KR20220145330A - 대용량 분리 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액체 취급 디바이스 및 하나 이상의 피펫 팁 컬럼을 포함하는 자동 분리 시스템이고, 액체 취급 디바이스에는 분리 매질을 포함하는 피펫 팁 컬럼을 개별적으로 수용하도록 배치되는 2 개 이상의 노즐이 구비된다. 더 나아가, 이 시스템은 컬럼 베드 위의 체임버 내의 컬럼에 높은 양의 압력 또는 음의 압력을 적용하여 각각의 피펫 팁 컬럼 내로의 흡인 및 각각의 피펫 팁 컬럼으로부터의 분배를 가능하게 하는 수단을 포함한다. 분무 프로세스 중에 의도하지 않게 노즐로부터 컬럼을 방출하지 않으면서 컬럼 베드를 통해 액체를 이동시키기 위해 사용되는 압력으로 실링을 가능하게 하기 위해, 각각의 노즐에는, 임의의 대응하는 리세스를 구비하지 않으면서, 실질적으로 균일하게 테이퍼를 이루는 피펫 팁 컬럼의 내측과 결합하도록 배치되는 적어도 하나의 환형 돌출부가 제공되어 있다. 각각의 노즐에는 피펫 팁 컬럼의 제거를 가능하게 하는 슬라이드 이젝터가 구비될 수 있다.

Description

대용량 분리 시스템

본 발명은 자동화된 방법으로 피펫 팁 컬럼(pipette tip column)을 취급할 수 있는 분리 시스템에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 체임버 및 크로마토그래피 베드의 둘 모두가 유체 흐름에 대해 높은 배압 또는 저항을 갖는 비교적 대용량인 본 발명에 따라 사용되는 충전된 피펫 팁 컬럼은 시스템에 실링 및 재현성의 요건을 부여한다. 본 발명은 또한 종래의 피펫팅 방법보다 더 많은 양의 액체를 유리하게 처리하는 방법에서 생체분자를 분리할 때 본 발명에 따른 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Eppendorf사가 독일에서 설립된 1960년대 이후 피펫 팁을 포함하는 수동 액체 처리 기기는 측정된 양의 액체를 이송하기 위해 실험실에서 널리 사용되어 왔다. 그 후, 이 기술은 끊임없이 발전하여 새로운 어플리케이션을 가능하게 하였다.

US 6,197,259(Rainin Instruments Co, Inc.)는 쉽게 방출가능한 것으로 설명된 피펫 팁에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 이 '259 특허는 샤프트에 끼워맞춤되도록 피펫 팁 재료를 늘림으로써 샤프트 상에 장착되는 종래의 '후프 스트레치' 피펫 팁의 방출에 관련된 수동 피펫팅에서의 문제를 설명하고 있다. 피펫 팁의 방출을 위해 더 낮은 힘을 가능하게 하고, 이로써 사람의 엄지 압력에 의한 방출에 더 적합하도록 만들기 위해, '259 특허는 균일하게 테이퍼를 이루지 않는, 그러나 샤프트 상에 장착될 때 반경방향 외측으로 늘어나지만 그 길이방향으로 테이퍼를 이루지 않는 특별히 설계된 환형 실링 영역을 포함하는 피펫 팁을 제안하고 있다.

US 6,596,240(Porex Corporation)은 실링 밴드를 포함하는 피펫 팁의 영역에 관한 것이다. 이러한 팁의 제거가 얼마나 어려울 수 있는지 '240에 설명되어 있으며, 하루 동안에 여러 번 사용하면 시간이 지남에 따라 피로 및 심지어 부상을 초래할 수 있다. 따라서 최소의 힘으로 삽입 및 방출할 수 있고, 우수한 실링을 유지할 수 있고, 다양한 피펫에 잘 맞는 피펫 팁을 제조하기 위한 방법이 필요하다. 또한, 피펫 팁의 내부 실링 면에 상대적으로 크고 탄성인 링을 형성하는 방법이 필요하다. 전형적으로, 내부 링의 크기는 팁을 형성하는 주형에서 "언더컷(undercut)"되므로 제한된다. 주형으로부터 부품을 제거하기 위해, 이것을 형성하는 주형 코어 상의 그루브로부터 링이 해제되도록 확장되어야 한다. 이로 인해 크기가 제한되고, 링이 제거될 때 "오염"될 수 있다.

표현된 문제에 대한 해결책으로서, '240 특허는 팁 부재가 중심 축선을 갖는 세장형 관형 리셉터클, 이 리셉터클의 내면 상의 돌출부, 및 돌출부에 인접한 내면 상의 리세스를 포함하는 해결책을 제안하고 있다. 팁 부재는 대체로 원뿔 형상을 가질 수 있고, 내면은 근위 단부의 후방 개구로부터 원위 단부의 팁 개구까지 테이퍼를 이룬다.

US 2012/0180579(Perkin Elmer Health Sciences, Inc)는 자동화된 액체 취급기에 로딩하기 위한 대용량 피펫 팁에 관한 것이다. 더 구체적으로는, '579 특허 출원은 마이크로피펫의 크기가 커짐에 따라, 특히 트레이 형식의 병렬 처리에서 크기가 더 커지면 서로 인접하여 끼워맞춤되는 것이 곤란해짐에 따라 문제가 어떻게 발생하는지를 설명하고 있다. 해결책으로서, '579 특허 출원은 그 중앙 부분이 마이크로피펫과 동일한 액체 취급기에 끼워맞춤하면서 종래의 피펫 팁보다 더 큰 용량을 유지하도록 설계된 직사각형 체임버 등의 확대된 체임버를 포함하는 피펫 팁을 제안하고 있다. 이와 관련하여, '579 특허 출원에 언급된 '대용량'은 약 5 mL 이상의 용량을 지칭하지만 더 큰 피펫 팁의 경우에 당업자는 필요한 변경을 즉시 이해한다고 언급되어 있다.

US 5,200,151(Dabe Behring Marburg)은 유체 분배 시스템, 특히 디스포저블(disposable) 피펫 팁과 함께 사용하기 위해 조정된 피펫 어셈블리를 포함하는 유제 분배 시스템에 관한 것이다. 피펫 팁을 유지하는 피펫 어셈블리의 스템(stem)의 원위 단부에 디스포저블 피펫 팁의 정확한 위치를 확보하기 위해, 피펫 팁의 근위 체임버는 스템의 원위 단부를 둘러싸고, 스템의 환형 영역을 둘러싸는 레지(ledge)를 포함하여 스템의 어버트먼트(abutment)를 형성하고 스템의 원위 단부와 피펫 팁 오리피스 사이에 정확한 거리를 확립한다. 바람직한 실시형태에서, 유체 분배 시스템은 자동 분석 기기 내에 포함된다.

US 2014/0219887(Agilent)은 일반적으로 피펫팅에 관한 것이고, 더 구체적으로는 상이한 피펫 팁이 동일한 피펫팅 장치와 호환가능한 자동 피펫팅에 관한 것이다. 따라서, 다양한 크기의 피펫 팁을 피펫터를 수정할 필요 없이 피펫터에 결합할 수 있다. 따라서 동일한 피펫터를 사용하여 상이한 피펫 팁을 교환할 수 있고, 이것은 자동화된 방식으로 수행할 수 있다. 피펫 팁은 피펫터와 접합하기 위한 근위 단부 및 피펫 팁과 접합하기 위한 원위 단부를 포함하는 어댑터에 결합될 수 있다. 근위 단부는 모두 동일한 피펫터와 일치되는 동일한 형상을 가질 수 있다. 원위 단부는 상이한 피펫 팁과 일치되는 상이한 형상을 가질 수 있다. 피펫터는 액체 취급 장치의 일부일 수 있고, 상이한 데크(deck) 위치까지 자동화된 방식으로 이동가능하다. 피펫터는 어댑터를 피펫터에 로킹하거나 피펫 팁을 직접 피펫터에 로킹하기 위한 로킹 메커니즘, 및 대응하는 어댑터로부터 피펫 팁을 방출하기 위한 방출 메커니즘을 포함할 수 있다.

US 2017/0211129(Phynexus, Inc.)는 프라스미드 정체를 위한 디바이스 및 방법에 관한 것이며, 피펫 팁 컬럼 및 이러한 정제를 위한 자동화된 방법을 설명하고 있다. 더 구체적으로, 실제로, 단백질 발현을 획득하기 위해 재조합 DNA 기술에서 유전자도입(transfection)이 사용되는 경우에, 마이크로그램 내지 밀리그램의 플라스미드 DNA가 통상적으로 필요하기 때문에 '129 특허 출원에서는 대규모 자동화 병렬 플라스미드 제조를 위한 필요성이 표현되어 있다. 이들 대량의 플라스미드 DNA를 얻기 위해, 대부분의 연구자들은 스핀 컬럼 또는 진공이나 중력에 의해 작동되는 컬럼을 사용하는 수동 플라스미드 정제를 수행한다. 해결책으로서, '129 특허 출원은 피펫 팁 컬럼 포맷으로 핵산을 정제하기 위한 자동화가능한 방법을 제안하고 있으며, 이것은 다음의 단계를 포함할 수 있다: (a) 세포 파편, 액체 및 플라스미드 DNA으로 구성된 세포 용해물을 제공하는 단계; (b) 플라스미드 DNA의 포획이 가능한 컬럼을 제공하는 단계; (c) 필터로 구성된 필터 장치를 제공하는 단계; (d) 세포 용해물을 필터 장치를 통과시켜 여과액을 생성하는 단계; (e) 여과액을 컬럼을 통과시키는 단계 - 여과액 중의 플라스미드 DNA의 일부는 컬럼에 포획됨 -; (f) 세척 용액을 컬럼을 통과시키는 단계; 및 (g) 탈착 용액을 컬럼을 통과시킴으로써 플라스미드 DNA를 용출하는 단계 - 컬럼으로부터 용출되는 플라스미드 DNA의 양은 750 μg 이상이고, 여기서 단계 (e) 내지 (g)는 미리 결정된 시간에 수행됨 -. 실시례에서, ME 반자동정제 시스템 (Phynexus, Inc., San Jose, Calif.)에 의해 처리되는 피펫 팁 컬럼을 사용하는 단계 (d)가 예시되며,여기서 컬럼들은 200 μL 7M 구아니디늄-HCl을 사용한 500 μL/분의 1 사이클의 왕복 흐름 및 흡인 및 분배 단계의 말기의 20 초 휴지를 수행함으로써 평형화되었다. ME 반자동 정제 시스템은 Biotage AB/Phynexus Inc로부터 최대 20000 μL(20 mL)의 용량으로 입수할 수 있는 PhyTips용으로 설계되어 있다. 대안으로서, '129 특허 출원에는 이 방법이 Tecan EVO, Biomek FX 또는 기타 로봇 액체 취급기에서 동작하도록 설계되었다고 기재되어 있다.

WO 2014/140640(Diagnostics For The Real World Ltd)은 폴리메라아제 연쇄 반응 (PCR) 및 시퀀싱 등의 다운스트림 어플리케이션에 적합한 생물학적 샘플을 취급하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, WO 2014/140640은 피펫, 핵산이 결합되는 고상 재료의 컬럼, 수송 장치, 공기 피스톤 장치 및 피펫을 수송 장치 및 공기 피스톤 장치에 결합하기 위한 어댑터를 포함하는 자동화 생물학적 샘플 처리 시스템을 기재하고 있다.

어댑터는 수송 장치 및 샘플의 처리 중에 수송 장치와 함께 이동하기 위한 공기 피스톤 장치와 착탈가능하게 맞물림가능하고, 피펫에 결합가능하고, 이로 인해 수송 장치는 피펫을 배치하도록 제어가능하고, 공기 피스톤 장치는 피펫 내로 액체를 흡인하도록 그리고 피펫으로부터 액체를 토출하도록 제어가능하고, 컬럼과 맞물림가능하다.

더 나아가, 어댑터는 피펫 또는 컬럼과 공기 피스톤 장치 사이의 액체 또는 에어로졸 이동을 방지하기 위한 필터를 포함한다.

요약하면, 이 분야에서는 예를 들면, SPE 또는 SLE 매질 등의 크로마토그래피 매질 또는 추출물 매질로 충전될 수 있는 개량된 자동 액체 취급 시스템 및 피펫 팁 컬럼, 특히 대량의 매질로 충전된 대용량 피펫 팁 컬럼으로 알려져 있는 충전된 피펫 팁의 장치 및 방출이 가능한 이러한 시스템이 여전히 필요하다. 이 분야에서는 어댑터 등의 복잡한 기계적 구조가 불필요하고, 피펫 팁이 노즐에 간단히 장착되는 간단한 해결책이 필요하다.

본 발명은 위에서 설명한 하나 이상의 필요를 충족하는 것을 목적으로 한다.

따라서, 본 발명의 제 1 양태는 액체 취급 디바이스 및 분리 매질을 포함하는 적어도 하나의 피펫 팁 컬럼을 포함하는 자동 분리 시스템이며, 액체 취급 디바이스에는 2 개 이상의 노즐 등의 하나 이상의 노즐이 구비되고 노즐은 피펫 팁 컬럼, 및 각각의 피펫 팁 컬럼 내로의 흡인 및 각각의 피펫 팁 컬럼으로부터의 분배를 가능하게 하는 양의 압력 또는 음의 압력을 적용하기 위한 수단을 수용하도록 배치되고, 시스템에서 각각의 노즐에는 적어도 하나의 환형 돌출부가 제공된다.

본 발명의 제 2 양태는 본 발명의 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자를 분리하는 방법이며, 샘플은 분리 매질을 포함하는 각각의 이와 같은 피펫 팁 컬럼 내로 흡인되고; 흡인된 액체 샘플의 생체분자는 일정 시간 동안 분리 매질에 결합하도록 허용되고; 임의의 미반응 생체분자를 포함하는 액체 샘플은 피펫 팁 컬럼으로부터 분배된다.

본 발명의 제 3 양태는 본 발명에 따른 분리 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자를 분리하기 위한 키트이며, 이 키트는 친화성 매질 등의 크로마토그래피 매질; 또는 고상 추출물(SPE) 매질 또는 지지 액체 추출물(SLE) 매질 등의 추출물 매질을 포함하는 4-20 mL의 베드 용량을 구비하는 20-40 ml의 피펫 팁 컬럼을 포함한다. 키트는 또한 별개의 구획실 내에 이러한 분리를 수행하기 위한 설명서를 포함한다.

1 - 8 mL, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 mL의 컬럼 베드 용량이 20 - 40 mL의 팁 용량으로 제공될 수 있고, 유리하게는 충전될 수 있다. 다른 실시형태에서, 충전된 베드를 포함하는 팁 용량은 20 - 50 mL, 20 - 60 mL, 30 - 70 mL, 30 - 80 mL, 40 - 90 mL, 40 100 mL, 또는 50 - 200 mL일 수 있다. 충전된 베드의 용량은 1- 50 mL, 2 - 40 mL, 3 - 30 mL 또는 4 - 20 mL일 수 있다.

본 발명의 추가의 세부사항, 장점 및 실시례는 종속 청구항 및 실시례를 포함하는 첨부한 명세서로부터 드러날 것이다.

정의

피펫 팁: 피펫과의 접속을 통해 액체를 흡인 및 분배하는 다양한 형상의 플라스틱 튜브 이 정의는 주사기 팁을 포함한다.

피펫 팁 용량: 피펫 팁이 수용할 수 있는 최대 용량.

충전된 피펫 팁 컬럼: 분리 매질이 팁의 내측에 배치된, 일반적으로는 팁의 원위 단부에 배치된 피펫 팁. 피펫 팁 컬럼은 피펫 팁, 주사기 또는 유사한 재료로 구성될 수 있다.

피펫 팁 컬럼 베드: 피펫 팁 컬럼의 내측에 배치된 분리 매질의 베드. 이것은 일반적으로 베드의 용량의 관점에서 설명된다.

피펫 팁 컬럼의 충전된 베드: 일반적으로 팁의 원위 단부의 저부에 배치된 프릿(frit) 및 매질 베드 위의 프릿을 구비한 매질. 매질 베드 위의 프릿은 베드 바로 위에 있을 수 있거나 베드의 상부 위에 간극을 두고 배치될 수 있다.

피펫 팁 컬럼 베드 용량: 일반적으로 μL 또는 mL로 설명되는 분리 매질의 베드의 용량.

피펫 팁 컬럼 체임버: 컬럼 베드 위의 피펫 팁 컬럼 내의 용량.

체임버 용량: 피펫 팁 컬럼 내의 베드의 상부 위의 용량.

피펫 팁 펌프: 피펫 팁 컬럼을 통해 진공 또는 압력에 의해 하나 이상의 유체를 펌핑하도록 구성된 펌프.

펌프 노즐: 피펫 팁 컬럼에 시일을 제공하는 펌프의 가동 부품. 분리의 영역에서, 노즐은 때때로 '샤프트'로 표시된다.

환형 돌출부: 피펫 팁 컬럼에 시일을 제공하는 펌프 노즐 상의 리지(ridge) 또는 융기면.

피펫 팁 컬럼 체임버 압력 또는 진공: 흡인 및 분배 중에 각각 액체를 피펫 팁 컬럼을 통해 흐르게 하는 양의 공기압 또는 음의 공기압.

피펫 팁 컬럼 흡인 유체 흐름: 피펫 팁 컬럼 내로 컬럼 베드 위의 체임버 내로의 흐름.

피펫 팁 컬럼 분배 유체 흐름: 컬럼 베드 위의 체임버로부터 피펫 팁 컬럼으로부터의 유출

피펫 팁 컬럼 배압: 컬럼 체임버에 진공 또는 압력이 가해질 때 컬럼을 통과하는 액체의 흐름에 대한 저항.

피펫 팁 컬럼 출구: 피펫 팁 컬럼의 원위 단부.

원위 단부: 펌프의 접속점으로부터 멀어지는 방향의 피펫 팁, 주사기 팁, 피펫 팁 컬럼 또는 주사기 팁 컬럼의 단부.

도 1은 컬럼에 대한 노즐의 시일이 체임버 내의 압력 및 진공 실링을 어떻게 제공하는지를 예시하는 고 실링 피펫 펌프 및 피펫 팁 컬럼의 예시적인 세트를 도시한다.
도 2는 환형 리지, 팁 컬럼 상부 및 슬라이드 이젝터(slide ejector)를 구비한 예시적인 펌프 노즐을 도시한다.
도 3은 펌프 노즐 저부에 배치된 팁 컬럼 상부를 도시하며, 환형 리지 형태의 돌출부가 베드 위의 컬럼 체임버 내측에 공기 및 진공 실링을 제공한다.
도 4는 2 개의 환형 리지, 팁 컬럼 상부 및 슬라이드 이젝터를 구비한 펌프 노즐 저부를 도시한다.
도 5는 펌프 노즐 저부 상에 배치된 피펫 팁 컬럼 상부를 도시한다.
도 6은 본 발명에 따라 슬라이드 이젝터 수단을 사용하여 펌프 노즐로부터 피펫 팁 컬럼을 제거하는 방법을 도시한다.

제 1 양태에서 본 발명은 액체 취급 디바이스 및 분리 매질을 포함하는 적어도 하나의 피펫 팁 컬럼을 포함하는 자동 분리 시스템에 관한 것이며, 액체 취급 디바이스에는 2 개 이상의 노즐 등의 하나 이상의 노즐이 구비되고 노즐은 피펫 팁 컬럼, 및 각각의 피펫 팁 컬럼 내로의 흡인 및 각각의 피펫 팁 컬럼으로부터의 분배를 가능하게 하는 양의 압력 또는 음의 압력을 적용하기 위한 수단을 수용하도록 배치되고, 시스템에서 각각의 노즐에는 적어도 하나의 환형 돌출부가 제공된다.

이와 관련하여, '액체 취급 디바이스'라는 용어는 액체 샘플의 바이오프로세싱(bioprocessing) 분야에서 잘 알려져 있는 디바이스를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 성능을 제어하는 적절한 소프트웨어를 포함하여 그 작동을 가능하게 하는 표준형 기구를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 '자동화'라는 용어는 시스템이 이하에서 설명하는 표준 작동의 전부 또는 적어도 일부를 자동화된 방법으로 실행할 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로는, 적어도 피펫 팁 컬럼의 노즐에의 장착 및 노즐로부터의 방출이 자동적으로 실행되어 이하에서 더 상세히 설명되는 힘을 가능하게 한다.

장착된 피펫 팁 컬럼과 접촉하는 각각의 노즐의 부분에 제공되는 환형 돌출부(들)은 도면의 설명과 관련하여 이하에서 더 상세히 설명된다. 액체 취급의 분야에서, '노즐'이라는 용어는 때때로 샤프트 또는 매니폴드의 헤드로 대체된다. 유리하게는, 본 발명에 따라, 노즐은 피펫 팁 컬럼과의 직접 접촉을 가능하게 하도록, 즉 필요한 끼워맞춤을 가능하게 하기 위한 어댑터 등의 추가 부품을 피하도록 구축되어 있다.

간단히 말하면, 본 발명의 돌출부(들)은 유리하게는 노즐이 제조될 때 그 일체 부품으로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 돌출부(들)은 후 단계에서 부착될 수 있다. 어떤 경우에도, 본 명세서에서 '돌출부를 구비한다'고 함은 돌출부가, 예를 들면, 추가된 O링과는 대조적으로 소정의 위치에 고정되는 것을 의미한다. 따라서 노즐은 임의의 적절한 플라스틱 또는 기타 강성 및 비반응성 고체 재료로 표준 프로세스에 따라 성형 및 제조될 수 있다.

따라서, 본 시스템의 각각의 노즐에는 1 개 또는 2 개의 환형 돌출부가 제공될 수 있고, 이들 둘 모두는, 예를 들면, 약 20 내지 약 40 mL 범위의 액체 등 적어도 약 20 mL의 액체 용량을 수용할 수 있는 장착된 피펫 팁 컬럼과 실링 결합 상태로 배치된다. 일 실시례에서, 피펫 팁 컬럼은 그 원위 단부에 약 2 ml의 충전된 베드를 그리고 충전된 베드 위의 체임버 용량에 약 18 ml의 액체를 수용하도록 배치된다.

각각의 노즐에는 필요에 따라 노즐로부터 팁의 제거를 가능하게 하는 슬라이드 이젝터가 구비될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 피펫 팁 컬럼은 작동 중에 소정의 위치에 머무르도록 노즐에 충분히 끼워맞춤되어야 하고, 사용 후에는 도면에 예시된 바와 같은 슬라이드 이젝터 등을 사용하여 쉽게 제거가능해야 한다.

피펫 팁 컬럼은 체임버 용량 내에 적어도 20 mL의 액체를 수용할 수 있는 균일하게 또는 실질적으로 균일하게 테이퍼를 이루는 플라스틱 피펫 팁 등의 종래의 설계이다. 본 발명의 일부의 실시형태에서, 적어도 40 mL의 액체가 수용될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에서, 적어도 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL, 및 200 mL의 액체가 수용될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 프릿들 사이에 유지되는 분리 매질의 충전된 베드는 본 명세서에서 설명하는 액체 용량에 비해 작으므로, 이 도면은 다양한 실시형태에서 충전된 베드를 포함하거나 배제하는 것으로 이해될 수 있다. 어느 경우에서도, 본 발명은 플라스미드 등의 생체분자의 분리를 위해 제안된 종래 기술보다 실질적으로 더 큰 용량을 자동적으로 관리할 수 있다.

피펫 팁 컬럼을 위해서는 이것이 본 명세서에서 설명하는 압력을 견디는 충분한 강성으로 제조되는 한 그리고 생체분자의 분리에서 일반적으로 사용되는 액체 및 시약을 고려하여 비반응성인 한 임의의 플라스틱 또는 폴리머 재료가 고려될 수 있다.

이제, 본 발명자들은 피펫 팁에 리세스 및 돌출부 등의 결합 기구가 제공되는 것을 빈번하게 제안하는 종래 기술과 대조적으로 액체 취급 디바이스의 노즐에 돌출부를 제공함으로써 피펫 팁 컬럼의 누출 또는 조기 손실을 수반하지 않으면서 관리가능한 힘을 사용하여 종래 설계의 피펫 팁 컬럼을 장착 및 방출할 수 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 이는 팁 컬럼도 최종적으로 문제없이 방출되어야 하므로 쉽게 장착되는 것이 어렵다는 것이 밝혀진 일반적으로 약 20 내지 약 40 mL의 체임버 액체를 수용하는 사용되는 피펫 팁 컬럼의 대형 베드 용량에 관련하여 놀라운 것이었다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 추가의 안전이 필요한 경우, 또는 더 높은 압력 및/또는 더 큰 용량이 상정되는 경우 등의 특정의 상황에서는 노즐과 피펫 팁 컬럼 사이의 결합부에 하나 이상의 종래의 O링이 포함될 수 있다.

본 발명의 일부의 실시형태에서, 펌프 노즐로부터 피펫 팁 컬럼을 제거하기 위해 2-3 파운드(0.9-1.6N)의 하향 힘이 필요하다. 일부의 실시형태에서, 펌프 노즐로부터 피펫 팁 컬럼을 제거하기 위해 2-10 파운드(0.9-4.7N), 3-9 파운드(1.6-4.2N) 또는 4-8 파운드(0.8-1.4N)의 힘이 필요하다. 이 노즐은 실시례 2에서 제 1 세대 노즐로 설명된다.

본 시스템의 다른 실시형태에서, 각각의 피펫 팁 컬럼은 약 50N 내지 약 160N 범위의 힘을 사용하여 노즐에 장착가능하다.

추가의 실시형태에서, 본 시스템의 각각의 피펫 팁 컬럼은 유사한 힘, 즉 약 50N 내지 약 160N을 사용하는 방출에 의해 해방가능하다. 방출 메커니즘은 노즐로부터 컬럼을 완전히 밀어낼 수 있어야 한다. 컬럼은, 자동화 로봇에서 컬럼이 부분적으로 방출되어 로봇 액체 취급기를 파손시키지 않는 것을 확실하게 하도록, 노즐을 완전히 제거해야 한다. 본 발명의 일부의 특정 실시형태에서, 펌프 노즐로부터 피펫 팁 컬럼을 제거하기 위해 3.5 파운드(1.6 N)의 힘이 필요하다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 컬럼을 장착 및 방출하기 위해 필요한 힘은 각각의 노즐의 돌출부(들)의 특정 설계에 의해 영향을 받는다. 본 설명으로부터 나타나는 바와 같이, 본 발명에 따른 시스템은 각각의 노즐에 하나의 돌출부 등의 하나 이상의 돌출부를 포함하며, 종래 기술과 반대로 피펫 팁 컬럼은 균일한 경사에 의해 형성된다. 즉 이것은 각각의 노즐 돌출부에 대응하는 어떤 리세스도 구비하지 않는다. 본 발명의 요지로부터 벗어나지 않고, 예를 들면, 각각의 노즐에 하나의 돌출부만이 제공되는 실시형태가 가능하다. 이러한 실시형태에서, 유일한 돌출부는 2 개 이상의 돌출부가 노즐 상에 제공되는 경우보다 약간 더 클 수 있다. 따라서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 각각의 피펫 팁 컬럼을 장착 및/또는 해방하는 데 필요한 힘은, 예를 들면, 노즐의 수 및/또는 형상 및 치수에 따라 달라진다. 본 명세서에 기재된 원리에 따라, 당업자는 노즐에 대해 피펫 팁 컬럼을 효율적으로 실링하기 위해 그리고 분리 프로세스가 완료되면 간단한 방출에 의해 피펫 팁 컬럼을 제거하기 위해 최적의 힘에 도달하기 위한 간단한 시험을 수행할 수 있을 것이다.

따라서, 위에서 정의된 범위로부터 벗어나는 것도 본 청구범위에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명에 포함될 수 있다.

피펫 팁 컬럼은 한번에 하나씩, 또는 동시에 방출될 수 있고, 선택적으로는 그 외면에는 방출을 촉진하는 수단에 제공될 수 있다. 이러한 수단은, 예를 들면, 외부 리지 또는 기타 돌출부일 수 있고, 이것을 사용하여 피펫 팁 컬럼을 자동적으로 밀어내어 해방시킬 수 있다.

본 발명의 장점은 처리 중에 효율적인 실링 뿐만 아니라 수동적 개입을 필요로 하지 않으면서 간단한 자동화된 방출을 포함하는 위에서 설명한 각각의 노즐로부터 대형의 충전된 피펫 팁 컬럼의 장착 및 방출을 가능하게 하는 펌프이다. 이와 관련하여, 본 출원의 전체를 통해서 설명되는 바와 같이 대형이라고 함은 20 mL 이상인 것으로 이해된다.

본 발명은 4 리터 이상 등 2 리터 이상의 샘플 용량 등 실질적으로 더 큰 용량의 피펫 팁 컬럼과 함께 사용될 수도 있다. 이와 관련하여, '피펫'이라는 용어는 액체를 흡인 및 분배하는 능력에 관하여 피펫 팁과 동일한 기능을 갖는 컬럼을 지칭하지만 크기 제한으로 해석되어서는 안된다.

본 자동 분리 시스템의 바람직한 펌프는 피스톤 펌프이며, 이것은 각각의 단계에서 필요에 따라 압력을 해방할 뿐만 아니라 긴밀하게 실링하기 위해 가요성 립(lip)을 사용하여 배치된다. 이 목적을 적합한 피스톤 펌프는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 펌프 실린더, 펌프 피스톤, 실린더 공간, 압력 센서, 및 압력 채널 등의 요소를 포함한다. 이러한 종래의 펌프로부터 출발하여, 본 발명자들은 본 명세서에서 설명하는 액체의 용량을 처리할 수 있는 실링 수단을 제공하였다. 더 구체적으로, 이 실링 수단은 가요성 플라스틱 또는 고무 등의 적절한 재료로 제조될 수 있다. 더 나아가, 압력을 각각 유지 및 해방하기 위해 필요한 응답성을 가능하게 하기 위해, 이러한 실링 수단은 유리하게는 적절한 윤활제를 구비한 가요성 립일 수 있다. 예를 들면, 피스톤의 단부로부터 제 1 수직 거리 및 제 2 수직 거리에서 피스톤을 둘러싸는 환형 립 등의 실링 립은 펌프 피스톤과 실린더 공간 사이의 하나 이상의 수직 위치에 배치될 수 있다.

결과적으로, 본 발명의 특정 양태는 위에서 설명한 힘을 사용하여 본 시스템의 액체 취급 디바이스에 배치되는 노즐에 20-40 mL 피펫 팁 컬럼 등 대형 피펫 팁 컬럼을 장착 및/또는 방출하는 방법이다.

본 발명에 따른 시스템은 서로에 대해 이동가능한 2-4 개의 컬럼 등 적어도 2 개의 독립적으로 배치되는 피펫 팁 컬럼을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, '독립적으로 배치'라는 용어는 피펫 팁 컬럼이 트레이 또는 플레이트와 같은 형식으로 배치되지 않고 종래의 액체 취급 시스템과 같은 더 큰 튜브처럼 배치되는 것을 의미한다. 작동 방법은 이러한 독립적으로 배치된 피펫 팁 컬럼이 어느 정도로 병렬로 또는 하나씩 작동되는지를 결정한다.

위에서 보여준 바와 같이, 그리고 첨부 도면에 의해 상세히 설명되는 바와 같이, 각각의 피펫 팁 컬럼은 실질적으로 균일하게 테이퍼를 이루고, 피펫 팁 컬럼의 내면과 노즐 사이에 긴밀한 실링을 제공하도록 배치된다. 유리하게는, 상기 실링을 개선하기 위해 피펫 팁 컬럼은 노즐의 외경보다 더 작은 내경을 가질 수 있다. 이러한 끼워맞춤은 마이크로피펫의 분야에서 설명되어 있으며, 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.

유리하게는, 각각의 노즐과 각각의 피펫 팁 컬럼 사이의 실링은 피펫 팁 컬럼의 원위 단부가 5% 미만의 압력 또는 진공 손실로 약 5 분 이상 동안 봉쇄된 상태에서 압력 및 진공 실링을 유지한다. 이러한 압력 또는 진공 손실은 이 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 시스템에서, 피펫 팁 컬럼(들)에 압력을 적용하기 위한 수단은 전기 모터에 의해 제공될 수 있다. 이러한 구동 수단은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 일반적으로 사용되는 액체 취급 디바이스용이 시판되고 있다.

생체분자의 분리는, 유리하게는, 피펫 팁 컬럼에 타겟 분자와 상호작용하고 타겟 분자를 유지할 수 있는 분리 매질을 충전함으로써 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 시스템에서, 각각의 컬럼은 크로마토그래피 매질 등의 충전된 분리 매질 또는 고상 추출물(SPE) 매질 등의 추출물 매질, 지지 액체 추출물 (SLE) 매질, 친화성 매질, 이온 교환 매질, 역상(reverse phase) 매질, 순상(normal phase), 카오트로픽 상(chaotropic phase) 매질, 소수성 상호작용 매질, 친수성 상호작용 매질 및 다른 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 이들 크로마토그래피 매질은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상업적 공급자로부터 쉽게 입수가능하다.

본 발명의 분리 매질은, 바람직하게는, 생체분자 및 기타 분자(대형 유기 분자 등)의 액체 샘플 처리 분야에서 통상적인 바와 같이 충전된 매질의 양측의 피펫 팁 컬럼의 상부 및 저부에 프릿, 즉 필터를 배치함으로써 정위치에 유지된다. 이와 관련하여 US 2017/0,211,129(Phynexus, Inc.)를 참조하면, 충전된 피펫 팁 컬럼이 이러한 프릿의 성질, 충전 레벨 등을 포함하여 상세히 기술되어 있다. 당업자는 이러한 기준에 기초하여 또는 단순히 일반적인 지식 및 공급자의 추천을 사용하여 피펫 팁 컬럼을 쉽게 충전할 수 있다. 본 시스템에서, 매질은, 유리하게는, 매질의 유동 베드와 대조적으로 충전으로서 제공, 즉 정위치에 유지되어야 한다.

본 발명의 제 2 양태 및 제 3 양태에 관하여 본 명세서의 이하 및 전체를 통해 제공되는 추가의 세부사항은 이 제 1 양태에 동등하게 적용가능하다.

제 2 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자 또는 유기 분자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 샘플 준비 또는 '샘플 제조' 방법일 수 있고, 일반적으로 타겟 분자의 분석에 선행하는 단계로서 사용되는 것으로 알려져 있다. 이러한 샘플 제조 방법에서, 매질은 액체 샘플로부터 오염물질을 제거하거나 액체 샘플의 나머지로부터 타겟 분자를 분리할 수 있다.

따라서, 일 모드에서, 본 발명의 방법은 본 시스템의 각각의 충전된 피펫 팁 컬럼 내로 샘플을 흡인하는 제 1 단계; 및 피펫 팁 컬럼으로부터 정제된 액체 샘플을 분배하는 제 2 단계를 포함할 수 있다. 이러한 모드에서, 분배된 액체는 피펫 팁 컬럼에서의 처리 전보다 훨씬 더 깨끗한 환경에서 타겟 분자를 포함한다.

다른 모드에서, 본 방법은 각각의 충전된 피펫 팁 컬럼 내로 용출액을 흡인하는 단계; 용출액이 분리 매질로부터 타겟 분자를 방출하게 하는 단계; 및 피펫 팁 컬럼으로부터 해방된 타겟 분자를 포함하는 용출액을 분배하는 단계를 더 포함한다.

분리된 생체분자, 즉, 이 방법의 타겟은 항체 등의 단백질; 항체 프래그먼트 등의 단백질 프래그먼트; 펩타이드; 및 선형 DNA, 선형 RNA, 올리고뉴클레오티드, 게놈 DNA 또는 플라스미드 등의 핵산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 유리하게는, 본 방법은 대량의 플라스미드가 벡터로서 사용되는 재조합 DNA 기술에서 후속 사용을 목적으로 하는 플라스미드의 분리에서 사용된다. 본 발명의 방법의 타겟은 본 방법에서 기타 생체분자, 즉 단백질, 펩타이드, 세포 파편의 성분, DNA 및 RNA 등의 샘플의 기타 성분으로부터 그리고 타겟 생체분자가 생성되는 발효 브로스(fermentation broth)로부터 유래하는 영양소 및 기타 성분으로부터 분리된다.

분리된 타겟 생체분자의 사용목적에 따라, 본 방법은 분리의 단일 단계로서 그 자체로서 사용될 수 있고, 또는 정제 프로토콜의 일부로서 사용될 수 있고, 이 경우에는 여과, 원심분리 등의 단계와 조합될 수 있다. 예를 들면, 여과 단계, 예를 들면, 중력 여과는 본 발명에 따라 피펫 팁 컬럼에서의 처리에 선행할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 출발 재료의 성질에 따라, 예를 들면, 원심분리에 의한 세포의 용해 및 세포 파편의 제거 등 종래의 처리 단계는 본 발명에 따른 방법의 실시형태에 포함될 수 있다.

본 발명의 시스템과 관련하여 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 장점은 노즐과 피펫 팁 컬럼 사이의 시일이 대용량의 액체의 긍정적인 처리에 요구되는 고압을 견딘다는 것을 예상외로 나타났다는 것이다. 따라서, 본 방법에서, 각 노즐의 피펫 팁 컬럼에 대한 실링을 실질적으로 손상하지 않으면서 4-5 psi 등의 3-5psi의 양의 압력이 피펫 팁 컬럼에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부의 실시형태에서, 적어도 5 분에 걸쳐 압력 누출을 수반하지 않고 그리고 펌프 노즐로부터 피펫 팁을 노출시키지 않고 2 - 15 psi의 양의 압력이 컬럼 체임버에 적용될 수 있다. 일부의 실시형태에서, 적어도 5 분의 기간에 걸쳐 진공의 누출을 수단하지 않고 1-10 psi의 진공이 컬럼 체임버에 적용될 수 있다. 누출이 없다는 것은 5% 이하의 변화로서 정의된다.

본 명세서에서 제 1 양태에 관하여 제공되는 모든 세부사항은 본 발명의 이 제 2 양태에도 적용가능하다.

제 3 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 분리 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자를 분리하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 크로마토그래피 또는 고상 추출물(SPE) 매질로 충전된 20-40 mL 용량 등의 대용량 피펫 팁 컬럼, 및 별개의 구획실 내에 이러한 분리를 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

더 나아가, 본 키트는, 별개의 구획실 내에, 평형화 완충액, 세척액, 및 용출액을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 당업자에게 잘 알려져 있고, 시판되고 있다.

본 발명의 제 3 양태를 이해함에 있어서, 제 1 양태 및 제 2 양태와 관련하여 본 명세세에 제공되는 모든 세부사항이 적용가능하다.

본 발명의 일부의 실시형태에서, 펌프 노즐의 실링 메커니즘은 바람직하게는 5 psi까지의 내부 컬럼 압력에서도 피펫 팁을 피펫 팁 컬럼에 긴밀하게 끼워맞춤한다. 본 발명의 일부의 실시형태에서, 컬럼은 4-6 psi, 3-7 psi, 3-8 psi, 3-10 psi 범위의 내부 컬럼 압력 또는 10 psi, 20 psi, 30 psi, 40 psi 또는 50 psi를 초과하는 내부 컬럼 압력으로 펌프 노즐에 실링된 상태 및 부착된 상태를 유지한다. 컬럼은 펌프 노즐에 대하여 음의 2 psi, 3 psi, 4 psi, 5 psi, 6 psi, 7 psi, 8 psi, 9 psi 또는 10 psi으로 실링한다. 실링된 상태로의 유지는 2 분, 3 분 4 분 또는 5 분의 기간 동안 5% 이상의 누출을 수반하지 않으면서 압력을 유지하는 것으로 정의된다.

위에서 설명한 바와 같이, 피펫 팁 컬럼의 내측의 헤드에 대한 노즐의 실링은 링 또는 핍(pip) 등의 환형 돌출부를 구비한다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 "환형"이라는 용어는 돌출부가 노즐 주위의 실질적으로 전체의 주위에 배치되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 이러한 "환형" 형상으로부터 작은 중단 또는 벗어남을 포함하는 임의의 실시형태는, 본 명세서에서 설명하는 유리하고 효율적인 실링이 얻어지는 한, 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 링은 컬럼의 헤드에 대하여 매우 강한 힘을 제공하므로 공기 또는 진공이 노즐을 통과하여 누출될 수 없다. 컬럼을 출입하는 신뢰가능하고 예측가능한 흐름을 유지하기 위해 내부 압력 또는 진공을 유지하는 것은 필수적이다. 누출이 발생한 경우에도 액체는 여전히 컬럼을 출입하지만 이 흐름은 예측불가하고 불완전하다. 로봇 액체 취급기의 경우 예측가능한 흐름이 특히 필요하다. 완전한 흐름은 컬럼으로부터의 샘플의 완전한 착, 세척 및 용출을 위해 필요하다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 펌프 노즐의 직경은 노즐의 적어도 일부가 컬럼에 대해 매우 긴밀하게 끼워맞춤되도록 증대된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 피펫 팁 컬럼에 대해 펌프 노즐을 긴밀하게 실링하기 위해 O링 또는 유사한 실링 디바이스가 노즐에 추가된다.

실링을 향상시키기 위한 이들 실링 메커니즘은 모두 컬럼 노즐로부터 컬럼을 쉽고 예측가능하게 방출할 수 있는 문제를 초래한다. 피펫 기술에서, 방출은 손의 힘으로 수행된다. 전기 액츄에이터는 추가의 힘을 제공할 수 있으나, 방출 메커니즘은 피펫 팁 컬럼의 상부 방출 레지를 손상시키지 않으면서도 균일하고 강력해야 한다. 이는 사용 중에 피펫 팁 컬럼을 2 번 이상, 최대 5, 10 또는 20 번 장착 및 방출하는 것이 필요할 수 있기 때문이다.

도 1에서는 본 발명에 따른 자동 분리 시스템의 고밀봉 피펫 펌프 및 컬럼이 도시되어 있다. 더 구체적으로, 도 1은 펌프 모터(1); 피스톤 플런저 구동 나사(2); 펌프 피스톤(3); 본 명세서에서 방출 레버(4)로 예시된 방출 수단; 본 명세서에서 노즐의 단일 돌출부로서 예시된 펌프 노즐 실링 수단(5); 피펫 팁 컬럼(6); 컬럼 베드(7); 및 마지막으로 샘플 또는 완충 유체(8) 등 흡인될 수 있는 액체를 포함하는 예시적인 용기를 도시한다.

본 발명에 따라 배치된 컬럼에 대한 노즐의 시일은 효율적인 압력 및 진공을 제공한다. 예를 들면, 5% 미만의 압력 또는 진공 손실로 5 분 이상의 실링.

도 2는 펌프 노즐 저부(13), 피펫 팁 컬럼 상부(14) 및 슬라이드 이젝터(15)의 배열을 도시한 근접도이다. 더 구체적으로, 펌프 노즐(9); 슬라이딩 이젝터(10); 피펫 팁 컬럼 상부(11); 및 환형 실링 리지(12) 형태의 돌출부가 도시되어 있다.

예시된 환형 돌출부는 피펫 팁 컬럼 상부의 내벽에 대해 추가의 힘을 제공하며, 이는 유리한 실링 힘을 제공한다. 작은 미세한 흠집이나 결함도 공기의 누출을 가능하게 하고 적절한 실링을 방해하므로 이 실링 힘은, 유리하게는, 공기의 누출을 방지하기 위해 내면 전체를 통해 균일하게 배치된다.

도 3은 펌프 노즐 저부 상에 배치된 피펫 팁 컬럼 상부(11)를 도시한다. 예시된 환형 돌출부 형태의 실링 수단(5)은 컬럼 내부에 공기 및 진공 실링을 제공한다. 본 발명에 따른 돌출부를 포함하는 노즐 설계의 보충으로서, 추가의 개선된 실링은 노즐의 직경을 증대하는 것 및/또는 긴밀한 끼워맞춤 O링을 사용하는 것을 포함한다.

도 4는 본 발명에 따른 자동 분리 시스템의 대안적 실시형태를 도시하며, 여기서 펌프 노즐 저부(13)에는 실링 리지(12) 형태의 2 개의 환형 돌출부, 팁 컬럼 상부 및 슬라이드 이젝터가 배치된다.

도 5는 강한 힘으로 펌프 노즐 저부에 배치된 피펫 팁 컬럼 상부를 도시한다. 이 예시적인 실시형태에서, 2 개의 환형 리지(12)가 베드 위의 컬럼 체임버 내측에 진공 실링을 제공한다.

도 6은 펌프 노즐로부터 강한 힘으로 피펫 팁 컬럼 상부를 제거할 수 있는 방법을 도시한다.

슬라이드 이젝터는 펌프 노즐로부터 강한 힘으로 컬럼 상부를 제거한다. 펌프 노즐로부터 피펫 팁 컬럼을 방출하는 것은 어렵다. 도 1에 도시된 바와 같이 컬럼을 방출하기 위해 레버가 사용될 수 있다. 그러나, 이젝터는 피펫 컬럼의 플라스틱 상부의 상부를 변형시켜서는 안된다. 피펫 팁 컬럼은 정제 방법에서 수 차례 장착 및 방출되어야 한다.

실험 부분

본 실시례는 설명의 목적을 위해서만 제공되며, 첨부한 청구범위에 의해 정의되는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이하에서 또는 본 명세서의 다른 부분에 제공된 모든 참조는 원용에 의해 본원에 포함된다.

실시례 1 - 플라스미드 정제

재료

플라스미드 정제를 위해 본 발명에 따른 자동 분리 시스템이 사용되었다. 더 구체적으로, 이 기기에는 하나의 환형 돌출부를 갖는 2 개의 노즐이 제공되었으며, 각각의 노즐에는 본 명세서에 기술된 바와 같이 컬럼, 샘플, 바이얼 및 튜브, 및 완충액이 장착되었다. 피펫 팁 컬럼에 폴리아크릴레이트 기질을 기반으로 하는 DEAE 약염기 음이온 교환 수지의 4 mL 베드를 충전함으로써 충전된 매질 베드를 제조하였다. 이렇게 제조된 4 mL 베드를 포함하는 컬럼 하드웨어는 20 mL 피펫 팁을 사용하여 구성하고, 충전된 베드는 컬럼의 원위 단부에 배치하였다. 샘플은 발현된 플라스미드를 포함하는 5 그램의 대장균 세포 펠릿으로 구성하였다. 샘플을 TRIS 완충액 중에 분산시키고, 1M의 NaOH 및 SDS 표면활성제로 용해시켜 세포 파편과 용해된 플라스미드의 현탁액을 형성하였다. 이 혼합물에 RNase를 첨가하였다. 샘플 제조의 전체 프로세스 중에 용량 또는 질량의 측정이 불필요하도록 첨가된 완충액을 컬러 코딩(color coding) 및 프리패키징(prepackaging)하였다. 다음에 샘플을 여과 샘플 저장소에 붓고 기기 프로세스를 시작하였다. 여과는 중력 여과를 통해 입자의 대부분을 제거한다. 제거된 입자는 프로세스에 따라 달라진다. 플라스미드 포착에서는, 단백질, 세포 파편, 게놈 DNA 기타 물질이 제거되는 한편 플라스미드는 용액 중에 잔류하고 여과액(filtrate) 내에서 필터를 통과한다. 여과 프로세스는 최대 1 시간이 걸리지만 여과가 시작된 직후에 시작하였다. 샘플이 흡인되었고, 피펫에 의해 등량의 여과액을 수용하는 6 개의 50 mL 원뿔형 튜브로 이송되었다. 피펫 팁 컬럼을 샘플을 수용한 각각의 원뿔형 튜브 내에 삽입하였고, 전체 샘플 여과액이 처리될 때까지 왕복 흐름 프로세스로 순차적으로 플라스미드를 포착하였다. 샘플 저장소로부터의 여과액으로부터 직접 샘플을 처리하는 것이 가능하다. 이 경우에는, 피펫 팁 컬럼을 저장소에 삽입하고, 여과액을 흡인한다. 다음에 컬럼을 원뿔형 튜브로 이동시키고, 샘플 분취량을 왕복 흐름으로 처리한다. 대안적으로, 샘플을 흡인하여 폐기하고, 피펫 팁 컬럼 베드를 통해 샘플을 1 회 흡인 및 분배함으로써 포착을 수행한다. 이들 프로세스를 샘플 여과액 전체가 처리될 때까지 반복한다. 모든 컬럼, 완충액, 바이얼 및 여과 저장소를 포함하는 기기는 Biotage AB(Uppsala, Sweden)으로부터 입수하였다.

방법

설명되어 있는 모든 작동은 노즐 상에 환형 돌출부를 포함하는 본 발명에 따른 자동 분리 시스템을 사용하여 수행하였다.

일반적 프로시저:

1. 용해된 플라스미드를 함유하는 침전된 세포 용해물을 여과하여 반투명 용해물을 생성한다. 용해된 플라스미드는 여과액 중에 잔류한다.

2. 독자적인 내독소(endotoxin) 제거 완충액을 반투명 용해물에 첨가하고 배양한다. 이는 내독소를 결합하고 DEAE 음이온 교환 컬럼 상의 내독소의 포착을 방지한다.

3. 실온에서 30 - 60 분간 평형화한다.

4. 반투명 용해물을 이송한다. 이 배양된 샘플을 팔콘 튜브(falcon tube)로 이송한다. 15 mL의 분취량. 다음 단계에서 포착을 위해 10 개의 튜브가 준비된다.

포착:

음이온 교환 컬럼을 샘플 원뿔형 튜브 내에 배치하고, 샘플을 컬럼 내로 흡인해 올리고 400 mL/분의 속도로 4 사이클 토출한다(흡인 및 분배). 400 mL/분으로 12 mL를 흡인하고, 45 초간 지연시킨다. 400 mL/분으로 2 mL를 토출하고 15초간 6회 지연시킨다. 각각의 반 사이클의 말기에 지연을 추가하여 컬럼을 통한 흐름이 정지할 수 있도록 한다. DEAE 음이온 교환 컬럼에 의해 플라스미드를 포착한다.

5. 진공 세척. 컬럼을 이동시켜 진공 세척 스테이션 내에 배치한다. 펌프를 아래로 이동시켜 저장소를 세척하고, 10 mL의 세척 완충제를 흡인한다.

다음에 375 mL/분으로 20 mL의 공기를 흡인한다. 375 mL/분으로 20 mL의 공기를 토출한다.

5-10 분취량에 대해 수차례 반복하고, 컬럼 및 팁을 방출한다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 세척은 진공을 사용하는 것만으로 팁을 세척한다.

6. 용출. 플라스미드는 TRIS 완충액 내에 포착된다. 필요한 회수율에 따라 용출 용적은 5, 10, 또는 20 mL일 수 있다. 용출 용량이 작으면 작을 수록 회수되는 플라스미드의 농도가 높아진다. 용출 용량이 크면 클수록 회수되는 플라스미드의 총 질량이 증가한다.

실시례 2 - 직경 실링 돌출부가 증가된 노즐

실시례에서 사용된 3 가지 유형의 긴밀한 끼워맞춤 노즐 제 1 유형의 노즐은 실시례1 및 실시례 3에서 설명한 작업에서 사용하였다. 이 실시례에서, 돌출부는 20.4 mm 직경의 피펫 팁의 상부에서 직경이 단 1회 증가하였다. 돌출부가 없고 피펫 컬럼 실링이 없는 노즐 직경은 19.8 mm였다.

제조된 제 2 세대는 노즐의 약간 아래에 끼워맞춤되는 20.6 mm 돌출부를 갖는다. 돌출부가 없고 피펫 컬럼 실링이 없는 노즐 직경은 19.8 mm였다. 이 노즐은 실시례 1에서 설명한 예에서도 사용되었다.

제 3 실시형태는 20.3 mm의 상부 리지 직경 및 20.2 mm의 저부 리지를 갖는 이중 리지 돌출부이다. 돌출부가 없고 피펫 컬럼 실링이 없는 노즐 직경은 19.8 mm였다. 직경은 제 2 실시형태보다 더 작지만 제거에 필요한 힘은 3 가지 실시형태 중 가장 컸다. 이 실시형태는 실시례 1에서 설명한 예에서도 사용되었다.

3 가지 세대의 설계 중에서 제 1 세대 설계의 실링이 우수하고, 가장 쉽게 제거된다. 제 3 세대 설계는 실링이 가장 우수하지만 제거는 가장 어렵다.

실시례 3 - 폴리펩타이드 탈염(desalting)

본 명세서에 설명되는 작업은 실시례 2에 기술된 제 1 실시형태로서 기술된 긴밀한 실링 노즐을 갖는 기기를 사용하여 수행하였다.

방법

20 mL 피펫 팁 컬럼을 3 mL 단계적 마크까지 절단하고 스크린을 부착하였다. 0.5, 1 또는 2 그램의 C18 수지를 피펫 팁 내에 장착하였다. 이들 수지의 질량은 수지 1, 2 또는 4 mL에 해당한다. 컬럼을 190 프루프 에탄올(proof ethanol)로 세척하고, 베드는 진공 하에서 건조시켰다. 충전된 베드 컬럼을 제조하기 위해 상부 스크린을 부착하였다. 시험된 수지는 Isolute C18 UC(Biotage, 9220-0500), Isolute C18 EC(Biotage, 9221-0100), MFC18(Biotage, 240-0005), Sep-Pak(Waters, WAT043350) 및 C18-역상 실리카겔(Sigma, 60757-50G)을 포함한다.

컬럼을 100% 아세토니트릴로 구성된 20 mL의 웨팅(wetting) 용액 내에 침지시켰다. 컬럼은 400 mL/분의 유량으로 12 mL의 4 회의 왕복 사이클 및 각각의 흡인 및 각각의 분배의 말기에 60 초 휴지를 사용하여 습윤하였다. 컬럼은 위에서 설명한 바와 같이 4 회의 왕복을 사용하여 20 mL의 0.1% TFA 용액 중에서 컨디셔닝하였다. 트립신에 의해 소화되는 BSA로 구성되는 펩타이드 표준을 1 또는 2 mg/mL의 최종 농도까지 10 mL의 0.1% TFA로 스파이킹(spiking)하였다. 컬럼을 샘플 내에 침지시키고 400 mL/분의 유량으로 9 mL의 24 회의 포착 사이클 및 각각의 흡인과 각각의 분배의 말기에 60 초 휴지를 사용하여 펩타이드를 포착하였다. 컬럼을 4 회의 왕복 사이클을 사용하여 3 mL의 0.1% TFA의 3 개의 연속적인 분취량으로 세척하였다. 펩타이드는 40% 아세토니트릴의 3 mL 용액을 컬럼의 상부에 적용함으로써 용출하였고, 플로우 스루(flow through)를 수집하였다.

NanoDrop 분광광도계와 폴리아크릴아미드 젤 전기이동을 사용하는 UV/Vis 흡광도에 의해 샘플을 분석하였다.

결과

소규모 정제에서는 수지간 변동성이 거의 없다.

500 mg의 5 가지 상이한 수지를 컬럼에 충전하고, 펩타이드에 대하여 최고의 선택성 및 수율을 나타내는 수지를 선택하기 위해 사용하였다. 각각의 컬럼에 대하여 10 mg의 펩타이드의 샘플을 5 mL의 포착 완충액 내에 스파이킹하고, 32 사이클로 포착한 후에 세척 및 용출하였다. 정제는 2회 수행하였다. Nanodrop를 사용하여 플로우 스루 및 용출을 분석하였다. 샘플과 샘플 완충액은 UV를 흡수하는 불순물을 함유하고, 이것은 플로우 스루 분석의 정확도에 영향을 주었다. 그러나, 분석은 방법의 개발에 유용한 경향을 밝혀냈다.

플로우 스루 데이터 및 용출 데이터는 선택 실험에서 예상되는 컬럼마다의 변동성을 보여주었다. 변동성을 고려하지 않으면 다양한 수지들 사이의 포착 성능 또는 용출에 실질적인 차이가 없었다(표 1).

MFC18는 복제의 변동성이 낮으므로 후속 스케일업(scale-up) 방법의 개발을 위해 선택되었다.

표 1: 소규모 수지 스크린
샘플	복제 #	플로우 스루(mg/mL)	% 포착	회수(mg)	% 회수
MFC18	1	0.624	33	8.8	88
MFC18	2	0.707	37	8.9	89
C18 UC	1	0.694	36	7.1	71
C18 UC	2	0.471	25	8.4	84
C18 EC	1	0.417	22	8.7	87
C18 EC	2	0.628	33	7.7	77
Sep-Pak	1	0.419	22	8.4	84
Sep-Pak	2	0.566	30	8.7	87
Fluka	1	0.626	33	7.7	77
Fluka	2	0.680	36	7.8	78

수지 스케일업 및 손상된 흐름

MFC18는 후속 방법 개발을 위한 2 mg 컬럼으로 스케일업되었다. 그러나, 흐름 문제가 관찰되었다. MFC18 컬럼은 충분히 습윤 및 컨디셔닝될 수 없었고, 이는 성능 저하를 초래하였다. 수지 용량을 증가시키면 배압이 예상한 것에 불균형적으로 증가하였음을 보여주었다. 소규모로 시험된 5 개의 수지를 장착량이 500 mg로부터 2 g으로 증가했을 때의 배압에 대해 재시험하였다. 이들 연구로부터 C18 UC는 최저 배압을 나타냈으며, 스케일업을 위한 최상의 후보였다.

효율적인 회수는 확장성이 있다

질량 회수율이 증가될 필요가 있는 대용량 샘플에 대해 분리가 기능하는지를 결정하기 위해 최적화된 방법을 더 시험하였다. 38 mg의 펩타이드를 20 mL의 포착 완충액에 스파이킹하였다. Isolute(Biotage, 9220-0500)를 사용하는 정제를 2회 수행하였다. 1 μL를 취출하고 8 회 및 32 회의 포착 사이클 후에 NanoDrop에 의해 분석하여 포착 완료를 평가하였다. 용출은 NanoDrop에 의해 분석하였다.

8 사이클 후에 약 80%의 펩타이드가 포착되었고, 이것은 32 사이클 후에 약 90%까지 향상되었다. 포착된 펩타이드는 용출 중에 완전히 회수되었고, 원래의 38 mg 중 약 34 mg이측정되었다.

표 2: 플라스미드의 회수

샘플 ID	단백질 농도(mg/mL)	용출 용량(mL)	수율(mg)
입력	1.905	20	38.1
좌 FT 8 사이클	0.736	10	7.36
우 FT 8 사이클	0.848	10	8.48
좌 FT 32 사이클	0.560	10	5.60
우 FT 32 사이클	0.633	10	6.33
좌 용출	2.927	12	35.124
우 용출	2.873	12	34.476

Claims (18)

1. 액체 취급 디바이스 및 적어도 하나의 피펫 팁 컬럼을 포함하는 자동 분리 시스템으로서,
   상기 피펫 팁 컬럼(들)은 분리 매질을 포함하고, 상기 액체 취급 디바이스에는 하나 이상의, 예를 들면, 2 개 이상의 노즐이 구비되고, 각각의 노즐은 피펫 팁 컬럼, 및 각각의 피펫 팁 컬럼 내로의 흡인 및 각각의 피펫 팁 컬럼으로부터의 분배를 가능하게 하는 양의 압력 또는 음의 압력을 적용하기 위한 수단을 수용하도록 배치되고, 상기 시스템에서 각각의 노즐에는 적어도 하나의 환형 돌출부가 제공되는, 자동 분리 시스템.
2. 제 1 항에 있어서,
   각각의 노즐에는 적어도 2 개의 환형 돌출부가 제공되고, 상기 돌출부의 둘 모두는 장착된 피펫 팁 컬럼과 실링 결합하여 배치되는, 자동 분리 시스템.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   각각의 노즐에는 슬라이드 이젝터(slide ejector)가 제공되는, 자동 분리 시스템.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   각각의 피펫 팁 컬럼은 적어도 약 20 mL의 액체 용량, 예를 들어 약 20 내지 약 40 mL 범위의 액체를 수용할 수 있는, 자동 분리 시스템.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   각각의 피펫 팁 컬럼은 균일하게 테이퍼를 이루고, 상기 피펫 팁 컬럼의 내면과 상기 노즐 사이에 긴밀한 시일을 제공하도록 배치되는, 자동 분리 시스템.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   각각의 노즐과 피펫 팁 컬럼 사이의 시일은 5% 미만의 압력 또는 진공 손실로 5 분 이상 동안 압력 또는 진공 실링을 유지하도록 배치되는, 자동 분리 시스템.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   각각의 피펫 팁 컬럼은 약 50N 내지 약 160N 범위의 힘을 사용하여 노즐에 장착가능한, 자동 분리 시스템.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   각각의 피펫 팁 컬럼은 약 50N 내지 약 160N 범위의 힘을 사용하여 방출에 의해 해방가능한, 자동 분리 시스템.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 피펫 팁 컬럼(들)에 압력을 적용하기 위한 수단은 전기 모터에 의해 제공되는, 자동 분리 시스템.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2 개의 독립적으로 배치되는 피펫 팁 컬럼, 예들 들어 2 개 내지 4 개의 컬럼을 포함하는, 자동 분리 시스템.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 피펫 팁 컬럼은 충전된 분리 매질을 포함하는, 자동 분리 시스템.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리 매질은 크로마토그래피 매질, 고상 추출물(SPE) 매질 및 지지 액체 추출물(SLE) 매질로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 자동 분리 시스템.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자를 분리하는 방법으로서,
    상기 샘플은 각각의 이와 같은 피펫 팁 컬럼 내로 흡인되고; 상기 흡인된 액체 샘플의 생체분자는 일정 시간 동안 상기 분리 매질과 반응하도록 허용되고; 임의의 미반응 생체분자를 포함하는 상기 액체 샘플은 상기 피펫 팁 컬럼으로부터 분배되는, 생체분자의 분리 방법.
14. 제 13 항에 있어서,
    각각의 충전된 피펫 팁 컬럼 내로 용출액을 흡인하는 단계; 상기 용출액이 상기 분리 매질로부터 생체분자를 방출하게 하는 단계; 및 상기 피펫 팁 컬럼으로부터 방출된 생체분자를 포함하는 상기 용출액을 분배하는 단계를 더 포함하는, 생체분자의 분리 방법.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    분리된 생체분자는 단백질; 펩타이드; 선형 DNA, 선형 RNA 또는 플라스미드 등의 핵산; 또는 이들의 프래그먼트(fragment) 또는 퓨전(fusion)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 생체분자의 분리 방법.
16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 노즐의 그 각각의 피펫 팁 컬럼에 대한 실링을 실질적으로 손상시키지 않으면서 상기 컬럼에 3-5 psi, 예를 들어 4-5 psi의 양의 압력이 가해지는, 생체분자의 분리 방법.
17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 분리 시스템을 사용하여 액체 샘플로부터 생체분자를 분리하기 위한 키트로서,
    상기 키트는 20-40 mL의 피펫 팁 컬럼 충전된 크로마토그래피 매질, 지지 액체 추출물(SLE) 매질 또는 고상 추출물(SPE) 매질, 및, 별개의 구획실 내에, 이러한 분리를 수행하기 위한 설명서를 포함하는, 생체분자 분리 키트.
18. 제 17 항에 있어서,
    상기 키트는, 별개의 구획실 내에, 하나 이상의 평형화 완충액; 세척액; 및 용출액을 포함하는, 생체분자 분리 키트.

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