CN115197214A - 取代三环类prmt5抑制剂的制备方法 - Google Patents

取代三环类prmt5抑制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化学领域，涉及取代三环类PRMT5抑制剂的制备方法，具体地，涉及式(I)的(R)‑7’‑((2‑乙酰基‑2‑氮杂螺[3.3]庚‑6‑基)氨基)‑2’‑(3‑(3,4‑二氢异喹啉‑2(1H)‑基)‑2‑羟丙基)‑2’,3’‑二氢‑1’H‑螺[环丙烷‑1,4’‑[2,6]萘啶]‑1’‑酮或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，

Description

取代三环类PRMT5抑制剂的制备方法
技术领域
本发明属于医药化学领域，具体涉及(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法。
背景技术
DNA的修饰在触发细胞生长和发育的不同阶段的基因表达程序中起着核心作用，其中精氨酸甲基化在细胞进程中担任重要角色，包括信号传导，转录，RNA加工，DNA重组和修复。蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到精氨酸的胍氮来催化特定精氨酸残基的甲基化，根据催化精氨酸甲基化方式的不同可将PRMTs分为三类：I型(PRMT 1,2,3,4,6和8)催化单甲基化和不对称二甲基化，II型(PRMT5和PRMT9)催化单甲基化和对称二甲基化，而III型(PRMT7)仅进行单甲基化。
其中，PRMT5与甲基转移酶复合体蛋白50(MEP50)特异性结合，可以对称甲基化组蛋白H3和H4，并调节特定靶基因组的转录。PRMT5催化的组蛋白H3精氨酸8(R8)和H4R3对称二甲基化已显示抑制几种肿瘤抑制基因的表达，例如抑癌基因7(ST7)，视网膜母细胞瘤(RB)肿瘤抑制基因家族和受体O型蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPROt)。
除了甲基化组蛋白的能力外，PRMT5还能够甲基化几种重要的转录因子，使其在细胞调节的过程发挥重要作用。PRMT5可以甲基化p53并改变其DNA结合活性，从而引发p53控制的基因表达程序的变化。PRMT5还显示甲基化N-MYC并改变其蛋白质稳定性以及增强其在神经母细胞瘤中的致癌活性。PRMT5还可直接甲基化转录因子，包括E2F-1和NF-κB/p65，诱导其靶基因表达。PRMT5不仅可修饰核转录因子，还可甲基化细胞质蛋白如golgin，核糖体蛋白S10(RPS10)。因此，除了其直接调节其自身靶基因的能力之外，PRMT5还能够通过关键转录因子的对称甲基化间接影响全局基因表达，从而影响细胞生长，增殖和分化。
大量研究已经证实PRMT5在不同类型和侵袭性的癌症中过度表达，包括B细胞和T细胞淋巴瘤，转移性黑素瘤，神经母细胞瘤和成胶质细胞瘤，生殖细胞肿瘤，卵巢癌，鼻咽癌，乳腺癌，结肠直肠癌和胃癌。目前研究表明PRMT5在控制细胞生长和增殖中起重要作用，并且其过表达促进细胞转化。
癌细胞中增强的PRMT5表达与其靶肿瘤抑制基因的转录沉默相关。PRMT5能够通过启动子组蛋白H3R8和H4R3的甲基化以及通过修饰包括E2F1和NF-kB/p65的关键转录因子的特定精氨酸残基引起全局染色质变化来促进癌细胞生长。PRMT5还会与程序性细胞死亡4(PDCD4)相互作用，使其在R110处变为甲基化并且在MCF-7细胞中丧失其肿瘤抑制活性。总的来说，PRMT5过表达可能使其与生长促进蛋白和肿瘤抑制蛋白的相互作用，从而以有利于癌细胞生长，存活与转移。
综上所述，PRMT5抑制剂在治疗肿瘤等相关疾病方面有着明确的机制，有很大潜力可以成为肿瘤治疗领域新的治疗手段，因此，需要开发更安全、更有效的PRMT5抑制剂以满足临床需求。
发明内容
本发明的发明人发现了一种取代三环类PRMT5抑制剂，其化合物结构如下式(I)所示，化学名称为(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮(以下简称“式(I)化合物”)：
Figure BDA0003592120970000021
本发明的发明人研究发现，式(I)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对PRMT5表现出了显著的抑制活性，非常有希望成为PRMT5相关疾病的治疗剂。
众所周知，对于人类用药，出于安全性因素要求，国内和国际管理机构对原料药(API)中未确证或毒性未定杂质的限度规定非常低。原料药中的杂质可能是由于自身的降解而产生的，也可能来源于制备方法，例如，包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成副产物等。因此，需要对式(I)化合物或其衍生物的制备方法进行研究，以获得反应条件温和，工艺稳定，纯化容易，易于操作，有利于工业化大生产的制备式(I)化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物或结晶的方法。
本发明的一个目的是提供式(I)所示的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，包括使式(II)的化合物与乙酸酐发生反应的步骤，
Figure BDA0003592120970000022
本发明的发明人考察了其它条件相同时，乙酸酐不同当量对反应进程及杂质的影响，实验数据见表1。试验结果显示，乙酸酐当量为0.9当量时原料式(II)所示的化合物已反应完全，提高乙酸酐当量至1.3当量时，最大单杂增大，式(I)所示的化合物纯度下降，且过量乙酸酐对产品质量产生一定风险。因此，在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中式(I)的化合物和乙酸酐的摩尔比为约1:0.8至1:2，优选为约1:0.9至1:1.3，进一步优选为约1:0.9。
表1
Figure BDA0003592120970000031
在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中进一步包括使用缚酸剂，所述缚酸剂优选选自N,N-二异丙基乙胺和三乙胺。
在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中反应溶剂优选选自二氯甲烷和四氢呋喃。
在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，进一步包括使式(III)的化合物脱除氨基保护基制得式(II)的化合物的步骤，其中R1为氨基保护基，
Figure BDA0003592120970000032
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中R1选自烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基和芳基氧基；进一步优选地，R1选自三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(THP)、甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基、甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl，Boc)、甲氧基、乙氧基、苯氧基和三甲基硅基乙氧基。
本发明的发明人考察了其它条件相同时，不同试剂对脱除氨基保护基进程的影响，实验数据见表2。试验结果显示，三氟乙酸及HCl-1,4-二氧六环溶液均能使原料反应完全，三氟乙酸条件下反应液最大单杂仅为2.37％，式(II)的化合物纯度为85.28％。在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中进一步包括在酸性试剂存在下使式(III)的化合物脱除氨基保护基；优选地，所述的酸性试剂选自三氟乙酸和HCl-1,4-二氧六环溶液。
表2
Figure BDA0003592120970000041
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(II)的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺。
在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(IV)的化合物和式(D)的化合物发生反应制得式(III)的化合物的步骤，其中R2为离去基团，R1为氨基保护基，
Figure BDA0003592120970000042
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中R2选自氟、氯、溴和碘，优选为氯。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中R1选自烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基和芳基氧基；进一步优选地，R3选自三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基、甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(THP)、甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基、甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl，Boc)、甲氧基、乙氧基、苯氧基和三甲基硅基乙氧基。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其进一步包括使用缚酸剂，优选地，所述的缚酸剂选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、三乙胺、叔丁醇钠和氢氧化钠。
在一些实施方案中，根据本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括催化剂，优选地，其中所述的催化剂选自四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)和三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd2(dba)3)。
本发明的发明人考察了其它条件相同时，三(二亚苄基丙酮)二钯作为金属催化剂，仅配体不同时化合物(IV)的剩余量及化合物(III)生成量，具体数据见表3，实验数据显示，选用Xphos和DPEphos为配体时，原料式(IV)的化合物剩余量较多；而以Ruphos、tBuXphos、Davephos和Johnphos为配体时，式(IV)的化合物基本反应完全，其中tBuXphos为配体时转化率最高，产物式(III)的化合物为80.41％。因此，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括配体，优选地，其中所述的配体选自2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(Ruphos)、2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯(Davephos)、2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos)、2-(二叔丁基膦)联苯(Johnphos)、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)、2-二叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(tBuXphos)、双(2-二苯基磷苯基)醚(DPEphos)和2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(RuPhos)；优选地，所述的配体选自2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯(Ruphos)、2-二叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(tBuXphos)、2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯(Davephos)和2-(二叔丁基膦)联苯(Johnphos)。
表3
Figure BDA0003592120970000051
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(III)的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和甲苯。
在一些具体的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(V)的化合物与式(C)的化合物发生反应生成式(IV)的化合物的步骤，其中，R2为离去基团，X为酸性试剂，
Figure BDA0003592120970000061
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(IV)的化合物的制备方法，其中R2选自氟、氯、溴和碘，优选为氯。
在一些优选的实施方案中，本发明的式(IV)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使用缚酸剂，优选地，所述的缚酸剂选自碳酸钠、碳酸钾、三乙胺、氢氧化钠和碳酸铯。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(IV)的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯和N,N-二甲基甲酰胺。
在一些优选的实施方案中，本发明的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(A)的化合物和式(B)的化合物在缚酸剂的存在下发生反应，再与酸性试剂反应生成式(V)的化合物的步骤，其中R3选自卤素，X为酸性试剂，
Figure BDA0003592120970000062
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(V)的化合物的制备方法，其中R3选自氟、氯、溴和碘，优选为氯。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(V)的化合物的制备方法，其中X选自顺丁烯二酸。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(V)的化合物的制备方法，其中缚酸剂选自碳酸钠、碳酸钾、三乙胺和氢氧化钠。
在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(V)的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自无水乙醇。
在一些具体的实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：
Figure BDA0003592120970000071
1)以无水乙醇为反应溶剂，碳酸钾为缚酸剂，式(A)的化合物与式(B-1)的R-(-)-环氧氯丙烷反应，再与顺丁烯二酸成盐制得式(V-1)的化合物；
2)以乙酸乙酯为反应溶剂，三乙胺为缚酸剂，先将式(V-1)的化合物游离，随后以N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，碳酸铯为缚酸剂，式(C-1)的化合物与式(V-1)的游离碱反应制得式(IV-1)的化合物；
3)以四氢呋喃为反应溶剂，叔丁醇钠为缚酸剂，三(二亚苄基丙酮)二钯和2-二叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯为催化剂，式(IV-1)的化合物和式(D-1)的化合物发生Buchwald偶联反应得发生反应制得式(III-1)的化合物；
4)以二氯甲烷为反应溶剂，在三氟乙酸条件下，式(III-1)的化合物脱去Boc基团得式(II)的化合物；
5)以二氯甲烷为反应溶剂，N,N-二异丙基乙胺为缚酸剂，式(II)的化合物与乙酸酐反应制得式(I)的化合物。
在一些优选的实施方案中，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，降温析晶；优选地，本发明提供式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，在氮气氛围下升温，过滤，降温析晶；其中所述溶剂优选选自二氯甲烷、乙腈、水、碳原子数小于6的酯类、碳原子数小于6的醇类和碳原子数小于6的酮类中的一种或几种，更优选选自乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、仲丁醇、异丙醇、二氯甲烷、丙酮和水中的一种或几种。
本发明的发明人发现，本发明提供的式(I)化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法反应路线步骤少、操作简便、更加环境友好、有较高的收率及纯度，反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，能够满足工业规模的生产和应用。
术语说明
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本发明的“离去基团”，具有本领域的通常含义，是指可以容易地置换的基团，当形成新键时，由分子发生置换反应的分子上的活性官能团。具有此功能的基团是本领域技术人员众所周知的，其具体实例可进一步参考本领域常见的有机合成手册。例如，所述离去基团可以是卤素原子、氨基、烷氧基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、羟基、羟基的活性酯，例如羧酸酯、磺酸酯、磷酸酯或硼酸酯。
本发明的“氨基保护基”是指本领域已知的适当的用于氨基保护的基团，参见文献(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5Th Ed.T.W.Greene&P.G.M.Wuts)中所述的氨基保护基团。例如，所述的氨基保护基可以是(C1-10烷基或芳基)三硅烷基，例如三甲基硅基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基、叔丁基二苯基硅基等；可以是C1-10烷基或取代烷基，例如甲基、叔丁基、烯丙基、三苯甲基、苄基、甲氧基甲基、乙氧基乙基、2-四氢吡喃基(THP)等；可以是(C1-10烷基或芳基)酰基，例如甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等；可以是(C1-6烷基或C6-10芳基)磺酰基，例如甲磺酰基、乙磺酰基、苯甲磺酰基等；可以是(C1-6烷氧基或C6-10芳基氧基)羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、苄氧羰基、2-联苯基-2-丙氧羰基、笏甲氧羰基、苯氧羰基、叔丁氧羰基；也可以是C1-6烷氧基或C6-10芳基氧基，例如甲氧基、乙氧基、苯氧基、三甲基硅基乙氧基等。
本发明的“缚酸剂”，具有本领域的通常含义，优选地，其中所述的缚酸剂选自醇盐碱、碱金属醇盐和碳酸盐碱；进一步优选地，所述缚酸剂选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、叔戊醇钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、碳酸氢铯、磷酸钾和磷酸氢二钾。
本发明的“酸”或“酸性试剂”可选自盐酸、氢溴酸、磷酸、氨基磺酸、硝酸、对甲基苯磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、乙酸、乙二酸、苯乙酸、丙酸、丙二酸、三氟乙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、抗坏血酸、双羟萘酸、羟基马来酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、柠檬酸、D-葡萄糖酸、乳酸、L-苹果酸、琥珀酸、L-酒石酸、富马酸、α-酮戊二酸、马尿酸、马来酸、D-酒石酸、甲烷磺酸或其类似物。
本发明“碱性试剂”是指能够使羟基或氨基去质子化的化合物。碱的实例包括但不限于，与醇溶剂组合的(C1-6烷基)氧化物((C1-6烷基)OM)，其中(C1-6烷基)氧化物包括但不限于MeO-、EtO-、n-PrO-、i-PrO-、t-BuO-、i-AmO-(异戊氧基)等，且其中M是碱金属阳离子，例如Li+、Na+、K+等。醇溶剂包括(C1-6烷基)OH，例如，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、异戊醇等。还可以使用非烷氧基碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、六甲基二甲硅基胺钠、六甲基二甲硅基胺锂、二异丙基酰胺锂、氢化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、DBU(1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯)、DBN(1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯)、格氏试剂例如(C1-6烷基)Mg(卤素)，其包括但不限于甲基氯化镁、甲基溴化镁、叔丁基氯化镁、叔丁基溴化镁等。
术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本发明化合物的形式。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明范围内，溶剂合物优选是水合物。
术语“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。
本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括13C和14C，氧的同位素包括16O和18O等。
具体实施方式
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
实施例1：(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮的制备
Figure BDA0003592120970000091
步骤1、(R)-2-(环氧乙烷-2-基甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉顺丁烯二酸盐的制备
Figure BDA0003592120970000092
于50L玻璃反应釜中加入无水乙醇(4.26kg)和R-(-)-环氧氯丙烷(0.75kg，8.11mol)。随后滴加1,2,3,4-四氢异喹啉(0.90kg，6.77mol)，控制反应体系内温不高于30℃。滴毕，维持25℃±5℃反应6h，加入碳酸钾(1.87kg，13.53mol)，维持25℃±5℃反应2h，反应完全后，过滤，以无水乙醇(2.13kg)淋洗反应釜，淋洗液用于漂洗滤饼。随后将滤液转移至50L玻璃反应釜中，缓慢加入顺丁烯二酸(0.86kg，7.41mol)，室温搅拌0.5h后冷却至5℃±5℃，析晶8h以上，过滤，以无水乙醇(0.71kg)淋洗反应釜，淋洗液用于漂洗滤饼，滤饼于40℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体1.59kg，收率77.1％。
步骤2、(R)-7'-氯-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000101
于50L玻璃反应釜中加入乙酸乙酯(6.44kg)和(R)-2-(环氧乙烷-2-基甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉顺丁烯二酸盐(1.43kg，4.68mol)，室温下搅拌均匀，随后加入三乙胺(1.18kg，11.70mol)，室温搅拌0.5h后加入纯化水(7.14kg)，搅拌1小时后分层，有机层用纯化水(7.14kg)洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干得红色液体。
于10L玻璃反应釜中加入N,N-二甲基甲酰胺(4.91kg)、上述红色液体、7'-氯-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-1'-酮(0.65kg，3.12mol)和碳酸铯(2.03kg，6.24mol)，随后加热将反应体系升温至95℃±5℃，反应1h，反应完全后，将反应体系冷却至25℃±5℃，过滤，滤饼用乙酸乙酯(4.69kg)漂洗。将滤液转移至50L玻璃反应釜中，加入水(10.40kg)洗涤，静置分层，水层用乙酸乙酯(4.69kg)萃取，静置分层，合并有机层，加入水(10.40kg)洗涤，静置分层，有机层加入无水硫酸钠干燥脱水，过滤，浓缩至干，加入乙酸乙酯(1.17kg)转移至10L玻璃反应釜中，加入正庚烷(1.33kg)，冷却至10℃±5℃打浆3小时以上，过滤，用正庚烷(0.44kg)淋洗反应釜，淋洗液用于漂洗滤饼，滤饼于40℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体0.95kg，收率76.6％。
步骤3、(R)-6-((2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-1'-氧代-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-7'-基)氨基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0003592120970000102
在10L玻璃反应釜中加入四氢呋喃(8.16kg)、(R)-7'-氯-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-1'-酮(0.92kg，2.31mol)、tert-butyl 6-氨基-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(0.59kg，2.78mol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0.04kg，0.046mol)，2-二叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(0.08kg，0.184mol)和叔丁醇钠(0.44kg，4.62mol)，随后用氮气置换空气，接着将反应液升温至65℃±5℃反应1h，反应结束后，将反应液冷却至25℃±5℃，过滤，滤饼用二氯甲烷(12.19kg)漂洗。将滤液转移至50L玻璃反应釜中，以纯化水(9.20kg)洗涤有机层3次，随后于有机层加入无水硫酸钠(1.84kg)干燥脱水，过滤，浓缩至干，加入乙酸乙酯(5.81kg)转移至50L玻璃反应釜中，加入正庚烷(8.81kg)，室温打浆8小时以上，过滤，滤饼于35℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体1.17kg，收率88.3％。
步骤4、(R)-7'-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000111
在10L玻璃反应釜中加入二氯甲烷(6.04kg)和(R)-6-((2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-1'-氧代-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-7'-基)氨基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(1.14kg，2.00mol)，随后将反应体系降温至5℃±5℃，滴加三氟乙酸(3.50kg)，并控制反应体系内温不高于30℃。加毕，维持25℃±5℃反应1h，反应完全后，浓缩反应液，加入纯化水(5.70kg)溶解后转移至50L玻璃反应釜，加入甲基叔丁基醚(4.22kg)，搅拌分层，有机层用纯化水(5.70kg)洗2次，合并水层转移至50L玻璃反应釜，加入乙腈(4.48kg)，在25℃±5℃下用2M氢氧化钠水溶液调节pH值至8～9。随后加入二氯甲烷萃取(30.21kg)，有机层加入无水硫酸钠，过滤，将滤液转移至50L玻璃反应釜，加入巯基硅胶(0.06kg，)，在25℃±5℃下搅拌0.5h，过滤，浓缩至干，固体于35℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体0.898kg，收率95.4％。
步骤5、(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮的制备
Figure BDA0003592120970000112
于50L玻璃反应釜中加入二氯甲烷(11.79kg)、(R)-7'-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[2,6]萘啶]-1'-酮(0.89kg，1.88mol)和N,N-二异丙基乙胺(0.49kg，3.76mol)，随后将反应体系冷却至0℃±5℃，滴加乙酸酐(0.16kg，1.69mol)的二氯甲烷(1.18kg)溶液，并控制反应体系内温不高于5℃，加毕维持0℃±5℃反应0.5h，反应完全后加入氢氧化钠(0.014kg)水(8.90kg)溶液，搅拌静置分层，有机层用纯化水(8.90kg)洗涤2次，无水硫酸钠干燥脱水，过滤，浓缩至干，加二氯甲烷(1.18kg)溶解后通过柱层析(洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1/20)分离纯化，柱液收集浓缩至干，固体于35℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体0.655kg，收率67.6％。
步骤6、(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮的精制
Figure BDA0003592120970000121
在20L玻璃反应釜中加入乙酸乙酯(2.62kg)，加入以上步骤中制得的(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮(0.58kg)，氮气氛围下升温至75℃±5℃搅拌3小时。随后将反应体系降温至25℃±5℃，搅拌析晶3小时，过滤，用乙酸乙酯(0.26kg)淋洗反应釜，淋洗液用于漂洗滤饼，滤饼于35℃±5℃真空干燥12小时以上，得固体0.49kg，收率84.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.71(s,1H),7.00-7.15(m,4H),6.87(m,1H),4.78(s,1H),4.16(s,1H),4.04-4.10(m,3H),3.88(m,1H),3.70-3.80(m,3H),3.61-3.63(m,2H),2.80-2.83(m,2H),2.70-2.72(m,2H),2.18-2.20(m,1H),1.98-2.02(m,4H),1.72(s,3H),1.24-1.30(m,4H),0.94-1.0(m,4H).LC-MS m/z:[M+H]+＝516.3.
比较例1：(S)-6-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-N-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)嘧啶-4-甲酰胺(化合物A)
Figure BDA0003592120970000122
参照WO2014/100719(PCT/US2013/077235)中化合物208公开的方法制备上式代表的化合物A，并通过氢谱和质谱鉴定。
比较例2：(R)-7'-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟基丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(化合物B)
Figure BDA0003592120970000123
步骤1:2-(1-氰基环丙基)苯甲酸甲酯的制备
Figure BDA0003592120970000124
将氢化钠(4.46g，111mmol)置于三颈瓶中，0℃下加入20mL无水N,N-二甲基甲酰胺，搅拌5min，缓慢加入2-(氰基甲基)苯甲酸甲酯(7.80g，44.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(80mL)，0℃下搅拌30min，然后缓慢滴加1,2-二溴乙烷(10.0g，53.5mmol)，滴毕后移至室温反应2h。反应完全后，加入20mL饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝202.
步骤2：2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000131
将2-(1-氰基环丙基)苯甲酸甲酯(13.3g，66.1mmol)溶解于150mL无水乙醇中，加入六水合氯化钴(31.5g，132mmol)，0℃下分批加入硼氢化钠(7.54g，198mmol)，移至室温反应1h后80℃反应2h。反应完全后，抽滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝174.
步骤3：7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000132
将2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(6.33g，36.6mmol)溶解于冰浴下冷却的浓硫酸(30mL)中，-10℃下分批加入硝酸钾(3.69g，36.6mmol)，移至室温反应1h。反应完全后，倒入冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼干燥得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝219.
步骤4：7'-氨基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000133
将7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(4.57g，210mmol)溶解于40mL乙醇和10mL水的混合溶剂中，加入铁粉(2.93g，52.4mmol)，氯化铵(3.33g，62.9mmol)，80℃反应2h。反应完全后，抽滤，滤液减压浓缩，二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝189.
步骤5：7'-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000141
将7'-氨基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(1.55g，8.24mmol)，1-乙酰基-4-哌啶酮(1.16g，8.24mmol)溶解于20mL甲醇中，加入冰醋酸(0.472mL，8.24mmol)，室温反应2h。然后0℃下缓慢滴加硼烷吡啶络合物(1.24mL，12.4mmol)，移至室温2h。反应完全后，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至碱性，二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝314.
步骤6：(R)-7'-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟基丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(化合物B)的制备
Figure BDA0003592120970000142
将7'-((1-乙酰基哌啶-4-基)氨基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(1.56g，4.98mmol)溶解于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，0℃下分批加入氢化钠(0.299g，7.48mmol)，搅拌30min，加入(R)-2-(环氧乙烷-2-基甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(0.942g，4.98mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)，移至室温反应过夜。反应完全后，加入8mL饱和氯化铵溶液淬灭，减压蒸除溶剂，经柱层析分离，经prep-HPLC(制备液相)制备分离得到标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.16-7.23(m,1H),7.05-7.16(m,3H),6.99-7.05(m,1H),6.65-6.77(m,2H),5.57(d,1H),4.75(s,1H),4.19(d,1H),3.94-4.10(m,1H),3.71-3.87(m,2H),3.62(s,2H),3.42-3.54(m,2H),3.34-3.41(m,1H),3.11-3.25(m,2H),2.75-2.94(m,3H),2.62-2.74(m,2H),2.36-2.48(m,2H),2.00(s,3H),1.79-1.96(m,2H),1.12-1.36(m,2H),0.75-0.97(m,4H).LC-MS m/z:[M+H]+＝503.
比较例3、(R)-7'-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(化合物C)
Figure BDA0003592120970000143
步骤1:2-(1-氰基环丙基)苯甲酸甲酯的制备
Figure BDA0003592120970000144
将氢化钠(4.46g，111mmol)置于三颈瓶中，0℃下加入20mL无水N,N-二甲基甲酰胺，搅拌5min，缓慢加入2-(氰基甲基)苯甲酸甲酯(7.80g，44.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(80mL)，0℃下搅拌30min，然后缓慢滴加1,2-二溴乙烷(10.0g，53.5mmol)，滴毕后移至室温反应2h。反应完全后，加入20mL饱和氯化铵溶液淬灭，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝202.
步骤2：2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000151
将2-(1-氰基环丙基)苯甲酸甲酯(13.3g，66.1mmol)溶解于150mL无水乙醇中，加入六水合氯化钴(31.5g，132mmol)，0℃下分批加入硼氢化钠(7.54g，198mmol)，移至室温反应1h后80℃反应2h。反应完全后，抽滤，滤液减压蒸除溶剂，柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝174.
步骤3：7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000152
将2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(6.33g，36.6mmol)溶解于冰浴下冷却的浓硫酸(30mL)中，-10℃下分批加入硝酸钾(3.69g，36.6mmol)，移至室温反应1h。反应完全后，倒入冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼干燥得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝219.
步骤4:(R)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000153
将7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(300mg,1.38mmol)溶解于10mL DMSO中，加入碳酸铯(900mg,2.75mmol)后室温搅拌0.5h，加入(R)-2-(环氧乙烷-2-基甲基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(520mg,2.75mmol)，100℃反应3h。反应完全后，加入水50mL，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂，经柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝408.
步骤5:(R)-7'-氨基-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000161
将(R)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-7'-硝基-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(500mg,1.23mmol)，还原铁粉(274mg,4.9mmol)，氯化铵(260mg,4.90mmol)，加入10mL乙醇和2mL水的混合溶液中，75℃反应2h。反应完全后，过滤，滤液减压蒸除溶剂，加入二氯甲烷20mL，过滤，滤液减压蒸除溶剂，得到标题化合物。LC-MSm/z:[M+H]+＝378.
步骤6:(R)-6-((2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-1'-氧代-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基)氨基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的制备
Figure BDA0003592120970000162
将(R)-7'-氨基-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(200mg,0.526mmol)，6-氧代-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(65.06mg,0.582mmol)溶解于5mL甲醇中，加入一滴冰醋酸，室温搅拌0.5h，冰浴滴加吡啶硼烷(74.0mg,0.796mmol)，室温搅拌0.5h。反应完全后，减压蒸除溶剂，经柱层析分离得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝573.
步骤7:(R)-7'-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000163
将(R)-6-((2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-1'-氧代-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基)氨基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(180mg，0.315mmol)溶解于10mL氯化氢甲醇(4.0mol/L)溶液中，室温搅拌0.5h。反应完全后，减压蒸除溶剂，得到标题化合物。LC-MS m/z:[M+H]+＝473.
步骤8:(R)-7'-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮的制备
Figure BDA0003592120970000164
将(R)-7'-((2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2'-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-1'-酮(140mg,0.297mmol)加入10mL二氯甲烷中，加入三乙胺至溶液呈弱碱性，完全溶解后，加入醋酸酐(61.0mg,0.593mmol)，室温搅拌15min。反应完全后，减压蒸除溶剂，柱层析分离得标题化合物。1HNMR(400MHz,MeOD)δ7.74(s,1H),7.31(m,1H),7.14-7.12(m,4H),7.06-7.00(m,1H),4.25-4.23(m,1H),4.05-3.83(m,5H),3.70-3.61(m,2H),3.45-3.37(m,2H),3.05-2.90(m,4H),2.87-2.72(m,2H),2.02-1.98(m,2H),1.93(s,3H),1.84-1.81(m,1H),1.79-1.76(m,3H),1.34-1.02(m,4H).LC-MS m/z:[M+HCO2 -]-＝559.
实验例1化合物体外激酶活性评价
1.实验材料
化合物：(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮和化合物C分别用DMSO配制成10mM母液，最终稀释为10个浓度进行检测，终浓度为10000.00nM、3333.33nM、1111.11nM、370.37nM、123.46nM、41.15nM、13.72nM、4.57nM、1.52nM、0.51nM。
试剂与耗材：PRMT5，购自于Active Motif公司，货号为31921；多肽底物H4(1-21)S1ac，购自于吉尔生化(上海)有限公司，货号为342095；[3H]-SAM，购自于PerkinElmer公司，货号为NET155V001MC；SAM，购自于Sigma，货号为A7007-100MG；SAH，购自于Sigma公司，货号为A9384-25MG；DTT，购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为A620058-0005。Corning-3657，购自于Corning公司，货号为3657；Echo Qualified 384-Well，购自于Labcyte公司，货号为P-05525；FlashPlate，购自于Perkin Elmer，货号为SMP410J001PK。
仪器：闪烁计数仪，购自于PerkinElmer公司，型号为MicroBeta2；超声波纳升液体处理系统，购自于Labcyte公司，型号为Echo 550。
2.实验方法
2.1.反应缓冲液和反应终止液配制：1倍反应缓冲液体成分为10mM Tris-HCl,pH8.0；0.01％Tween-20；1mM DTT。反应终止液成分为125μM的3H-SAM溶液。
2.2化合物配制
2.2.1化合物稀释
化合物用100％DMSO溶解成10mM母液，再将化合物在Echo384孔板上稀释到所需要的浓度。
2.2.2转移化合物到384反应板
用Echo550仪器从上述稀释好Echo384孔板中转移250nL化合物到384孔反应板中。
2.3酶学反应
2.3.1配制1.67倍酶溶液
将PRMT5加入1倍反应缓冲液，形成1.67倍酶溶液。
2.3.2配制2.5倍的底物溶液
将多肽底物和[3H]-SAM加入1倍反应缓冲液，形成2.5倍底物溶液(终浓度分别为100nM和250nM)。
2.3.3向384孔板中加入酶溶液
向384孔反应板孔中加入15μL的1.67倍酶溶液。对于无酶活对照孔，用15μL的1倍反应缓冲液替代酶溶液。1000rpm离心1min，室温下孵育15分钟。
2.3.4向384孔板中加入底物溶液启动酶学反应
向384孔反应板每孔中加入10μL的2.5倍底物溶液。1000rpm离心1min。25℃反应60分钟。
2.3.5酶学反应的终止
向384孔反应板每孔中加入5μL的反应终止液终止反应。从试验板中每孔取25uL转移到Flashplate中，在室温下放置1h。然后用0.1％的Tween-20溶液洗Flashpate板3次。
2.4MicroBeta 2读取数据
2.4抑制率计算
从Microbeta 2上复制数据。把数据转化成抑制率数据。其中最大值是指DMSO对照的转化率，最小值是指无酶活对照的转化率。抑制率(％)＝(最大值-样本值)/(最大值-最小值)×100％。
将数据导入GraphPad，并使用“log(inhibitor)vs.response--Variable slope”进行曲线拟合，得到IC50。部分化合物的IC50结果见表4。
表4
Figure BDA0003592120970000181
实验例2化合物体外细胞活性评价
1.实验材料
受试化合物：(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮和化合物A、化合物B分别用DMSO配制成10mM母液，最终稀释为8个浓度进行检测，Z-138细胞实验的化合物终浓度为33333.00nM、6666.60nM、1333.32nM、266.66nM、53.33nM、10.67nM、2.13nM、0.43nM，MDA-MB-468和NCI-H358细胞实验化合物终浓度为50000nM、10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM。
人套细胞淋巴瘤细胞Z-138、三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、人非小细胞肺癌细胞NCI-H358购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
试剂：Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMEM培养基)，货号为ATCC 30-2005；Leibovitz's L-15Medium(L-15培养基)，货号为Gibco 11415-064；1640培养基，货号为Gibco22400089；马血清，货号为Gibco 16050122；Fetal Bovine Serum，货号为Gibco10099-141；青链霉素，货号为Gibco 15140-122；丙酮酸钠，货号为Gibco 11360070；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay，货号为Promega G7571。CCK-8增殖抑制检测试剂盒，货号为KeyGEN KGA317。
2.实验方法
2.1细胞复苏：
2.1.1Z-138细胞复苏：从液氮罐中取出Z-138细胞冻存管置于37℃水浴锅中，轻轻摇动使其尽快解冻。解冻后取出冻存管，用酒精棉球消毒后旋开盖子，吸出细胞液注入离心管，并加入1mL含10％马血清的完全培养基，混匀后置于离心机中，1000rpm，离心5min。之后弃上清液，加入完全培养基反复吹打至细胞完全吹散、重悬。以适宜浓度接种于培养皿中。置37℃，5％CO2、95％潮湿空气的CO2培养箱中培养。
2.1.2MDA-MB-468细胞复苏：从液氮罐中取出MDA-MB-468细胞冻存管置于37℃水浴锅中，轻轻摇动使其尽快解冻。解冻后取出冻存管，用酒精棉球消毒后旋开盖子，吸出细胞液注入离心管，并加入1mL含10％FBS的L-15培养基，混匀后置于离心机中，1000rpm，离心5min。之后弃上清液，加入完全培养基反复吹打至细胞完全吹散、重悬。以适宜浓度接种于培养皿中。置37℃，95％潮湿空气的无CO2培养箱中培养。
2.1.3NCI-H358细胞复苏：从液氮罐中取出NCI-H358细胞冻存管置于37℃水浴锅中，轻轻摇动使其尽快解冻。解冻后取出冻存管，用酒精棉球消毒后旋开盖子，吸出细胞液注入离心管，并加入1mL含10％FBS的1640培养基，混匀后置于离心机中，1000rpm，离心5min。之后弃上清液，加入完全培养基反复吹打至细胞完全吹散、重悬。以适宜浓度接种于培养皿中。置37℃，5％CO2，95％潮湿空气的CO2培养箱中培养。
2.2细胞培养和传代：
2.2.1Z-138细胞培养和传代：细胞生长至约80-90％，将培养基(IMDM培养基+10％马血清+1％青链霉素)转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。去除上清，用完全培养基重悬细胞，按所需密度接种于培养皿中，置于37℃、5％CO2、95％潮湿空气的培养箱中培养，视细胞生长情况每2-3天补一次培养液或进行传代。
2.2.2MDA-MB-468细胞培养和传代：细胞生长至约80-90％，将培养基(Leibovitz's L-15Medium培养基+10％FBS+1％青链霉素)转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。去除上清，用完全培养基重悬细胞，按所需密度接种于培养皿中，置于37℃、95％潮湿空气的无CO2培养箱中培养，视细胞生长情况每2-3天换一次培养液或进行传代。
2.2.3NCI-H358细胞培养和传代：细胞生长至约80-90％，将培养基(1640培养基+10％FBS+1％青链霉素+1mM丙酮酸钠)转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。去除上清，用完全培养基重悬细胞，按所需密度接种于培养皿中，置于37℃、5％CO2、95％潮湿空气的CO2培养箱中培养，视细胞生长情况每2-3天换一次培养液或进行传代。
2.3实验步骤：
实验第一天：
Z-138细胞传代后以1000个/孔的密度重悬于完全培养基中，接种于96孔培养板内：96孔板最外面一圈36个孔以200μL PBS填充，以防边缘培养基蒸发较快导致内部板孔的培养条件差异过大；内部60个孔的最左列为空白孔，不加细胞，以等体积的PBS填充；其余的54个孔以排枪进行细胞铺板，每孔为含对应细胞的100μL培养基，铺板完成后，拍打96孔板使细胞均匀悬浮，放入5％CO2培养箱内37℃培养24h。
MDA-MB-468细胞传代后以对应的密度重悬于完全培养基中，2000个/孔，接种于96孔培养板内：细胞外面一圈以200μL PBS填充，以防边缘培养基蒸发较快导致内部板孔的培养条件差异过大；内部60个孔的最左列为空白孔，不加细胞，以等体积的PBS填充；其余的54个孔以排枪进行细胞铺板，每孔100μL，放入无CO2培养箱内37℃培养24h。
NCI-H358细胞传代后以对应的密度重悬于完全培养基中，1000个/孔，接种于96孔培养板内：细胞外面一圈以200μL PBS填充，以防边缘培养基蒸发较快导致内部板孔的培养条件差异过大；内部60个孔的最左列为空白孔，不加细胞，以等体积的PBS填充；其余的54个孔以排枪进行细胞铺板，每孔100μL，放入5％CO2培养箱内37℃培养24h。
实验第二天：
Z-138细胞在原培养基(100μL)的基础上，加入50μL的(3×)药物，每个浓度组设置两个复孔，继续放入CO2培养箱培养7天。化合物配制如下：提前称取化合物1-2mg，使用DMSO配置成10mM母液。使用完全培养基稀释药物，药物终浓度以33333.00nM为起始最高浓度，按1:4梯度依次稀释至7个浓度梯度：6666.60nM、1333.32nM、266.66nM、53.33nM、10.67nM、2.13nM、0.43nM。①取10mM的母液1:4稀释成对应的药液，共8个浓度(10μL母液+40μLDMSO)；②取5μL①的药物加入的495μL完全培养基，配制成对应的浓度(3×)(稀释100倍)。
MDA-MB-468细胞在原培养基(100μL)的基础上，加入100μL的(2×)药物，每个浓度组设置两个复孔，继续放入无CO2培养箱培养7天。化合物配制如下：提前称取化合物1-2mg，使用DMSO配置成10mM母液。使用完全培养基稀释药物，药物终浓度以50000nM为起始最高浓度，按1:4梯度依次稀释至7个浓度梯度：50000nM、10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM。①取10mM的母液1:4稀释成对应的药液，共8个浓度(10μL药液+40μL DMSO)；②取5μL①的药物加入的495μL完全培养基，配制成对应的浓度(2×)(稀释100倍)。
NCI-H358细胞在原培养基(100μL)的基础上，加入100μL的(2×)药物，每个浓度组设置两个复孔，继续放入5％CO2培养箱培养7天。化合物配制如下：提前称取化合物1-2mg，使用DMSO配置成10mM母液。使用完全培养基稀释药物，药物终浓度以50000nM为起始最高浓度，按1:4梯度依次稀释至7个浓度梯度：50000nM、10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM。①取10mM的母液1:4稀释成对应的药液，共8个浓度(10μL药液+40μL DMSO)；②取5μL①的药物加入的495μL完全培养基，配制成对应的浓度(2×)(稀释100倍)。
实验第八天：
Z-138细胞在药物处理7天后，提前30min将CellTiter-Glo Luminescent CellViabillity Assay取出，平衡至室温。空白孔将PBS吸弃，加入150μL的完全培养基，然后空白孔、给药孔和DMSO孔都加入75uL的Celltiter-Glo reagent，室温震荡2min。继续室温孵育10min后，每孔各吸取180μL转移至不透明白板，去除气泡后，检测化学发光信号，震荡，Read进样检测条件为500ms。根据酶标仪导出的A.U.值，计算每个孔相对于溶剂对照孔的抑制率：Inhibition(％)＝100-(A.U.实验孔–A.U.空白孔)/(A.U.溶剂对照孔-A.U.空白孔)*100。根据不同药物浓度及其所对应的抑制率，使用GraghPad 5.0软件进行IC50曲线绘制，分析数据，得出最终IC50值，实验结果见表5。
MDA-MB-468和NCI-H358细胞药物处理7天后吸弃孔内培养基，加入100μL已加入CCK-8的完全培养基(CCK-8：完全培养基＝1:10)，第一竖排PBS作为空白对照孔，同步加入100μL的CCK-8，然后放入培养箱培养40min-2h左右，根据CCK-8的显色深浅决定最佳检测时间(DMSO组的OD值在1.0左右最佳)。待CCK-8显色至橙色，并且出现肉眼可分辨的一定梯度，将96孔板从培养箱中取出，置于室温中平衡5-10分钟；打开酶标仪软件，调整好检测参数，检测450nm处的吸光度(OD值)；将培养板的盖子取下，直接将培养板水平放置于板槽内，开始读数；读数完成后，保存程序，导出数据，关闭软件和电脑。根据酶标仪导出的OD值，计算每个孔相对于溶剂对照孔的抑制率：Inhibition(％)＝100-(OD实验孔–OD空白孔)/(OD溶剂对照孔-OD空白孔)*100。根据不同药物浓度及其所对应的抑制率，使用GraghPad 5.0软件进行IC50曲线绘制，分析数据，得出最终IC50值，实验结果见表5。
表5
Figure BDA0003592120970000221
从以上实验可以看出，本发明式(I)的化合物对人套细胞淋巴瘤细胞Z-138、三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、人非小细胞肺癌细胞NCI-H358均表现出了良好的抑制活性，非常有希望成为淋巴瘤、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌治疗剂。
实验例3电生理手动膜片钳检测化合物对hERG钾通道的作用
hERG钾离子通道是药物安全筛查的标准。hERG钾离子通道被阻滞会导致心脏中毒和心室复极延长，严重时可能会导致猝死。具有hERG钾通道抑制作用的药物可能是临床用药的潜在祸患。因此，化合物对hERG钾离子通道抑制作用弱则安全性高。药物导致的QT间期延长与致命性室性心律失常和猝死的危险性增加有关。
1实验材料
主要试剂：青霉素-链霉素溶液(100×)、DMEM/F12购自Gibco公司；胎牛血清购自PAA公司；DMSO、EGTA、MgATP购自Sigma公司；KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、NaCl购自Sinopharm公司；葡萄糖购自General-reagent公司；HEPES购自Solarbio公司；奎尼丁购自aladdin公司。
仪器：TI-S-FLU显微镜购自Nikon公司；SMZ-140/143显微镜购自Motic公司；EPC-10放大器、Patchmaster V2X60购自HEKA公司；TMC-36防震台购自TMC公司；MP-225、MPC-200操控器、ROE-200微操纵仪、P-97电极拉制仪购自Sutter公司；VC3-8PP灌流给药系统购自ALA公司。
2实验方法
测试溶剂配制：细胞外液配制(mM)：137NaCl、4KCl、1.8CaCl2、1MgCl2、10葡萄糖和10HEPES(pH 7.4)；细胞内液配制(mM)：130KCl、1MgCl2、5EGTA、5MgATP和10HEPES(pH 7.2)；阴性对照配制：细胞外液+0.3％DMSO；阳性对照：奎尼丁。
化合物处理：分别称取(R)-7’-((2-乙酰基-2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)氨基)-2’-(3-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-2-羟丙基)-2’,3’-二氢-1’H-螺[环丙烷-1,4’-[2,6]萘啶]-1’-酮和化合物B溶解于DMSO中，配制10mM母液，用DMSO稀释母液成次级母液，浓度为3.3，1.1，0.37，0.12mM。取母液和次级母液各90μL稀释至30mL细胞外液中，用于电生理检测。化合物的终浓度为30，10，3.3，1.1，0.37μM，DMSO的终浓度为3：1000。
稳转细胞培养：细胞株来源于过表达hERG钾离子通道HEK-293细胞，是在纽约大学医学院Mohamed Boutjdir博士实验室提供技术支持后科瑞斯生物与之合作建立并验证。细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养。当细胞密度达培养皿80％时，先用磷酸盐缓冲液(PBS)预清洗，然后用胰蛋白酶/EDTA消化细胞2-3min，加入细胞培养基停止消化，轻轻把细胞吹下来并转移到离心管中，1000rpm*3min，上清液弃置，加入细胞培养基，轻轻吹打将细胞混匀，随后转移到培养皿中进行传代培养，或将细胞滴于圆形玻片之上并置于培养皿中待细胞贴壁用于实验。
细胞培养基组成：DMEM、15％胎牛血清和1％100×青霉素-链霉素。
电生理手动膜片钳系统实验：将稳转的细胞接种于玻片上，细胞密度低于50％，培养过夜。将实验用细胞转移到一个嵌于倒置显微镜平台的约1mL的浴槽中，灌流细胞外液，灌流速度为2.7mL/min。稳定5分钟后即可开始实验。采用HEKA EPC-10膜片钳放大器和PATCHMASTER采集系统记录膜电流。所有实验均在室温(22-24℃)下完成。实验中使用P-97微电极拉制仪拉直电极(BF150-110-10)。电极内径为1-1.5mm，充满内液后的入水电阻为2-4MΩ。hERG钾通道的电生理刺激方案，是首先将膜电压钳制在-80mV，给予细胞持续2s、+20mV电压刺激，激活hERG钾通道，再复极化至-50mV、持续5s，产生外向尾电流，刺激频率每15s一次。电流值为尾电流的峰值。实验中采用全细胞记录模式记录通道电流。首先灌流细胞外液(大约每分钟2mL)并持续记录，并等待电流稳定(5分钟内电流衰减(Run-Down)小于5％)，此时尾电流峰值即为对照电流值。接着灌流含待测药物的细胞外液并持续记录直到药物对hERG电流的抑制作用到达稳定状态，此时尾电流峰值即为加药后电流值。稳定状态的标准以最近的连续3个电流记录线是否重合来判断。达到稳定态势以后如果以细胞外液灌流冲洗后hERG电流回复或接近加药物之前的大小，则可以继续灌流测试其它浓度或药物。30μM奎尼丁被用于实验中作为阳性对照以保证所使用的细胞反应正常。
3参数分析和数据分析统计
本研究通过测量对照组与药物处理组的电流最大值，计算处理组最大电流值所占对照组最大电流值的比率，评估待测化合物在测试浓度下对hERG钾离子通道的作用效果(Mean±SE)。
实验数据使用PATCHMASTER V2X60采集，并采用Origin 8.5软件以及MicrosoftExcel进行分析和统计。实验结果见表6。
表6
Figure BDA0003592120970000241
从以上实验可以看出，本发明式(I)的化合物对hERG钾通道抑制作用轻，对心脏的毒性低，优于化合物B。此外，化合物B在离体心脏实验中表现出显著延长QT间期，而本发明式(I)的化合物在离体心脏实验中未对QT间期有影响。本发明的化合物具有更好的心脏安全性。
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

Claims (10)

1.一种式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，包括使式(II)的化合物与乙酸酐发生反应的步骤，
Figure FDA0003592120960000011
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中式(I)的化合物和乙酸酐的摩尔比为约1:0.8至1:2，优选为约1:0.9至1:1.3，进一步优选为约1:0.9。
3.根据权利要求1或2所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(III)的化合物脱除氨基保护基制得式(II)的化合物的步骤，其中R1为氨基保护基，
Figure FDA0003592120960000012
4.根据权利要求3所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中R1选自烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基和芳基氧基。
5.根据权利要求3或4所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中制得式(II)的化合物的步骤进一步包括在酸性试剂存在下使式(III)的化合物脱除氨基保护基；优选地，所述的酸性试剂选自三氟乙酸和HCl-1,4-二氧六环溶液。
6.根据权利要求3-5之任一项所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(IV)的化合物和式(D)的化合物发生反应制得式(III)的化合物的步骤，其中R2为离去基团，R1为氨基保护基，
Figure FDA0003592120960000013
7.根据权利要求6所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中R2选自氟、氯、溴和碘，优选为氯；R1选自烷基三硅烷基、芳基三硅烷基、烷基、烷基酰基、芳基酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、烷氧基和芳基氧基。
8.根据权利要求6或7所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(V)的化合物与式(C)的化合物发生反应生成式(IV)的化合物的步骤，其中，R2为离去基团，X为酸性试剂，
Figure FDA0003592120960000021
9.根据权利要求8所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中R2选自氟、氯、溴和碘，优选为氯。
10.根据权利要求8或9所述的式(I)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(A)的化合物和式(B)的化合物在缚酸剂的存在下发生反应，再与酸性试剂反应生成式(V)的化合物的步骤，其中R3选自卤素，X为酸性试剂，
Figure FDA0003592120960000022
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