛋白-多酚共价复合物作为乳化剂在制备β-胡萝卜素乳液中的应用，其特征在于，所述的油相中β-胡萝卜素浓度为8-12％wt(w/v)；水相中的紫苏蛋白和紫苏蛋白-多酚共价复合物的浓度为1-5％wt(w/v)。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115624169A (zh) * 2022-10-28 2023-01-20 陕西师范大学 一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法
CN115969041A (zh) * 2022-12-05 2023-04-18 四川大学 一种多酚基纳米颗粒改性营养物质的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115624169A (zh) * 2022-10-28 2023-01-20 陕西师范大学 一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法
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