CN115210360A - 源自母乳的新型罗伊氏乳杆菌lm1071菌株,以及包含所述菌株或其培养物的用于缓解经前期综合征的组合物 - Google Patents
源自母乳的新型罗伊氏乳杆菌lm1071菌株,以及包含所述菌株或其培养物的用于缓解经前期综合征的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P),以及包含其的用于缓解月经痛的组合物。根据本申请的一个体现例的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P),其通过降低血液中NO、前列腺素E2以及白三烯,增加前列腺素E1/前列腺素E2的产生比以及环氧二十碳三烯酸(EET),可以缓解经前期综合征,且上述菌株可应用于食品组合物、健康功能食品组合物、药物组合物等。
Description
技术领域
本申请涉及源自母乳的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P),以及包含其的用于缓解经前期综合征的组合物。
背景技术
经前期综合征(premenspengel syndrome,PMS)是将月经前反复发生的情绪性、行为性、身体性症状作为特征的一系列症状群,伴随着月经痛等各种身体症状和情绪波动、抑郁感、焦虑、攻击性等心理变化等。这些症状在排卵后逐渐加重,并在月经前一周最为严重,然后在月经开始后几天内消失。
在具有代表性身体症状的特征中,月经痛作为一种可孕女性在到达闭经期为止,每个人每月都会定期经历的普通妇科症状,是女性生理周期中非常常见的症状。
根据将韩国女性作为对象的研究结果,显示77~94%呼诉月经痛。显示出,其中47%的人每月都忍受月经痛,53.2%的人忍受严重的月经痛,46%的生产职业女性表示因月经痛活动受到限制。国外的情况,显示月经痛的患病率高达60~93%,42%的人忍受着严重的月经痛。女学生中有10~50%的人表示,因为月经痛,学校生活等日常活动受到制约,工业领域的情况,推算因月经痛造成的损害的结果,称每年有6亿小时的工作损失和20亿美元的生产性损失。
因此,对与月经痛相关因素的变化或机制的研究结果,可以作为开发成经前期综合征相关食品素材、健康功能食品素材和医药品等的充分的证据资料。
作为通过催乳素(prolactin)的变化来缓解经前期综合征而开发的组合物的例子,有包含从麦芽提取物中分离的化合物作为有效成分的用于改善经前期综合征症状的组合物(韩国授权专利第10-2187335)等。然而,关于缓解经前期综合征,仍需要对表现出优异效果的组合物进行深入开发以及多样的研究。
因此,本发明人为了开发能够缓解经前期综合征的优异的组合物,为此而努力的结果,开发了降低NO、前列腺素E2(prostaglandin E2)以及白三烯(leukotriene),并增加血液中前列腺素E1/前列腺素E2的产生比以及环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacid,EET)的新型菌株,由此完成了本发明。
发明内容
发明所要解决的问题
本申请的目的在于,提供新型源自母乳的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LM1071(KCCM12650P)菌株,以及包含所述菌株的用于缓解经前期综合征的组合物。
但是,本申请要解决的问题不限于上述问题,本领域技术人员通过以下描述将清楚地理解其他未提及的问题。
用于解决问题的方案
本申请的第一方面,提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P)。
本申请的第二方面,提供一种用于缓解月经痛的食品组合物,其包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P)、上述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。
本申请的第三方面,提供一种用于预防或治疗经前期综合征的药物组合物,其包含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P)、上述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。
发明效果
根据本申请的一个实施例的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株(KCCM12650P),通过降低血液中NO、前列腺素E2以及白三烯,增加前列腺素E1/前列腺素E2的产生比以及环氧二十碳三烯酸(EET),可以缓解经前期综合征,且上述菌株可应用于食品组合物、健康功能食品组合物、药物组合物等。
附图说明
图1是示出在巨噬细胞中,根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的NO(一氧化氮)分泌量的变化的图。
图2是示出在巨噬细胞中,根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的PGE2分泌量变化的图。
图3是示出在巨噬细胞中,根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的PGE1分泌量变化的图。
图4是示出在巨噬细胞中,根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的PGE1/PGE2比例的变化的图。
图5是示出根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的LTB4分泌量变化的图。
图6是示出根据罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的EET分泌量变化的图。
具体实施方式
以下,将参照附图对本申请的实施例进行详细说明,以便本领域技术人员能够容易地实施。但本申请可以以多种不同的形式实现,并且不限于本文描述的实施例。另外,为了在附图中清楚地描述本申请,省略了与描述无关的部分,并且贯穿本申请说明书,对于类似的部分使用了类似的附图标记。
贯穿本申请说明书,当称一个构件位于另一个构件“上”时,其不仅包括一个构件与另一个构件接触的情况,还包括另一个构件存在于两个构件之间的情况。
贯穿本申请说明书,当称一个部分“包括”一个组成要素时,除非另有说明,其意味着还可以包括其他组成要素,而不是排除其他组成要素。如贯穿本申请说明书所使用的术语“大约”、“实质上”等在呈现所述含义中固有的制造和材料公差时以等于或接近该数值的意义所使用,并且用于防止不道德的侵权者不当使用为了帮助理解本申请而描述的精确或绝对数值的公开内容。如贯穿本说明书所使用的,表示程度的术语“~(的)步骤”或“~的步骤”并不意味着“为~的步骤”。
贯穿本申请说明书,包括在马库什形式的表达中的术语“它们的组合(们)”是指一种选自根据马库什形式表达的组成要素构成的组中的一个以上的混合或组合,其意味着包括选自上述组成要素构成的组中的一个以上。
贯穿本申请说明书,描述“A和/或B”是指“A或B,或A和B”。
以下,将参照附图对本申请的体现例以及实施例进行详细说明。然而,本申请可以不限于这些体现例、实施例以及附图。
本申请的第一方面,提供一种罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)。
在本申请的一个体现例中,上述菌株可以是降低血液中的NO生成量的菌体。
贯穿本申请说明书所使用的术语“NO(nitric oxide)”被称为“氧化氮”或“一氧化氮”,是指氮被氧化的形态的化合物。它由细胞中作为氨基酸的精氨酸形成,作为一种信号转导物质,参与免疫作用、血管舒张和信号转导等多种生理活性。此外,还已知通过促进炎症细胞因子,如TNF-α和IL-6的分泌来诱发炎症和疼痛(Hu等,2020)。
因此,可以看出本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株使NO的生成量降低,从而可以显示出缓解月经痛的效果。
根据本申请的一个体现例,上述菌株可以是降低血液中的前列腺素E2的菌株。
贯穿本申请说明书所使用的术语“前列腺素(prostaglandin)”作为经期分泌的一种激素,是指起到使子宫收缩,将子宫内膜剥离时的经血,顺利推出体外的作用。
前列腺素是利用环氧化酶(cyclooxygenase,COX)系统由花生四烯酸转化为前列腺素,随着花生四烯酸转化为前列腺素G2,然后转化为前列腺素H2,可以产生具有各种生理活性的前列腺素。此外,有报道称,前列腺素是引起炎症和疼痛的物质(Jayesh等,2020年)。
贯穿本申请说明书所使用的术语“PGE2(前列腺素E2)”也被称为“地诺前列酮”,是指具有催产素(oxytocin)特性的天然前列腺素。
PGE2根据与PGE2受体结合的G蛋白介导受损组织或细胞中的炎症来诱发疼痛(Treutlein等,2018),并刺激中枢神经系统(central nervous system)和周围神经系统(peripheral nervous system)(等,2017)。
因此,可以看出本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株降低血液中的前列腺素E2,由此可以显示出对缓解月经痛的效果。
根据本申请的一个体现例,上述菌株可以是增加血液中前列腺素E1/前列腺素E2的比例的菌株,具体地,上述菌株可以是对比前列腺素E2,增加前列腺素E1的产生比。
贯穿本申请说明书所使用的术语“PGE1(前列腺素E1)”也被称为“前列地尔(Alprostadil)”,是指一种在体内可以起到扩张血管作用的天然前列腺素,众所周知,其通过平滑肌松弛和减少炎症细胞因子分泌,起到缓解疼痛的效果(Gezginci-Oktayoglu等,2016)。
PGE1/PGE2(PGE1比PGE2)产生比是女性经前期综合征相关食品药品指标内的主要指标,如果该比率增加,则判断其包含与治疗经前期综合征相关的功能。
因此,可以看出本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株增加血液中前列腺素E1/前列腺素E2的产生比,由此可以显示出缓解月经痛和对经前期综合征的效果。
根据本申请的一个体现例,上述菌株可以是降低血液中的白三烯的菌株。
贯穿本申请说明书所使用的术语“白三烯(leukotriene,LT)”是指花生四烯酸通过5-脂氧合酶(5-lipoxygenase)代谢而生成的类花生酸(eicosanoid)家族的炎症介质物质,众所周知,其为一种诱发炎症反应和血管损伤等的物质(Tunctan等,2019)。因此,通过抑制花生四烯酸代谢来缓解炎症和疼痛的研究持续被报道(Cheng等,2019,Jayesh等,2020)。
因此,可以看出本申请的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株降低白三烯,由此可以显示出对缓解月经痛的效果。
根据本申请的一个体现例,上述菌株可以是增加血液中的环氧二十碳三烯酸(EET)的菌株。
贯穿本申请说明书所使用的术语“环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacid,EET)”作为信号转导分子,是指如花生四烯酸等的具有20个碳的不饱和脂肪酸通过两种途径形成的物质。众所周知,环氧二十碳三烯酸通过抑制NK-kB的活性来防止炎症细胞因子,如IL-6的增加,以及促进过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的活性来介导炎症(Tunctan等,2019年)。
因此,可以看出本申请的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株增加血液中的环氧二十碳三烯酸,由此可以显示出对缓解月经痛的效果。
根据本申请的一个体现例,上述菌株可以是缓解月经痛的菌株,具体地,上述菌株可以包含在用于缓解月经痛的食品组合物、健康功能食品组合物、药物组合物等多种组合物中。
本申请的第二方面,提供一种用于缓解月经痛的食品组合物,其包含罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)、上述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。与第一方面重复的内容同样适用于第二方面的食品组合物。
贯穿本申请说明书所使用的术语“缓解”是指通过施用上述组合物,月经痛得到减轻或相关症状得到好转的所有行为。
根据本申请的一个体现例,上述组合物可以缓解月经痛的组合物,具体地,可以通过降低血液中的NO、前列腺素E2和白三烯,增加血液中前列腺素E1/前列腺素E2的产生比以及环氧二十碳三烯酸(EET)来缓解月经痛。
根据本申请的一个体现例,上述组合物可以是包括罗伊氏乳杆菌LM1071菌株、其活菌体、其死菌体、其培养物、其裂解物和/或其提取物的组合物。
贯穿本申请说明书所使用的术语“死菌体”作为活菌体的相反概念,是指通过热处理等,使通过发酵获得的活菌和代谢产物无法发生菌生长的形态。死菌体可以包括细胞质(cytoplasm)、细胞壁(cell wall)、细菌素(bacteriocin)等抗菌活性物质、多糖(polysaccharide)、有机酸等。使用上述死菌体的产品与活菌体产品相比具有高稳定性,尤其耐热性优秀,由于其对外界环境的稳定性高,因此具有比现有的活菌产品更容易储存和可以延长保质期的优点。此外,由于对抗生素使用的限制正在加强,作为替代剂的活用性和正式投入死菌体产品生产的企业屈指可数,因此市场性和增长可能性很大。
贯穿本申请说明书所使用的术语“培养物”是指通过在已知的液体培养基或固体培养基中培养本申请的菌株而获得的物质,且可以与“培养液”混用。
贯穿本申请说明书所使用的术语“食品”是指肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、快餐类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、口服剂、酒精饮料、维生素复合剂、健康功能食品以及健康食品等,包括常规意义上的所有食品。
贯穿本申请说明书所使用的术语“健康功能食品”是指根据健康功能食品相关的法律第6727号,使用具有对人体有用功能性的原料或成分制备以及加工的食品,“功能性”是指对人体的结构及功能调节营养素或对生理学作用等保健用途取得有用的效果。
本申请的食品可以采用本领域常规方法制备,在上述制备时,可以添加本领域通常添加的原料以及成分制备。此外,上述食品的剂型只要是被认定为是食品的剂型,可以不受限制的制备。本发明的食品用组合物可以制备成各种形态,与一般的药品不同,将食品作为原料,因此具有长期服用药品时不会产生副作用等优点,且携带性优异,因此本发明的食品可以作为增进肠道环境改善效果的辅助剂摄取。
上述健康食品(health food)是指与一般食品相比,具有积极的健康维持或增进作用的食品,健康辅助食品(health supplement food)是指以健康辅助为目的的食品。根据情况,健康功能食品、健康食品和健康辅助食品的术语可以混用。具体地,上述健康功能食品是指将本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株添加到饮料、茶类、香辛料、口香糖、饼干类等食品材料中,或者以胶囊化、粉末化、悬浊液等制备的食品,将其摄取时,虽然意味着对健康带来一定的效果,但与一般的药品不同,将食品作为原料,因此具有长期服用药品时不会产生副作用的优点。
由于本申请的食品组合物可以经常摄取,因此可以期待对改善抑郁症的高效果,故可以非常有用地使用。
上述食品组合物还可以含有生理学上可接受的载体,载体的种类没有特别限制,可以使用本领域常规的任何载体。
此外,上述食品组合物可以包括通常用于食品组合物以改善气味、味道、视觉等的附加成分。例如,可以包括维生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、烟酸(niacin)、生物素(biotin)、叶酸(folate)、泛酸(panthotenic acid)等。此外,可以包括锌(Zn)、铁(Fe)、钙(Ca)、铬(Cr)、镁(Mg)、锰(Mn)、铜(Cu)、铬(Cr)等矿物质。此外,还可以包括赖氨酸(Lysine)、色氨酸(Tryptophan)、半胱氨酸(Cysteine)、缬氨酸(Valine)等氨基酸。
此外,上述食品组合物还包括防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠、水杨酸、脱氢乙酸钠等)、杀菌剂(漂白粉和高度漂白粉、次氯酸钠等)、抗氧化剂(丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等)、着色剂(焦油色素等)、成色剂(亚硝酸钠、亚硝酸钠等)、漂白剂(亚硫酸钠)、调味剂(MSG谷氨酸钠等)、甜味剂(甘素(dulcin)、甜蜜素、糖精、钠等)、香料(香草醛、内酯类等)、膨胀剂(明矾、D-酒石酸氢钾等)、强化剂、乳化剂、增稠剂(糊料)、成膜剂、胶姆糖基础剂、抑泡剂、溶剂、改良剂等食品添加剂(food additives)。上述添加剂可以根据食品种类选择并适量使用。
本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株可以直接添加,也可以与其他食品或食品成分一起使用,并可以根据常规方法适当使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的(预防、保健或治疗性处置)适当确定。通常,在食品或饮料的制备中,本发明的食品组合物的添加量相对于食品或饮料可以为50重量份以下,具体为20重量份以下。但以保健和卫生为目的长期摄取时,可以包括上述范围以下的含量,且由于在安全性方面没有任何问题,因此有效成分也可以按上述范围以上的量使用。
作为本申请的食品组合物的一个例子,可以作为健康饮料组合物使用,在这种情况下,可以与常规的饮料相似地,含有各种香味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述天然碳水化合物可以是如葡萄糖、果糖的单糖类;如麦芽糖、蔗糖的二糖类;如糊精、环糊精的多糖类;如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇类。甜味剂可以使用如索马甜、甜菊糖苷提取物的天然甜味剂;如糖精、阿斯巴甜的合成甜味剂等。上述天然碳水化合物的比例通常可以为每100mL本发明的健康饮料组合物约0.01~0.04g,具体为约0.02~0.03g。
除上述以外,健康饮料组合物还可以含有各种营养素、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸、果胶酸盐、海藻酸、海藻酸盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精或碳酸化剂等。此外,可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例虽然不是很重要,但通常每100重量份本发明的健康饮料组合物,在0.01~0.1重量份的范围内选择。
如果本申请的食品组合物能够表现出改善肠道环境的效果,那么其可以按各种重量%包含本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,具体地,相对于食品组合物的总重量,本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株的含量可以为0.00001~100重量%或0.01~80重量%,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,上述食品组合物可以是健康功能食品组合物。
本申请的第三方面,提供一种用于预防或治疗经前期综合征的药物组合物,其包含罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)、上述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。与第一方面和第二方面重复的内容同样适用于第三方面的药物组合物。
根据本申请的一个体现例,上述组合物可以是包括罗伊氏乳杆菌LM1071菌株、其活菌体、其死菌体、其培养物、其裂解物和/或其提取物的组合物。
贯穿本申请说明书所使用的术语“治疗”是指将包含本申请的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株作为有效成分的药物组合物施用于经前期综合征发病的个体,使经前期综合征的症状得到好转或得到改善的任何行为。
根据本申请的一个体现例,上述组合物可以是治疗或预防经前期综合征的组合物,具体地,其通过降低血液中NO、前列腺素E2以及白三烯,增加前列腺素E1/前列腺素E2的产生比以及环氧二十碳三烯酸(EET),从而治疗或预防经前期综合征。
贯穿本申请说明书所使用的术语“经前期综合征”是指将月经前反复发生的情绪性、行为性、身体性症状作为特征的一系列症状群,有水肿、乳房痛、消化障碍、头痛、腰痛、下腹痛、腹胀、便秘、腹泻、抑郁症以及失眠症等。
根据本申请的一个体现例,上述药物组合物可以分别根据常规的方法,配成如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浊液、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射液的形态制剂来使用,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,在制剂化上述药物组合物时,可以使用稀释剂或赋形剂,如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂等来制备,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂等,并且此类固体制剂在制备时,可以在上述菌株的死菌体中掺入至少一种以上的赋形剂,例如,淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)或明胶等。此外,例如,除了简单的赋形剂以外,还可以使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,用于口服给药的液体剂型对应于悬浊剂、内服溶液、乳剂、糖浆剂等,除了常用的作为常规稀释剂的水、液体石蜡外,还可以包括各种赋形剂,例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,用于肠胃外给药的制剂可以包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浊剂、乳剂、冻结干燥制剂以及栓剂,但不限于此。例如,作为上述非水溶剂或悬浊剂,可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油、如油酸乙酯的可注射酯等,但不限于此。例如,作为上述栓剂,可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂油、甘油明胶等,但不限于此。
根据本申请的一个体现例的药物组合物可以是医药品组合物或准药品组合物。
贯穿本申请说明书所使用的术语“准药品”是指在用于将诊断、治疗、改善、减轻、处置或预防人类或动物疾病为目的的物品中,作用比医药品微弱的物品,例如,根据药事法,准药品为除了以医药品的用途使用的产品以外的物品,包括用于治疗或预防人类和动物疾病的产品,以及对人体有轻微或没有直接作用的产品。
本申请的上述准药品组合物可以按选自身体清洁剂、消毒清洁剂、清洁剂、厨房清洁剂、清扫清洁剂、牙膏、漱口水、湿纸巾、洗剂、肥皂、洗手液、头发清洁剂、头发柔软剂、加湿器填充剂、面膜、软膏剂以及过滤器填充剂组成的组中的剂型而制备,但不限于此。
根据本申请的一个体现例,上述药物组合物可以以药学有效量给药,本申请的术语“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗或预防的合理的受惠/风险比例治疗或预防疾病的量,有效用量标准可以根据疾病的严重程度、药物的活性、患者的年龄、体重、健康、性别、患者对药物的敏感度、所使用的本发明组合物的给药时间、给药途径以及排泄率、治疗时间、将与所使用的本发明组合物配合或同时使用的药物包括在内的因素以及医学领域中众所周知的其他因素来确定。本申请的药物组合物可以单独给药或与众所周知的对已知肠道疾病表现出治疗效果的成分组合给药。将上述因素都考虑在内,在没有副作用的情况下,重要的是以最小的量获得最大效果的量给药。
根据本申请的一个体现例,本领域技术人员可以考虑使用目的、疾患的成瘾程度、患者的年龄、体重、性别、病史,或用作有效成分的物质的种类等来决定上述药物组合物的给药量。例如,本发明的药物组合物能够以每名成人约0.1ng至约1000mg/kg,优选1ng至约100mg/kg的量给药,并且本发明组合物的给药频率不特别限于此,可以1日1次给药,或也可以将容量进行分多次给药。上述给药量或给药频率,无论在何种方面,均不限定本申请的范围。
本申请的药物组合物不特别限于此,但根据目的,可以通过腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、透皮贴剂给药、口服给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药等途径给药。然而,当口服给药时,其可以以非制剂形式给药,并且由于罗伊氏乳杆菌LM1071菌株可能会因为胃酸变性或降解,因此,对于口服用组合物,可以将活性药剂进行包衣或以防止在胃中降解的制剂形态或以口服用贴剂的形态口腔内给药。此外,上述组合物可以根据活性物质能够移动至靶细胞的任意装置给药。
最佳实施方式
以下,将通过本申请的实施例对本发明进行更详细的描述,下列实施例仅用于帮助理解本申请,本申请的内容不限于以下实施例。
实施例
包含罗伊氏乳杆菌LM1071的缓解经前期综合征的组合物的制备
根据本实施例的罗伊氏乳杆菌LM1071菌体以分批培养法制备。
上述乳酸菌培养在100L的发酵罐(kobiotech)中,用60L总量的培养液进行实施,搅拌速度为30rpm,温度为30℃至37℃,pH保持在5至6.5。培养后,将培养液以13000rpm离心30分钟以回收菌体。将回收的菌体与冻结保护剂混合并在超低温冰箱中冻结24小时,最后通过冻结干燥过程获得菌体(罗伊氏乳杆菌LM1071)。
RAW264.7细胞培养和细胞毒性实验
将RAW264.7巨噬细胞培养在含有10%FBS的RPMI1640中。此外,为了进行细胞毒性实验,将其以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。将罗伊氏乳杆菌LM1071以四种不同浓度(10、20、30、40ug/mL)对被LPS刺激的RAW264.7细胞进行处理。弃去细胞培养液,利用培养的细胞进行细胞毒性实验,为此使用了EZ-Cytox细胞活性检测试剂盒(韩国,DaeilLabservice)。根据下式确定细胞增殖率(%)。
方程
为确认本申请的新型菌株,罗伊氏乳杆菌LM1071(Lactobacillus reuteriLM1071,保藏机构:韩国微生物保藏中心,保藏编号:KCCM12650P,保藏日期:2019年12月31日)的缓解月经痛的效果,进行以下实验。
实施例1:确认通过乳酸菌处理引起的一氧化氮(NO)生成量的变化
为了测量使用巨噬细胞RAW264.7细胞的NO生成能力,将RAW264.7细胞以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中,并在37℃、5%的CO2条件下的培养箱中培养24小时。24小时后,加入各浓度的罗伊氏乳杆菌LM1071,在37℃、5%的CO2条件下的培养箱中培养24小时后,在100uL培养上清液中加入格里斯试剂(Griess reagent),室温放置10分钟后,使用ELISA平板读数仪在540nm处测量吸光度。由使用亚硝酸钠获得的标准曲线计算出NO的代谢物亚硝酸盐的浓度。
将阳性对照组(LPS处理组)作为100%,与罗伊氏乳杆菌LM1071(KCCM12650P)处理组进行比较的结果,确认了用罗伊氏乳杆菌LM1071菌株处理后NO产生显着减少(p<0.05)。随着将罗伊氏乳杆菌LM1071分别以10、20、30和40μg/mL进行处理,与阳性对照组相比,确认到NO产生量分别为87.57、63.28、14.26和8.22%,NO生成量显著减少(参照图1)。
基于上述结果,可以确认本申请的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LM1071菌株通过减少NO产生量而显示出缓解月经痛的效果。
实施例2:确认通过乳酸菌处理引起的前列腺素分泌量的变化
为了分析PGE1和PGE2的生成能力和PGE1/PGE2比例,将RAW 264.7巨噬细胞培养在含有10%FBS的RPMI 1640中。此外,为了酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析,将其以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。将罗伊氏乳杆菌LM1071以四种不同浓度(10、20、30、40ug/mL)对被LPS刺激的RAW264.7细胞进行处理。通过ELISA试剂盒(美国,恩佐生命科学),使用培养的细胞培养液分析PGE1(前列腺素E1)和PGE2(前列腺素E2)的产生以及比例(PGE1/PGE2)。
由实验结果可以看出,在罗伊氏乳杆菌LM1071菌株实验组中,PGE2的分泌量分别为291.16、224.23、135.13和71.06pg/mL(以10、20、30和40μg/mL乳酸菌粉末处理),PGE2的分泌量显著减少(参照图2)。
此外,罗伊氏乳杆菌LM1071菌株实验组在10、20、30和40μg/mL的处理浓度下,PGE1的分泌量减少至3467.35、3062.71、2668.48和2434.98pg/mL,相对于阳性对照组(LPS处理对照组),在40μg/mL的处理浓度下减少了28.37%(参照图3)。
最后,通过PGE1和PGE2的比例,确认了相对的PGE2的分泌变化,其结果,确认了罗伊氏乳杆菌LM1071可以将PGE1/PGE2比例增加至34.31(参照图4)。
因此,可以确认罗伊氏乳杆菌LM1071菌株通过减少疼痛诱发物质PGE2,并增加与经前期综合征相关的主要指标PGE1/PGE2的产生比,从而对缓解月经痛和经前期综合征显示出效果。
实施例3:确认通过乳酸菌处理引起的白三烯(leukotriene,LTB4)和环氧二十碳
三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid,EET)分泌量的变化
为了分析疼痛诱发物质白三烯(LTB4)和炎症缓解物质环氧二十碳三烯酸(EET),将RAW 264.7巨噬细胞培养在含有10%FBS的RPMI 1640中。此外,为了酶联免疫吸附剂测定(ELISA)分析,将其以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。将罗伊氏乳杆菌LM1071以四种不同浓度(10、20、30、40ug/mL)对被LPS刺激的RAW264.7细胞进行处理。通过ELISA试剂盒(美国,恩佐生命科学),使用含有LTB4和EET的培养的细胞培养液进行分析。
实验结果显示,与阳性对照组(LPS处理组)相比,在20、30和40μg/mL的浓度下,罗伊氏乳杆菌LM1071菌株实验组的LTB4显著减少,在40μg/mL的浓度下,LTB4的分泌量被测定为减少了91.29%的15.75pg/mL(参照图5)。
此外,罗伊氏乳杆菌LM1071菌株实验组显示出比阳性对照群(LPS处理群)更高浓度的EET分泌量,确认了通过抑制炎症反应来缓解疼痛的可能性。根据罗伊氏乳杆菌LM1071的处理浓度,EET的分泌量增加至184.79、190.25、218.98和268.41μg/mL(参照图6)。
因此,可以确认罗伊氏乳杆菌LM1071菌株抑制白三烯的产生,并增加环氧二十碳三烯酸(EET)的分泌量,从而显示出缓解炎症和疼痛的功效。
综上所述,可以确认罗伊氏乳杆菌LM1071菌株能够抑制NO和作为疼痛诱发物质的PGE2和LTB4,增加PGE1/PGE2比例,并促进炎症缓解物质EET的生成,从而有助于缓解月经痛。
上述本申请的描述是为了举例,本申请所属领域的普通技术人员可以理解,在不改变本申请的技术思想或必要特征的情况下,可以很容易地修改为其他具体形态。因此,应当理解,上述实施例在所有方面都是示例性的,而不是限制性的。例如,描述为单一类型的每个组成要素可以分散实施,同样描述为分散型的组成要素也可以以组合的形式实施。
本申请的范围由所附权利要求来表示,而非上述详细说明,应理解为,凡由权利要求的含义和范围以及其均等概念导出的所有改动或修改,均包含在本申请的范围内。
[保藏编号]
保藏单位:韩国微生物保藏中心(海外)
保藏编号:KCCM12650P
保藏日期:20191231
Claims (9)
1.一种罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)。
2.根据权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,其特征在于,所述菌株是降低血液中的NO生成量的菌株。
3.根据权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,其特征在于,所述菌株是降低血液中前列腺素E2的分泌量的菌株。
4.根据权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,其特征在于,所述菌株是增加血液中前列腺素E1/前列腺素E2的比例的菌株。
5.根据权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,其特征在于,所述菌株是降低血液中的白三烯生成的菌株。
6.根据权利要求1中所述的罗伊氏乳杆菌LM1071菌株,其特征在于,所述菌株是增加血液中的环氧二十碳三烯酸生成的菌株。
7.一种用于缓解月经痛的食品组合物,其特征在于,包含罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)、所述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。
8.一种用于预防或治疗经前期综合征的药物组合物,其特征在于,包含罗伊氏乳杆菌LM1071菌株(KCCM12650P)、所述菌株的培养物、裂解物、提取物中的一种以上作为有效成分。
9.根据权利要求8中所述的用于预防或治疗经前期综合征的药物组合物,其特征在于,所述经前期综合征为选自水肿、乳房痛、消化障碍、头痛、腰痛、下腹痛、腹胀、便秘、腹泻、抑郁症以及失眠症组成的组中的一种以上的经前期综合征。
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