CN115154488A

CN115154488A - 一种鼠李糖乳杆菌改善记忆损伤的新用途

Info

Publication number: CN115154488A
Application number: CN202210332169.1A
Authority: CN
Inventors: 徐毅; 张洁; 汪惠丽
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2042-03-31
Also published as: CN115154488B

Abstract

本发明公开了一种乳酸菌株的新用途，属于益生菌的新功能用途的技术领域。目前，益生菌产品及其健康调节效应受到了人们的普遍关注。特异的益生菌株通常具有调节肠道菌群、调节免疫、抑制病原菌侵染等功能。部分益生菌株具有神经调节效应，即通过不同的途径影响到脑等中枢神经系统的功能，从而改善人们的精神健康。本发明对鼠李糖乳杆菌GR‑1对空间记忆损伤的干预能力进行了检测，发现这株益生菌的孕期摄入可以显著预防铅暴露所致的学习记忆损伤。这是首次发现单株益生菌能够通过母代摄入的方式预防子代学习记忆损伤，对拓展益生菌的应用领域、维护发育期机体的精神健康具有相应的应用价值。

Description

一种鼠李糖乳杆菌改善记忆损伤的新用途

技术领域

本发明属于益生菌株新用途的技术领域，尤其涉及一种鼠李糖乳杆菌GR-1改善铅致学习记忆损伤的新用途。

背景技术

随着现代社会压力的增大及环境暴露、食品安全等原因，目前人群中记忆损伤或缺陷出现了上升的趋势。其中，慢性铅暴露是一种重要的学习记忆损伤模型。铅作为一种环境中存在的难以降解的重金属污染物，主要通过摄食( 食物) 和呼吸进入血液循环，最终沉积在软组织和骨骼中，对血液、骨骼、泌尿、免疫和神经等多种系统造成破坏，对儿童和动物中枢神经系统的发育具有极大的毒性。铅会导致机体抗氧化防御系统受到抑制，促使体内产生大量活性氧，并导致脂质过氧化和氧化性DNA损伤，最终损害机体健康。学习和记忆认知障碍是铅中毒儿童的主要临床症状。铅暴露通过影响突触功能可塑性，即长时程增强或长期抑制，从而影响动物的学习记忆能力。

益生菌是一类可赋予宿主有益健康效应的活体微生物。益生菌通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康，从而产生有利于健康的单微生物或组成明确的混合微生物。有研究表明益生菌是通过调节宿主内部菌群组成或通过调节宿主的免疫功能，达到维护宿主肠道健康和促进营养吸收的目的。对益生菌效应谱的解析和探究为益生菌制剂产品的研究和开发提供了理论基础，也不断揭开了益生菌强大的益生作用的奥秘，在国际上引起了广大科学家和消费者的强烈关注。

益生菌的益生效应具有显著的菌株特异性，即使同种的不同菌株在效应模式和作用途径上也有显著的差别。鼠李糖乳杆菌GR-1是一株分离自人泌尿生殖道的乳酸菌，但该菌同样可以经口摄入而调节肠道平衡，因此是一株典型的益生菌。目前对GR-1的益生功能的解析主要在于对病原菌的竞争性抑制作用和免疫调节作用，关于其是否具有神经调节效应目前尚不得而知。

发明内容

本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌GR-1预防学习记忆损伤的新用途。

本发明是通过以下步骤的技术方案得以实现：

所用菌株为鼠李糖乳杆菌GR-1（Lactobacillus rhamnosus GR-1）,所使用的培养基为MRS培养基。

（1）菌株活化

配置好的液体培养基用高压蒸汽灭菌锅于121℃条件下灭菌20 min。待液体培养基冷却至室温后，吸取50μL 冷冻保藏的菌种，接入液体培养基，然后将液体培养基置于37℃ 恒温培养箱中培养过夜，之后取200 μL菌种发酵液接入相应的液体培养基中，进行传代培养。

（2）菌株的暴露

将活化后的GR-1菌株收集下来后，以10⁹CFU^//只/天的剂量灌胃SD大鼠。灌胃从雌鼠与雄鼠同笼后一周后开始进行，一直持续到产前，即持续整个孕期。子代出生后，在哺乳期（出生至出生后21天）喂饲含醋酸铅的水，使得每天的暴露剂量为125 ppm, 直至断奶时止。随后正常喂养大鼠至出生后第八周并开始行为学实验。

此外，通过GR-1的哺乳期暴露和断奶后暴露（出生后21天至行为学实验止）判断不同处理模式下对学习记忆的改善作用。

(3) 行为学实验

空间记忆的情况通过大鼠的水迷宫实验和Y迷宫实验来进行。Morris水迷宫实验利用实验动物厌水的天性迫使其记忆并寻找藏匿在水面下的平台，是一种经典的测试实验动物空间记忆能力的行为学实验。在本课题中使用的Morris水迷宫实验平台由一个池内有高380 mm、直径100 mm圆形平台的直径1600 mm、高700 mm的圆形水池、摄像头、ANY-maze行为学分析软件组成。准备工作:往水池内注入400 mm深的水，水温与动物房温度保持一致，加入可食用焦糖色素使池水变为黑色使水面下的平台肉眼不可见;用软件将圆形水池区域划分为等大的四个扇形象限，圈出平台所在位置为平台象限。训练实验:将大鼠放置在平台，上30秒，然后将其取出在一二象限交界处使大鼠面朝池壁放入，入水即刻开始记录运动轨迹。90秒内若其找到平台则自动结束第一次运动轨迹的记录，并允许其在平台站30秒；若未找到平台则引导其找到平台并允许其在平台上站30秒。30秒后再进行下一次训练，入水位置分别在二三象限交界处、三四象限交界处、一四象限交界处，四次训练完成后将大鼠取出擦干防止大鼠生病再放回鼠笼，开始下一只动物的训练实验。每只动物一天训练四次连续五天，每天在相同的时间进行实验。期间记录大鼠找到平台用的时间(潜伏期)，游泳速度等指标。测试实验:第6天，将平台取出后大鼠从第三象限中间位置面朝池壁放入水中，使用软件自动记录90秒内大鼠游泳轨迹、第一次穿过平台象限潜伏期、穿过平台所在位置次数等数据。

Y迷宫实验是利用动物探索新领域的天性，记录其在Y型迷宫中自由探索期间自发交替率，反映实验动物工作记忆能力的行为学实验。Y迷宫装置由在等边三角形( 100 mm *100 mm * 100 mm)三条边上汇聚的三个黑色医用聚苯乙烯臂50X 10X25cm (长*宽*高)组成。在每个实验开始时，将每只大鼠放置在三个臂的交汇中心，然后允许大鼠自由探索迷宫的三个臂，记录十分钟内动物进入每个壁的顺序。自发交替率是指动物每三次进入的臂中没有重复的臂的次数(总进臂次数-2)。如:进臂顺序为12323131213则加下划线的这几次为成功完成自发交替，自发交替率为4/(11-2)。每只动物完成Y迷宫测试后清理迷宫，清除可能存在的动物排泄物后用酒精擦拭迷宫内部，祛除可能留下的气味以排除对后面进入迷宫的动物造成干扰。所有行为学实验都在安静且光线偏暗的环境中进行。血铅水平的检测通过双道原子荧光法来进行。

（4）肠道菌群测序

提取成年大鼠粪便DNA;使用lon Plus Hragment Library Kit(Thermofisher，Beijing， China) 构建文库，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用LifelonS5TMxL进行上样测序。根据测序所得序列，使用扩增子分析系统QIME 1.9.1进行Alpha多样性分析和UPGMA聚类。使用R软件2.15.3进行NMDS分析与作图,并分析组间的β多样性差异。使用LEifSe软件进行LEfSE分析。

（5）GR-1对大肠杆菌的体外抑制作用分析

由于菌群测序结果中，GR-1与大肠杆菌具有相反的丰度变化。因此，我们进一步通过体外实验研究GR-1对大肠杆菌的抑制作用，以判断GR-1是否通过对大肠杆菌的抑制发挥记忆改善作用。共培养的培养基体系为10 ml，其中含 MRS 肉汤培养基5 ml，牛肉膏蛋白胨培养基5 ml。共培养时，每支试管培养基中加入100 μL 的大肠杆菌 O157菌液，而后分别加入0 μL、100 μL、200 μL 和300 μL 的鼠李糖乳杆菌 GR-1菌液。共培养的培养基的pH值在培养基混匀后，加入氢氧化钠和盐酸，利用 pH 计进行测量调整。在恒温培养箱中进行共培养。

所述鼠李糖乳杆菌GR-1的孕期摄入能够显著改善铅暴露鼠在水迷宫实验中的表现，体现出显著的学习记忆改善能力；

进一步地，GR-1的哺乳期和断奶后暴露也能够改善大鼠的学习记忆；

进一步地，在GR-1预防记忆损伤的过程中，铅的暴露水平并没有显著地降低；

进一步地，在GR-1预防记忆损伤的过程中，因铅暴露引起的肠道菌群紊乱得到了一定程度的修复；

进一步地，在GR-1预防记忆损伤的过程中，拟杆菌们、大肠杆菌的丰度得到了一定程度的修复；

进一步地，体外实验表明，GR-1具有针对大肠杆菌的生长抑制能力，说明GR-1通过对大肠杆菌的抑制实现了学习记忆的修复。

有益效果

本发明利用鼠李糖乳杆菌GR-1实现了学习记忆的改善，尤其是在孕期暴露能够预防铅致学习记忆损伤。这个新用途是第一次发现鼠李糖乳杆菌GR-1具有预防铅致学习记忆损伤的作用。由于在整个实验过程中益生菌与铅不存在任何是时期上的重合，因此这种预防性效应对于通过非创伤性营养干预可能的记忆损伤、改善新生儿的记忆潜力具有重要意义。另一方面，对肠道菌群的调整和对大肠杆菌生长的抑制是GR-1发挥记忆调节作用的重要途径，因此获得了在同代有效改善学习记忆的重要微生物靶点，有利于通过对该靶点的直接调整实现学习记忆的改善。

附图说明

图1 GR-1处理条件下大鼠在水迷宫和Y迷宫的行为学表现。A图为第一次寻找到平台的延缓时间；B图为水迷宫的代表性轨迹图；C图为穿越目标平台的次数；D图为目标象限的运动距离；E图为Y迷宫的自发交替次数；F图为血铅的含量

图2为各种处理条件下的肠道菌群结构分析。GP指的是预防模式；4/6/8指的是取样的出生后周数；GR指的是修复模式；A图为不同的门的堆积图；B图拟杆菌的丰度变化；C图为大肠杆菌的丰度变化。

图3 为不同培养条件下GR-1对大肠杆菌的抑制分析。大肠杆菌的接种量为100 µl, 其活菌计数采用平板计数法进行。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

活菌计数手段

通过平板计数的方法，得到不同条件下的抑菌效果数据。首先对菌种进行光动力杀菌处理，再根据需要的浓度对菌液进行等梯度稀释。稀释完成后即可进行涂布实验。取50μl稀释菌液于固体培养基上，用充分灼烧且冷却后的涂布棒涂布均匀。静置15 min，将平板倒置，于培养箱中37℃恒温培养15h后计数，根据菌落计数，计算杀菌效率。

实施例2 PI染色实验

PI染料可以穿过破损细胞或死细胞的细胞膜，并对其DNA染色使其产生红色荧光，但是它不能通过活细胞膜。通过荧光显微镜拍照观察红色荧光数量，可以定性判断光敏剂的杀菌效果同时也可以判断细胞膜的通透性。

取1 ml 菌液离心5000 rpm，3min，弃去上清，用生理盐水清洗3次，加入997μL生理盐水和3μLPI 染液混合均匀，室温避光孵育30 min, 再用生理盐水清洗3次，加入2μL抗荧光猝灭剂，立即制片，使用荧光显微镜观察细胞存活率。

实施例3铅含量检测实验

(1) 用CO2将实验动物快速处死，立即通过腹腔动脉收集新鲜血液于含抗凝素的抗凝管内，使血液与抗凝剂混匀，若不立即使用则于3^oC~5^oC存放;

(2) 转移1ml血液到消解管中，加入3ml硝酸混匀，在消解炉上缓慢加热，令消解管底有小气泡形成而不至于沸腾，待杯中液体剩余1 m1左右时加入1 ml高氯酸继续加热至所有液体蒸发，若杯底出现碳化固体杂质则重新加入3 ml硝酸使其充分溶解，重复以上步骤，直到杯底为白色结晶或无结晶。设置空白对照组不加入血液样本，其余步骤一致;

(3) 称取0.1599g硝酸铅溶于1L硝酸中配置成含铅0.1 mg/ ml的标准铅溶液母液，取1 ml定容至100ml配置成lug/ ml标准液。分别取0，50ul， 100ul， 300ul加入10ml比色管中，冲入少量双蒸水后混匀。再加入(1+1)盐酸0.4 ml,草酸0.4 ml摇匀，再加入铁氰化钾1 ml,用水稀释至刻度，配置成0.0，5.0， 10.0， 30.0ng/ ml .的标准系列。放置30 min后测定。

(4) 样品的蒸干后在小烧杯中加入0.4 m1(1+1)盐酸，用少量水吹洗烧杯壁，加热溶解盐类后转入10ml比色管中，少量水冲洗烧杯后并入比色管(注:总体积不超过7 ml)。再加入草酸0.4 ml摇匀，入铁氰化钾1 ml，用水稀释至刻度。放置30min后测定。

(5) 配置载液:在200 ml双蒸水中加入(1+1)盐酸 10 ml，草酸10 ml，铁氰化钾25ml混匀，定容至250 ml;配置还原剂:在90ml双蒸水中加入硼氢化钾2g,氢氧化钾0.5g混匀，定容至100 ml。

(6) 测血铅含量：用ICP-MS仪器测定，先测定0、0.5、1、2、5、10、50、250、500和1000ppb等一系列浓度的标准溶液，元素根据样品中的含量选择不同浓度的标准溶液建立元素含量与仪器响应值之间的线性关系,Pb元素在He模式检测。另外，在测试过程中，为了最大限度地降低灵敏度漂移所带来的影响，每测试10个样品，再加测 1 个已知浓度的标准溶液(QC) 来进行外标校正。

Claims

1.一种鼠李糖乳杆菌GR-1的新用途，其特征在于，该菌株能够预防铅暴露所导致的大鼠空间记忆损伤。

2.一种如权利要求1所述的新用途，其特征在于，鼠李糖乳杆菌的摄入方式是孕期母体摄入。

3.一种如权利要求2所述的新用途，其特征在于，鼠李糖乳杆菌的摄入剂量是10⁹CFU^//只/天，从怀孕暴露至出生前。

4.一种如权利要求3所述的新用途，其特征在于，空间记忆损伤模型是通过哺乳期慢性铅暴露而构建。

5.一种如权利要求4所述的新用途，其特征在于，铅暴露方式为每日自由饮水摄入，暴露剂量为125 ppm。

6.一种如权利要求1所述的新用途，其特征在于，大鼠空间记忆通过水迷宫行为学实验来测定。

7.一种鼠李糖乳杆菌GR-1的新用途，其特征在于，该菌株能够缓解记忆损伤。