CN115165968A - 组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法 - Google Patents

Abstract

一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过一特异性征诱发单元使组织层面中的单分子分辨率水平的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用；通过一获取单元获取目标物质在发生特异性作用过程中产生的特征信息；通过一结果生成单元，生成目标对象位置与表征特征之间的映射关系，获得目标物质的原位成像结果。本发明的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

Description

组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法

技术领域

本发明涉及生物成像技术领域，具体涉及一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法。

背景技术

生物标志物通常作为评价生物生理过程、病理过程或对药物干预反应的特异性特征的对象。生物标志物的检测在医学诊断、临床研究、新药开发方面具有重要意义，尤其在肿瘤、病毒感染性疾病或其他疾病的诊断和治疗上具有重要价值。以肿瘤研究为例，肿瘤发生发展过程中，会产生特定的肿瘤标志物，能够直接反映肿瘤的来源、良恶性等信息，检测组织层面的肿瘤标志物对癌症诊断和治疗有重要意义。

组织层面生物标志物中，蛋白标志物具有非常重要的地位。蛋白是生物学功能的执行者，是研究和应用最广泛的生物标志物。现有技术中，对组织层面特定的蛋白标志物的检测方法，通常是依据抗原与抗体特异性结合的原理对蛋白标志物进行免疫学检测，经常利用放射性同位素、酶、胶体金和有机荧光染料分子等对抗体进行标记，利用被标记的抗体，识别组织细胞上相应的蛋白标记物，通过定性和定量检测已标记的抗体而达到检测目标蛋白的目的。现有技术中的这些方法，需要通过光显微镜进行成像判断，例如荧光发光法是通过光显微镜获取成千上万个抗原抗体蛋白整体的发光情况成像，染色的情况下也是通过光显微镜获取成千上万个染色的目标蛋白整体的发光情况成像。由于光显微镜检测到单个蛋白分子的光强度，现有技术中基于光学显微镜技术的检测方法，无法得到单个蛋白尺度的目标物的情况信息。

此外，现有技术中的检测方法，因为要在抗原抗体蛋白结合的复合物分子达到一定的浓度(含量)才能检测到光强度信息，通常将组织蛋白破碎做成悬液的形式进行检测，此时的检测对象经过破碎无法还原原始组织层面的信息情况，故，现有技术中的方法，无法实现组织层面单分子分辨率水平目标物质的原位成像信息。

组织层面生物物质单分子分辨率水平的检测，一直是没有解决的重要技术问题。因此，提供一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法以克服此技术难题甚为必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，实现在单分子分辨率水平下的组织层面目标物质成像。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

提供一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过如下方式进行：

通过一特异性征诱发单元使组织层面中的单分子分辨率水平的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用；

通过一获取单元获取目标物质在发生特异性作用过程中产生的特征信息；

通过一结果生成单元，生成目标对象位置与表征特征之间的映射关系，获得目标物质的原位成像结果。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合逐渐分离再变化到目标物质与参照物质完全分离。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，获取单元获取目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息中的至少一种作为表征特征信息。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，获取单元根据目标物质在发生特异性作用过程中产生的前后变化信息获得表征特征信息，或者将目标物质在发生特异性作用过程中产生的信息与参照样本信息进行比对得到表征特征信息，所述参照样本信息是特异性征诱发单元作用于组织层面的不含有目标物质时得到的信息。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，所述结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征的分布G(x,y,g(α))；

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y)……式(1)；

其中，P(x,y)表示原位成像像素的位置信息，本处用笛卡尔坐标系表达，x是横坐标,y是纵坐标。

g(α)是对应的P(x,y)成像位置的信号表达，即获取单元获取的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息。

具体的，关于力的变化特征信息，g(α)为F＝kd，其中，k为弹性系数，d为偏移量；

关于电的变化特征信息：g(α)为

其中，Φ为电磁场的电势，A为磁向量势，E为电场强度，t为时间；

关于光的变化特征信息：g(α)为

其中，α₁为吸收系数，z为穿透深度。优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，目标物质与参照物质之间发生抗原-抗体特异性作用。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性结合形成目标物质与参照物质之间的结合力，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合力逐渐减小再变化到目标物质与参照物质完全分离。

优选的，获取单元获取目标物质与参照物质之间的形变或者结合力，根据形变或者结合力的变化获得特征信息；g(α)为F＝kd，其中，k为弹性系数，d为偏移量；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的介电参数变化，根据介电参数的变化获得特征信息；g(α)为

其中，Φ为电磁场的电势，A为磁向量势，E为电场强度，t为时间；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的光的变化，根据光的变化获得特征信息；g(α)为

其中，α₁为吸收系数，z为穿透深度。

优选的，上述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，特异性征诱发单元为形变生物传感器，形变生物传感器设置有用于被外部驱动装置夹持以进行移动的夹持部和具有用于与目标蛋白发生特异性作用的参照物质的耦合部；耦合部为具有弹性的尖状体，尖状体用于耦合单个目标物质；耦合部和夹持部设置有反射任何方向激光的光滑面层。

优选的，获取单元设置有激光发射器、光敏感应器和特征信息处理器，激光发射器将激光照射在形变生物传感器的光滑面层，所述光滑面层将激光反射回光敏感应器；所述光敏感应器检测反射回来的激光在光敏感应器上的偏移量；所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处形变传感器的光路变化现象或者形变偏移量或者形变传感器耦合部受到的作用力信息中的至少一种信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于光的或者力的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)；或者

获取单元设置有介电特征检测机构和特征信息处理器，所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处的介电参数的变化信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于介电性能的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)；或者

获取单元设置有光子特征检测机构和特征信息处理器，所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处的光的光强或频率的变化信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于光的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)。

本发明的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过一特异性征诱发单元使组织层面中的单分子分辨率水平的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用；通过一获取单元获取目标物质在发生特异性作用过程中产生的特征信息；通过一结果生成单元，生成目标对象位置与表征特征之间的映射关系，获得目标物质的原位成像结果。本发明的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，解决了现有技术中无法实现单分子分辨率水平下的组织层面目标物质成像的技术难题。该方法直接对组织进行检测，避免了现有技术中需要对检测样本进行复杂制备后才能进行检查的缺陷，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

附图说明

图1是本发明方法获得的一组织蛋白原位可视化点位图，比例尺＝1μm。

图2是本发明方法中的一种形变生物传感器的结构示意图。

图3是本发明方法中的一种形变检测系统的示意图。

图4是本发明方法中的另一形变检测系统的示意图。

图5是本发明的方法的流程图。

图6是本发明的方法的检测到的一种变化示意图。

在图1至图5中，包括：

形变生物传感器100、耦合部110、夹持部120、反射点130、固定点140、驱动装置200、激光发射器300、光敏传感器400、处理单元500、组织物600。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1。

本实施例是一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，组织层面是指本发明的方法直接对生物组织进行测试，不需要现有技术中对测试样品进行处理后才能进行检测，测试的生物组织可以是组织切片或者其它待测试的生物样本。

一般的分子直径大小是10^-10m级别，即0.1纳米。各种不同的物质，分子直径不同，较小的氢分子直径是0.23纳米。本发明的核心目的是为了能够检测到单个蛋白目标物质的成像，要检测到单个蛋白目标物质，需要在0.1-10nm的分辨率尺度能够成像。因此，本发明中的单分子分辨率水平指0.1-10nm的分辨率尺度。目标物质可以是单个蛋白或者分子或者其它物质。

图1是通过本发明的方法获得的其中一幅组织蛋白原位可视化点位图，从图中可以看到三角形代表的各个目标蛋白(即目标物质)在组织中的分布及具体的位置。通过此图可以看到，在组织中哪个位置存在目标蛋白，即在目标蛋白在组织中的位置。

本实施例的一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过如下方式进行：

通过一特异性征诱发单元使组织层面中的单分子分辨率水平的目标物质与特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用；

通过一获取单元获取目标物质在发生特异性作用过程中产生的特征信息；

通过一结果生成单元，生成目标对象位置与表征特征之间的映射关系，获得目标物质的原位成像结果。

特异性征诱发单元的设置，是为了诱导与待检测的组织中的目标物质发生作用，以创造能够检测到因为组织中因为含有目标物质而产生有别于组织中不含目标物质的特性。因此，特异性征诱发单元设置有参照物质，利用特异性征诱发单元检测组织时，当组织层面中含有目标待测物质时，待测的目标物质将与参照物质发生特异性作用。所谓特异性作用是指参照物质与目标物质之间特异性发生的作用，参照物质与非目标物质之间不发生这种作用。

具体的，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合逐渐分离再变化到目标物质与参照物质完全分离。

特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面再到逐渐远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间产生作用力所形成的特征，可以对此过程中的变化信息进行监测。获取单元获取目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息中的至少一种作为表征特征信息。

例如，获取单元可获取目标物质与参照物质作用过程中产生的形变或者受力变化，根据形变或者受力的变化获得特征信息；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的介电参数变化，根据介电参数的变化获得特征信息；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的光的变化，根据光的变化获得特征信息。

具体的，获取单元根据目标物质在发生特异性作用过程中产生的前后变化信息获得特征信息，或者将目标物质在发生特异性作用过程中产生的信息与参照样本信息进行比对得到特征信息，参照样本信息是特异性征诱发单元作用于组织层面的不含有目标物质时得到的信息。

结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征的分布G(x,y,g(α))；

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y)……式(1)；

其中，P(x,y)表示原位成像像素的位置信息，本处用笛卡尔坐标系表达，x是横坐标，y是纵坐标。

获取单后获取到目标物质发生的特征信息后，说明在此检测位置处，组织中存在待检测的目标位置，结果生成单元根据此结果结合组织的空间位置，得到该目标物质在组织中的原始位置即原位信息。得到某个特定的目标物质与其原始位置的映射关系。当对组织中的所有位置检测完毕后，就可以获得如图1所示的组织中的目标物质的原位成像图。

本实施例的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，解决了现有技术中无法实现单分子分辨率水平下的组织层面目标物质成像的技术难题。该方法直接对组织进行检测，避免了现有技术中需要对检测样本进行复杂制备后才能进行检查的缺陷，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

实施例2。

一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其它特征与实施例1相同，还具有如下特征：目标物质与参照物质之间发生抗原-抗体特异性作用。

在该组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法中，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性结合形成目标物质与参照物质之间的结合力，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合力逐渐减小再变化到目标物质与参照物质完全分离。

获取单元获取目标物质与参照物质之间的形变或者结合力，根据形变或者结合力的变化获得特征信息。根据特征信息得到组织中此位点是否存在目标物质。

结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征的分布G(x,y,g(α))；

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y)……式(1)；

其中，g(α)、P(x,y)分别是获取单元获取的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息和位置分布信息，(x,y)是位置坐标。

g(α)是对应的P(x,y)成像位置的信号表达，即获取单元获取的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息。

获取单元可获取目标物质与参照物质之间的形变或者结合力，根据形变或者结合力的变化获得特征信息；g(α)为F＝kd，其中，k为弹性系数，d为偏移量；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的介电参数变化，根据介电参数的变化获得特征信息；g(α)为

其中，Φ为电磁场的电势，A为磁向量势，E为电场强度，t为时间；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的光的变化，根据光的变化获得特征信息；g(α)为

其中，α₁为吸收系数，z为穿透深度。

依次采用相同的方式对组织中不同位点进行检测，根据每个位点的位置信息及是否存在目标物质结果，可以得到整个生物组织的目标物质位点图。

本实施例的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，解决了现有技术中无法实现单分子分辨率水平下的组织层面目标物质成像的技术难题。该方法直接对组织进行检测，避免了现有技术中需要对检测样本进行复杂制备后才能进行检查的缺陷，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

实施例3。

一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，本实施例中目标物质与参照物质之间发生抗原-抗体特异性作用。

本实施例以目标物质为抗原蛋白、特异性征诱发单元设置有抗体为例进行说明。需要说明的是，实际检测中，可以根据需要设置对应的匹配关系，不局限于本实施例的对应方式。

具体的，特异性征诱发单元为形变生物传感器100，如图2所示，形变生物传感器设置有用于被外部驱动装置夹持以进行移动的夹持部120和具有用于与目标蛋白发生特异性作用的参照物质的耦合部110。耦合部110与片状夹持部120一体式连接，耦合部110设置于片状的夹持部120的侧端。耦合部110为具有弹性的尖状体，尖状体用于耦合单个目标物质，通常在尖状体的尖端处耦合单个抗体分子。

该耦合一般采用被动和共价附着的方式将抗体分子固定在底物上，即本发明的耦合部110的尖端位置。尖状的耦合部，可以耦合单个抗体分子。当耦合固定好的抗体分子与组织物上的抗原充分接触时，产生特异性结合力，该结合力在耦合部与组织物分离过程中，使耦合部产生微小形变。

夹持部120为刚性体或者弹性体，用于耦合部的固定以及移动。当夹持部带着耦合部与组织物分离过程中，因为特异性结合作用力的存在，耦合部会发生微小形变。当夹持部120为弹性体时，也会伴随着小于耦合部的微小的形变。

耦合部110和夹持部120具有反射任何方向激光的光滑面层。优选光滑面层为金属镀层。金属镀层可以减少激光的散射，将更多光量反射回光敏传感器，有效提高形变传感器的灵敏度。

当耦合部110和夹持部120表面反射激光时，其形变能被激光位移传感器识别。

该形变生物传感器，其使用是这样的，耦合部110的尖端耦合抗体分子，与组织物上的抗原分子充分接触发生特异性结合，当耦合部与组织物分离过程中，因为结合力的存在使具有弹性的耦合部会发生微小形变。该微小形变因为耦合部光滑表面能反射激光，被激光位移传感器识别到形变。

获取单元设置有激光发射器300、光敏感应器400和特征信息处理器500，激光发射器将激光照射在形变生物传感器的光滑面层(本实施例中具体是将激光照射在三角形片状耦合部110的光滑面层)，光滑面层将激光反射回光敏感应器；光敏感应器检测反射回来的激光在光敏感应器上的偏移量，如图3所示。

将激光照射在耦合部110的表面上的点定义为反射点130。需要说明的是,反射点130不局限于在耦合部110的表面，也可以是在夹持部120表面，如图4所示。当耦合部110形状为细小的针形，其表面积不足以接收激光发射器的激光时，将反射点设置在具有反射激光和弹性形变的夹持部120上，同样达到检测形变传感器形变量的效果。

驱动装置200与夹持部120连接固定，驱动弹性耦合部110远离或者靠近待测组织物600。将驱动装置200与夹持部120连接固定的点定义为固定点140。

特征信息处理器500可以为计算机，根据公式(1)将光敏感应器上的偏移量换算为形变传感器的形变偏移量或者根据公式(2)计算得到形变传感器耦合部受到的作用力；

其中，d是形变生物传感器的形变偏移量，D是形变生物传感器发生形变后反射光在光敏传感器上的偏移量，a是形变生物传感器上的反射点与形变生物传感器固定点之间的距离，b是形变生物传感器上反射点与激光发射器之间的距离，θ是激光发射器发射激光的入射角；

其中，反射点是红外激光发射器的激光照射在形变生物传感器上的点，固定点是驱动装置与固定部连接的点；

F＝kd……(2)；

其中，F为形变传感器耦合部受到的作用力，k为形变传感器耦合部的弹性系数。

特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处形变传感器的形变偏移量及形变传感器耦合部受到的作用力信息判断是否存在特征信息。

本发明的方法，特征信息处理器500向驱动装置200发送命令，驱动耦合部100逐渐靠近并充分接触组织物，再逐渐离开组织物600。特征信息处理器500控制激光发射装置300在耦合部100移动过程中发射红外激光照射在耦合部130的照射点上，同时该反射点将激光反射回红外光敏感应器400。因为耦合部100的形变导致激光在红外光敏感应器400上发生偏移，特征信息处理器500收集该偏移量并结合公式(1)计算形变生物传感器100的形变量或者通过公式(2)计算得到形变传感器耦合部受到的作用力。根据组织层面不同点位(或者称位置)处是否检测到目标蛋白，从而获得单个目标蛋白的原位成像信息。

本实施例中使用弹性生物传感器，当弹性生物传感器上的抗体分子与组织上待测目的蛋白分子发生结合时，弹性生物传感器的形变量发生变化，通过检测弹性生物传感器的形变，判断抗体分子与组织上待测目的蛋白分子是否发生结合，结合组织空间位置信息，获得组织原位蛋白可视化点位图。能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，解决了现有技术中无法实现单分子分辨率水平下的组织层面目标物质成像的技术难题，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

实施例4。

本实施例的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，使用形变生物传感器作为特异性征诱发单元，为了提高检测效率，本实施例中，耦合部设置有多个，多个耦合部呈矩阵式排列。每个耦合部可以与一个目标物质特异性结合，通过设置多个耦合部，可以提高检测效率。

实施例5。

本实施例提供一种应用实施例3形变生物传感器作为特异性征诱发单元、以激光发射器300、光敏感应器400和特征信息处理器500作为获取单元进行组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过以下步骤进行：

S1：耦合部耦合抗体分子

将形变生物传感器用无水乙醇浸泡洗涤，再用超纯水洗涤；

将超纯水洗涤后的形变生物传感器置于抗体溶液中偶联反应，再用PBS洗涤；

洗涤后的形变生物传感器置于PBS中低温保存；

处理过程可采用如下的其中一种参数工艺：无水乙醇浸泡洗涤次数为三次，每次5min。超纯水的洗涤次数为三次，每次5min。抗体溶液中的抗体为CD117，体积为100uL。偶联反应的时间为1.5h。PBS洗涤次数为三次，每次5min。

S2：组织物的前处理

裁取一定体积的新鲜的组织样本或者冰冻的组织样本，置于缓冲液中静置待用。

处理过程提供其中一种下方式的处理参数：组织物的体积大小为0.1*0.1*0.1cm³-2*2*2cm³。缓冲液的pH为7.0-7.6，成分主要包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、无水硫酸镁、葡萄糖、葡聚糖、腺苷、谷胱甘肽。

S3：传感器形变量的实时检测

将形变传感器平行正对待检测组织表面并保持距离；

红外激光发射器向形变生物传感器表面发出激光，然后激光被反射回光敏传感器，得到激光在光敏感应器上的偏移量D；

记录形变生物传感器上的反射点与形变生物传感器固定点之间的距离a，记录形变生物传感器上反射点与激光发射器之间的距离b；

处理单元通过公式(1)实时计算形变生物传感器的形变偏移量d；

S4：形变生物传感器与组织物进行接触和分离

驱动装置驱动弹性耦合部向组织物靠近直至接触，实时记录该过程的形变生物传感器的形变偏移量和弹性耦合部的位移量；

驱动装置驱动弹性耦合部向组织物远离并脱离组织物，实时记录该过程的形变生物传感器的形变偏移量和弹性耦合部的位移量；

S5:特异性结合点坐标的获取

特征信息处理器以S4步骤获得的实时的形变生物传感器的形变偏移量为x轴，弹性耦合部的位移量为y轴作点线图，根据点线图中是否出现拐点，判断抗体与抗原分子是否产生特异性结合并记录组织物上有特异性结合点的坐标信息；

S6：绘制组织物图像上特异性结合点

调整弹性耦合部与组织物在水平方向的相对位置，重复S3至S5步骤，直至将组织物上以固定距离分布的所有点检测完；

将所有S5步骤记录的坐标信息，以点的形式绘制在组织物图像上，形成单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化点位图。

本发明的一种单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化的方法，其实施方式是这样的，通过S1步骤批量制备含有抗体的形变生物传感器，当有需要检测的组织物时，先对组织物按S1步骤处理，再将形变生物传感器与待测组织物结合，按S2至S3步骤测其形变量。接着通过S4至S5步骤获取组织物上具有特异性结合的点，最后将所有的点汇集在组织物图像上，形成可视化的散点图。

本发明的一种单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化的方法，通过上述方式实施，具有快速、可视化的特点。

实施例6。

本实施例提供一种应用实施例3形变生物传感器作为特异性征诱发单元、以激光发射器300、光敏感应器400和特征信息处理器500作为获取单元进行组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，通过以下步骤进行：

S1：耦合部耦合抗体分子

将形变生物传感器用无水乙醇浸泡洗涤，再用超纯水洗涤；

将超纯水洗涤后的形变生物传感器置于抗体溶液中偶联反应，再用PBS洗涤；

洗涤后的形变生物传感器置于PBS中低温保存；

处理过程可采用如下的其中一种参数工艺：无水乙醇浸泡洗涤次数为五次，每次8min。超纯水的洗涤次数为三次，每次10min。抗体溶液中的抗体为CD117，体积为200uL。偶联反应的时间为2.0h。PBS洗涤次数为三次，每次5min。

S2：组织物的前处理

裁取一定体积的新鲜的组织样本或者冰冻的组织样本，置于缓冲液中静置待用。

处理过程提供其中一种下方式的处理参数：组织物的体积大小为0.1*0.1*0.1cm³-2*2*2cm³。缓冲液的pH为7.0-7.5，成分主要包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、无水硫酸镁、葡萄糖、葡聚糖、腺苷、谷胱甘肽。

S3：传感器形变量的实时检测

将形变传感器平行正对待检测组织表面并保持距离；

红外激光发射器向形变生物传感器表面发出激光，然后激光被反射回光敏传感器，得到激光在光敏感应器上的偏移量D；

记录形变生物传感器上的反射点与形变生物传感器固定点之间的距离a，记录形变生物传感器上反射点与激光发射器之间的距离b；

处理单元通过公式(1)实时计算形变生物传感器的形变偏移量d；

再根据公式(2)实时计算传感器与生物组织之间的作用力F。

S4：形变生物传感器与组织物进行接触和分离

驱动装置驱动弹性耦合部向组织物靠近直至接触，实时记录该过程的形变生物传感器的形变偏移量和弹性耦合部的位移量；

驱动装置驱动弹性耦合部向组织物远离并脱离组织物，实时记录该过程的形变生物传感器的形变偏移量和弹性耦合部的位移量并根据公式(2)计算实时过程中传感器与生物组织之间的作用力F；

S5:特异性结合点坐标的获取

特征信息处理器以S4步骤获得的生物传感器与生物组织之间的距离为x轴，传感器与生物组织之间的作用力F为y轴作点线图，如图6所示，根据点线图中出现的拐点，判断抗体与抗原分子产生了特异性结合并记录组织物上有特异性结合点的坐标信息；

S6：绘制组织物图像上特异性结合点

调整弹性耦合部与组织物在水平方向的相对位置，重复S3至S5步骤，直至将组织物上以固定距离分布的所有点检测完；

将所有S5步骤记录的坐标信息，以点的形式绘制在组织物图像上，形成单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化点位图。

本发明的一种单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化的方法，其实施方式是这样的，通过S1步骤批量制备含有抗体的形变生物传感器，当有需要检测的组织物时，先对组织物按S1步骤处理，再将形变生物传感器与待测组织物结合，按S2至S3步骤测其形变量及对应力。接着通过S4至S5步骤获取组织物上具有特异性结合的点，最后将所有的点汇集在组织物图像上，形成可视化的散点图。

本发明的一种单分子分辨率水平的组织原位蛋白可视化的方法，通过上述方式实施，具有快速、可视化的特点。

实施例7。

本实施例提供一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，射频发射阵列近场发射射频电磁波，获取自发射-自接收反馈参数，通过获取单元获取目标物质即单元组织与参照物质即射频电磁场作用过程中产生的反射参数变化，得到反映单元组织的介电参数的特征。

采用开端同轴探头法，获取单元获取目标物质发生特异性作用过程中产生的介电参数的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的介电参数的变化特征的分布G(x,y,g(α))。

具体的，结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于电的变化特征的分布G(x,y,g(α))；

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y)……式(1)。

作为方式之一，获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的介电参数变化，根据介电参数的变化获得特征信息；g(α)为

其中，Φ为电磁场的电势，A为磁向量势，E为电场强度，t为时间。

本发明的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。

实施例8。

将单元目标用放射性生物核素进行标定，检测放射性核素单次辐射的伽马射线光子。光子变化包括光强、频率变化等。获取单元获取目标物质的光强、辐射频率，该光强和频率信息反映参照物质的分布变化，根据光强和频率的变化获得特征信息；

采用光强和频率探测，获取单元获取目标物质发生特异性作用过程中产生的光强、频率的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)。结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于光的变化特征的分布G(x,y,g(α))；得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的光的变化特征的分布G(x,y,g(α))。

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y)……式(1)。

作为方式之一，获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的光的变化，根据光的变化获得特征信息；g(α)为

其中，α₁为吸收系数，z为穿透深度。

本发明的成像方法能够在组织层面进行单分子分辨率水平的目标物质成像，具有对检测样本要求简单，检测速度快、检测精度高的特点。以光强、频率等作为表征对象，能够反映物质本身的性能特性，结果准确。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，通过如下方式进行：

通过一特异性征诱发单元使组织层面中的单分子分辨率水平的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用；

通过一获取单元获取目标物质在发生特异性作用过程中产生的特征信息；

通过一结果生成单元，生成目标对象位置与表征特征之间的映射关系，获得目标物质的原位成像结果。

2.根据权利要求1所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性作用，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合逐渐分离再变化到目标物质与参照物质完全分离。

3.根据权利要求2所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，获取单元获取目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息中的至少一种作为表征特征信息。

4.根据权利要求3所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，获取单元根据目标物质在发生特异性作用过程中产生的前后变化信息获得表征特征信息，或者将目标物质在发生特异性作用过程中产生的信息与参照样本信息进行比对得到表征特征信息，所述参照样本信息是特异性征诱发单元作用于组织层面的不含有目标物质时得到的信息。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，

所述结果生成单元根据式(1)的目标对象位置与表征特征之间的映射关系，得到组织层面点(x,y)对应的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征的分布G(x,y,g(α))；

G:(x,y,g(α))→g(α)·P(x,y) ……式(1)；

其中，P(x,y)表示原位成像像素的位置信息，本处用笛卡尔坐标系表达，x是横坐标，y是纵坐标；

g(α)是对应的P(x,y)成像位置的信号表达，即获取单元获取的目标物质发生特异性作用过程中产生的关于力的、电的或者光的变化特征信息。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，目标物质与参照物质之间发生抗原-抗体特异性作用。

7.根据权利要求5所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，特异性征诱发单元接近并贴压于组织层面，组织层面中的目标物质与所述特异性征诱发单元中含有的参照物质发生特异性结合形成目标物质与参照物质之间的结合力，在特异性征诱发单元远离组织层面的过程中，目标物质与参照物质之间从结合力逐渐减小再变化到目标物质与参照物质完全分离。

8.根据权利要求7所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，

获取单元获取目标物质与参照物质之间的形变或者结合力，根据形变或者结合力的变化获得特征信息；g(α)为F＝kd，其中，k为弹性系数，d为偏移量；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的介电参数变化，根据介电参数的变化获得特征信息；g(α)为

其中，Φ为电磁场的电势，A为磁向量势，E为电场强度，t为时间；或者

获取单元获取目标物质与参照物质作用过程中产生的光的变化，根据光的变化获得特征信息；g(α)为

其中，α₁为吸收系数，z为穿透深度。

9.根据权利要求8所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，特异性征诱发单元为形变生物传感器，形变生物传感器设置有用于被外部驱动装置夹持以进行移动的夹持部和具有用于与目标蛋白发生特异性作用的参照物质的耦合部；耦合部为具有弹性的尖状体，尖状体用于耦合单个目标物质；耦合部和夹持部设置有反射任何方向激光的光滑面层。

10.根据权利要求8所述的组织层面单分子分辨率水平目标物质原位成像方法，其特征在于，

获取单元设置有激光发射器、光敏感应器和特征信息处理器，激光发射器将激光照射在形变生物传感器的光滑面层，所述光滑面层将激光反射回光敏感应器；所述光敏感应器检测反射回来的激光在光敏感应器上的偏移量；所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处形变传感器的光路变化现象或者形变偏移量或者形变传感器耦合部受到的作用力信息中的至少一种信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于形变和力的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)；或者

获取单元设置有介电特征检测机构和特征信息处理器，所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处的介电参数的变化信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于介电性能的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)；或者

获取单元设置有光子特征检测机构和特征信息处理器，所述特征信息处理器根据形变生物传感器作用于组织层面过程中获得的各个位置处的光的光强或频率的变化信息判断是否存在特征信息，获得目标物质发生特异性作用过程中产生的关于光的变化特征信息g(α)和位置分布信息P(x,y)。

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