CN115151825A - 大体积分离系统 - Google Patents

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O·埃里克森
J·艾萨拉
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Abstract

本发明是一种自动分离系统，包括液体处理设备以及一个或更多个移液管尖端柱，其中液体处理设备配备两个或更多个喷嘴，被布置成对应地接收包括分离介质的移液管尖端柱。此外，系统包括用于为柱床上方的柱内侧腔施加正压或负压的装置，以实现每一移液管尖端柱的吸入以及每一移液管尖端柱的分配。为了在分离过程期间实现对用于移动液体通过柱床的压力进行密封而不会无意地从喷嘴推顶出柱，每一喷嘴已设有至少一个环形突起部，被布置为与大体均匀锥形的且不具有任何相应的凹槽的移液管尖端柱的内侧接合。每一喷嘴可设有滑动推顶器，以实现移液管尖端柱的移除。

Description

大体积分离系统
技术领域
本发明涉及一种能够以自动方式处理移液管尖端柱(pipette tip column)的分离系统。更具体地，根据本发明所使用的填充的移液管尖端柱中的腔和层析床具有相对大的体积，具有高背压或高流体流动阻力，使得对系统的密封性和可重复性有要求。本发明还涉及一种使用根据本发明的系统来分离生物分子的方法，所述方法相比于常规移液方法有利于处理较大体积的液体。
背景技术
自1960年代Eppendorf公司在德国成立以来，包括移液管尖端的手动液体处理设备已经广泛地用于实验室来运输测定体积的液体。从那时起，此技术不断进化以开启新的应用。
US6,197,259(Rainin Instruments Co,Inc.)涉及被描述为容易推顶的移液管尖端。更具体地，‘259专利描述了在手动移液时与常规‘环拉伸’移液管尖端的推顶相关联的问题，常规‘环拉伸’移液管尖端通过拉伸移液管尖端材料而被安装在轴上从而与此轴配合。为了使推顶移液管尖端的力更低，从而使它们更适合于通过人的拇指压力推顶，‘259专利提出的移液管尖端不呈均匀的锥形，而是包括特别设计的环形密封区域，所述环形密封区域在被安装在轴上时径向地向外拉伸，但所述移液管尖端在纵向方向上不呈锥形。
US6,596,240(Porex公司)涉及到包括密封带的移液管尖端领域。在‘240中，描述了为何移除这种尖端会是困难的，且伴随一天中的多次使用，随着时间推移会有疲劳甚至损伤。因此，提出了一种生产移液管尖端的方法的需求，这种移液管尖端可以最小的力插入和推顶，维持良好的密封，且在各种移液管上提供良好的配合。此外，还提出了一种在移液管尖端的内部密封表面上形成相对大的弹性环的方法的需求。典型地，由于内部环在形成尖端的模具中被“底切”，此内部环的尺寸受限。为了从模具中移除部件，此部件必须膨胀，从而使环从形成此环的模具芯上的槽中释放。这限制了其尺寸，且会在移除时“弄脏”环。
作为所提出问题的解决方案，‘240专利提出一种解决方案，其中尖端构件包括具有中心轴的细长管托架、位于托架的内表面上的突起部以及位于邻近于突起部的内表面上的凹槽。尖端构件可以具有大体圆锥形状，且内表面从近端处的后部开口至远端处的尖端开口呈锥形。
US2012/0180579(Perkin Elmer Health Sciences,Inc)涉及在自动液体处理器中用于填充的大体积移液管尖端。更具体地，‘579专利申请描述了随着微型移液管尺寸增大而产生的问题，特别是更大尺寸使得在托盘格式的并行处理中彼此难以相邻配合而产生的问题。作为解决方案，‘579专利申请提出了一种移液管尖端，此移液管尖端的中心部分包括扩大的腔(诸如，矩形腔)，此扩大的腔被设计以比常规移液管尖端容纳更大的体积，同时能配合在与微型移液管相同的液体处理器中。在此背景下，‘579专利申请中所提及的‘大’体积指约5mL及以上的体积，尽管它陈述了对于甚至更大的移液管尖端，技术人员将立即明了所需的改变。
US5,200,151(Dabe Behring Marburg)涉及一种流体分配系统，特别是涉及一种包括适于与一次性移液管尖端共同使用的移液管组件。为了确保一次性移液管尖端在保持此移液管尖端的移液管组件的杆的远端上的准确位置，移液管尖端的近端腔包封杆的远端，且包括环绕杆的环形区域的凸台，从而形成杆的基座，且在杆远端与移液管尖端孔之间产生准确的距离。在优选的实施方案中，液体分配系统被纳入自动分析仪器中。
US2014/0219887(Agilent)总体涉及移液，更具体地，涉及自动移液，其中不同的移液管尖端可与同一移液设备兼容。因此，不同尺寸的移液管尖端可以在不需要修改移液器的情况下被联接至此移液器。因此，同一移液器可以用于更换不同的移液管尖端，这可以以自动方式完成。移液管尖端可被联接至适配器，所述适配器包括与移液器对接的近端以及与移液管尖端对接的远端。近端都可以具有相同的几何形状，与同一移液器匹配。远端可以具有不同的几何形状，与不同的移液管尖端匹配。移液器可以是液体处理设备的一部分，且以自动方式可移动至不同的平台位置。移液器可包括：锁定机构，用于将适配器锁定至移液器或将移液管尖端直接地锁定至移液器；以及，推顶机构，用于从对应的适配器推顶移液管尖端。
US2017/0211129(Phynexus,Inc.)涉及质粒纯化的设备和方法，且描述了用于这种纯化的移液管尖端柱以及自动方法。更具体地，‘129专利申请中提出了对大规模自动及并行质粒制备的需求，因为在实践中，当在重组DNA技术中使用转染以获得蛋白质表达时，通常需要微克至毫克量的质粒DNA。为了获得这些大量的质粒DNA，大多数研究人员使用旋转柱或经由真空或重力操作的柱来进行手动质粒纯化。作为解决方案，‘129专利申请提出了一种用于在移液管尖端柱格式中纯化核酸的自动化方法，可以包括以下步骤：(a)提供包括细胞碎片、液体和质粒DNA的细胞溶解液；(b)提供柱，其中柱能够捕获质粒DNA；(c)提供包括过滤器的过滤器设备；(d)使细胞溶解液通过过滤器设备，从而产生滤液；(e)使滤液通过柱，其中滤液中的一部分质粒DNA被柱捕获；(f)使洗涤溶液经过柱；以及，(g)通过使解吸溶液经过柱来洗脱质粒DNA，其中从柱中洗脱的质粒DNA的量至少为750μg，其中步骤(e)至(g)是在预定时间执行的。在实施例中，步骤(d)使用由ME半自动纯化系统(Phynexus,Inc.,San Jose,Calif.)处理的移液管尖端柱来例示，其中柱以200μL 7M盐酸胍平衡，以500μL/min执行来回流动的一次循环，在吸入步骤和分配步骤结束时停顿20秒。ME半自动纯化系统是为PhyTips设计的，PhyTips可从Biotage AB/Phynexus Inc获得，其体积可达20000μL(20mL)。作为替代方案，‘129专利申请中陈述了此方法被设计为在Tecan EVO、Biomek FX或其他机器人液体处理器上操作。
WO2014/140640(Diagnostics For The Real World Ltd)涉及一种用于处理生物样本的设备和方法，适于诸如聚合酶链式反应(PCR)和测序的下游应用。更具体地，WO2014/140640描述了一种自动生物样本处理系统，包括移液管、结合核酸的固相材料柱、运输设备、空气活塞设备以及用于将移液管联接至运输设备和空气活塞设备的适配器。
适配器与运输设备和空气活塞设备可拆卸地接合，以用于在处理样本期间与运输设备一起移动，且适配器可联接至移液管，使得运输设备可控制地定位移液管，从而使空气活塞设备可控制地将液体抽入移液管内且将液体从移液管排出，且适配器可与柱接合。
此外，适配器包括过滤器，以用于防止液体或气溶胶在移液管或柱与空气活塞设备之间的转移。
综上，本领域中仍存在对于改进的自动液体处理系统的需求，这种系统能够安装和推顶填充的移液管尖端(称作移液管尖端柱)，所述填充的移液管尖端可已被例如层析介质或萃取介质(诸如，SPE或SLE介质)填充，特别是填充有大体积介质的大体积移液管尖端柱。本领域中存在对于简单解决方案的需求，其中移液管尖端很容易地安装在喷嘴上，有利地避免了对复杂的机械结构(诸如，适配器)的需求。
发明内容
本发明旨在满足上文所提出的一个或多个需求。
因此，本发明的第一方面是一种自动分离系统，包括：液体处理设备以及包括分离介质的至少一个移液管尖端柱，其中所述液体处理设备配备：一个或更多个喷嘴，诸如两个或更多个喷嘴，每一喷嘴被布置成接收移液管尖端柱；以及，用于施加正压或负压的装置，以实现每一移液管尖端柱的吸入以及每一移液管尖端柱的分配，在此系统中，每一喷嘴设有至少一个环形突起部。
本发明的第二方面是一种使用本发明的系统从液体样本中分离生物分子的方法，其中将所述样本吸入每一包括分离介质的这种移液管尖端柱中；允许所吸入的液体样本的生物分子与分离介质结合一段时间；以及，从移液管尖端柱分配包括任何未反应生物分子的液体样本。
本发明的第三方面是一种使用根据本发明的分离系统从液体样本分离生物分子的试剂盒，所述试剂盒包括具有4至20mL床体积且包括层析介质(诸如，亲和介质)的20至40mL的移液管尖端柱；或者，萃取介质，诸如固相萃取(SPE)介质或支撑液萃取(SLE)介质。所述试剂盒还包括，在单独隔室中，用于执行这种分离的书面指示。
1至8mL的柱床体积或者1、2、3、4、5、6、7或者8mL的柱床体积可被设置(有利地被填充)在20至40mL的尖端体积中。在其他实施方案中，含有填充床(packed bed)的尖端体积可以是20至50mL、20至60mL、30至70mL、30至80mL、40至90mL、40至100mL或者50至200mL。填充床的体积可以是1至50mL、2至40mL、3至30mL或者4至20mL。
从从属权利要求以及从所附说明书(包括其实施例)，本发明的进一步细节、优势和实施例将明显。
定义
移液管尖端：多种形状的塑料管，通过与移液管连接来吸入液体以及分配液体。此定义包括注射器尖端。
移液管尖端体积：移液管尖端可容纳的最大体积。
填充的移液管尖端柱：具有定位在尖端内侧内的分离介质的移液管尖端，通常放置在尖端的远端处。移液管尖端柱可从移液管尖端、注射器或类似材料配置。
移液管尖端柱床：放置在移液管尖端柱内侧的分离介质床。通常以床的体积来描述。
填充的移液管尖端柱床：介质，其中滤头(frit)通常位于尖端的底部远端上，滤头位于介质床上方。介质床上方的滤头可以直接地位于所述床的上方，或者可以被定位成在床的顶部上方具有一间隙。
移液管尖端柱床体积：分离介质床的体积，通常以μL或mL描述。
移液管尖端柱腔：移液管尖端柱中柱床上方的体积。
腔体积：移液管尖端柱中床顶部上方的体积。
移液管尖端泵：已被配置为通过真空或压力将一种或多种流体泵送通过移液管尖端柱的泵。
泵喷嘴：泵的可移动部分，为移液管尖端柱提供密封。在分离领域中，喷嘴有时被指示为“轴”。
环形突起部：泵喷嘴上的脊或凸起表面，为移液管尖端柱提供密封。
移液管尖端柱腔压力或真空：在吸入和分配期间分别迫使液体流过移液管尖端柱的正气压或负气压。
移液管尖端柱的吸入流体流：流入移液管尖端柱，进入柱床上方的腔。
移液管尖端柱的分配流体流：从柱床上方的腔流出移液管尖端柱。
移液管尖端柱背压：当对柱腔施加真空或压力时，液体流过柱的阻力。
移液管尖端柱出口：移液管尖端柱的远端。
远端：移液管尖端、注射器尖端、移液管尖端柱或注射器尖端柱的远离与泵的连接点的端部。
附图说明
图1示出了一组例示性的高密封移液管泵和移液管尖端柱，例示了喷嘴在柱上的密封如何提供内部腔压力以及真空密封。
图2示出了一个例示性的带有环形脊的泵喷嘴底部、尖端柱顶部以及滑动推顶器。
图3示出了定位在泵喷嘴底部上的尖端柱顶部，以及呈环形脊形式的突起部为床上方的柱腔内侧提供空气和真空密封。
图4示出了设有两个环形脊的泵喷嘴底部、尖端柱顶部以及滑动推顶器。
图5示出了定位在泵喷嘴底部上的移液管尖端柱顶部。
图6示出了根据本发明的可如何使用滑动推顶器装置从泵喷嘴移除移液管尖端柱。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及一种自动分离系统，所述自动分离系统包括液体处理设备以及包括分离介质的至少一个移液管尖端柱，其中所述液体处理设备配备：一个或更多个喷嘴，诸如两个或更多个喷嘴，每一喷嘴被布置成接收移液管尖端柱；以及，用于施加正压或负压的装置，以实现每一移液管尖端柱的吸入以及分配，在此系统中，每一喷嘴已设有至少一个环形突起部。
在此背景下，应理解，术语‘液体处理设备’是指在液体样本生物处理领域中公知的设备。因此，它可以包括能够实现其操作的任何标准类型的特征，包括控制其性能的适当软件。
术语‘自动’在此意味着，系统能够以自动方式执行所有或至少一些下文所讨论的标准操作。具体地，在允许在下文中更详细讨论的力的情况下，至少将移液管尖端柱安装至喷嘴以及将移液管尖端柱从喷嘴中推顶出是自动执行的。
环形突起部被设置在每一喷嘴的将与所安装的移液管尖端柱接触的部分上，环形突起部将在下文结合附图描述进一步详细描述。在液体处理领域中，术语‘喷嘴’有时被轴或歧管头部代替。有利地，根据本发明，喷嘴已被构造为允许与移液管尖端柱直接接触，即避免了用于实现配合所需的附加部件诸如适配器。
简言之，此突起部可以有利地在制造喷嘴时设置为该喷嘴的整体部分。替代地，突起部可以在之后的阶段被附接。在任何情况下，术语‘设有突起部’在此意味着突起部被固定就位，而不是增加O型环。这样的喷嘴可以根据标准工艺、由任何合适的塑料或其他刚性以及非反应性固体材料来模制和制造。
因此，此系统的每一喷嘴可以设有一个或两个环形突起部，这两个突起部被布置成与所安装的移液管尖端柱密封接合，能够保持例如至少约20mL的液体体积，诸如在约20mL至约40mL的液体范围内。在一个实施例中，移液管尖端柱被布置成用于在其远端处保持约2ml的填充床，且在填充床上方的腔体积中保持约18mL的液体。
每一喷嘴可设有滑动推顶器，所述滑动推顶器在适当时实现从喷嘴中移除尖端。技术人员将理解，移液管尖端柱应充分配合至喷嘴，从而在操作过程中保持就位，同时在使用之后(诸如，通过使用如图中所例示的滑动推顶器)很容易移除。
移液管尖端柱(诸如，能够在腔体积中保持至少20mL的液体的、均匀或大体均匀的锥形塑料移液管尖端)是常规设计。在本发明的一些实施方案中，能够保持至少40mL的液体。在本发明的一些实施方案中，能够保持至少50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL和200mL的液体。技术人员将理解，由于与本文所讨论的液体体积相比，保持在滤头之间的分离介质的填充床相对小，所以在不同的实施方案中，图可以理解为包含或不包含填充床。在任一情况下，相比于现有技术所建议的生物分子(诸如，质粒)分离，本发明能够自动管理大体更大的体积。
任何塑料或聚合物材料都可以设想用于移液管尖端柱，只要它们足够刚性以承受在此所描述的压力，且不与生物分子分离中常用的液体和试剂发生反应。
当前，发明人出乎意料地发现，通过为液体处理设备的喷嘴设置突起部，不同于现有技术经常建议的为移液管尖端设置接合特征(诸如，凹槽和突起部)，可以使用可管理的力来安装以及推顶出常规设计的移液管尖端柱，而不会出现泄漏或移液管尖端柱的过早缺失。这关于所使用的移液管尖端柱的大床体积而言是令人惊讶的，移液管尖端柱通常保持约20mL至约40mL的腔液体，鉴于移液管尖端柱最终也需要被无问题地推顶出，发现了尖端柱的安装是困难的。技术人员将理解，对于特定的情况，诸如如果需要附加的安全保障，或者如果设想更高的压力和/或更大的体积，可以在喷嘴与移液管尖端柱之间的接合处包括一个或多个常规的O型环。
在本发明的一些实施方案中，需要2至3磅(0.9至1.6N)的向下力来从泵喷嘴移除移液管尖端柱。在一些实施方案中，需要2至10磅(0.9至4.7N)、3至9磅(1.6至4.2N)或4至8磅(0.8至1.4N)的力来从泵喷嘴移除移液管尖端柱。此喷嘴被描述为实施例2中的第一代喷嘴。
在本系统的其他实施方案中，每一移液管尖端柱可使用从约50N至约160N范围内的力安装至喷嘴。
在进一步的实施方案中，本系统的每一移液管尖端柱使用类似的力(即，从约50N至约160N范围内的力)通过推顶可释放。推顶机构必须能够将柱完全地从喷嘴推出。柱必须完全离开喷嘴，从而在自动机器人中确定柱未被部分地推顶出以及导致机器人液体处理器的崩溃。在本发明的一些具体实施方案中，需要3.5磅(1.6N)的力来将移液管尖端柱从泵喷嘴中移除。
技术人员将理解，用于安装和推顶柱所需的力将受每一喷嘴的突起部的具体设计的影响。从此描述可以看出，根据本发明的系统将包括一个或多个突起部(诸如，每一喷嘴上一个突起部)，而(与现有技术相反)移液管尖端柱由均匀的坡度限定(即，它并未设有与每一喷嘴突起部所对应的任何凹槽)。在不偏离本发明主旨的情况下，例如在每一喷嘴上仅设置一个突起部的实施方案是可能的。在这样的实施方案中，相比于在喷嘴上设置两个或更多个突起部的情况，唯一的突起部可能略微更大。因此，技术人员将理解，安装和/或释放每一移液管尖端柱所需的力将根据例如喷嘴的数目和/或形状以及尺寸而改变。遵循本文所描述的原理，技术人员将能够运行简单的测试，以得出用于将移液管尖端柱有效地密封至喷嘴的最佳力；且一旦分离过程已经完成，通过简单的推顶来将移液管尖端柱移除。
因此，偏离以上限定的范围还会被本发明权利要求书所限定的发明包括。
移液管尖端柱可以被逐一推顶；或者，被同时推顶；且可选地，它们的外表面可以设有便于它们的推顶的装置。这种装置例如可以是外部脊或其他突起部，所述外部脊或其他突起部能够被用于自动推松移液管尖端柱。
本发明的优点是，泵能够实现上文所讨论的大的填充的移液管尖端柱与它们对应的喷嘴的安装，以及从它们对应的喷嘴的推顶出，包括在处理期间的有效密封以及在不需要人工干预的情况下的简单自动推顶。在此背景下，大被理解为是20mL或更大，如贯穿本申请所讨论的。
本发明还可以与显著更大体积(诸如，样本体积为2升或以上，诸如4升或以上)的移液管尖端柱一起使用。在此背景下，应理解，术语“移液管”是指在涉及吸入液体以及分配液体能力时，与移液管尖端具有相同功能的柱，但这不应解释为对尺寸的任何限制。
此自动分离系统的优选泵是活塞泵，所述活塞泵被布置成根据每一阶段的需求使用柔性凸缘紧密密封以及释放压力。适于此目的的活塞泵在本领域是公知的，包括元件诸如泵缸、泵活塞、缸空间、压力传感器以及压力通道。从这种常规泵开始，发明人提供了用于密封的装置，以实现本文所讨论的液体体积的处理。更具体地，此用于密封的装置可以由合适的材料(诸如，柔性塑料或橡胶)制成。此外，为了分别地允许保持和释放压力所需的反应性，这种密封装置可以是柔性凸缘，柔性凸缘有利地设有适当的润滑剂。密封凸缘可在一个或多个竖向位置处被布置在泵活塞与缸空间之间，诸如环形凸缘在距离活塞端部处的第一竖向距离与第二竖向距离处围绕此活塞。
因此，本发明的具体方面是使用上文所讨论的力，将大的移液管尖端柱(诸如，20至40mL的移液管尖端柱)安装至布置于此系统的液体处理设备上的喷嘴和/或推顶出所述喷嘴的方法。
根据本发明的系统可包括至少2个独立布置的移液管尖端柱(诸如，相对彼此可移动的2至4个柱)。在此背景下，术语“独立布置”意味着，移液管尖端柱并非以托盘或板类型的格式布置，而是如同常规液体处理系统的较大管。操作方法将决定这些独立布置的移液管尖端柱在多大程度上并行操作或逐一操作。
如上文所指示的且如附图所详细描述的，每一移液管尖端柱是大体均匀的锥形，且被布置成在移液管尖端柱的内表面与喷嘴之间提供紧密密封。有利地，为了提高所述密封，移液管尖端柱可以具有比喷嘴的外径更小的内径。这种配合已经在微型移液管领域中进行了描述，对于本领域的技术人员而言是公知的。
有利地，在移液管尖端柱远端被堵塞的情况下，每一喷嘴与其对应的移液管尖端柱之间的密封在小于5％的压力损失或真空损失的情况下，维持压力密封和真空密封5分钟或更久，这种压力损失或真空损失可以使用此领域中公知的技术来测量。
在根据本发明的系统中，用于向移液管尖端柱施加压力的装置可以由电马达来提供。这样的驱动装置在本领域中是公知的，且市售用于常用的液体处理设备。
生物分子的分离可以有利地通过用分离介质填充移液管尖端柱来获得，所述分离介质能够与目标分子相互作用且保留目标分子。因此，在根据本发明的系统中，每一柱可以包括填充的分离介质，诸如层析介质或萃取介质，诸如固相萃取(SPE)介质、支撑液萃取(SLE)介质、亲和介质、离子交换介质、反相介质、正相介质、离液相介质、疏水作用介质、亲水作用介质以及其他层析介质。这些层析介质对于技术人员而言是公知的，且从商业供应商容易获得。
此分离介质有利地通过在填充介质的每一侧上、在移液管尖端柱的顶部处及底部处布置滤头(即，过滤器)来保持就位，如在生物分子及其他分子(诸如，大有机分子)的液体样本处理领域中常规的。在此背景下，参考例如US2017/0,211,129(Phynexus,Inc.)，其中详细描述了填充的移液管尖端柱，包括这种滤头的性质、填充水平等。技术人员可以基于这样的参考或者简单地使用一般常识以及供应商的推荐，很容易地填充移液管尖端柱。在此系统中，介质应有利地设置为填充物，即被保持就位，与介质的流化床不同。
下文且贯穿此说明书所提供的关于本发明的第二方面以及第三方面的进一步细节同样适用于此第一方面。
在第二方面，本发明涉及一种使用根据本发明的系统从液体样本中分离生物分子或有机分子的方法。此方法可以是一种样本制备或‘样本准备’方法，通常已知用作分析目标分子之前的步骤。在此样本准备方法中，介质可以从液体样本中移除污染物；或者，介质可以将目标分子从液体样本的其他部分分离。
因此，在一种模式中，本发明的方法可包括：第一步骤，将样本吸入此系统的每一填充的移液管尖端柱内；以及，第二步骤，从移液管尖端柱中分配纯化的液体样本。在此模式中，所分配的液体将包括处于比在移液管尖端柱中处理之前干净得多的环境中的目标分子。
在另一模式中，此方法包括附加的步骤：将洗脱液吸入每一填充的移液管尖端柱内；允许洗脱液从分离介质中释放目标分子；以及，从移液管尖端柱中分配包括所释放的目标分子的洗脱液。
所分离的生物分子(即，此方法的目标)可选自包括如下项的组：蛋白质(诸如，抗体)；蛋白质片段(诸如，抗体片段)；多肽；以及，核酸(诸如，线性DNA、线性RNA、寡核苷酸、基因组DNA或质粒)。有利地，此方法用于分离质粒，所述质粒旨在随后用于重组DNA技术，其中大量的质粒被用作载体。本发明的任何方法的目标在此方法中从样本的其他成分中分离，所述目标的其他成分诸如为其他生物分子，即蛋白质、多肽、细胞碎片成分、DNA和RNA；以及，本发明的任何方法的目标从源自发酵液体培养基的营养物和其他成分分离，其中产生目标生物分子。
根据所分离的目标生物分子的预期用途，此方法可被用作单个分离步骤；或者，用作纯化方案的一部分，在此情况下，此方法可以与过滤、离心等步骤结合。例如，根据本发明，在移液器尖端柱中的处理之前，可以进行过滤步骤(例如，重力过滤)。技术人员将理解，根据初始材料的性质，常规处理步骤(诸如，细胞裂解以及例如通过离心的移除细胞碎片等)可以被包括在根据本发明的方法的实施方案中。
如上文有关本发明的系统所讨论的，本发明的优势在于喷嘴与移液管尖端柱之间的密封出乎意料地示出能承受正向处理大体积液体所需的高压力。因此，在此方法中，3至5psi(诸如，4至5psi)的正压可被施加至移液管尖端柱，而不会显著地损坏每一移液管尖端柱喷嘴的密封。在本发明的一些实施方案中，2至15psi的正压可被施加至柱腔，而在至少5分钟内没有压力泄漏，且移液管尖端不会从泵喷嘴暴露。在一些实施方案中，1至10psi的真空可被应用于柱腔，且在至少5分钟的时段内没有真空泄漏。无泄漏被限定为不大于5％的变化。
此说明书所提供的关于第一方面的所有细节还适用于本发明的此第二方面。
在第三方面，本发明涉及一种使用根据本发明的分离系统从液体样本中分离生物分子的试剂盒(kit)。本发明的试剂盒可包括：大体积的移液管尖端柱，诸如20至40mL的体积，填充有层析介质或固相萃取(SPE)介质；以及，在单独的隔室中，用于执行这种分离的书面指示。
此外，此试剂盒可以在单独的隔室中包括平衡缓冲液、洗涤液体、以及洗脱液中的一种或多种，所有这些都是技术人员公知的且是商业可得的。
在理解本发明的第三方面时，此说明书中所提供的关于第一方面和第二方面的所有细节均适用。
在本发明的一些实施方案中，即使柱内部压力高达优选5psi，泵喷嘴的密封机构提供了移液管尖端与移液管尖端柱的紧密配合。在本发明的一些实施方案中，在柱内部压力范围为4至6psi、3至7psi、3至8psi、3至10psi或大于10psi、20psi、30psi、40psi或50psi的情况下，柱保持密封且被附接至泵喷嘴。柱在泵喷嘴上的密封至负2psi、3psi、4psi、5psi、6psi、7psi、8psi、9psi或10psi。保持密封被限定为在2min、3min、4min或5min的时段内维持压力不大于5％的泄漏。
如上文所讨论的，喷嘴在移液管尖端柱的内侧头部上的密封设有环形突起部，诸如环或尖(pip)。在此背景下，应理解，术语“环形”在此意味着，突起部被布置成大体围绕喷嘴的全部周长。然而，任何在这种“环形”形状中包括微小中断部或偏差的实施方案旨在被本发明所涵盖，只要能获得本文所讨论的有利及有效的密封。这种环将在柱的头部上提供非常紧密的力，使得空气或真空不能够泄漏经过喷嘴。维持内部压力或真空对于维持可靠且可预测的柱流入及柱流出而言是至关重要的。如果出现任何泄漏，则液体仍将流入柱或流出柱，但是流动是不可预测且不完整的。机器人液体处理器而言尤其需要可预测的流动。完整流动是需要的，以用于从柱中完全捕获、洗涤及洗脱样本。
在本发明的其他实施方案中，增大泵喷嘴的直径，以使得喷嘴的至少一部分提供与柱的非常紧密的配合。在本发明的其他实施方案中，O型环或类似的密封装置被添加至喷嘴，以提供泵喷嘴与移液管尖端柱的紧密密封。
所有这些增大密封的密封机构都提供了容易且可预测地将柱从柱喷嘴推顶出的问题。在移液管技术中，推顶是通过手部力来执行。电致动器可以提供附加的力，然而，推顶机构必须是均匀且有力的，且不会损坏移液管尖端柱的顶部推顶凸台。这是因为在使用期间，可能需要不止一次(多达5次、10次或20次)对移液管尖端柱进行装载和推顶。
附图的详细描述
图1中示出了根据本发明的自动分离系统的高密封移液管泵和柱。更具体地，图1示出了：泵马达1；柱状活塞驱动螺杆2；泵活塞3；推顶装置，在此以推顶杆4例示；泵喷嘴密封装置5，在此以喷嘴的单个突起部例示；移液管尖端柱6；柱床7；以及，最后例示性的容器，包含可以被吸入的液体(诸如，样本或缓冲流体8)。
根据本发明所布置的喷嘴在柱上的密封提供了有效的压力和真空。例如，密封5分钟或更久之后，压力损失或真空损失小于5％。
图2示出了例示泵喷嘴底部13、移液管尖端柱顶部14以及滑动推顶器15的布置的更近视图。更具体地，示出了：泵喷嘴9；滑动推顶器10；移液管尖端柱顶部11；以及，呈环形密封脊12形式的突起部。
例示性的环形突起部在移液管尖端柱顶部的内侧壁上提供附加的力，这转而提供了有利的密封力。密封力有利地跨整个内侧表面均匀地布置，以防止空气泄漏，因为即使小的微划痕或缺陷可能允许空气逸出且阻止充分密封。
图3示出了定位在泵喷嘴底部上的移液管尖端柱顶部11。呈例示性的环形突起部形式的密封装置5在柱内侧提供空气和真空密封。作为对包括根据本发明的突起部的喷嘴设计的补充，进一步改进的密封包括增大喷嘴的直径和/或使用紧密配合的O型环。
图4示出了根据本发明的自动分离系统的替代实施方案，其中泵喷嘴底部13被布置成带有呈密封脊12形式的两个环形突起部、尖端柱顶部以及滑动推顶器。
图5示出了以强有利的力定位在泵喷嘴底部上的移液管尖端柱顶部。在此例示性的实施方案中，两个环形脊12提供床上方的柱腔内侧的真空密封。
图6示出了滑动推顶器如何能以强有利的力从泵喷嘴移除移液管尖端柱顶部。
滑动推顶器以强有利的力从泵喷嘴移除柱顶部。将移液管尖端柱从泵喷嘴推顶出是困难的。如图1中所描绘的，可以使用杆来推顶柱。然而，推顶器必须不使移液管柱的塑料顶部的顶部变形。在一种纯化方法中，移液管尖端柱必须被多次装载和推顶。
实验部分
此实施例仅以例示性目的提供，不应被解释为对所附权利要求书所限定的本发明的限制。下文或者此说明书中其他地方所提供的所有参考在此通过引用的方式纳入本文。
实施例1—质粒纯化
材料
根据本发明的自动分离系统被用于质粒纯化。更具体地，仪器设有两个喷嘴，每一喷嘴具有如本文所描述的一个环形突起部，装载有柱、样本、小瓶和管以及缓冲液。通过为移液管尖端柱中填充4mL基于聚丙烯酸酯基质的DEAE弱碱性阴离子交换树脂床来制备介质的填充床。含有如此制备的4mL床的柱硬件是使用20mL移液管尖端所构造的，将填充床放置在柱的远端处。样本包含含有表达质粒的5g大肠杆菌细胞球。样本被分散至TRIS缓冲液中，以1M NaOH和SDS表面活性剂裂解，从而形成细胞碎片和溶解质粒的悬浮液。RNase被添加到混合物中。所添加的缓冲液进行彩色编码，且被预封装，以使得在整个样本制备过程期间不需要测量体积或质量。之后将样本倒入过滤样本储液罐内，开始仪器处理。过滤通过重力过滤来移除大部分的颗粒物。颗粒物的移除取决于过程。在质粒捕获中，蛋白质、细胞碎片、基因组DNA及其他物质被移除，而质粒被保留在溶液中，且在滤液中经过过滤器。过滤过程将花费高达一小时，但是在过滤开始之后直接地开始。样本被吸入，且通过移液管被转移至六个包含等量滤液的50mL圆锥管。将移液管尖端柱插入每一包含样本和所捕获的质粒的圆锥管中，串联往复流动处理，直至处理了整个样本滤液。可以处理直接来自样本储液罐的滤液的样本。在此情况下，将移液管尖端柱插入储液罐，吸入滤液。然后，将柱移动至圆锥管，用往复流动的方式处理样本试样。替代地，将样本吸入至废液，以样本单次吸入和分配通过移液管尖端柱床执行捕获。重复这些过程，直至处理了所有样本滤液。包括所有的柱、缓冲液、小瓶和过滤储液罐的设备是从Biotage AB(乌普萨拉，瑞典)获得的。
方法
所有描述的操作是使用根据本发明的、包括位于喷嘴上的环形突起部的自动分离系统执行的。
总体程序：
1.将含有溶解质粒的沉淀细胞裂解液过滤，以产生半清透的裂解液。溶解质粒保留在滤液中。
2.在半清透的裂解液中添加专有的内毒素移除缓冲液且培养。此结合了内毒素，且防止内毒素被DEAE阴离子交换柱捕获。
3.在室温下平衡30至60min。
4.转移半清透的裂解液。将培养的样本转移至离心管中。以15mL的试样。准备10个管以用于下一步的捕获。
捕获：
将阴离子交换柱放置在样本圆锥管内，将样本抽吸至柱内，以400mL/min的速率排出(吸入且分配)4个循环。以400mL/min吸入12mL，延迟45秒。以400mL/min排出2mL，延迟15秒，重复6次。在每半周期结束时添加延迟，以允许穿过柱的流动停止。质粒被DEAE阴离子交换柱捕获。
5.真空洗涤。将柱转移且放置在真空洗涤站内。向下移动泵，以洗涤储液罐且吸入10mL洗涤缓冲液。
然后，以375mL/min吸入20mL的空气。以375mL/min排出20mL空气。通过多个柱和尖端以及柱和尖端的推顶，重复5至10个试样。替代地，在其他实施方案中，仅使用真空将洗涤液从尖端抽出。
6.洗脱。质粒被捕获在TRIS缓冲液中。取决于所需的回收率，洗脱液体积可以是5、10或20mL。较低的洗脱液体积增大了所回收的质粒的浓度。较高的洗脱液体积增大了所回收的质粒的总质量。
实施例2-带有增大直径的密封突起部的喷嘴。
在实施例中使用了三种类型的紧密配合的喷嘴。在实施例1和实施例3所描述的工作中使用了第一类型的喷嘴。在此实施例中，突起部的直径在移液管尖端的顶部部分处单次增大，直径为20.4mm。在没有突起部且没有移液管柱密封件处的喷嘴直径为19.8mm。
第二代制备有20.6mm的突起部，配合在喷嘴的更低处。在没有突起部且没有移液管柱密封件处的喷嘴直径为19.8mm。此喷嘴也被用在实施例1所描述的实施例中。
第三实施例是双重脊突起部，其中顶部脊直径为20.3mm且底部脊为20.2mm。在没有突起部且没有移液管柱密封件处的喷嘴直径为19.8mm。尽管此直径比第二实施方案小，但用于移除所需的力是三个实施方案中最大的。此实施方案也被用于实施例1所描述的实施例中。
在这三代设计中，第一代设计密封良好且最容易移除。第三代设计密封最佳，但最难移除。
实施例3-多肽脱盐
在此所描述的工作通过具有如实施例2的第一实施方案所描述的紧密密封喷嘴的仪器执行。
方法
20mL移液管尖端柱刻有3mL的分度标记，且附接筛网。0.5、1或2克的C18树脂被装载到移液管尖端内。这些质量的树脂对应于1、2或4mL的树脂。用190标准酒精度的乙醇洗涤柱，且在真空下干燥床。顶部筛网被附接，以产生填充床柱。测试的树脂包括Isolute C18UC(Biotage，9220-0500)、Isolute C18 EC(Biotage，9221-0100)、MFC18(Biotage，240-0005)、Sep-Pak(Waters，WAT043350)以及C18反向硅胶(Sigma，60757-50G)。
将柱浸没在20mL包括100％乙腈的润湿溶液中。以每分钟400mL的流动速率进行4次12mL的往复循环且在每次吸入及每次分配之后停顿60秒来润湿柱。在20mL的0.1％TFA溶液中使用如上文所描述的4次往复来调节柱。将包括胰蛋白酶所消化的BSA的多肽标准品加入10mL的0.1％TFA内，最终浓度为1或2mg/mL。将柱浸没在样品内，以每分钟400mL的流动速率进行24次9mL的捕获循环，且在每次吸入结束时及每次分配结束时停顿60秒以用于捕获多肽。使用4次往复循环，以三个连续3mL的0.1％TFA的试样洗涤柱。通过应用3mL的40％乙腈溶液至柱的顶部来洗脱多肽，且收集流通。
用NanoDrop分光光度计对样品进行UV/Vis吸收分析，且进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
结果
小规模纯化展现出很小的树脂间差异
500mg的五种不同树脂被填充至柱，且用于筛选出对多肽展现出最高选择性和产量的树脂。对于每一柱而言，将10mg的多肽样品加入至5mL的捕获缓冲液内，通过32次循环来捕获，之后进行洗涤和洗脱。纯化重复执行。使用Nanodrop来分析流通和洗脱。注意，样品和样品缓冲液含有吸收UV的杂质，这影响了流通分析的精确性。然而，分析揭示了在方法开发中有用的趋势。
流通数据和洗脱数据示出了柱之间的一些变化，这对于筛选实验而言是预期的。在不考虑此变化的情况下，多种树脂之间的捕获性能或洗脱实际上没有差别(表1)。
由于复制的变化性低，MFC18被选定以用于后续扩展的方法开发。
表1：小规模树脂筛选
Figure BDA0003810957200000181
树脂扩展和受损流动
MFC18被扩展至2mg柱，以用于后续方法开发。然而，观察到了流动问题。MFC18柱不能完全润湿和调节，这产生了低性能。增大的树脂体积揭示了增大的背压与预期不成比例。当装载的体积从500mg增大至2g时，小规模所测试的五种树脂的背压进行了重新测试。根据这些研究，C18 UC展现了最低的背压，是用于扩展的最佳候选。
高效回收是可扩展的
优化方法进行进一步测试，以确定分离是否能用于需要增大质量回收的较大样品体积。38mg的多肽被加入20mL的捕获缓冲液内。重复地执行使用Isolute(Biotage，9220-0500)的纯化。在8次和32次捕获周期之后移除1μL且通过NanoDrop分析，从而评估捕获完成情况。通过NanoDrop分析洗脱。
约80％的多肽在8次循环之后被捕获，且在32次循环之后被提高至约90％。所捕获的多肽在洗脱期间被完全地回收，其中测量到了初始38mg中的约34mg。
表2：质粒的回收
Figure BDA0003810957200000191

Claims (18)

1.一种自动分离系统，所述自动分离系统包括液体处理设备以及至少一个移液管尖端柱，其中所述移液管尖端柱包括分离介质，且所述液体处理设备被配备：一个或更多个喷嘴，诸如两个或更多个喷嘴，每一喷嘴被布置成接收移液管尖端柱；以及，用于施加正压或负压的装置，以实现每一移液管尖端柱的吸入以及每一移液管尖端柱的分配，其中在系统中，每一喷嘴已设有至少一个环形突起部。
2.根据权利要求1所述的系统，其中每一喷嘴设有至少两个环形突起部，所述至少两个环形突起部被布置成与所安装的移液管尖端柱密封接合。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其中每一喷嘴已设有滑动推顶器。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中每一移液管尖端柱能够保持至少约20mL的液体体积，诸如约20mL至约40mL的范围内的液体。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中每一移液管尖端柱是均匀的锥形，且被布置成在所述移液管尖端柱的内表面与所述喷嘴之间提供紧密密封。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中每一喷嘴与移液管尖端柱之间的密封被布置成在压力损失或真空损失小于5％的情况下，维持压力密封或真空密封5分钟或更久。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中使用约50N至约160N范围内的力，能将每一移液管尖端柱安装至喷嘴。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中使用约50N至约160N范围内的力，通过推顶能释放每一移液管尖端柱。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中用于向所述移液管尖端柱施加压力的所述装置由电马达提供。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，所述系统包括至少两个独立布置的移液管尖端柱，诸如两个柱至四个柱。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中每一移液管尖端柱包括填充的分离介质。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述分离介质选自包括如下项的组：层析介质、固相萃取(SPE)介质以及支撑液萃取(SLE)介质。
13.一种使用根据权利要求1至12中的任一项所述的系统从液体样本分离生物分子的方法，其中：将所述样本吸入每一这种移液管尖端柱；允许所吸入的液体样本的生物分子与分离介质反应一段时间；以及，从所述移液管尖端柱分配包括任何未反应的生物分子的液体样本。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法包括附加步骤：将洗脱液吸入每一填充的移液管尖端柱内；允许洗脱液从所述分离介质释放生物分子；以及，从所述移液管尖端柱分配包括所释放的生物分子的洗脱液。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所分离的生物分子选自包括如下项的组：蛋白质；多肽；以及，核酸，诸如线性DNA、线性RNA或质粒；或者，上述的片段或融合体。
16.根据权利要求13至15中的任一项所述的方法，其中3至5psi、诸如4至5psi的正压被施加至柱，而不显著损坏每一喷嘴与其对应的移液管尖端柱的密封。
17.一种使用根据权利要求1至12中的任一项所述的分离系统从液体样本中分离生物分子的试剂盒，所述试剂盒包括：20至40mL的移液管尖端柱，被填充有层析介质、支撑液萃取(SLE)介质或固相萃取(SPE)介质；以及，在单独隔室中，用于执行这种分离的书面指示。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，所述试剂盒包括：在单独隔室中，一种或多种平衡缓冲液；洗涤液体；以及，洗脱液。
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