CN115624169A

CN115624169A - 一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法

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Publication number: CN115624169A
Application number: CN202211340480.7A
Authority: CN
Inventors: 刘永峰; 葛鑫禹; 郝长春; 卢浩楠
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-01-20

Abstract

本发明公开了一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，通过分子对接模拟儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和茶黄素与牛肌球蛋白重链间的相互作用，发现儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素与牛肌球蛋白重链之间通过氢键和范德华力进行结合。在分子对接基础上，将儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和茶黄素与肌原纤维蛋白混合制备肌原纤维蛋白复合凝胶。在羟自由基存在下，肌原纤维蛋白复合凝胶表现出低羰基含量和高巯基含量，能够有效提高肌原纤维蛋白稳定性。本发明对维持肌原纤维蛋白稳定性具有积极作用，同时高稳定性的肌原纤维蛋白在食品加工中具有广阔应用前景。

Description

一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体涉及一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法。

背景技术

肌肉蛋白是肌肉中的主要成分，约占肌肉质量的15％～22％。肌原纤维蛋白是肌肉蛋白中的重要成分，约占总蛋白的55％～60％，主要包括肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白等。肌原纤维蛋白是由排列成束状的细丝蛋白构成，通常利用离子强度0.5以上的高浓度盐溶液提取，提取的肌原纤维蛋白可溶于低离子强度的盐溶液中。在食品工业上，肌原纤维蛋白可应用于淀粉制备中，以改变淀粉的质构特性和保水性；肌原纤维蛋白还可以作为活性物质的递送载体，提高活性物质的溶解度和生物利用率，但肌原纤维蛋白的功能特性受到pH、温度、离子强度和离子类型等因素影响，使其在加工过程中容易降解和发生变性。蛋白质稳定性被破坏则会导致其功能特性丧失、食品难以达到预期要求等问题，因此提高肌原纤维蛋白稳定性对于肌原纤维蛋白在食品加工中的应用至关重要。

分子对接技术是利用生物信息学对受体与配体的相互作用模式进行预测，对小分子的位置和二面角进行优化，获得受体与配体相互作用的最佳构象。随着食品研究的不断深入，近年来分子对接技术也常用于食品作用机制、加工贮藏与毒素检测等内容研究。通过对蛋白质(受体)与小分子物质(配体)进行分子对接，可以预测二者之间的结合能、结合位点及作用力，其中结合能为负值表明小分子物质与蛋白质能够自发结合，结合能越低，表明小分子物质与蛋白质结合效果越好。因此，利用分子对接技术探究活性小分子物质与肌原纤维蛋白的相互作用，掌握其相互作用机理，更好地使活性小分子物质提高蛋白质稳定性方面发挥积极作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，该方法利用分子对接技术能够准确、快速筛选出活性分子，制备出稳定性更高的肌原纤维蛋白。

针对上述目的，本发明采用的技术方案由下述步骤组成：

(1)构建蛋白质结构：采用与牛肌球蛋白重链氨基酸序列相似性和评分最高的蛋白质6YSY为模板，构建牛肌球蛋白重链模型；

(2)开展分子对接：将步骤(1)中的牛肌球蛋白重链模型与小分子物质的结构模型进行分子对接，选择最稳定的对接方式；

(3)确定活性分子：对步骤(2)中最稳定的对接方式进行Protein Contacts分析，根据结合能初步判断各小分子物质与牛肌球蛋白重链间的相互作用，获得能与牛肌球蛋白重链自发结合的活性分子，所述活性分子为儿茶素(C)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、茶黄素(TF)中任意一种；

(4)提取肉中的肌原纤维蛋白；

(5)制备肌原纤维蛋白复合凝胶：将提取的肌原纤维蛋白用蛋白稀释缓冲液稀释后，再加入步骤(3)获得的活性分子，涡旋30～60s，得到肌原纤维蛋白复合凝胶，置于4℃下保存。

上述步骤(4)中，所述的肉为牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鱼肉等中任意一种。

上述步骤(5)中，优选所述蛋白稀释缓冲液中肌原纤维蛋白的加入量为5～10mg/mL。

上述步骤(5)中，优选所述活性分子的加入量为10～50μmol/g肌原纤维蛋白。

上述步骤(5)中，所述蛋白稀释缓冲液含0.5～0.6mol/L NaCl、0.05～0.1mol/LNa₂HPO₄/NaH₂PO₄的pH值为6.0～6.3的磷酸盐缓冲液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用分子对接技术，对小分子物质与牛肌球蛋白重链进行分子对接模拟，筛选出能与牛肌球蛋白重链自发结合且结构稳定的活性分子，该方法具有缩短试验周期，减小工作量和降低成本的优势。

2、针对肌原纤维蛋白稳定性低等问题，可以依据本发明方法筛选活性分子，制备高稳定性肌原纤维蛋白。

3、本发明能够提高肌原纤维蛋白稳定性，在稳定肉制品油/水系统及改善肉制品品质等方面发挥重要作用。

4、本发明操作简单、功能性强、应用前景广泛，对于肌原纤维蛋白在食品加工中的应用具有重要意义。

附图说明

图1是牛肌球蛋白重链结构模型。

图2是3种活性分子与牛肌球蛋白重链分子对接结果，其中A、B、C分别为C、ECG、TF，A1～C1代表对接模式图，A2～C2代表模式图局部放大，A3～C3代表相互作用2D图。

图3是3种活性分子对肌原纤维蛋白羰基含量影响测定结果。

图4是3种活性分子对肌原纤维蛋白总巯基和游离巯基含量影响测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、构建蛋白质结构

牛肌球蛋白重链模型如图1所示。

根据牛肌球蛋白重链氨基酸序列，从SWISS-MODEL上搜索到6YSY序列与目标蛋白序列具有较高的相似性且评分最高，其中序列一致性(Identity)为93.65％，全局模型质量评估分数(GMQE)为0.35，满足同源建模要求，以6YSY为模板构建牛肌球蛋白重链模型。

2、开展分子对接

通过AutoDock 4.2软件分别对牛肌球蛋白重链同源建模模型与小分子物质进行分子对接。经过d-watering、添加氢原子、修正不规则氨基酸和调整电荷等几个步骤，将牛肌球蛋白重链和小分子物质转换为自动对接兼容系统文件，其中蛋白质被认为是受体，对接位点被认为是使用遗传算法将各小分子物质与蛋白质的活性结合位点。对接完成后，利用PyMol选择最稳定的对接方式，进一步观察牛肌球蛋白重链和小分子物质结合位点周围的氨基酸环境。

3、确定活性分子

对步骤2中最稳定的对接方式进行Protein Contacts分析，根据小分子物质与牛肌球蛋白重链的结合能及结合方式，初步判断各小分子物质与牛肌球蛋白重链间的相互作用，获得能与牛肌球蛋白重链自发结合的活性分子，从而获得可用于提高肌原纤维蛋白稳定性的活性分子为儿茶素(C)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、茶黄素(TF)。牛肌球蛋白重链和这3种活性分子的分子对接情况如表1所示，3种活性分子与肌球蛋白重链的最佳模式的结合能值从大到小为C、ECG、TF，其结合能分别为-6.32、-5.08和-4.60kcal/mol。3种活性分子中，C与牛肌球蛋白重链的结合能最强，ECG与牛肌球蛋白之间的范德华力最强，3种活性分子均与牛肌球蛋白重链氢键结合。3种活性分子和蛋白质之间的静电力均较弱，这表明3种活性分子和牛肌球蛋白重链之间的主要相互作用力是范德华力和氢键。

表1 3种活性成分与肌球蛋白重链分子对接情况

3种活性分子与蛋白质的结合位点不同，除TF外，其他活性分子都嵌入到蛋白质的疏水空腔中。在分子对接构象放大图(图2)中显示了在

的距离上，3种活性分子与肌球蛋白重链结合位点的氨基酸环境。C与肌球蛋白重链结合位点的氨基酸残基为LEU270和THR484，同时预测到C与肌球蛋白重链复合物中存在2个氢键；ECG与肌球蛋白重链结合位点的氨基酸残基为ARG148，并预测表ECG与肌球蛋白重链之间存在2个氢键；TF与肌球蛋白重链之间存在4个氢键，其结合位点的氨基酸残基主要为ASN29、LYS30、PHE32和ALA34。

4、提取牛肉中的肌原纤维蛋白

称取10g牛肉，切碎，加入40mL分离缓冲液(0.1mol/L KCl、2mmol/L MgCl₂、1mmol/L EGTA、0.05mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，缓冲液pH为7.0)，以10000r/min匀浆60s，除去结缔组织，以6000r/min冷冻离心15min，弃去上清液，将所得沉淀重复上述步骤两次。向最后一次沉淀中加入40mL 0.1mol/L NaCl水溶液，以10000r/min匀浆30s，6000r/min冷冻离心15min，重复上述步骤两次，最后通过4层纱布过滤，收集滤液，并用0.1mol/L HCl水溶液将滤液pH调节至6.25，6000r/min冷冻离心15min，得到的沉淀即为肌原纤维蛋白。以上操作均在4℃下进行。

5、制备肌原纤维蛋白复合凝胶

用蛋白稀释缓冲液将肌原纤维蛋白稀释至浓度为5mg/mL，分别加入C、ECG和TF，使各组活性分子浓度达到30μmol/g肌原纤维蛋白，涡旋30s，得到3种肌原纤维蛋白复合凝胶，置于4℃下保存。所述蛋白稀释缓冲液为含0.6mol/L NaCl、0.05mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄的pH值为6.25的磷酸盐缓冲液。

对所得肌原纤维蛋白复合凝胶的各项指标进行测定，具体测定方法和测定结果如下：

1、测定方法

(1)羟自由基破坏处理

在肌原纤维蛋白复合凝胶中加入反应溶液(终浓度为10μmol/L FeCl₃、100μmol/L抗坏血酸、1mmol/L H₂O₂)，在4℃下反应12h，用终浓度为1mmol/L Trolox作为终止剂，最终体系肌原纤维蛋白浓度为20mg/mL。以添加Trolox的肌原纤维蛋白溶液作为未破坏对照组(MP组)，添加反应溶液和Trolox的肌原纤维蛋白溶液作为破坏对照组(MPO组)。

(2)羰基含量测定

分别吸取0.1mL样品各2份，一份加入0.5mL 2mol/L HCl水溶液作为对照组，另一份加入0.5mL 0.02mol/L DNPH水溶液作为测定组，混合均匀后在37℃下避光反应15min，然后加入0.5mL体积浓度为20％的三氯乙酸水溶液，混合均匀后置于离心机中10000r/min离心5min，弃去上清液，沉淀用乙酸乙酯和乙醇混合溶液(v/v＝1:1)洗涤3次，最后沉淀用1mL6mol/L盐酸胍水溶液溶解，37℃水浴15min后，加入4mL超纯水，370nm处测吸光度。样品羰基含量计算公式如下：

(3)巯基含量测定

总巯基含量测定方法为：吸取0.5mL样品，加入2.5mL Tris-甘氨酸缓冲溶液(0.086mol/L Tris、0.09mol/L甘氨酸、4mmol/L EDTA、8mol/L尿素，pH 8.0)，振荡10s，加入20μL Ellman试剂，37℃水浴15min，10000r/min离心10min，412nm处测吸光度。

游离巯基含量测定方法为：吸取0.5mL样品，加入2.5mL Tris-甘氨酸缓冲溶液(不含尿素)，其余步骤同上，计算公式如下：

2、测定结果

羰基含量测定结果如图3所示，MPO组的羰基含量显著高于MP组(P<0.05)，表明牛肉肌原纤维蛋白受到羟基自由基攻击而产生羰基积累。与MPO组相比，3种活性分子组的羰基含量均显著降低，其中添加C组的羰基含量最低，较MPO组降低了53.88％(P<0.05)。可见，3种活性分子均可以抑制羰基形成，其中C的抑制作用最强。

由图4可知，MPO组的总巯基含量显著低于MP组，较MP组降低了16.50％(P<0.05)。在肌原纤维蛋白中添加C可以显著抑制总巯基含量的降低，其总巯基含量分别达到46.99nmol/mg，显著高于MPO组(P<0.05)；ECG-MP组的总巯基含量与MPO组之间无显著差异(P>0.05)，TF-MP组的总巯基含量显著低于MPO组(P<0.05)。此外，MPO组的游离巯基含量也显著低于MP组(P<0.05)，添加了C和ECG的肌原纤维蛋白其游离巯基含量显著高于MPO组(P<0.05)；而TF-MP组的游离巯基含量显著低于MPO组(P<0.05)，这可能是由于TF与蛋白质巯基基团反应形成了蛋白质交联，此外，巯基-醌加合物的形成也是巯基含量减少的重要原因。C在抑制肌原纤维蛋白巯基含量减少上表现出显著优势，这一点证实了分子对接模拟中C与肌球蛋白间以氢键和范德华力结合，并表现出最强的结合能力，从而发挥优异提高蛋白质稳定性的作用。

Claims

1.一种提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建蛋白质结构

采用与牛肌球蛋白重链氨基酸序列相似性和评分最高的蛋白质6YSY为模板，构建牛肌球蛋白重链模型；

(2)开展分子对接

将步骤(1)中的牛肌球蛋白重链模型与小分子物质的结构模型进行分子对接，选择最稳定的对接方式；

(3)确定活性分子

对步骤(2)中最稳定的对接方式进行Protein Contacts分析，根据结合能初步判断各小分子物质与牛肌球蛋白重链间的相互作用，获得能与牛肌球蛋白重链自发结合的活性分子，所述活性分子为儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、茶黄素中任意一种；

(4)提取肉中的肌原纤维蛋白；

(5)制备肌原纤维蛋白复合凝胶

将提取的肌原纤维蛋白用蛋白稀释缓冲液稀释后，再加入步骤(3)获得的活性分子，涡旋30～60s，得到肌原纤维蛋白复合凝胶，置于4℃下保存。

2.根据权利要求1所述的提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的肉为牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鱼肉中任意一种。

3.根据权利要求1所述的提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述蛋白稀释缓冲液中肌原纤维蛋白的加入量为5～10mg/mL。

4.根据权利要求1或3所述的提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述活性分子的加入量为10～50μmol/g肌原纤维蛋白。

5.根据权利要求1或3所述的提高肌原纤维蛋白稳定性的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述蛋白稀释缓冲液含0.5～0.6mol/L NaCl、0.05～0.1mol/L Na₂HPO₄/NaH₂PO₄的pH值为6.0～6.3的磷酸盐缓冲液。