CN115197911A - 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用 - Google Patents

一种婴儿树突状细胞的制备及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115197911A
CN115197911A CN202211065365.3A CN202211065365A CN115197911A CN 115197911 A CN115197911 A CN 115197911A CN 202211065365 A CN202211065365 A CN 202211065365A CN 115197911 A CN115197911 A CN 115197911A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hole
mixed solution
concentration
added
dendritic cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211065365.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115197911B (zh
Inventor
李雁笛
王素萍
冯永亮
连佳
韩雨洁
陈转转
任朝敏
崔旭锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Medical University
Original Assignee
Shanxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Medical University filed Critical Shanxi Medical University
Priority to CN202211065365.3A priority Critical patent/CN115197911B/zh
Publication of CN115197911A publication Critical patent/CN115197911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115197911B publication Critical patent/CN115197911B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/001114—CD74, Ii, MHC class II invariant chain or MHC class II gamma chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明适用于生物细胞技术领域，提供了一种婴儿树突状细胞的制备及其应用。本发明利用1岁婴儿单核细胞系THP‑1和一系列混合液制备婴儿未成熟树突状细胞和婴儿成熟树突状细胞，能有效表现出两者树突状细胞的形态特征和表型特征，并且对HBV或/和乙肝疫苗产生了有效的免疫反应，在HBV刺激下，抗原提呈第一信号、第二和第三信号分子受到抑制，模拟了婴儿长期处于母体HBV高危生物环境中，树突状细胞免疫功能受抑的情形；在乙肝疫苗作用下，抗原提呈3类信号分子有效上调，模拟了正常婴儿树突状细胞对乙肝疫苗免疫反应良好的情形；在先HBV后乙肝疫苗的作用下，抗原提呈3类信号分子受到抑制，模拟了HBsAg阳性母亲婴儿树突状细胞对乙肝疫苗免疫反应不佳的情形。

Description

一种婴儿树突状细胞的制备及其应用
技术领域
本发明属于生物细胞技术领域，尤其涉及一种树突状细胞的制备及其应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎(乙肝)是全球特别是中国的一项重大公共卫生问题。WHO最新数据显示，截止2019年，全球约有2.96亿慢性HBV感染者，每年新发感染150万例，约有82万死于慢性HBV感染[1]。目前我国一般人群HBsAg流行率为5％～6％，约有7000万例慢性HBV感染者[2]，实现WHO“2030年消除乙型肝炎”目标仍然任重道远。婴儿作为HBV感染的易感人群之一，出生第一年感染HBV的婴儿90％将成为乙肝慢性携带者，是我国乙肝患者积累的主要原因，同时，婴儿期发生HBV感染，使其日后因肝硬化和肝细胞癌晚期而发生死亡的风险更高[3]。可见，预防婴儿感染HBV迫在眉睫。
目前，防止婴儿感染HBV，接种乙肝疫苗是最有效的方法。但仍然有一部分婴儿疫苗应答效果不佳，其中很大一部分是HBsAg阳性孕妇婴儿，在我国HBsAg阳性孕妇婴儿中，7月龄乙肝疫苗无/弱应答率为12.2-24.4％，12月龄乙肝疫苗无/弱应答率高达28.4％-30.2％[4-6]。如果是乙肝疫苗无/弱应答的女婴，极易感染HBV，其成人后继续成为乙肝孕妇，这种“代代相传”的循环，为防控乙肝带来很大的困难。可见，提高HBsAg阳性孕妇婴儿乙肝疫苗应答效果是防控乙肝的关键，那么如何提高婴儿对乙肝疫苗的应答水平呢？首先需要攻克该高危人群乙肝疫苗应答不佳的原因和机制难题。
造成乙肝疫苗无弱应答的因素很多，包括病原体，环境，宿主以及其他方面的原因[7]，其中宿主免疫方面的原因不容忽视。由于天然免疫是免疫系统的第一道防线，同时可以激活特异性免疫，是乙肝疫苗免疫应答的关键环节，同时在机体抵御和清除病原体过程中发挥着不可替代的作用。
天然免疫反应的首要环节是抗原提呈，树突状细胞(dendritic cell，DC)作为机体功能最强的抗原提呈细胞，是唯一能激活初始性T淋巴细胞的抗原提呈细胞，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。机体接种乙肝疫苗后，DC一方面通过其表面模式识别受体(PRR)识别病原体相关分子模式(PAMPs)，发挥天然免疫作用，一方面通过抗原捕获、提呈和对T细胞的协调刺激作用，发挥体液免疫作用，产生保护性抗体[8-10]。因此，DC功能活化在乙肝疫苗免疫应答中起着至关重要的作用。与一般胎儿不同，HBsAg阳性孕妇胎儿长期处在母体HBV高危生物环境下，其天然免疫状态特别是DC功能会受到不同程度影响，继而影响其乙肝疫苗免疫应答效果，因此亟待研究DC功能受抑制的深层机制。
目前HBsAg阳性母亲婴儿DC的体外沉默/过表达机制实验研究难以开展，主要瓶颈是以现有方法制备的DC模拟HBsAg阳性母亲婴儿DC存在诸多局限性，首先婴儿原代单核细胞制备的DC受到采血量(伦理学)的限制，获得的数量极少，难以满足下游机制研究实验的重复孔设置和多项指标的检测；其次，成人原代单核细胞所制备的DC，基因背景不稳定，实验结果往往难以重现，常常受到不同供血者个体差异以及同一供血者不同时期生理状况差异的影响；再次，脐带血原代细胞所制备的DC，受到可及性差的制约，同时在体外存活时间很短，难以满足长时间下游实验的开展，最后，鼠骨髓细胞制备的树突状细胞，受到物种差异的影响，导致实验结果难以外推到人类，研究成果难以应用并造福于人类。
综上，本研究以来源于1岁男婴的单核细胞系(THP-1)为细胞来源，制备DC，并分析其在体外是否对HBV或/和乙肝疫苗产生免疫反应，考察模拟效果和应用效果，为HBsAg阳性母亲婴儿DC机制研究提供新的优良的实验模拟物。
参考文献：
[1]Liu,J.,W.Liang,W.Jing,et al.Countdown to 2030:eliminatinghepatitis B disease,China.Bulletin of the World Health Organization,2019,97(3):230-238；
[2]王贵强，段钟平，慢性乙型肝炎防治指南(2019年版).中国病毒病杂志,2020(1):1-25；
[3]Organization,W.H.,Global Hepatitis Report,2017.2017:GlobalHepatitis Report,2017；
[4]Lu,Y.,X.Liang,F.Wang,et al.Hepatitis B vaccine alone may be enoughfor preventing hepatitis B virus transmission in neonates of HBsAg(+)/HBeAg(-)mothers.Vaccine,2017,35(1):40-45；
[5]王静。冯玉岭，刘明晖，et al.HBsAg阳性母亲所生婴儿联合免疫后乙型肝炎表面抗体的动态变化。中华肝脏病杂志，2013,21(8):4；
[6]Wang,J.,Y.He,D.Jin,et al.No response to hepatitis B vaccine ininfants born to HBsAg(+)mothers is associated to the transplacental transferof HBsAg.Infectious diseases(London,England),2017,49(8):576-583；
[7]Singh,A.,S.Plitt,C.Osiowy,et al.Factors associated with vaccinefailure and vertical transmission of hepatitis B among a cohort of Canadianmothers and infants.Journal of viral hepatitis,2011,18(7):468-73；
[8]Chrisikos,T.,Y.Zhou,N.Slone,et al.Molecular regulation ofdendritic cell development and function in homeostasis,inflammation,andcancer.Molecular immunology,2019,110:24-39；
[9]Dai,S.,M.Zhuo,L.Song,et al.Dendritic cell-based vaccination withlentiviral vectors encoding ubiquitinated hepatitis B core antigen enhanceshepatitis B virus-specific immune responses in vivo.Acta biochimica etbiophysica Sinica,2015,47(11):870-9；
[10]Jan,R.,Y.Lin,C.Chen,et al.Hepatitis B virus surface antigen canactivate human monocyte-derived dendritic cells by nuclear factor kappa B andp38 mitogen-activated protein kinase mediated signaling.Microbiology andimmunology,2012,56(10):719-27。
发明内容
本发明提供一种婴儿树突状细胞的制备及其应用，旨在解决背景技术提出的问题。
本发明是这样实现的：
一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)完全培养基的制备：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的1640培养基，1％的青霉素-链霉素溶液和10％的胎牛血清；
3)第一混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第一混合液；
4)第二混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中均加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第二混合液；
5)第三混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第三混合液；
6)培养第七天，从第三混合液中得到婴儿未成熟树突状细胞。。
优选的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度为1.5ng/ml。
优选的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度为10ng/ml。
一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)制备完全培养基：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的1640培养基，1％的青霉素-链霉素溶液和10％的胎牛血清；
3)第四混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第四混合液；
4)第五混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，再吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第五混合液；
5)第六混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第六混合液；
6)第七混合液的制备：培养第七天，向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入2ul的LPS形成第七混合液；
7)培养第九天，从第七混合液中得到婴儿成熟树突状细胞。
优选的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为1.5ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
优选的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为10ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
优选的，通过上述方案所述制备方法制备可以得到的婴儿树突状细胞。
优选的，本发明提供了上述方案制备的所述的婴儿树突状细胞在HBsAg阳性母亲婴儿乙肝疫苗免疫反应中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中，相比于无法稳定传代的人原代细胞所制备的树突状细胞，细胞系THP-1可以稳定重复传代，THP-1制备的树突状细胞，有更稳定的基因背景，利于实验结果的重现，不受不同供血者个体差异以及同一供血者不同时期生理状况差异的影响；
2、本发明中，相比于短时间内来源有限的人原代细胞制备的树突状细胞，传代细胞系THP-1可以进行多次传代，THP-1制备的树突状细胞的来源量大，进行体外实验的分子机制研究不受细胞量的限制；
3、本发明中，由于原代细胞制备的树突状细胞在体外存活时间很短(1周)，而传代细胞系THP-1制备树的突状细胞在体外可以存活相当长的时间(3周)，不受干预作用时长的限制；
4、本发明中，相比于鼠骨髓细胞制备树突状细胞，THP-1是从一名患有急性单核细胞白血病1岁男婴的外周血中分离得到，THP-1制备的树突状细胞的生物背景更接近人类，研究HBV感染与乙肝疫苗免疫机制时，对人类的外推性强，推广应用价值更高，不受物种差异的影响；
5、本发明中，由于研究婴儿乙肝疫苗免疫应答机制时，婴儿原代细胞来源的DC含量极少难以满足体外实验细胞量最低要求，且脐血来源或成人外周血来源的DC对婴儿DC的模拟效果较差，而THP-1细胞系是从1岁男婴外周血中分离得到，因此，THP-1来源的DC生物学性状更接近婴儿，可更贴切地模拟婴儿对乙肝疫苗免疫反应。
附图说明
图1为本发明200倍显微镜视野下THP-1诱导的婴儿未成熟DC形态；
图2为本发明200倍显微镜视野下THP-1诱导的婴儿成熟DC形态。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：
一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)完全培养基的制备：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的RPMI 1640培养基(RPMI 1640，BI)，1％的青霉素-链霉素混合溶液(Penicillin-Streptomycin，BI)和10％的胎牛血清(Foetal Bovine Serum，Gibco)；
3)第一混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第一混合液；
4)第二混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中均加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第二混合液；
5)第三混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第三混合液；
6)培养第七天，从第三混合液中得到婴儿未成熟树突状细胞。
进一步的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度为1.5ng/ml。
一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)制备完全培养基：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的1640培养基，1％的青霉素-链霉素溶液和10％的胎牛血清；
3)第四混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第四混合液；
4)第五混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，再吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第五混合液；
5)第六混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第六混合液；
6)第七混合液的制备：培养第七天，向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入2ul的脂多糖(LPS，sigma)形成第七混合液；
7)培养第九天，从第七混合液中得到婴儿成熟树突状细胞。
进一步的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为1.5ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
在本实施方式中，本发明为一种婴儿树突状细胞的制备方法，涉及其在HBsAg阳性母亲婴儿乙肝疫苗免疫反应中的模拟应用。婴儿未成熟树突状细胞制备步骤3)中要求向第一混合液中加入1ml浓度为14ng/ml的rhGM-CSF和浓度为3ng/ml的rhIL-4的完全培养基，最终使THP-1的终密度为5×105个/ml，且rhGM-CSF的终浓度为7ng/ml，rhIL-4的终浓度为1.5ng/ml；婴儿未成熟树突状细胞制备步骤6)中对培养七天的第三混合液进行形态学观察和流式细胞术检测分析，婴儿未成熟树突状细胞制备制备成功的标志为：形态学上部分发生聚团，部分半贴壁，边界不圆润，个别细胞伸出短小突起，流式细胞术显示表面分子CD80低表达，CD86中表达。
婴儿成熟树突状细胞制备步骤3)中要求向第四混合液中加入1ml浓度为14ng/ml的rhGM-CSF和浓度为3ng/ml的rhIL-4的完全培养基，使THP-1的终密度为5×105个/ml，且rhGM-CSF的终浓度为7ng/ml，rhIL-4的终浓度为1.5ng/ml；婴儿成熟树突状细胞制备步骤6)中向第七混合液中加入2ul浓度为1ug/ul的LPS，使其终浓度为1ug/ml；婴儿成熟树突状细胞制备步骤7)中对第七混合液进行形态学观察和流式细胞术检测分析，婴儿成熟树突状细胞制备成功的标志为：形态学上聚团明显，大部分半贴壁，层叠生长，形状不规则，细胞伸出长短不一的树突状突起或伪足，流式细胞术显示表面分子CD80中表达，CD86高表达。
具体实验方案为：
一、实验分组：
组1：阴性对照组1：婴儿未成熟DC，在7d+12h形态学观察，行流式细胞术检测。
组2：阳性对照组1：婴儿未成熟DC+LPS，在7d+12h形态学观察，行流式细胞术检测。
组3：HBV组：未成熟DC+HBV(MOI＝0.5)，在7d+12h形态学观察，行流式细胞术检测。
组4：阴性对照组2：婴儿未成熟DC，在7d+36h形态学观察，行流式细胞术检测。
组5：阳性对照组2：7d+12h时，婴儿未成熟DC+LPS，在7d+36h形态学观察，行流式细胞术检测。
组6：乙肝疫苗组：7d+12h时，婴儿未成熟DC+乙肝疫苗(1ug/ml)，在7+36h形态学观察，行流式细胞术检测。
组7：HBV+乙肝疫苗组：7d时，婴儿未成熟DC+HBV(MOI＝0.5)，7d+12h时，未成熟DC+乙肝疫苗(1ug/ml)，在7+36h形态学观察，行流式细胞术检测。
二、检测方法：
1、DC第一信号分子HLA-DR和第二信号分子CD80、CD86的蛋白水平检测：流式细胞术(FCM)。
(1)FCM原理：抗原抗体特异性结合。
(2)FCM所用仪器和试剂：
CytoFlex流式细胞仪(贝克曼)；HLA-DR抗体(HLA-DR Monoclonal Antibody-PerCP-Cyanine5.5，Bdbiosciences)；CD80抗体(Mouse Anti-Human CD80-FITC，Bdbiosciences)；CD86抗体(Mouse Anti-Human CD86-FITC，Bdbiosciences)。
(3)FCM步骤：
①收集各组细胞，设置相应的表面分子管，1200rpm离心5分钟，弃上清，剩100μl细胞悬液；
②加抗体：“CD86”管加入2μl CD86抗体，“CD80、HLA-DR”管加入2种相应的抗体各2μl，4℃避光孵育15分钟；
③加PBS：各加1ml，1200rpm离心5分钟，弃上清；
④重悬上机：各加200μl的4℃预冷的PBS，上机。
⑤数据获取与分析：采用CytExpert软件圈门，获取流式细胞术分子表达百分比数据，采用SPSS软件进行统计分析。
2、DC第三信号分子IL-12A转录水平检测：逆转录荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)。
(1)RT-qPCR原理：碱基互补配对。
(2)RT-qPCR所用仪器和试剂：
基因扩增仪(杭州博日)，Mx3005P荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；RNA提取试剂盒(M5total RNA Extraction Reagent)，逆转录试剂盒(GoTaq qPCR Master Mix)，荧光定量PCR试剂盒(GoScript Reverse Transcription Mix,Oligo(dT))。
(3)RT-qPCR步骤：
①提取RNA：收集各组细胞，按照RNA提取试剂盒说明书，提取细胞中的总RNA；
②逆转录：以总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书设置反应体系，设置基因扩增仪的反应条件为25℃-5min→42℃-30min→85℃-5min，将RNA逆转录为cDNA；
③引物序列：
Figure BDA0003828198310000121
④反应体系：按照荧光定量PCR试剂盒说明书设置体系。
⑤反应条件：设置Mx3005P荧光定量PCR仪的反应条件为95℃，10min→95℃，15s，39个循环→60℃，1min→65℃；
⑥数据获取与分析：各样品C(t)值经内参基因β-actin标化后，采用EXCEL软件，根据2-△△C(t)计算IL-12A mRNA的相对表达量，采用SPSS软件进行统计分析。
三、产品结构鉴定数据：
(一)如图1所示：200倍显微镜视野下THP-1诱导的婴儿未成熟DC形态结构；
(二)如图2所示：200倍显微镜视野下THP-1诱导的婴儿成熟DC形态。
四、效果数：
(一)婴儿DC抗原提呈第一信号分子的表达
1、12h的HLA-DR在HBV组的表达明显低于阴性对照组和阳性对照组(P＜0.05)，表明HBV降低DC抗原提呈的第一信号分子HLA-DR的表达，见表1。
2、36h的HLA-DR在疫苗组的表达数值上高于阴性对照组和阳性对照组(P＞0.05)，表明乙肝疫苗一定程度上促进DC抗原提呈的第一信号分子HLA-DR的表达，见表1。
3、36h的HLA-DR在HBV+乙肝疫苗组的表达明显低于疫苗组、阴性对照组和阳性对照组(P＜0.05)，表明HBV破坏DC表面发挥抗原提呈功能的第一信号分子，从而削弱其对乙肝疫苗的反应，见表1。
表1：HBV或/和乙肝疫苗干预后DC抗原呈第一信号分子的表达
分组 HLA-DR
阴性对照-12h 0.9852±0.0067a
阳性对照-12h 0.9808±0.0036a
HBV-12h 0.0901±0.0033c
阴性对照-36h 0.9541±0.0078b
阳性对照-36h 0.9553±0.0041b
疫苗-36h 0.9602±0.0028b
HBV+疫苗-36h 0.0681±0.0008d
F 16881.164
P ＜0.001
注：字母不同表示两两比较有统计学意义。
(二)婴儿DC抗原提呈第二信号分子的表达：
1、12h的CD86与CD80分子在3组间的表达趋势一致，HBV组明显低于阴性对照组和阳性对照组(P＜0.05)，表明HBV降低DC抗原提呈的第二信号分子CD86与CD80表达，见表2。
2、36h的CD86与CD80在疫苗组明显高于阴性组，疫苗组明显低于阳性组(P＜0.05)，表明乙肝疫苗促进DC抗原提呈的第二信号分子CD86与CD80表达，见表2。
3、36h的CD86在HBV+乙肝疫苗组的表达明显低于疫苗组、阴性对照组和阳性对照组(P＜0.05)，表明HBV破坏DC表面发挥抗原提呈功能的第二信号分子，从而削弱其对乙肝疫苗的反应，见表2。
表2：HBV或/和乙肝疫苗干预后DC抗原呈第二信号分子的表达
分组 CD86 CD80
阴性对照-12h 0.5331±0.0683a 0.0283±0.0031a
阳性对照-12h 0.7316±0.0082b 0.2849±0.0111b
HBV-12h 0.0840±0.0007c 0.0164±0.0036c
阴性对照-36h 0.2976±0.0116d 0.0324±0.0017d
阳性对照-36h 0.6007±0.0153e 0.1575±0.0144e
疫苗-36h 0.4553±0.0172f 0.0515±0.0034f
HBV+疫苗-36h 0.1511±0.0064g 0.0665±0.0035g
F 147.087 351.604
P ＜0.001 ＜0.001
注：字母不同表示两两比较有统计学意义。
(三)婴儿DC抗原提呈第三信号分子的表达：
1、12h的IL-12A mRNA水平在阴性对照组在数值上低于HBV组，HBV组数值上低于阳性对照组，表明HBV一定程度上阻止DC抗原提呈第三信号分子IL-12表达水平上调到成熟状态，见表3。
2、36h的IL-12A mRNA水平在乙肝疫苗组数值上高于阴性对照组，表明乙肝疫苗促进DC抗原提呈的第三信号分子IL-12的表达，见表3。
3、36h的IL-12A mRNA在HBV+乙肝疫苗组的表达明显低于疫苗组、阴性组和阳性组，表明HBV破坏DC抗原提呈的第三信号分子，从而削弱其对乙肝疫苗的反应，见表3。
表3：HBV或/和乙肝疫苗干预后第三信号分子表达
分组 IL-12A mRNA相对表达量 F P
阴性对照-12h 1.00 4.179 0.136
阳性对照-12h 3.66±1.82
HBV-12h 1.36±0.08
阴性对照-36h 1.00 1.855 0.278
阳性对照-36h 8.88±5.19
疫苗-36h 4.44±6.10
HBV+疫苗-36h 0.55±0.40
实施例2：
一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)完全培养基的制备：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的RPMI 1640培养基(RPMI 1640，BI)，1％的青霉素-链霉素混合溶液(Penicillin-Streptomycin，BI)和10％的胎牛血清(Foetal Bovine Serum，Gibco)；
3)第一混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第一混合液；
4)第二混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中均加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第二混合液；
5)第三混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第三混合液；
6)培养第七天，从第三混合液中得到婴儿未成熟树突状细胞。
进一步的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度为10ng/ml。
一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)制备完全培养基：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的RPMI1640培养基(RPMI 1640，BI)，1％的青霉素-链霉素混合溶液(Penicillin-Streptomycin，BI)和10％的胎牛血清(Foetal Bovine Serum，Gibco)；
3)第四混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第四混合液；
4)第五混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，再吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第五混合液；
5)第六混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含人重组集落刺激因子(rhGM-CSF，R&D)和人重组白细胞介素4(rhIL-4，R&D)的完全培养基形成第六混合液；
6)第七混合液的制备：培养第七天，向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入2ul的脂多糖(LPS，sigma)形成第七混合液；
7)培养第九天，从第七混合液中得到婴儿成熟树突状细胞。
进一步的，步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为10ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
在本实施方式中，本发明为一种婴儿树突状细胞的制备方法，涉及其在HBsAg阳性母亲婴儿乙肝疫苗免疫反应中的模拟应用。婴儿未成熟树突状细胞制备步骤3)中要求向第一混合液中加入1ml浓度为50ng/ml的rhGM-CSF和浓度为20ng/ml的rhIL-4的完全培养基，最终使THP-1终密度为2.5×105个/ml，且rhGM-CSF的终浓度为25ng/ml，rhIL-4的终浓度为10ng/ml；婴儿未成熟树突状细胞制备步骤6)中对培养七天的第三混合液进行形态学观察和流式细胞术检测分析，婴儿未成熟树突状细胞制备成功的标志为：形态学上部分发生聚团，部分半贴壁，边界不圆润，个别细胞伸出短小突起，流式细胞术显示表面分子CD80低表达，CD86中表达。
婴儿成熟树突状细胞制备步骤3)中要求向第四混合液中加入1ml浓度为50ng/ml的rhGM-CSF和浓度为20ng/ml的rhIL-4的完全培养基，使THP-1终密度为2.5×105个/ml，且rhGM-CSF的终浓度为25ng/ml，rhIL-4的终浓度为10ng/ml；婴儿成熟树突状细胞制备步骤6)中向第七混合液中加入2ul浓度为1ug/ul的LPS，使其终浓度为1ug/ml；婴儿成熟树突状细胞制备步骤7)中对第七混合液进行形态学观察和流式细胞术检测分析，婴儿成熟树突状细胞制备成功的标志为：形态学上聚团明显，大部分半贴壁，层叠生长，形状不规则，细胞伸出长短不一的树突状突起或伪足，流式细胞术显示表面分子CD80中表达，CD86高表达。
实施例2的实验步骤同实施例1的实验步骤，产生的效果数为：
(一)效果数
结果显示，婴儿未成熟树突状细胞表面抗原提呈第一信号分子HLA-DR呈中高表达，抗原提呈第二信号分子CD80和CD86均呈低表达；婴儿成熟树突状细胞表面抗原提呈第一信号分子HLA-DR呈中高表达，抗原提呈第二信号分子CD80和CD86均呈中表达，见表4。表明此方案不能制备出符合要求的DC。
表4：低细胞密度与高剂量诱导剂制备的未成熟与成熟DC表面抗原提呈信号分子
DC表面分子 未成熟DC 成熟DC
CD86 0.0475 0.4194
CD80 0.0009 0.2500
HLA-DR 0.6079 0.6032
对比实施例1和实施例2，实施例1更能制备出符合要求的婴儿树突状细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养
2)完全培养基的制备：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的1640培养基，1％的青霉素-链霉素溶液和10％的胎牛血清；
3)第一混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第一混合液；
4)第二混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中均加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第二混合液；
5)第三混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第三混合液；
6)培养第七天，从第三混合液中得到婴儿未成熟树突状细胞。
2.如权利要求1所述的一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于：步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度为1.5ng/ml。
3.如权利要求1所述的一种婴儿未成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于：步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)中的加入的rhGM-CSF浓度为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度为10ng/ml。
4.一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养1岁婴儿来源的单核细胞系(THP-1)：以完全培养基采取半换液的方式进行培养；
2)制备完全培养基：完全培养基的各组分的质量百分比为：含89％的1640培养基，1％的青霉素-链霉素溶液和10％的胎牛血清；
3)第四混合液的制备：培养第一天，取1瓶THP-1细胞混匀，吸取1ml放置到六孔板的第一孔中，再向第一孔中加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第四混合液；
4)第五混合液的制备：培养第三天，用移液枪充分吹打第一孔底壁，再吸取1ml第一孔内的第一混合液放置到六孔板的第二孔中，再向第一孔和第二孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第五混合液；
5)第六混合液的制备：培养第五天，用移液枪分别充分吹打第一孔和第二孔底壁，再从第一孔和第二孔各吸取1ml第二混合液分别放置到六孔板的第三孔和第四孔中，再向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入1ml含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基形成第六混合液；
6)第七混合液的制备：培养第七天，向第一孔、第二孔、第三孔和第四孔中分别加入2ul的LPS形成第七混合液；
7)培养第九天，从第七混合液中得到婴儿成熟树突状细胞。
5.如权利要求4所述的一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于：步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为1.0×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为14ng/ml，加入的rhIL-4浓度为3ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为7ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为1.5ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
6.如权利要求4所述的一种婴儿成熟树突状细胞的制备方法，其特征在于：步骤3)中取用的THP-1细胞的浓度为0.5×106个/ml，加入的rhGM-CSF浓度为50ng/ml，加入的rhIL-4浓度为20ng/ml；
步骤4)和步骤5)中的加入的rhGM-CSF浓度均为25ng/ml，加入的rhIL-4浓度均为10ng/ml；
步骤6)中加入的LPS浓度为1ug/ul。
7.如权利要求1至6任一权利要求所述的制备方法制备得到的婴儿树突状细胞。
8.如权利要求7所述婴儿树突状细胞在HBsAg阳性母亲婴儿乙肝疫苗免疫反应中的应用。
CN202211065365.3A 2022-09-01 2022-09-01 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用 Active CN115197911B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211065365.3A CN115197911B (zh) 2022-09-01 2022-09-01 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211065365.3A CN115197911B (zh) 2022-09-01 2022-09-01 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115197911A true CN115197911A (zh) 2022-10-18
CN115197911B CN115197911B (zh) 2023-09-12

Family

ID=83571720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211065365.3A Active CN115197911B (zh) 2022-09-01 2022-09-01 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115197911B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112830974A (zh) * 2021-01-08 2021-05-25 深圳市珈钰生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112830974A (zh) * 2021-01-08 2021-05-25 深圳市珈钰生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAN GUO等: "Intracellular Overexpression of HIV-1 Nef Impairs Differentiation and Maturation of Monocytic Precursors towards Dendritic Cells", PLOS ONE, pages 1 - 9 *
于爱莲;王芳;乔云波;张玉德;张海涛;: "宫内感染乙型肝炎病毒免疫失败婴幼儿树突状细胞和T细胞亚群的变化", 中国病原生物学杂志, no. 09, pages 7 - 10 *
何娜;周迎会;张光波;陈永井;王雪峰;邱天宇;顾文超;崔浩杰;张学光;: "一株特异性识别4IgB7-H3单克隆抗体的研制及其生物学特性的初步分析", 现代免疫学, no. 06, pages 9 - 14 *
施引等: "STAT3信号通路在人急性单核细胞白血病细胞向树突状细胞分化中的作用及机制探讨", 山东医药 *
李紫薇;于宁;朱肖肖;赵霖;张博;郭强;张振;魏然;丁娜;李霞;: "人参皂苷Ro促进THP-1细胞向DC分化的作用", 中国免疫学杂志, no. 08, pages 56 - 62 *
王凡平;王明永;郭晓芳;石如玲;徐素玲;马淑君;李海斌;郭继强;杨秀丽;: "MBL抑制LPS诱导DC成熟机制的研究", 中国实验血液学杂志, no. 03, pages 245 - 249 *
罗云萍等: "白血病细胞系来源的树突状细胞诱导及其抗肿瘤免疫功能研究", 中国实验血液学杂志, pages 230 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115197911B (zh) 2023-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yoshio et al. Human blood dendritic cell antigen 3 (BDCA3)+ dendritic cells are a potent producer of interferon‐λ in response to hepatitis C virus
Laustsen et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function
Tsubouchi et al. Infection and dysfunction of circulating blood dendritic cells and their subsets in chronic hepatitis C virus infection
CN109652369B (zh) 利用外周血体外制备成熟红细胞的方法及制剂
WO1991002820A1 (en) Methods for culturing hcv in eukaryotic cells
CN112334573B (zh) 人类dc细胞扩增方法和人类dc细胞资源库
CN107164332A (zh) 经干扰序列修饰的TGF‑β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用
CN101914489A (zh) 肝炎病毒体外培养模型及其构建方法与应用
Wang et al. Exosomes in hepatitis B virus transmission and related immune response
WO2022062687A1 (zh) 肿瘤复合抗原、树突状细胞多价疫苗及其应用
EP3964579A1 (en) Method for predicting effectiveness of treatment of hemoglobinopathy
JPH09509328A (ja) 出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大
CN115197911B (zh) 一种婴儿树突状细胞的制备及其应用
Chesebro et al. Persistence of infectious Friend virus in spleens of mice after spontaneous recovery from virus-induced erythroleukemia
CN117286100A (zh) 一种基于DCline诱导细胞毒性T细胞用于治疗病毒感染的方法
CN113943704B (zh) 一种肿瘤新生抗原特异性t细胞的制备方法
CN109609452A (zh) 一种高效的巨噬细胞体外制备方法
WO2002103033A1 (fr) Procede pour detecter et isoler des cellules hepatiques indifferenciees au moyen de dlk
CN110585427B (zh) 提高机体免疫力的组合物及在抗成人t细胞白血病或鼻咽癌中的应用
CN118620040A (zh) 一种针对乙型肝炎病毒的抗原肽
CN113687077A (zh) PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用
CN115845046A (zh) 2’3’-cGAMP钠盐在制备增强DC乙肝疫苗免疫应答的药物中的应用
CN111909899A (zh) 一种富集t细胞的方法及其在过继性t细胞治疗中的应用
CN109943568B (zh) 一种单链核酸适配体及其用途
CN107541495B (zh) 一种fgf19过表达的人肝癌细胞系及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant