CN115181254B - 一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取真氧产碱杆菌中聚3‑羟基丁酸酯的新方法，包括以下步骤：以N’N‑二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体作为提取溶剂对真氧产碱杆菌中的聚3‑羟基丁酸酯进行提取。本发明采用N’N‑二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体提取聚3‑羟基丁酸酯，为简化聚3‑羟基丁酸酯的提取过程提供了便利条件，由该离子液体提取得到的聚3‑羟基丁酸酯具有与标准聚3‑羟基丁酸酯一样的物化性能；本发明的提取过程简单，无需对真氧产碱杆菌进行任何预处理，溶剂成本低、毒性低，产物收率高、纯度高，提取后的离子液体可重复使用。
Description
技术领域
本发明涉及聚3-羟基丁酸酯的提取技术领域，尤其是涉及一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法。
背景技术
塑料污染是当今世界面临的严峻挑战之一。全球塑料年产量超过三亿吨，因此造成了严重的环境问题，且塑料产量还在逐年递增。传统的塑料通常要花费几十年才能分解，且在分解过程中会产生有毒物质，从而导致环境污染、水污染和空气污染等一系列问题，人们越来越意识到塑料对环境的有害影响。这一问题引起了人们对生物质可降解塑料的广泛关注，并开展了一系列研究，以改进绿色进程，将可持续资源转化为染料和生物化学品。
聚3-羟基丁酸酯（PHB）是最有潜力取代传统塑料的聚合物。其与塑料的主要成分聚丙烯、聚乙烯有着相似的物化性能，且容易在酶、细菌、酵母和真菌等活性物质的作用下发生降解，其降解的最终产物为二氧化碳和水，不会对环境造成污染。但聚3-羟基丁酸酯存在脆性高、热稳定性差和成核密度低等缺点。并且聚3-羟基丁酸酯生物塑料的生产成本远高于传统塑料，生产成本的问题是生物基塑料替代传统合成塑料的主要问题。其中，降低聚3-羟基丁酸酯的提取成本是让聚3-羟基丁酸酯得到更广泛应用的最关键步骤之一。
目前用于聚3-羟基丁酸酯的提取方法包括：酶提取法、机械破碎法、化学试剂法、基因工程法、溶剂提取法。上述方法中，溶剂提取法是普遍采用的提取方法，常用溶剂有氯仿、次氯酸钠、苯甲醚、环己酮、苯乙醚、碳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMFO）、己烷和丙醇等。其中，萃取PHB最常用的溶剂是氯代烃类溶剂，如氯仿。但其存在毒性大、成本高、不能循环利用等缺点。而其他的一些溶剂，也存在提取步骤繁琐等缺点。同时，上述提取溶剂均还存在聚3-羟基丁酸酯收率和纯度低的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提出一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，解决现有技术中聚3-羟基丁酸酯的提取溶剂毒性大、成本高、不能循环利用的技术问题。
本发明提供一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体作为提取溶剂对真氧产碱杆菌中的聚3-羟基丁酸酯进行提取。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明采用N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体提取聚3-羟基丁酸酯，为简化聚3-羟基丁酸酯的提取过程提供了便利条件，由该离子液体提取得到的聚3-羟基丁酸酯具有与标准聚3-羟基丁酸酯一样的物化性能；
本发明的提取过程简单，无需对真氧产碱杆菌进行任何预处理，溶剂成本低、毒性低，产物收率高、纯度高，提取后的离子液体可重复使用。
附图说明
图1为对比例1中N’N-二甲基乙酰胺提取聚3-羟基丁酸酯的光学照片；
图2为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯粉末的光学照片；
图3为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的SEM图片；
图4为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的FITR图片；
图5为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的气相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体作为提取溶剂对真氧产碱杆菌中的聚3-羟基丁酸酯进行提取。
发明人在N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体可溶解多糖类高分子的基础上，创造性的发现了N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体对聚3-羟基丁酸酯的高效提取能力。在该离子液体的作用下，真氧产碱杆菌的细胞壁被破坏，多糖、蛋白质、核酸等物质溶解于该离子液体中，而聚3-羟基丁酸酯不溶于该离子液体，通过离心分离而达到对聚3-羟基丁酸酯的有效提取。此外，该离子液体对聚3-羟基丁酸酯的提取收率、纯度高，提取方法简便、成本低且可重复利用，适用于对聚3-羟基丁酸酯的大批量或是高纯度提取。
本发明中，真氧产碱杆菌以果糖为碳源，在有氧条件下培养得到。
本发明中，N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，氯化锂的质量分数为8~12%，优选为10%。
本发明中，提取过程中，反应的温度为30~120°C，包括但不限于30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C、110°C和120°C，优选为70~120°C；反应的时间为1~6 h，包括但不限于1h、2h、3h、4h、5h和6h，优选为2~6h。
本发明中，真氧产碱杆菌在N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中的投加量为10~60 g L-1，包括但不限于10g L-1、20g L-1、30g L-1、40g L-1、50g L-1和60g L-1，优选为40~50g L-1。
本发明中，反应结束后，经离心、乙醇和去离子水清洗、干燥得到聚3-羟基丁酸酯。
在本发明的一些优选实施方式中，上述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，包括以下步骤：
S1、获得真氧产碱杆菌干燥菌体粉末；
S2、将氯化锂与N’N-二甲基乙酰胺混合，加热搅拌直至氯化锂完全溶解，得到N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体；
S3、将上述真氧产碱杆菌干燥菌体粉末加入N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，在加热条件下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，得到聚3-羟基丁酸酯。
进一步地，上述获得真氧产碱杆菌干燥菌体粉末的步骤包括：
S11、将冻存的真氧产碱杆菌（Cupriavidus necator H16 DSM-428）用接种环接种到胰酶大豆培养基中，25~35°C下震荡培养15~25h；然后，将TSB菌液接种至限氮基本培养基中，持续在25~35°C下震荡培养48~72 h；其中，真氧产碱杆菌在胰酶大豆培养基中的质量分数为0.5~2wt%；TSB菌液与限氮基本培养基的用量比为0.8~1.2uL：1mL；限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 g L-1CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1MgSO4·7H2O、1 g L-1NH4Cl、5.2 g L-1NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖。微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L-1CuSO4·5H2O、2.4 g L-1MnSO4·H2O、15 g L-1FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1ZnSO4·7H2O。
S12、将步骤S11中培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗，离心，去除残留的其他水溶性化学组分，然后将菌体冷冻干燥24-72h，得到真氧产碱杆菌干燥菌体粉末。
进一步地，步骤S2中，加热搅拌的温度为60~100°C，更进一步为80°C。
对比例1
一种以N’N-二甲基乙酰胺对聚3-羟基丁酸酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）真氧产碱杆菌的培养：将冻存的真氧产碱杆菌（Cupriavidus necator H16DSM-428）用接种环接种到5ml胰酶大豆培养基（Sigma-aldrich试剂有限公司，分析纯）中，30°C下震荡培养20h；然后，将50 µL TSB菌液接种至50 mL限氮基本培养基中，持续在30°C下震荡培养72 h（200 rpm）；其中，该限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 gL-1CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1MgSO4·7H2O、1 g L-1NH4Cl、5.2 g L-1NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖。微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L- 1CuSO4·5H2O、2.4 g L-1MnSO4·H2O、15 g L-1FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1ZnSO4·7H2O。
（2）将步骤（1）中培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗2遍，离心，去除残留的其他水溶性化学组分，然后将菌体冷冻干燥48h，得到干燥菌体粉末。
（3）将步骤（2）中的0.2g干燥菌体粉末加入10mLN’N-二甲基乙酰胺溶剂中，在110°C下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，提取时间为3h，溶液冷却至室温后发现其凝固，导致无法通过离心分离出聚3-羟基丁酸酯（见图1），说明N’N-二甲基乙酰胺单溶剂不具备对聚3-羟基丁酸酯的提取能力。
实施例1
一种以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂对聚3-羟基丁酸酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）真氧产碱杆菌的培养：将冻存的真氧产碱杆菌（Cupriavidus necator H16DSM-428）用接种环接种到5ml胰酶大豆培养基（Sigma-aldrich试剂有限公司，分析纯）中，30°C下震荡培养20h；然后，将50 µL TSB菌液接种至50 mL限氮基本培养基中，持续在30°C下震荡培养72 h（200 rpm）；其中，该限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 gL-1CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1MgSO4·7H2O、1 g L-1NH4Cl、5.2 g L-1NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖。微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L- 1CuSO4·5H2O、2.4 g L-1MnSO4·H2O、15 g L-1FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1ZnSO4·7H2O。
（2）将步骤（1）中培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗2遍，离心，去除残留的其他水溶性化学组分，然后将菌体冷冻干燥48h，得到干燥菌体粉末。
（3）将氯化锂与N’N-二甲基乙酰胺混合，80°C下加热搅拌直至氯化锂完全溶解，得到N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体。其中，氯化锂的质量分数为10wt%。
（4）将步骤（2）中的0.2g干燥菌体粉末加入10mLN’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，分别在30、40、50、60、70、80、90、100、110和120°C下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，提取时间为3h，反应结束后，经离心、乙醇和去离子水清洗、干燥得到聚3-羟基丁酸酯。
性能测试：分别用SEM和FTIR对产品形貌和化学结构进行表征。图2为实施例1在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的光学照片。图3为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的SEM图片，表明该离子液体在提取过程中不会对聚3-羟基丁酸酯的粒状结构有破坏作用。图4为实施例1中在110°C下提取得到的聚3-羟基丁酸酯的FITR图片，表明该离子液体在提取过程中不会对聚3-羟基丁酸酯的化学结构有破坏作用。通过气相色谱仪对产品的纯度进行测试，结果如图5所示，出峰时间与标准聚3-羟基丁酸酯一致，均为11.57min，表明该提取产物确实为聚3-羟基丁酸酯。经过出峰面积与标准聚3-羟基丁酸酯对比，产物纯度均在90%以上。通过称重及计算，产物收率均在90%以上（见表1）。
表1 不同提取温度条件下产物收率和纯度
实施例2
一种以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂对聚3-羟基丁酸酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）真氧产碱杆菌的培养：将冻存的真氧产碱杆菌（Cupriavidus necator H16DSM-428）用接种环接种到5ml胰酶大豆培养基（Sigma-aldrich试剂有限公司，分析纯）中，30°C下震荡培养20h；然后，将50 µL TSB菌液接种至50 mL限氮基本培养基中，持续在30°C下震荡培养72 h（200 rpm）；其中，该限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 gL-1CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1MgSO4·7H2O、1 g L-1NH4Cl、5.2 g L-1NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖。微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L- 1CuSO4·5H2O、2.4 g L-1MnSO4·H2O、15 g L-1FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1ZnSO4·7H2O。
（2）将步骤（1）中培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗2遍，离心，去除残留的其他水溶性化学组分，然后将菌体冷冻干燥48h，得到干燥菌体粉末。
（3）将氯化锂与N’N-二甲基乙酰胺混合，80°C下加热搅拌直至氯化锂完全溶解，得到N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体。其中，氯化锂的质量分数为10wt%。
（4）将步骤（2）中的0.2g干燥菌体粉末加入10mLN’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，在110°C下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，提取时间分别为1、2、3、4、5和6h，反应结束后，经离心、乙醇和去离子水清洗、干燥得到聚3-羟基丁酸酯。
性能测试：采用FTIR对产品化学结构进行表征，结果与实施例1相似。采用气相色谱仪对产品进行测试，出峰时间与实施例1一致。经过出峰面积与标准聚3-羟基丁酸酯对比，产物纯度均在93%以上。通过称重及计算，产物收率均在90%以上（见表2）。
表2 表1 不同提取时间条件下产物收率和纯度
实施例3
一种以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂对聚3-羟基丁酸酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）真氧产碱杆菌的培养：将冻存的真氧产碱杆菌（Cupriavidus necator H16DSM-428）用接种环接种到5ml胰酶大豆培养基（Sigma-aldrich试剂有限公司，分析纯）中，30°C下震荡培养20h；然后，将50 µL TSB菌液接种至50 mL限氮基本培养基中，持续在30°C下震荡培养72 h（200 rpm）；其中，该限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 gL-1CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1MgSO4·7H2O、1 g L-1NH4Cl、5.2 g L-1NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖。微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L- 1CuSO4·5H2O、2.4 g L-1MnSO4·H2O、15 g L-1FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1ZnSO4·7H2O。
（2）将步骤（1）中培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗2遍，离心，去除残留的其他水溶性化学组分，然后将菌体冷冻干燥48h，得到干燥菌体粉末。
（3）将氯化锂与N’N-二甲基乙酰胺混合，80°C下加热搅拌直至氯化锂完全溶解，得到N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体。其中，氯化锂的质量分数为10wt%。
（4）将步骤（2）中的干燥菌体粉末加入10mLN’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，投加量分别为10、20、30、40、50和60g L-1在110°C下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，提取时间为3h，反应结束后，经离心、乙醇和去离子水清洗、干燥得到聚3-羟基丁酸酯。
性能测试：纯度检测与实施例1一致，经过出峰面积与标准聚3-羟基丁酸酯对比，得到的纯度数据如表3所示。实施例3中产物纯度最高时投加量为10g L-1，纯度为98.9%。产物收率均在80%以上（见表3）。
表3 不同投加量条件下产物收率和纯度
为了使本发明的优势更加清楚，进一步列举现有的部分溶剂对聚3-羟基丁酸酯的提取结果，具体见表4。
表4 不同溶剂对聚3-羟基丁酸酯的提取能力的对比
通过表1可以看出，本发明通过以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂为提取溶剂对聚3-羟基丁酸酯进行提取，与现有的常见溶剂相比，在缩短提取时间的同时，显著提高了收率和纯度，并且提取工艺更为简单。虽然乙酸丁酯和氯仿也表现出了较好的提取效果，但是其易燃、毒性大、成本高，不适用于大规模提取。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1. 一种提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：以N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体作为提取溶剂对真氧产碱杆菌中的聚3-羟基丁酸酯进行提取；其中，所述真氧产碱杆菌在N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中的投加量为10~60 g L-1；所述提取过程中，反应的温度为30~120°C，反应的时间为1~6 h。
2.根据权利要求1所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，氯化锂的质量分数为8~12%。
3.根据权利要求1所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，氯化锂的质量分数为10%。
4.根据权利要求1所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，反应结束后，经离心、乙醇和去离子水清洗、干燥得到聚3-羟基丁酸酯。
5.根据权利要求1~4中任一项所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得真氧产碱杆菌干燥菌体粉末；
将氯化锂与N’N-二甲基乙酰胺混合，加热搅拌直至氯化锂完全溶解，得到N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体；
将所述真氧产碱杆菌干燥菌体粉末加入所述N’N-二甲基乙酰胺/氯化锂离子液体中，在加热条件下对聚3-羟基丁酸酯进行提取，得到聚3-羟基丁酸酯。
6.根据权利要求5所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述获得真氧产碱杆菌干燥菌体粉末的步骤包括：
将冻存的真氧产碱杆菌用接种环接种到胰酶大豆培养基中，25~35°C下震荡培养15~25h；
将真氧产碱杆菌菌液接种至限氮基本培养基中，持续在25~35°C下震荡培养48~72 h；
将培养得到的真氧产碱杆菌用去离子水清洗，离心，然后将菌体冷冻干燥，得到真氧产碱杆菌干燥菌体粉末。
7.根据权利要求6所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述真氧产碱杆菌在胰酶大豆培养基中的质量分数为0.5~2wt%；TSB菌液与限氮基本培养基的用量比为0.8~1.2uL：1mL。
8. 根据权利要求6所述提取真氧产碱杆菌中聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，所述限氮基本培养基包含1 mL L-1微量元素溶液、0.08 g L-1 CaCl2·2H2O、0.45 g L-1K2SO4、0.8 g L-1 MgSO4·7H2O、1 g L-1 NH4Cl、5.2 g L-1 NaH2PO4·2H2O、11.6 g L-1Na2HPO4·12H2O和20 g L-1果糖，且微量元素溶液包含0.1 M HCl、0.48 g L-1 CuSO4·5H2O、2.4 g L-1 MnSO4·H2O、15 g L-1 FeSO4·7H2O以及2.4 g L-1 ZnSO4·7H2O。
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