CN115210569A - 用于定量测定样品中降钙素原的诊断试剂 - Google Patents

Abstract

本文提供一种诊断试剂，其适用于用简单的光度计进行比浊分析并且对样品中降钙素原的定量测定具有高灵敏度，其中，该试剂是聚合物颗粒的水性悬浮液，其中，降钙素原抗体与所述聚合物颗粒共价结合，其中，即使在较长的放置时间后也没有或仅检测到极轻微的凝集/沉降趋势，并且颗粒的比反应性基本上保持不变，为此，本发明提出悬浮聚合物颗粒的平均粒径为150‑450nm，悬浮液包含一定比例的糖或糖醇，其以25‑250g/l的范围溶解在其中，并且悬浮液的pH为8‑10。

Description

用于定量测定样品中降钙素原的诊断试剂

本发明涉及一种用于定量测定样品中降钙素原的诊断试剂，其中，该试剂是聚合物颗粒的水性悬浮液，抗降钙素原抗体与所述聚合物颗粒共价结合。本发明还涉及制备这种诊断试剂的方法。

降钙素原(PCT)是激素降钙素的前体，也是诊断败血症最重要的标志物之一。PCT是标准使用的，特别是用于败血症的术后控制。其原因是，在手术后特别是细菌感染的情况下，肝脏和脂肪细胞会产生更多的PCT。然而，在日常临床常规中，PCT不仅用于术后，还通常作为初步诊断和鉴别病毒、细菌、真菌和原生动物/寄生虫所引起的败血症的辅助措施，之后用于后续控制，即检查所用药物的有效性。

败血症有几个与诊断相关的范围。低于0.5ng/ml不太可能发生败血症。高于0.5-2ng/ml可能发生炎症。败血症的存在必须通过对PCT以及必要时其他参数的重复的时间延迟测定来解析。高于2-10ng/ml可能存在败血症与细菌的结合。高于10ng/ml时，存在严重的败血性休克。该分类用于表征败血症以及从所述表征中得出的措施。这对于时间因素尤其重要。

败血症未被诊断出来或诊断延迟的每一小时在统计上都会使死亡率增加7％。出于这个原因，败血症是世界所有地区的第三大死亡原因。考虑到这一点，必须对败血症的诊断提出极高的灵敏度和重现性要求。即使经过长时间的储存，用于诊断的试剂也必须提供可靠的结果。

现有技术中已知多种基于免疫测定的诊断方法，其可以用于定量测定患者血液中的PCT。PCT抗体与聚合物颗粒结合后与待测样品中所含的PCT反应，之后即可进行分析。

CLIA法(化学发光免疫测定)需要使用化学发光试剂组分，因此可以根据发生的化学发光进行分析。为此，需要一种特殊的装置，其中，通常必须不断地重新悬浮颗粒。

PETIA法(颗粒增强比浊免疫测定法)中，基于通过反应流体的光透射率的降低进行比浊分析。样品中的PCT越多，被抗体占据的颗粒之间发生的交联越强，这导致液体的浊度更大，从而导致透射率降低。因此，不需要额外的化学发光试剂，并且可以使用几乎每个诊断实验室都配备的简单光度计系统进行测定。

对于比浊分析的准确性和诊断相关性，与PCT反应而发生的浊度程度始终与样品中PCT的定量可靠相关是绝对关键的。例如，如果载有抗体的颗粒自发/非特异性凝集或沉降，或者如果它们针对PCT的特异性抗原结合能力在制备后随时间变化，则情况就不是如此了。

因此，需要一种诊断试剂，其适用于用简单的光度计进行比浊分析并且对于样品中的降钙素原的定量测定具有高灵敏度，其中，该试剂是聚合物颗粒的水性悬浮液，其中，降钙素原抗体与所述聚合物颗粒共价结合，其中，即使在较长的放置时间后也没有或仅检测到极轻微的凝集/沉降趋势，并且颗粒的比反应性基本上保持不变。

根据本发明，该目的通过以下方式实现

～悬浮聚合物颗粒的平均粒径范围为150-450nm，

～悬浮液包含一定比例的糖或糖醇，其以25-250g/l的范围溶解在其中，以及

～悬浮液的pH为8-10。

本发明提出的特征组合提供了一种用于PCT定量测定的诊断试剂，其在样品中极低PCT浓度的相关范围内具有非常高的灵敏度。此外，即使在长达24个月的长期储存期间，这种高灵敏度也能保持。鉴于本发明使用的聚合物颗粒具有150nm及更大的相对大的粒径，这种高储存稳定性特别值得注意。

聚合物颗粒的大粒径是特别需要的，特别是在诊断试剂所需的高灵敏度方面。相对较大的颗粒具有相应较大的表面积，因此其可以共价结合相应较大数量的PCT抗体。因此，PCT分子有更多潜在的偶联位点，从而提高了诊断试剂的灵敏度。

大粒径在光散射特性方面也是有利的。已经发现，本发明的聚合物颗粒的“光产率”明显更好。在相同程度的交联下，本发明的颗粒基本上重新放大了信号。颗粒越大，信号越强。基本原理是对悬浮液中胶体纳米颗粒的作用，例如瑞利散射、米氏散射等。

尽管颗粒尺寸大，但是本发明却令人惊讶地能够实现比预期更好的储存稳定性。较大的颗粒通常具有更大的沉降趋势，因此在较长的储存期后更难重新悬浮。但是，本发明提出的溶解在悬浮液中的糖或糖醇与悬浮液中设定的pH的组合令人惊讶地使得本发明的相对较大的悬浮液颗粒也可以获得具有一致反应性的高度储存稳定的悬浮液。

此处要求保护的诊断试剂用于样品中PCT的定量测定。在本发明的上下文中，“样品”应理解为为了分析目的而制备的任何含有待分析量的PCT的材料。在大多数情况下，样品将可能是为了进行分析而适当制备的新鲜全血样品。然而，本发明还包括其他含有PCT的液体样品，例如标准溶液和校准物。

本发明的诊断试剂适用于PCT定量测定。本文中的“定量测定”是指可以从与聚合物颗粒结合的PCT分子的量推断样品中PCT的量。

在本发明的试剂中，聚合物颗粒存在于水性悬浮液中。在本文中，术语“水性悬浮液”是指负载有抗降钙素原抗体的聚合物颗粒在水中或溶解有糖、糖醇和/或缓冲物质的水溶液中的浆料。在本发明的上下文中，术语“悬浮液”必须被狭义地解释并且意味着几乎所有的颗粒都悬浮在水相中并且没有沉降。因此，当至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％的聚合物颗粒自由悬浮时，存在本发明意义上的悬浮液。

根据本发明，聚合物颗粒的平均粒径为150-450nm。在要求保护的范围内的某些实施方式中，平均粒径优选为>190nm、>240nm或甚至>300nm。在要求保护的范围内的其他实施方式中，平均粒径优选<410nm、<360nm或甚至<300nm。在本发明的情况下，聚合物颗粒的粒径通过25℃下的动态光散射测定，例如使用Malvern’s Zetasizer Pro。平均粒径是指数量平均值。

构成聚合物颗粒的聚合物材料优选选自丙烯酸聚合物、葡聚糖-表氯醇共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、二氧化硅(硅胶)及其组合。在某些实施方式中，聚合物颗粒完全由一种聚合物材料或其混合物组成。在其他实施方式中，颗粒由多层不同聚合物组成。

在具体实施方式中，颗粒可以包含芯和涂覆在该芯上的一层或多层。芯和涂覆在其上的一层或多层可以由一种聚合物材料、不同的聚合物材料或非聚合物材料组成，只要聚合物颗粒主要由聚合物材料组成即可。

当颗粒由至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％或100重量％的聚合物材料或不同聚合物材料的组合组成时，存在本发明意义上的聚合物颗粒。

聚合物颗粒的总密度优选为0.9-1.1g/cm³，特别优选为1.0±0.5g/cm³。

在表面上，聚合物颗粒优选包含官能团，抗体可以通过其与聚合物颗粒的表面发生共价结合。这些官能团优选选自羧基(-COOH)、伯胺基(-RNH₂)、芳香胺基(-ArNH₂)、氯甲基(-CH₂Cl)、芳香氯甲基(-ArCH₂Cl)、酰胺基(-CONH₂)、酰肼基(-CONHNH₂)、醛基(-CHO)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、环氧基和生物素-抗生物素蛋白。

本发明的诊断试剂悬浮液的水性部分含有溶解的糖或糖醇部分，其浓度范围为25-250g/l。在某些实施方式中，糖和/或糖醇的浓度范围为50-200g/l。在一些实施方式中，浓度为50-150g/l，而在其他实施方式中，浓度为150-250g/l。

在某些实施方式中，溶解在悬浮液的水性部分中的糖或糖醇选自蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、棉子糖、鼠李糖及其组合。当使用糖/糖醇的组合时，上述量是指该组合中糖/糖醇的比例之和。

其中悬浮有负载抗体的聚合物颗粒悬浮的水性悬浮液的pH为8-10。在一些实施方式中，pH为9.0-10.0。在某些实施方式中，悬浮液的pH＞9。在一些实施方式中，悬浮液的pH为9.1-10.0。在某些实施方式中，悬浮液的pH为9.0±0.5。在特定实施方式中，悬浮液的pH为9.5±0.1。

本发明要求保护的诊断试剂的特征在于非常高的储存稳定性。这例如表现为，悬浮液的浊度与初始值相比即使在几个月后也是稳定的。本发明的悬浮液的具体特征在于，在制备悬浮液后90、120、150甚至180天内，悬浮液在660nm处的吸光度与第零天的初始值的偏差小于5％。在某些实施方式中，偏差甚至在12个月内或甚至在24个月内仍小于5％。在某些实施方式中，偏差甚至小于3％或甚至小于2％。在本发明的某些实施方式中，上述时间段内浊度的轻微偏差也可以在340-800nm范围内的其他波长处测得。

在本发明的一个具体实施方式中，与聚合物颗粒共价结合的抗体是PCT单克隆抗体。在其他实施方式中，抗体是PCT多克隆抗体。在本发明的其他实施方式中，聚合物颗粒负载有共价结合的PCT重组抗体或共价结合的PCT抗体片段。

本发明还要求保护制备上述类型的诊断试剂的方法。在该方法中，首先使聚合物颗粒与PCT抗体接触，这发生在抗体与聚合物颗粒表面发生共价结合的条件下。抗体在聚合物颗粒上的负载在水性悬浮液中特定的时间和特定的温度和特定的pH下发生。

本发明的方法的特征在于，抗体通过聚合物颗粒表面上的官能团在pH3-6下发生共价结合。在某些实施方式中，在pH3-5下发生共价结合。在某些实施方式中，通过聚合物颗粒表面上的官能团共价结合抗体的反应中的pH为4.0±0.5。

优选使用诸如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、乙酸/乙酸盐等无机或有机缓冲物质来设定通过聚合物颗粒表面上的官能团共价结合抗体的反应中的pH。优选使用盐酸/氢氧化钠溶液设定/调节pH。

在本发明的方法的某些实施方式中，通过聚合物颗粒表面上的官能团共价结合抗体发生在20-29℃的温度范围内。在其他实施方式中，该反应发生在30-34℃，或甚至在35-45℃。

在本发明的方法的某些实施方式中，抗体的共价结合在上述限定的pH范围之一和在上述限定的温度范围之一内在20-80小时的时间段内发生。在某些实施方式中，反应发生在>30、>40、>50或甚至>60小时的时间段内。

在上述指定的时间段结束时，将现在负载有抗体的聚合物颗粒的悬浮液的pH降低到8-10。为此，可以添加一种或多种上述碱化剂或缓冲物质。

悬浮液中的pH优选使用包含胺基的缓冲物质设定，例如EPPS、HEPPS、tricine、tris、甘氨酰甘氨酸、bicine、TAPS、硼酸、乙醇胺、CHES、甘氨酸和CAPS。优选使用盐酸/氢氧化钠溶液设定/调节pH。

如前文所述，使用本发明的方法获得的负载有抗体或抗体片段的聚合物颗粒表现出极高的灵敏度和极高的储存稳定性。

出于原始公开的目的，应该注意的是，如从本说明书、附图和权利要求书中向本领域技术人员所揭示的，所有特征即使仅仅结合特定的其他特征进行了描述，也可以与这里公开的其他特征或特征组合以单独的或任何组合的方式进行组合，除非这被明确排除或者技术条件使得这种组合不可能或毫无意义。仅仅为了描述的简洁性和易读性，这里省略了对所有可能的特征组合的全面、明确的介绍。

还应当注意，对于本领域技术人员来说显而易见的是，以下实施方式的示例仅旨在说明本发明的可能实施方式的示例。因此，本领域技术人员将容易地理解，具有权利要求中所述的根据本发明的特征或特征组合的所有其他实施方式也落入本发明的保护范围内。仅仅为了描述的简洁性和易读性，这里省略了对所有可能的实施方式的全面、明确的介绍。

附图

图1：孵育时间对灵敏度影响的检验结果

图2：pH对灵敏度影响的检验结果

图3：储存稳定性的检验结果

图4：储存稳定性的检验结果

图5：粒径对测量精度影响的检验结果

图6：粒径对灵敏度和线性影响的检验结果

图7：糖浓度对校准影响的检验结果

图8：蔗糖和pH的不同组合对灵敏度影响的检验结果

图9：蔗糖和pH的不同组合对灵敏度影响的检验结果

图10：蔗糖和pH的不同组合对灵敏度影响的检验结果

图11：孵育时间对灵敏度影响的检验结果

图12pH8.1下的反应性稳定性的检验结果

图13pH9.0下的反应性稳定性的检测结果

图14pH9.5下的反应性稳定性的检验结果

图15长期稳定性的检验结果

图16长期稳定性的检验结果

实施方式的示例

下面给出各种对比测试，其中对本发明的诊断试剂的制备方法的不同参数进行了改变。为此目的，聚苯乙烯的聚合物颗粒在不同条件下负载PCT抗体。

在一个实施方式变体中，聚合物颗粒包含羧基(-COOH)作为官能团，而在另一个实施方式变体中，聚合物颗粒包含氯甲基(-CH₂Cl)作为官能团。

I.具有氯甲基的实施方式变体

1.孵育时间

使用的聚合物颗粒具有>350nm的平均粒径。颗粒在15-48小时内与抗体偶联，不同批次的结果如图1所示。

这些结果以660nm处的吸光度表示，孵育时间为48小时的批次的相对高的吸光度值表明，孵育时间较长的批次在样品中PCT的各自浓度下提供显著更高的灵敏度，因为样品中所含PCT的结合比例明显高于其他批次。因此可以以更准确的定量方式确定样品中所含的PCT量。

2.pH

在这些实验中，偶联反应过程中的pH在4-9的范围内变化。

图2显示的结果表明，较低的pH值下实现了更好的负载效率。通过这种方式，获得了对PCT具有更高结合能力并因此具有更高灵敏度的聚合物颗粒。

3.储存稳定性

为了检查本发明的诊断试剂的悬浮稳定性，将聚合物颗粒的水性悬浮液与教学样品(生理盐水溶液)混合，然后测定所得混合物的浊度。将如此使用的聚合物颗粒在不同的pH条件下储存长达120天。

图3和图4所示的结果表明，当聚合物颗粒在pH9.0下储存时，浊度明显低于在pH8.1下储存的样品，特别是对于储存60天或更长时间的样品而言。这清楚地表明，在pH9下储存的批次中，凝集和沉降的趋势显著降低。

如图12至14所示，在较高pH范围内，即在pH9.0(参见图13)至pH9.5(参见图14)范围内，反应性的稳定性优于在较低范围内(参见图12：pH8.1)。在本文中研究的60天期间，在pH>9的范围内可以观察到特别高的反应性稳定性(参见图14：pH9.5)。

图15和16展示了pH9.0的储存缓冲液的实施方式的长达24个月的高长期稳定性。校准物反应性检查结果中12个月时曲线的小幅跳跃可以通过12个月后更换检测器上的灯来解释。

II.不同粒径的实施方式变体

为了研究粒径的影响，将包含氯甲基且平均粒径>350nm的聚合物颗粒与包含氯甲基且平均粒径<300nm的聚合物颗粒进行比较。

图5表明，特别是在0.2-2ng/mL的浓度范围内(两个医学相关的降钙素原决策范围位于其中)，平均粒径大于350nm的聚合物颗粒的反应性显著大于平均粒径<300nm的聚合物颗粒。这显著提高了测量精度。

平均粒径＞350nm的聚合物颗粒的回收率(浓度精度)也优于平均粒径＜300nm的聚合物颗粒(参见下表1)。

表1

图6显示了灵敏度的测定(在截止时作为精度测定)和稀释样品的回收率线性的结果。

对于平均粒径<300nm的聚合物颗粒，线性测定仅可能达到目标值35ng/mL。更高的浓度无法区分。

平均粒径>350nm的聚合物颗粒的线性回收率高达65ng/mL。因此，较大颗粒的相关系数也高于较小颗粒的相关系数。

在医学相关临界值(0.5ng/mLPCT)下，较大颗粒的样品回收率和精度也明显优于较小颗粒(见下表2)。

表2

III.不同糖浓度的实施方式变体

为了研究不同糖浓度的影响，在具有不同糖浓度的储存缓冲液中分析包含氯甲基且平均粒径>350nm的聚合物颗粒。

图7显示储存缓冲液中50g/L与75g/L与125g/L蔗糖的比较产生了相似的校准曲线。但是，蔗糖浓度越高，精度(作为含有0.5ng/mLPCT的样品的20倍测定的CV％测定)变得显著更好(CV％更低)(见下表3)。

表3

图8、9和10显示了蔗糖+pH的组合效应数据。氯甲基颗粒重新悬浮在蔗糖125g/L和pH8.1/8.5和9.0的三种储存缓冲液中。不同测定天数的试剂空白值线性回归线的斜率对应于颗粒的聚集，其应尽可能接近0(Excel页“组合效应suc-pH”)。

IV.羧基的实施方式变体

使用的聚合物颗粒具有<310nm的平均粒径。颗粒在12-24小时内与抗体偶联，偶联反应的pH为4-6。

如图11所示的结果表明，使用包含羧基的聚合物颗粒可以获得良好的反应性。但是，相比之下，包含氯甲基的聚合物颗粒表现出明显更强的反应性。

包含羧基的聚合物颗粒也必须在偶联反应之前被活化(EDC+NHS)，以使COOH基团具有反应性。这种活化很复杂，并不总是呈现出可重现和批次均匀的方式。在该情况下，五次尝试中只有一次活化实际上是成功的。相比之下，包含氯甲基基团的聚合物颗粒能非常可靠地偶联(这里数据来自三个批次)。

Claims (11)

1.一种用于定量测定样品中降钙素原的诊断试剂，其中，该试剂是聚合物颗粒的水性悬浮液，抗降钙素原抗体与所述聚合物颗粒共价结合，其特征在于

-悬浮聚合物颗粒的平均粒径范围为150-450nm，

-悬浮液包含一定比例的糖或糖醇，其以25-250g/l的范围溶解在其中，以及

-悬浮液的pH为8-10。

2.如权利要求1所述的诊断试剂，其特征在于，聚合物颗粒的聚合物选自丙烯酸聚合物、葡聚糖-表氯醇共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和二氧化硅。

3.如权利要求1和2中任一项所述的诊断试剂，其特征在于，抗体的共价键通过位于聚合物颗粒表面的官能团形成，其中，官能团选自羧基(-COOH)、伯胺基(-RNH₂)、芳香胺基(-ArNH₂)、氯甲基(-CH₂Cl)、芳香氯甲基(-ArCH₂Cl)、酰胺基(-CONH₂)、酰肼基(-CONHNH₂)、醛基(-CHO)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、环氧基和生物素-抗生物素蛋白。

4.如权利要求1-3中任一项所述的诊断试剂，其特征在于，糖或糖醇选自蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、棉子糖、鼠李糖及其组合。

5.如权利要求1-4中任一项所述的诊断试剂，其特征在于，悬浮液在制备悬浮液后90、120、150或180天或甚至12个月或24个月内在660nm处的吸光度与第0天的初始值偏差小于5％、小于3％或甚至小于2％。

6.如权利要求1-5中任一项所述的诊断试剂，其特征在于，与聚合物颗粒共价结合的降钙素原抗体为单克隆、多克隆或重组抗体或抗体片段。

7.如权利要求1-6中任一项所述的诊断试剂，其特征在于，悬浮液的pH为9.0-10.0。

8.制备权利要求1-7中任一项所述的诊断试剂的方法，其特征在于，抗体通过聚合物颗粒表面上的官能团在pH3-6下发生共价结合。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，抗体通过聚合物颗粒表面上的官能团在20-29℃、30-34℃或35-45℃的范围内的温度下发生共价结合。

10.如权利要求8和9中任一项所述的方法，其特征在于，抗体在限定的pH范围和限定的温度下在20-80小时的时间段内发生共价结合。

11.一种用于定量测定样品中降钙素原的诊断试剂，其特征在于，其可以使用如权利要求8-10中任一项所述的方法获得。

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