CN115197932A - 一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 - Google Patents
一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115197932A CN115197932A CN202211077119.XA CN202211077119A CN115197932A CN 115197932 A CN115197932 A CN 115197932A CN 202211077119 A CN202211077119 A CN 202211077119A CN 115197932 A CN115197932 A CN 115197932A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- immobilized
- glucosidase
- beta
- stability
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 title claims abstract description 84
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 69
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 9
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 5
- 239000010903 husk Substances 0.000 claims description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims description 3
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 claims 2
- SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N Picolinic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC=N1 SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 18
- 229940081066 picolinic acid Drugs 0.000 abstract description 14
- -1 picolinic acid modified iron oxide Chemical class 0.000 abstract description 13
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 13
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical class [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 11
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 4-nitrophenyl alpha-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-ZIQFBCGOSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 229960002089 ferrous chloride Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229920003139 Eudragit® L 100 Polymers 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- TZJALUIVHRYQQB-XFDQAQKOSA-N Icariin Natural products O(C)c1ccc(C2=C(O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)C(=O)c3c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)c(C/C=C(\C)/C)c3O2)cc1 TZJALUIVHRYQQB-XFDQAQKOSA-N 0.000 description 1
- NGMYNFJANBHLKA-SENBMHEBSA-N Icariside II Natural products O(C)c1ccc(C2=C(O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)C(=O)c3c(O)cc(O)c(C/C=C(\C)/C)c3O2)cc1 NGMYNFJANBHLKA-SENBMHEBSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001447 ferric ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- TZJALUIVHRYQQB-XLRXWWTNSA-N icariin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C(CC=C(C)C)=C2O1 TZJALUIVHRYQQB-XLRXWWTNSA-N 0.000 description 1
- TZJALUIVHRYQQB-UHFFFAOYSA-N icariine Natural products C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(OC2C(C(O)C(O)C(C)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CC=C(C)C)=C2O1 TZJALUIVHRYQQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGMYNFJANBHLKA-LVKFHIPRSA-N icariside II Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C(CC=C(C)C)=C2O1 NGMYNFJANBHLKA-LVKFHIPRSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000012844 infrared spectroscopy analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- NDLPOXTZKUMGOV-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoferriooxy)iron hydrate Chemical compound O.O=[Fe]O[Fe]=O NDLPOXTZKUMGOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明涉及酶工程技术领域，具体的说就是一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β‑葡萄糖苷酶。对氧化铁磁性纳米颗粒进行表面皮脂酸修饰，并吸附酶进行固定化。用该方法获得的β‑葡萄糖苷酶固定化酶在pH稳定性、热稳定性、机械稳定性、耐储存性等方面都优于游离酶，对有机溶剂的耐受力增强，并可以被重复用于稻壳粉和玉米芯粉等天然材料的分解。基于皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒的固定化策略为固定化酶提供了更高效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体的说就是一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶。
背景技术
酶是生物体内产生的一类能催化反应的蛋白或核酸，比化学催化剂拥有更高的催化活性，而且反应条件温和，底物专一性强，符合绿色化学的发展趋势。近年来，酶已在农业、食品、轻工等众多领域获得广泛应用，但是在应用过程中也存在一些问题，比如很多酶在分离纯化后容易降解，稳定性差；另外，在催化反应后，残留的有活性的酶不能重复使用。酶的固定化技术通过回收和反复利用固定化酶的方式，为克服这些缺点提供了解决方案(张璟譞等.生物加工过程，2022，20(1)：9-19)。β-葡萄糖苷酶是一种自然界中常见的可实现生物降解的酶，主要功能是水解葡萄糖苷键并产生葡萄糖。近年来，科学家们用以Eudragit L-100(E)为载体,对β-葡萄糖苷酶(CB)进行固定化修饰。固定化酶的热稳定性有了一定的提高,并且固定化酶重复利用5次后仍保留41％的初始酶活力(燕杰善等.化工科技，2018,26(3):5-10)。通过制备壳聚糖交联SBA-15型介孔二氧化硅(SBA-15)固定化β-葡萄糖苷酶(β-Glc),促进了淫羊藿苷高效转化为稀有宝藿苷I(刘聪燕等.中草药2021.52(3):685-691)。来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶具有很高的酶活力和热稳定性，适用于将各类纤维素的降解(邢胜利等.轻工学报，2022，37(1):20-25)。但是到目前为止，固定化里氏木霉β-葡萄糖苷酶的催化能力、稳定性和可重复利用性等方面，仍有待提高。究其原因，主要是因为固定化载体表面修饰效果不佳，导致载体与酶的相互作用不利于酶学性质的发挥，从而影响到酶的催化功能和稳定性。因此，我们建立了一种有效的固定化酶策略，并用于实现来自里氏木霉的β-葡萄糖苷酶的固定化。简要的说，就是用皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒，并对该酶进行固定化。对氧化铁磁性纳米颗粒的表面进行修饰后，形成核-壳状的稳定结构，并在表面引入羧基基团，能与酶的氨基基团形成稳定的相互作用。本发明用皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒实现β-葡萄糖苷酶的固定化，不仅增强了该酶对某些有机溶剂的耐受性，还显著增强酶活性、pH稳定性、热稳定性、耐储存性、机械稳定性等，增加了该酶工业应用的前景。此外，本发明所构建的β-葡萄糖苷酶固定化酶在分解玉米芯粉和稻壳粉等农副产品多糖方面，也表现良好，进一步展现出良好的应用潜力。
发明内容
1.本发明旨在提供一种酶的高效固定化技术，以及应用该技术获得的有工业应用前景的固定化β-葡萄糖苷酶。通过皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒，使其表面携带羧基基团，通过与酶的氨基基团结合而实现酶的固定化。一轮催化反应结束后，通过磁场力分离固定化酶，从而实现重复使用。采用该方法获得的β-葡萄糖苷酶固定化酶对某些有机溶剂的耐受性比游离酶显著增强。固定化酶的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性和耐储存性也明显高于游离酶。更重要的是，由于皮脂酸的修饰作用，使得酶与固定化载体之间作用力强，固定化酶颗粒稳定性强，重复催化10次反应能能保持60％以上的原始活性。此外，β-葡萄糖苷酶固定化酶可被重复应用于水解玉米芯粉和稻壳粉等农副产品中的葡萄糖苷键，对这些农副产品中的杂质耐受性强。为实现上述目的，反应过程如下：
1)首先将表达重组酶基因的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，并在含有适当抗生素的培养基中培养。当菌体生长到对数生长期时，加入适当浓度的IPTG诱导表达目的蛋白。离心收集菌体并尽心裂解，通过层析柱等方法进行蛋白纯化，用于固定化；2)三价和二价铁离子按照一定比例混合，在氨水存在下进行共沉淀，得到磁性氧化铁纳米颗粒，然后在高温下与皮脂酸混合，用皮脂酸对纳米颗粒进行表面修饰(即DMNP的获得)，使得纳米颗粒表面包被一层羧基基团；3)将上述纯化后的酶与DMNP充分混合，在恒温振荡器中充分固定。固定后，外加磁场进行分离和5次清洗，清洗液采用磷酸缓冲液(pH＝7.0)，最终得到固定化的DMNP。
与现有的固定化酶方法，以及所获得的固定化β-葡萄糖苷酶相比，本发明具有显著的优势，具体表现为：
1)本发明所设计的氧化铁磁性纳米颗粒表面积大，能够在外源磁场力作用下从反应体系中分离出来。在皮脂酸修饰后，由于纳米颗粒表面含有羧基基团，可以与酶分子上的氨基基团形成稳定的相互作用。这种酶的固定化方法制备成本、稳定性好，而且固定化酶与反应溶液分离过程简单方便。
2)本发明所设计的β-葡萄糖苷酶固定化酶对某些有机溶剂，即使是高浓度的有机溶剂，也表现出较强耐受性：β-葡萄糖苷酶固定化酶在50％的酒精溶液中保持了高达35％的活性，而游离β-葡萄糖苷酶酶则仅仅残留不到10％的活性。同时，游离β-葡萄糖苷酶在低浓度丁醇溶液中活性基本丧失，而β-葡萄糖苷酶固定化酶则保持了20％以上的相对活性。由于化工都领域经常需要在有机溶剂存在下进行催化反应，因此本发明所涉及的酶固定化方法和所获得的固定化β-葡萄糖苷酶将具有独特的应用潜力。
3)本发明所设计和构建的固定化β-葡萄糖苷酶可被重复应用于水解玉米芯粉和稻壳粉等农副产品中的葡萄糖苷键，具体表现为：采用固定化β-葡萄糖苷酶分解稻壳粉，循环使用11次后该酶的活性才降低为0；用固定化β-葡萄糖苷酶分解玉米芯粉，循环使用6次后酶活性才降低为0。众所周知，农副产品天然底物中常含有很多杂质，对酶有强烈的抑制作用，而本发明所构建的固定化β-葡萄糖苷酶对这些抑制剂不敏感，表明该酶在农副产品天然底物降解方面将具有广泛的应用前景。
4)与游离β-葡萄糖苷酶相比，本发明所构建到的固定化β-葡萄糖苷酶在热稳定性、pH稳定性、机械稳定性和耐储存性等方面也有显著提高。尽管以往的固定化方法及其产生的固定化酶也有很多成功的范例，但是没有像本发明这样全面提升酶功能的相关报道。
附图说明
图1是本发明所设计的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶的方法的步骤，以及所获得的β-葡萄糖苷酶固定化酶用于催化反应的示意图。
图2是本发明所设计的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的红外线光谱IR图谱和扫描电镜SEM图谱。a和b分别是固定化前和固定化β-葡萄糖苷酶后皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒的IR图谱；c和d分别是固定化前和固定化β-葡萄糖苷酶后皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒的SEM图谱。
图3是本发明中游离酶和固定化酶受到pH和温度影响效果的对比图。a和b分别是pH和温度对游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶活性的影响。
图4是本发明所涉及的不同浓度有机溶剂对游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的影响比较图。
图5是本发明所涉及的游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的稳定性分析。a，b，c，d分别是pH稳定性，热稳定性，机械稳定性和耐储存性的比较。
图6是本发明所涉及的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶循环使用数。a，b分别是分解稻壳粉和玉米芯粉的循环次数及其催化效果。
具体实施方式
本发明旨在提供一种酶的高效固定化技术，以及应用该技术获得的有工业应用前景的固定化β-葡萄糖苷酶。通过皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒，使其表面携带羧基基团，通过与酶的氨基基团结合而实现酶的固定化。采用该方法获得的β-葡萄糖苷酶固定化酶对某些有机溶剂的耐受性比游离酶显著增强。固定化酶的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性和耐储存性也明显高于游离酶。另外，固定化酶颗粒稳定性强，重复催化10次反应能能保持60％以上的原始活性。此外，β-葡萄糖苷酶固定化酶可被重复应用于水解玉米芯粉和稻壳粉等农副产品中的葡萄糖苷键，对这些农副产品中的杂质耐受性强。
实施例1：本发明所涉及的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒的构建
在10ml水中溶解2.8g氯化亚铁，用微孔过滤器去除杂质；然后吸取7.5mL的氯化亚铁溶液与0.2mol/L的氯化铁溶液在烧杯中混合。将温度升高到70℃，在溶液中快速加入18mL 25％的NH3·H2O并快速搅拌1min。然后在上述反应体系中加入3.34g皮脂酸，继续在70℃快速搅拌1h。反应结束后，获得的黑色沉淀物为皮脂酸修饰后的氧化铁磁性纳米颗粒。用外源磁场对上述沉淀物进行分离，并分别用酒精和水洗涤3次。然后将沉淀物与200mL水混合，超声波处理2h，并用水洗3次。最后，用外源磁场将沉皮脂酸修饰后的氧化铁磁性纳米颗粒分离出来，在室温下干燥。
实施例2：本发明所涉及的β-葡萄糖苷酶的表达和纯化，以及皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的制备与表征
将含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因(NCBI Reference Sequence:XM_006966752.1)的重组质粒pETM11-BglC转化入肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有kana抗性的LB平板上。将菌落接种到含有kana的TB液体培养基中，在37℃振荡过夜培养至OD600＝0.4-0.6之间时，加入0.1mmol/L终浓度的IPTG。在90rpm转速和25℃条件下诱导表达12h后离心收集菌体。将菌体从新悬浊于pH＝7.0的磷酸缓冲液(50mmol/L)，并用超声波破碎菌体，然后用高速离心方法收集粗提酶液，然后用Ni-NTA进行蛋白纯化。在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.0)中加入20mg制备上述皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒并搅拌均匀，然后加入200μL纯化后的游离酶液，将混合物放置在25℃恒温振荡器中80rpm震荡4h完成固定化。固定后的产物用外源磁力进行分离，并用磷酸缓冲液(pH＝7.0)清洗5次，洗脱游离酶，最终得到皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶。
1)p-NPG法测定β-葡萄糖苷酶活性
将100μL纯酶液或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶悬浊液与815μL磷酸缓冲液(pH＝7.0)混合，然后加入25μL 100mmol/L的p-NPG溶液，在40℃反应30min。反应结束后，向反应体系中加入60μL 2mmol/L的碳酸钠溶液终止反应。然后离心取上清液，并测定OD400值。
2)游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶的表面特征分析
对样品进行红外线光谱分析。将制备好的样品与溴化钾混合，并压片处理，然后进行4000-500cm-1红外线扫描。图2a和2b显示β-葡萄糖苷酶在固定化前后吸收峰的峰形变化很大，可能是由于酶固定化后遮挡了纳米颗粒载体表面的基团，造成吸收峰的显著变化，说明该酶已被成功固定化到皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒上。对样品进行SEM分析则采用0.05-30kV加速电压和20-50k放大倍数，并在喷金后进行形貌观察。图2c和2d显示β-葡萄糖苷酶在固定化前后都属于纳米级颗粒大小，固定化后颗粒大小增加，进一步说明固定化成功。
实施例3：本发明所述方法制备的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的酶学性质研究
1)皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶最适pH和最适温度的测定
取游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶悬浊液100μL，调节pH到3.0-10.0，测定相对酶活力。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，游离β-葡萄糖苷酶和固定化酶的最适pH没有差别，都是pH＝7.0。但是在碱性条件下(pH＞9.0)皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶表现出更高的活性(如图3a所示)。这表明皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶更适合用于碱性条件下的酶促反应。
取游离酶和或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶100μL，在20℃到100℃的温度范围内测定酶活性。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶的最佳温度分别为60℃和40℃(如图3b所示)，说明皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶更适于低温下的催化反应。
2)有机溶剂对对游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶活性的影响
取游离β-葡萄糖苷酶或皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶100μL，分别与100μL的10％-50％浓度的酒精、丙酮、或者丁醇溶液混合，并进行残留酶活性测定。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，游离β-葡萄糖苷酶和皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶活性都受到各种有机溶剂的抑制，而且抑制效果随着有机溶剂浓度的增大而增强。但是，相同条件下皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶的活性明显优于游离β-葡萄糖苷酶(如图4所示)。有机溶剂作为蛋白质变性剂具有羟基和羰基等基团，可以与蛋白质中的相关基团形成稳定的氢键，破坏蛋白质本身的氢键，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒所具有的羧基基团可能通过与有机溶剂相关基团的作用而削弱有机溶剂对蛋白质的破坏作用，从而使固定化酶比游离酶拥有更高的残留活性。
3)本发明所涉及方法制备的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶各种稳定性的测定
pH稳定性的测定：取游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶悬浊液100μL，调节pH到3.0-10.0，在30℃温度下反应30min后进行酶活性测定。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，在不同pH值下皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶均表现出比游离β-葡萄糖苷酶更高的pH稳定性，这种优势在碱性和酸性条件下更加显著(如图5-a所示)。因此，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶比其游离酶更适合在极端的环境条件下进行催化反应。
热稳定性测定：取游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶100μL，在30℃到90℃的温度范围内温浴30min，然后测定热稳定性。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，温度＞70℃时游离β-葡萄糖苷酶已经完全失活，而皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶在90℃温浴3min后仍有残余活性(如图5-b所示)。因此脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶更耐高温，说明虽然最适温度降低，脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶的热稳定性反而有所提高。
机械稳定性的测定：取游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶悬浊液100μL，分别涡旋0-60min，然后进行酶活性测定。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，旋涡震荡1h后，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶的残余活性约为40％，显著高于游离β-葡萄糖苷酶的数值(如图5-c所示)，这一结果说明固定化过程增加了酶的机械稳定性，这对于后续生产和运输固定化酶有积极意义。
耐储存性测定：取游离β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶悬浊液100μL，放置在20℃条件下，每隔3d取样一次进行残余酶活测定。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶在20℃条件下保藏34d后，残留活性约为40％，而相同条件下游离β-葡萄糖苷酶的残留活性仅为20％(如图5-d所示)。因此，β-葡萄糖苷酶或者皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化酶比游离酶更有利于长期储存。
实施例4：本发明所涉及方法制备的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶循环利用效果及降解天然农副产物效果研究
固定化酶循环利用效果测定：皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶每次活性测定后，用磷酸缓冲液(pH＝7.0)清洗3次，然后添加溶于磷酸缓冲液(pH＝7.0)的底物p-NPG，继续进行酶活测定，并将上述测定重复10次。结果表明，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶在重复反应10次仍保持＞60％的相对活性(如图6-a所示)，说明固定化酶循环利用效果良好。
天然农副产物降解效果分析：将20mg的玉米芯或者稻壳粉中加入890μL的pH＝7.0磷酸缓冲液和50μL的皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶悬浊液，在40℃反应30min，然后进行活性测定。在外源磁场作用下，将皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶从反应混合物中分离出来，用磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)洗涤三次。然后与新的玉米芯或稻壳粉混合进行下一轮反应，直到无法测到活性为止。每个反应取三次重复的平均值，样品活性与最高活性的比值百分数为相对活性。结果表明，固定化酶用于降解稻壳粉6次，降解玉米芯粉10次以后才完全失去活性(如图6-b所示)。这表明，皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒固定化β-葡萄糖苷酶在天然农副产物降解方面有重要的应用前景。
Claims (3)
1.一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶，其特征在于：通过皮脂酸修饰氧化铁磁性纳米颗粒，使其表面携带羧基基团，通过与酶的氨基基团结合而实现酶的固定化。一轮催化反应结束后，通过磁场力分离固定化酶，从而实现重复使用。
2.按权利要求1所述一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶，其特征在于：β-葡萄糖苷酶固定化酶对某些有机溶剂的耐受性比游离酶显著增强。固定化酶的热稳定性、pH稳定性、机械稳定性和耐储存性也明显高于游离酶。
3.按权利要求1所述一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶，其特征在于：由于皮脂酸的修饰作用，使得酶与固定化载体之间作用力强，固定化酶颗粒稳定性强，重复催化10次反应能能保持60％以上的原始活性。此外，β-葡萄糖苷酶固定化酶可被重复应用于水解玉米芯粉和稻壳粉等农副产品中的葡萄糖苷键，对这些农副产品中的杂质耐受性强。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211077119.XA CN115197932A (zh) | 2022-09-02 | 2022-09-02 | 一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211077119.XA CN115197932A (zh) | 2022-09-02 | 2022-09-02 | 一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115197932A true CN115197932A (zh) | 2022-10-18 |
Family
ID=83572176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211077119.XA Pending CN115197932A (zh) | 2022-09-02 | 2022-09-02 | 一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115197932A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1496255A (zh) * | 2000-11-17 | 2004-05-12 | �������о�����չ˽������˾ | 用三萜组合物抑制NF-κB |
| CN101157944A (zh) * | 2007-09-21 | 2008-04-09 | 北京化工大学 | 利用固定化脂肪酶催化合成二元酸酯的方法 |
| CN101270352A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-09-24 | 东华大学 | 一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 |
| CN106222157A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 南京工业大学 | 一种以聚氨基酸修饰的聚苯乙烯树脂为载体的固定化酶及其制备方法 |
-
2022
- 2022-09-02 CN CN202211077119.XA patent/CN115197932A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1496255A (zh) * | 2000-11-17 | 2004-05-12 | �������о�����չ˽������˾ | 用三萜组合物抑制NF-κB |
| CN101157944A (zh) * | 2007-09-21 | 2008-04-09 | 北京化工大学 | 利用固定化脂肪酶催化合成二元酸酯的方法 |
| CN101270352A (zh) * | 2008-04-11 | 2008-09-24 | 东华大学 | 一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的制备方法 |
| CN106222157A (zh) * | 2016-08-12 | 2016-12-14 | 南京工业大学 | 一种以聚氨基酸修饰的聚苯乙烯树脂为载体的固定化酶及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张双正: "磁响应交联糖化酶聚集体的制备及催化特性", 《化工学报》, vol. 68, no. 7, 20 April 2017 (2017-04-20) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108396023B (zh) | 用研磨法制备磁性mof材料并用于酶的固定 | |
| Limadinata et al. | Temperature-responsive nanobiocatalysts with an upper critical solution temperature for high performance biotransformation and easy catalyst recycling: efficient hydrolysis of cellulose to glucose | |
| CN110564717B (zh) | 一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用 | |
| CN105624128B (zh) | 一种固定化单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用 | |
| CN109576256B (zh) | 一种磁性dna水凝胶封装双酶的方法 | |
| Amadi et al. | Concurrent production of cellulase, xylanase, pectinase and immobilization by combined Cross-linked enzyme aggregate strategy-advancing tri-enzyme biocatalysis | |
| Velmurugan et al. | MgO-Fe3O4 linked cellulase enzyme complex improves the hydrolysis of cellulose from Chlorella sp. CYB2 | |
| CN113584013A (zh) | 磁性生物炭固定化酶复合材料及其制备方法 | |
| CN112387299B (zh) | 一种生物质化学-酶法制备l-呋喃丝氨酸的方法 | |
| CN106480005A (zh) | 一种带侧链的d‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法 | |
| Adalberto et al. | Immobilization of pectinase from Leucoagaricus gongylophorus on magnetic particles | |
| CN115197932A (zh) | 一种皮脂酸修饰的磁性纳米颗粒的制备及其固定化β-葡萄糖苷酶 | |
| CN109607517B (zh) | 一种部分还原氧化石墨烯及其制备方法与应用 | |
| Hassan et al. | Biofabrication of magnetic nanoparticles and their use as carriers for pectinase and xylanase | |
| Rai et al. | Development of recyclable magnetic cross-linked enzyme aggregates for the synthesis of high value rare sugar d-tagatose in aqueous phase catalysis | |
| Mustafa et al. | Cellulase immobilized on silica coated magnetic nanoparticles for improved stability and reusability | |
| CN110484529B (zh) | 一种金属有机框架-腈水合酶复合物及其制备方法和应用 | |
| CN106318994B (zh) | 使用琼脂水解酶制备源自海藻的半乳糖的方法 | |
| KR101717818B1 (ko) | 산화철 요크 쉘 나노구조체를 이용한 효소 고정화 | |
| CN112626060B (zh) | 一种用于生产肌醇的固定化多酶体系以及生产肌醇的方法 | |
| CN111607584A (zh) | 一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法 | |
| CN106701858B (zh) | 一种京尼平的制备方法 | |
| Zeng et al. | Inert enzyme nanoaggregates for simultaneous biodecarboxylation and CO2 conversion | |
| CN111690637A (zh) | 有机磷降解酶基多功能催化剂的制备方法和有机磷降解酶基多功能催化剂及其应用 | |
| CN111647593A (zh) | 生物矿化型固定脂肪酶的制备方法及其在催化合成opo中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |