CN113831548A - 青霉mj51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用 - Google Patents

青霉mj51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用 Download PDF

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CN113831548A CN202111150037.9A CN202111150037A CN113831548A CN 113831548 A CN113831548 A CN 113831548A CN 202111150037 A CN202111150037 A CN 202111150037A CN 113831548 A CN113831548 A CN 113831548A
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humic acid
lignite
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extracellular fluid
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韩燕来
李世莹
李芳�
谭金芳
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明提供了一种利用青霉MJ51胞外液溶解褐煤制备水溶性腐植酸的新方法。首先将褐煤粉碎过筛，采用青霉MJ51的无细胞培养液溶解褐煤，过滤收集滤液，得到含腐植酸的提取液。与传统强碱法提取出的腐植酸相比，该方法制备的水溶性腐植酸溶液pH为中性，氮含量较高，抗絮凝能力较强，含氧官能团含量较高，可作为水溶性腐植酸肥料直接使用。本发明工艺简单，效率高，提取腐植酸所用的生物溶剂对环境友好，腐植酸产品生理活性高，解决了传统工艺中的流程繁琐和环境污染问题，青霉MJ51胞外液提取褐煤中腐植酸为褐煤的高效利用和腐植酸产品在农业上的应用提供了一条新的途径，该制备方法具有很好的发展潜力。

Description

青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用
技术领域
本发明涉及煤加工技术领域，尤其涉及青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用。
背景技术
褐煤是一种煤化程度低、反应活性高的低阶煤。褐煤水分含量高、热值低，其直接燃烧效率低且污染环境，因此有必要开发经济上高效、环境上安全的褐煤利用新技术。目前，从褐煤中提取腐植酸是实现褐煤非燃料和高附加值转化利用的重要途径。
目前，已报道的从褐煤中提取腐植酸的方法有碱提取法、酸提取法、微生物溶解法和有机溶剂萃取法等，其中碱提取法是腐植酸提取的经典方法。腐植酸的羧基、酚羟基等酸性含氧功能团首先与碱类物质反应生成可溶性腐植酸盐，然后加酸调节pH＜2，固液分离，从而达到提纯、分离腐植酸的目的。然而该溶液直接使用则碱性较强，烘干后使用则消耗大量能量，而将该溶液用酸沉淀，水洗沉淀后再烘干，虽然可获得高纯度腐植酸，但工艺流程繁琐，消耗大量的酸，生产效率较低，且在提取腐植酸过程中所使用的这些强碱溶剂及有机溶剂并非为绿色环保溶剂，容易造成环境污染。此外，碱提取法制备得到的腐殖酸产物中含有的活性基团少，不利于盐碱地后续利用等缺点。针对这些情况，本专利发明了一种工艺简单，绿色环保的腐植酸提取工艺，即利用微生物胞外液代替强碱试剂提取褐煤中腐植酸。
据报道，微生物可以通过分泌碱性物质来溶解褐煤，从而促进褐煤中水溶性腐植酸的释放。相比常规碱提取法，褐煤经微生物溶解后，不仅水溶性腐植酸含量有所提高，而且腐植酸的结构也有所不同，主要表现为分子量和芳香缩合程度降低，氮含量提高，生物活性增强。不同的微生物如Penicillium sp.P6、Bacillus sp.Y7、StreptomycesfulvissimusK59等已被报道具有产生碱性次级代谢产物的能力，且该碱性物质在溶解褐煤产生高生理活性的腐植酸方面发挥重要作用。Bacillus sp.Y7分泌的耐高温碱性物质可在12d内溶解36.77％的褐煤(Jiang,F.,Li,Z.,Lv,Z.,Gao,T.,Yang,J.,Qin,Z.,Yuan,H.,2013.Thebiosolubilization of lignite by Bacillus sp.Y7 and characterization of thesoluble products.Fuel,103,639-645.)。Streptomycesfulvissimus K59也能产生碱性物质溶解褐煤，且褐煤经5N HNO3预处理后，生物增溶效果最佳，增溶产物中腐植酸浓度最高，为原煤的15倍(Sobolczyk-Bednarek,J.,Choińska-Pulit,A.,
Figure BDA0003286653400000021
W.,2021.Biosolubilization of low-rank coal by the newly isolated strainStreptomyces fulvissimus K59.Fuel,301,121082.)。
与细菌相比，真菌在溶解褐煤改变产物腐植酸的结构，提高腐植酸的生理活性方面发挥更强的作用。真菌中的青霉属具有产生物碱的能力，这种生物活性生物碱具有溶解褐煤的功能。已有研究证明，青霉属中的一些菌株能通过分泌碱性物质、表面活性剂、胞外酶来溶解褐煤(Achi,1994；Yuan et al.,2006)。现有技术公开了一株青霉MJ51，该青霉MJ51的培养物能够用于降解褐煤生产黄腐酸。但是目前没有关于青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用青霉MJ51胞外液溶解褐煤制备水溶性腐植酸的新途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用。
优选的，所述溶解褐煤制备水溶性腐植酸的方法包括以下步骤：
将所述青霉MJ51胞外液和氧化褐煤混合，得到混合液，混合液于60～90℃条件下进行溶煤，得到溶解液，所述溶解液中包含水溶性腐植酸。
优选的，所述混合液中氧化褐煤的质量浓度为3％～5％。
优选的，所述氧化褐煤的制备方法包括以下步骤：将硝酸和褐煤混合后进行氧化还原反应；
将所述氧化还原反应得到的反应料液固液分离，得到固体组分，所述固体组分为氧化褐煤。
优选的，所述氧化还原反应的温度为25～30℃。
优选的，所述硝酸的当量浓度为4～6N。
优选的，所述青霉MJ51胞外液的制备方法包括以下步骤：
将青霉MJ51的孢子悬浮液接种于液体培养基，进行培养，得到培养液；
分离出所述培养液中的青霉MJ51胞外液；
所述孢子悬浮液中青霉MJ51的孢子浓度为(1～9)×107个；所述孢子悬浮液和培养基的体积比为5：(80～120)。
优选的，所述培养的温度为25～30℃；所述培养的时间为55～65h。
优选的，所述液体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖12～18g/L、KNO32～4g/L、KH2PO4 0.8～1.2g/L、Na2HPO4 0.3～0.8g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L；所述培养基的pH值为5.8～6.2。
优选的，所述青霉MJ51的保藏编号为：CGMCC No.18120。
本发明提供了一种利用青霉MJ51胞外液溶解褐煤制备水溶性腐植酸的新方法。首先将褐煤粉碎过筛，采用青霉MJ51的无细胞培养液溶解褐煤，过滤收集滤液，得到含腐植酸的提取液。与传统强碱法提取出的腐植酸相比，该方法制备的水溶性腐植酸溶液pH为中性，氮含量较高，抗絮凝能力较强，含氧官能团含量较高，可作为水溶性腐植酸肥料直接使用。本发明工艺简单，效率高，提取腐植酸所用的生物溶剂对环境友好，腐植酸产品生理活性高，解决了传统工艺中的流程繁琐和环境污染问题，青霉MJ51胞外液提取褐煤中腐植酸为褐煤的高效利用和腐植酸产品在农业上的应用提供了一条新的途径，该制备方法具有很好的发展潜力。
附图说明
图1为腐植酸的结构表征，其中(a)为HA样品的FTIR光谱，(b)为固态交叉极化魔角旋转13C核磁共振光谱，HA-control为氢氧化钠从煤中提取出的腐植酸；HA-CFFs为无细胞滤液(CFFs)从煤中提取出的腐植酸。
生物保藏说明
青霉MJ51，拉丁文为Penicillium camemberti，于2019年08月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18120。
具体实施方式
本发明提供了青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用。
在本发明中，所述青霉MJ51胞外液能够改变水溶性腐植酸结构，增加水溶性腐植酸结构中的脂肪族碳和羧基碳含量，降低芳香族碳含量，青霉MJ51胞外液提取的水溶性腐植酸具有较低的分子量，较高的氮含量和絮凝限值。
在本发明中，所述青霉MJ51(Penicillium camemberti)的保藏编号为：CGMCCNo.18120。
在本发明中，所述青霉MJ51胞外液的制备方法优选的包括以下步骤：将青霉MJ51的孢子悬浮液接种于液体培养基，进行培养，得到培养液；分离出所述培养液中的青霉MJ51胞外液；所述孢子悬浮液中青霉MJ51的孢子浓度优选为(1～9)×107个；所述孢子悬浮液和培养基的体积比优选为5：(80～120)，更优选为1：100。在本发明中，所述培养的温度优选为25～30℃；所述培养的时间优选为55～65h，更优选为60h。在本发明中，所述培养的方式优选为震荡培养；所述震荡培养的转速优选为150～200rpm，更优选为160～180rpm。
在本发明中，所述液体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖12～18g/L、KNO3 2～4g/L、KH2PO4 0.8～1.2g/L、Na2HPO4 0.3～0.8g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L；所述培养基的pH值为5.8～6.2；所述培养基的pH值优选为5.8～6.2，更优选为6。在本发明中，所述液体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖15g/L、KNO3 3g/L、KH2PO4 1g/L、Na2HPO40.5g/L和MgSO4 0.4～0.6g/L。
在本发明中，所述褐煤优选为高阶褐煤；所述褐煤的粒径优选为0.18～0.25mm，更优选为0.2mm。
在本发明中，所述溶解褐煤制备腐植酸的方法包括以下步骤：将所述青霉MJ51胞外液和氧化褐煤混合，得到混合液，混合液于60～90℃条件下进行溶煤，得到溶解液，所述溶解液中包含水溶性腐植酸。
在本发明中，所述混合液中氧化褐煤的质量浓度优选为3％～5％，更优选为4％。
在本发明中，所述氧化褐煤的制备方法优选的包括以下步骤：所述氧化褐煤的制备方法包括以下步骤：将硝酸和褐煤混合后进行氧化还原反应；将所述氧化还原反应得到的反应料液固液分离，得到固体组分，所述固体组分为氧化褐煤。在本发明中，所述氧化还原反应的温度优选为25～30℃。在本发明中，所述硝酸的当量浓度优选为2～6N，更优选为4N。
在本发明中，所述硝酸的体积和褐煤的质量的比例优选为(20～30)mL：1g，更优选为25mL：1g；所述氧化还原反应的温度优选为25～30℃，更优选为28℃；所述氧化还原反应的时间优选为40～50h，更优选为48h。在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心；所述离心的转速优选为6000～8000rpm，更优选为7000rpm；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在收集固体组分后优选的还包括对所述固体组分进行清洗，直至洗涤液无色且pH>5；所述洗涤采用的试剂优选为去离子水；所述清洗后，优选的还包括对清洗后的组分进行干燥；所述干燥的方式优选为烘干；所述干燥的温度优选为70～90℃，更优选为80℃；所述干燥的时间优选为30～40h，更优选为36h。
本发明在得到溶解液后，优选的还包括从所述溶解液中分离腐植酸，包括以下步骤：对所述溶解液进行过滤，收集滤液，调节所述滤液的pH值至1.8，静置，离心，收集沉淀，得到腐植酸。在本发明中，所述过滤采用的滤纸优选为Whatman No.1；调节所述滤液的pH值采用的试剂优选为6.0MHCl水溶液；所述静置的时间优选为20～30h，更优选为24h；所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm；所述离心的时间优选为3～8min，更优选为5min。本发明在收集沉淀后，优选的还包括清洗沉淀和干燥；所述清洗采用的试剂优选为蒸馏水；所述干燥的温度优选为60℃；所述干燥的时间以干燥至恒重为准。在本发明中，所述腐植酸的保存温度优选为4℃。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例和对比例中采用的褐煤样品采自云南弥勒，经过破碎、粉磨、筛分，制得粒径为0.18～0.25mm的原煤煤样，80℃烘干至恒重。煤的工业分析(水分、灰分、挥发分和固定碳)参照GB/T212-2008；煤的总发热量参照GB/TT13-2008采用5E-C5508量热仪(中国湖南开元长沙)测定；煤的镜质组反射率参照GB/T6948-2008采用Leitz Orthoplan显微镜(Solms,Germany)光度计测定。经测定，煤中水分为9.52％，灰分为29.5％，挥发分为44.04％，固定碳含量为26.46％，煤的热值为18.63MJ/kg，镜质组反射率为0.39％。参考中国煤层煤分类标准(GB/T 17607-1998)，本研究所用煤样为中灰分高阶褐煤。
实施例1
1)煤样的硝酸氧化预处理
用浓度为4N的硝酸对褐煤样品进行氧化预处理；以每25ml溶液1g褐煤样品的比例混合，进行氧化还原反应，制备预处理褐煤样品。氧化还原反应在50ml玻璃瓶中进行，30℃，48h。氧化还原反应后，以7000rpm离心10min，用去离子水洗涤残余煤样，直到洗涤液无色，pH大于5。然后放烤箱中80℃烘干36h。
2)无细胞滤液(CFFs)的制备
将青霉MJ51MJ51(Penicillium camemberti，保藏编号为：CGMCC No.18120)接种于PDA培养基，28℃培养6d，加入0.1％生理盐水形成孢子悬液，显微镜下血细胞计数板观察孢子数。将2.5mL(1×107个孢子)孢子悬浮液接种到250mL三角瓶中，该三角瓶中装有50mL液体培养基，其组成如下(g/L)：蔗糖15.0、KNO33.0、KH2PO41.0、Na2HPO40.5，MgSO4·7H2O0.5，pH06.0。接种后在160rpm和28℃条件下培养60h。过滤真菌悬浮培养液并分为菌丝体和胞外液，收集胞外液，测定pH值，上清液过0.22μm膜过滤器得到无细胞滤液CFFs。
实施例2
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于60℃条件下溶解6h，得到溶解液，使用重量法测定水溶性腐植酸浓度，测定结果显示，腐植酸浓度为29.62g/L。
实施例3
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于60℃条件下溶解10h，与实施例1不同的是，步骤1)中所述硝酸的浓度为2N。测定结果显示，腐植酸浓度为17.52g/L。
实施例4
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为3％，于75℃条件下溶解8h。测定结果显示，腐植酸浓度为30.68g/L。
实施例5
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为3％，于75℃条件下溶解8h，与实施例1不同的是，步骤1)中所述硝酸的浓度为6N。测定结果显示，腐植酸浓度为32.29g/L。
实施例6
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为5％，于75℃条件下溶解6h。测定结果显示，腐植酸浓度为29.28g/L。
实施例7
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于75℃条件下溶解8h。测定结果显示，腐植酸浓度为40.01g/L。
实施例8
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于75℃条件下溶解10h，与实施例1不同的是，步骤1)中所述硝酸的浓度为6N。测定结果显示，腐植酸浓度为32.32/L。
实施例9
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为5％，于75℃条件下溶解8h，与实施例1不同的是，步骤1)中所述硝酸的浓度为6N。测定结果显示，腐植酸浓度为29.95/L。
实施例10
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于90℃条件下溶解6h。测定结果显示，腐植酸浓度为33.18g/L。
实施例11
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为3％，于60℃条件下溶解8h。测定结果显示，腐植酸浓度为30.15g/L。
实施例12
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于75℃条件下溶解6h，与实施例1不同的是，步骤1)中所述硝酸的浓度为2N。测定结果显示，腐植酸浓度为16.82/L。
实施例13
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于90℃条件下溶解10h。测定结果显示，腐植酸浓度为38.05g/L。
实施例14
将实施例1得到的无细胞滤液CFFs和预处理褐煤样品混合，煤装载量为4％，于60℃条件下溶解10h。测定结果显示，腐植酸浓度为32.74g/L。
试验例3
腐植酸产品的品质评估
采用实例7中的方法进行溶溶煤，溶煤后用Whatman No.1滤纸过滤上清液。为方便评估腐植酸溶液的各项表征指标，特采用酸沉淀法对腐植酸进行分离，而在腐植酸的应用过程中，可直接使用无需进一步酸沉淀。具体操作步骤如下：用6.0M HCl调节滤液pH至1.8，沉淀24h后，10000rpm离心5min收集沉淀腐植酸。用蒸馏水清洗腐植酸三次，在60℃下干燥，4℃下保存以供进一步分析。对照用0.1M氢氧化钠溶液代替无细胞滤液进行腐植酸提取，其他方法同上。
1、腐植酸的元素分析
腐植酸的元素组成用Vario-EL元素分析仪(德国)测定，通过差值计算氧含量。E4/E6值用SPECORD 200Analytik紫外-可见分光光度计(德国耶拿)测定。将样品溶解在pH 8.4的0.05M NaHCO3溶液中，浓度为20mg/LHA。所得溶液在室温下以6,000rpm离心4min以去除不溶性残留物。碳酸氢钠缓冲液作为空白对照。
结果参见表1。
表1不同腐植酸的化学特性对比结果
Figure BDA0003286653400000091
注：*和**代表p<0.05，p<0.01水平上的显著性差异。
2.腐植酸凝聚限度(絮凝极限)是反应腐植酸在可溶状态耐电解质絮凝作用的能力的一种度量。即0.02％腐植酸碱液在1h内凝聚时需要加入电解质(0.1mol/L CaCl2)的最小毫克当量数。具体步骤如下：准备一系列干试管，加入2.5ml不同浓度的CaCl2溶液。在每个试管中加入5ml 0.02％HA溶液。盖上地帽，摇匀，静置1h。观察开始出现沉淀(絮凝)的试管，絮凝限度的计算方法为：絮凝限度(mmol/L)＝M·V×1000/5＝200MV；式中：M—CaCl2浓度，此处为0.1mol/L；V—达到凝聚限度时的最少CaCl2加量(ml)。结果见表1。由表1可以看出，与化学法从褐煤中提取出的腐植酸相比，真菌无细胞滤液从褐煤中提取出的腐植酸氮和氧含量显著提高，硫和碳含量显著降低，H/C，O/C，絮凝极限值和E4/E6值均显著或极显著增加(p<0.05，p<0.01)。H/C和E4/E6比值越高，芳香度和分子质量越低。腐植酸氮含量的增加和分子量的降低有利于植株的吸收和利用，而抗絮凝能力的增加则有益于其作为液体肥料施用。
3、腐植酸的结构表征
采用FTIR和13C-qNMR分析了HA的结构和官能团分布。为获得FTIR光谱，将2mgHA样品与200mg干KBr充分混匀后压入托盘，用IS10 FTIR光谱仪(Nicolet instruments Co.，USA)在4000400cm-1范围内对样品进行FTIR扫描获得。Has样品的13C核磁共振谱使用AVANCEIII 500MHz光谱仪(Bruker，Karlsruhe,German)获得。为了定量，光谱被分成不同的化学位移区域分配给特定的碳组。结果见图1和表2。
表2固态CP/MAS 13C NMR测定的腐植酸样品中碳的分布结果
Figure BDA0003286653400000101
由图1a可知，两种腐植酸具有相似的FTIR光谱。共有峰包括：3500-3300cm-1(醇和酚中的O-H伸展)、1720cm-1(羧基和羰基)、1380-1480cm-1(亚甲基和甲基的变形振动)和1035cm-1(多糖成分的C-O伸展)。与HA对照组相比，HA-CFFs样品的光谱在1617cm-1和911cm-1的波数中不包含芳环中C＝C基团的拉伸和芳环C-H弯曲吸收带，这可能与芳环的降解有关；而HA-CFFs在1538cm-1处有一个吸收带，这是由C＝N拉伸和N-H变形引起的，HA-CFF中氮含量的增加可能与该官能团的增加有关。图1b和表2显示，与HA对照相比，HA-CFFs中甲氧基碳，羧基，酮基碳增加，脂肪族碳增加，芳香族碳降低。由于羧基和甲氧基在促进植物生长方面发挥重要作用，该结果预示着HA-CFFs可能具有更强的生理活性。
4、腐植酸的生物活性
为了验证HAs的生物活性对玉米生长的影响，建立了两个处理，每个处理三个重复：(1)施加HA-control 0.03g kg-1，(2)施加HA-CFFs 0.03gkg-1。盆(20cm×25cm大小)装有7.5kg风干土壤，随机排列。所有处理均使用相同量的N、P2O5、K2O：分别为0.15、0.1和0.12g kg-1。每盆播种三粒玉米种子。30天后，测定各处理植株的茎粗、株高、植株的地上部和地下部生物量。使用方差分析测试数据集的统计显着性。p值<0.05被认为具有统计学意义。结果见表3。
表3腐植酸对玉米生长的影响
Figure BDA0003286653400000111
由表3可以看出，与施加HA-control相比，施加HA-CFFs处理能够明显促进植物生长，表现为植株茎粗、株高、地下部生物量、地上部生物量和整株生物量的显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.青霉MJ51胞外液在溶解褐煤制备水溶性腐植酸中的应用。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述溶解褐煤制备水溶性腐植酸的方法包括以下步骤：
将所述青霉MJ51胞外液和氧化褐煤混合，得到混合液，混合液于60～90℃条件下进行溶煤，得到溶解液，所述溶解液中包含水溶性腐植酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述混合液中氧化褐煤的质量浓度为3％～5％。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氧化褐煤的制备方法包括以下步骤：将硝酸和褐煤混合后进行氧化还原反应；
将所述氧化还原反应得到的反应料液固液分离，得到固体组分，所述固体组分为氧化褐煤。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述氧化还原反应的温度为25～30℃。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述硝酸的当量浓度为4～6N。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述青霉MJ51胞外液的制备方法包括以下步骤：
将青霉MJ51的孢子悬浮液接种于液体培养基，进行培养，得到培养液；
分离出所述培养液中的青霉MJ51胞外液；
所述孢子悬浮液中青霉MJ51的孢子浓度为(1～9)×107个；所述孢子悬浮液和培养基的体积比为5：(80～120)。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养的温度为25～30℃；所述培养的时间为55～65h。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液体培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：蔗糖12～18g/L、KNO32～4g/L、KH2PO40.8～1.2g/L、Na2HPO40.3～0.8g/L、MgSO40.4～0.6g/L；所述培养基的pH值为5.8～6.2。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述青霉MJ51的保藏编号为：CGMCCNo.18120。
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