CN115144580A - 基于NanoSPR技术的生物传感芯片及其在检测基因递送载体上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于NanoSPR技术的生物传感芯片及其在检测基因递送载体上的应用，属于基因递送载体的定性定量检测技术领域。本发明提供的生物传感芯片包括基片和修饰在基片上的蛋白、抗体或功能基团；基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和金膜，基底表面矩阵排列有纳米孔；钛膜的厚度为2‑30nm，银膜的厚度为5‑100nm，金膜的厚度为2‑100nm；蛋白、抗体或功能基团具体是指与基因递送载体特异性结合的蛋白、抗体或功能基团，基因递送载体是指病毒载体(如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等)和非病毒载体(脂质纳米颗粒、外泌体等)。本发明还提供了上述芯片的修饰方法，以及应用方法，检测灵敏度高，检测速度快且高通量，可用于基因递送领域的高通量定量或筛选质控。

Description

基于NanoSPR技术的生物传感芯片及其在检测基因递送载体 上的应用
技术领域
本发明属于基因递送载体定性定量检测技术领域，特别是基于NanoSPR技术的快速检测基因递送载体的方法。
背景技术
基因递送载体是一种用于装配目的基因并将其导入到靶细胞或相应的宿主细胞中，使目的基因进行表达所必须的介质，常见的基因递送载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和非病毒载体(例如脂质纳米颗粒LNP、外泌体等)。腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种没有包膜的直径为70-90nm的颗粒，是一种最常见的基因递送载体。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患，不同血清型也可引起同一种疾患。
纳米等离子芯片技术(NanoSPR)不同于等离子芯片技术(SPR)和局部表面等离子体共振技术(LSPR)两种技术模式，由于其独特的三维结构，不同于平面模型的SPR效应，也不同于金属纳米颗粒的LSPR效应，可以同时支持SPR与LSPR两种模式。
纳米孔阵列生物传感器的等离子共振效应可以直接入射到纳米孔金属结构，表面光场立即激发，因此不需要复杂的光路和大型光学仪器的支持。NanoSPR技术既保留了传统SPR传感器的实时、无需标记、无背景干扰、高分辨率等诸多优点，又保留了LSPR传感器在性能改造上的优势；通过对纳米孔阵列的孔径、深度、形状、周期以及表面金属的类型、厚度等参数的调节，选择出可以捕捉到存在LSPR最强信号的高品质芯片，无需大型光谱仪也可以得到更强的信号。
现有技术中，美国授权专利US8158343B2“检测病毒相关免疫标志物用于诊断呼吸道感染的方法”中，提到了可以利用SPR生物传感器芯片定性检测血清样品中呼吸道病毒(例如人Parainfluenza病毒1、人Parainfluenza病毒2、人Parainfluenza病毒3、呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B和腺病毒)相关蛋白。然而，采用普通的SPR技术方法检测腺病毒，步骤繁琐，耗时较长，灵敏度也有待提高。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种基于NanoSPR技术的生物传感芯片及其在检测基因递送载体上的应用，发明了一种能够快速检测基因递送载体的生物传感芯片，具有较高的检测灵敏度，采用该生物传感芯片检测腺病毒等基因递送载体具有高通量、耗时短，检测结果准确等优点。具体通过以下技术实现。
基于NanoSPR技术的生物传感芯片，包括基片和修饰在所述基片上的蛋白、抗体或功能基团；所述基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和金膜，所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述纳米孔直径为50-800nm，高度为100-800nm，相邻两个所述纳米孔的间距为200-1000nm；所述钛膜的厚度为2-30nm，所述银膜的厚度为5-100nm，所述金膜的厚度为2-100nm；所述蛋白、抗体或功能基团具体是指与基因递送载体特异性结合的蛋白、抗体或功能基团。例如CAR蛋白(可以结合腺病毒的柯萨奇病毒腺病毒受体)、Fx蛋白(即FactorX凝血因子)、腺病毒六邻体蛋白抗体、腺相关病毒受体(AAVR)、生物素化肝素；可以结合慢病毒(HIV-1)的P24衣壳蛋白抗体，慢病毒细胞结合受体蛋白等；可以结合外泌体的CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27抗体等。所述基因递送载体是指病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等)和非病毒载体(脂质纳米颗粒LNP、外泌体等)；功能基团为可以结合带电荷的脂质纳米颗粒的阴离子、阳离子或两性离子基团。
优选地，所述钛膜的厚度为15nm，所述银膜的厚度为70nm，所述金膜的厚度为20nm。
本发明还提供了上述基于NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，包括以下步骤：
S1、清洗所述基片，滴加5-50μg/ml CAR蛋白和/或Fx蛋白溶液1-50μl；4-37℃孵育1.5-24h，再用PBST溶液多次清洗已包被CAR蛋白和/或Fx蛋白的基片，
S2、在步骤S1所得基片表面滴加封闭液，25-37℃孵育1-4h，去除多余封闭液；
S3、在步骤S2所得基片表面滴加保护液，25-37℃孵育0.5-1h，去除多余保护液，干燥后制得生物传感芯片。
所述封闭液是将牛血清白蛋白溶解于CBS溶液中配制而成的浓度10μg/ml的复合液；所述CBS溶液中含有碳酸钾4-6g/L、碳酸氢钠7.5-10g/L、防腐剂Proclin300 2.5-5ml/L；
所述保护液是将糖类溶解于PBST溶液中配制而成的浓度10-200μg/ml的复合液；所述糖类为葡聚糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种；
优选地，所述PBST溶液中含有十二水磷酸氢二钠2-3g/L、磷酸二氢钠0.2-0.5g/L、氯化钾0.1-0.3g/L、氯化钠6-8g/L、Tween-20 0.5-1ml/L、防腐剂Proclin300 0.5-1ml/L。
本发明还提供了一种芯片微孔板，该芯片微孔板集成了上述生物传感芯片。该芯片微孔板可以选用1孔…48孔、96孔等各种不同种类的微孔板。
本发明还提供了一种基因递送载体的检测试剂盒，该试剂盒包括上述生物传感芯片，或者包括上述芯片微孔板。该试剂盒可以基于不同的检测方法(无标记检测、夹心法)，配备其他不同的试剂。
优选地，上述检测试剂盒还包括洗涤液、基因递送载体纯化参考品、胶体金溶液、基因递送载体样品。基因递送载体抗体、CAR蛋白和/或Fx蛋白分别能在基因递送载体的不同表位与之结合。
利用上述芯片微孔板或检测试剂盒检测待测样品中的基因递送载体浓度的第一种使用方法，该方法不需要使用胶体金等发光试剂，而是直接将芯片微孔板插入全光谱酶标仪中进行检测，对基因递送载体检测具有非常好的灵敏度和特异性，具体方法为：
P1、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～50μL洗涤液，放入酶标仪中，记录初始值，然后弃去孔内液体；
P2、用稀释液稀释获得不同浓度的基因递送载体纯化参考标准品，每个孔中分别加入30-200μl不同稀释倍数的稀释样本加入孔中，振板反应，弃去孔内液体；
P3、再向芯片微孔板的每孔中分别加入100-200μl洗涤液，洗板、拍板、甩干；振板反应后放入酶标仪中，记录终点值，绘制标准曲线；
P4、另取按照步骤P1操作后的新的芯片微孔板，重复按照步骤P2-P4的操作方法在芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl稀释后的待测样本，再次记录终点值，对照标准曲线进行读取，即可得到待测样本的浓度。
利用上述芯片微孔板或检测试剂盒检测待测样品中的基因递送载体浓度的第二种使用方法，该方法需要先使用胶体金等发光试剂结合芯片上的CAR蛋白、Fx蛋白、腺病毒六邻体蛋白抗体、生物素化肝素等能够与基因递送载体特意结合的化合物，然后再将芯片微孔板插入全光谱酶标仪中进行检测，对基因递送载体检测具有非常好的灵敏度和特异性，具体方法为：
Q1、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～50μL洗涤液，放入酶标仪中，记录初始值，然后弃去孔内液体；
Q2、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl基因递送载体纯化参考品，振板反应0.5-1h，弃去孔内液体；
Q3、向芯片微孔板的每孔中分别加入100-200μl洗涤液，洗板、拍板、甩干；
Q4、在经步骤P3处理后的芯片微孔板的每孔中分别加入30-50μl稀释后的胶体金溶液，以500-700rpm的转速振板反应5-15min，放入酶标仪中，记录终点值，绘制标准曲线；
Q5、另取按照步骤P1操作后的新的芯片微孔板，向芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl稀释后的待测样本，重复步骤P2-P4的操作方法，再次记录终点值，对照标准曲线进行读取，即可得到待测样本的浓度。
上述这两种检测方法，所用的待测样本可以从人或动物的血清中采集，也可以应用在生产制备以基因递送载体为载体的疫苗或生物制剂等试剂中，用以检测基因递送载体浓度。因此不论是以诊断、治疗为目的，还是以非诊断、治疗为目的，都可以采用上述方法对基因递送载体进行定性和定量检测，并具有非常好的灵敏度和特异性。
稀释基因递送载体纯化参考品或待测样本的稀释液可以选用常见的Hanksbuffer、PBS buffer或Tris buffer溶液，且里面还含有0.5-4％蔗糖或葡萄糖，还含有0.02-2.5％PEG、0.03-0.1％P300，pH值5-8。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明基于NanoSPR技术，提供了一种能够用于检测基因递送载体的生物传感芯片，还提供了一种集成了上述生物传感芯片的芯片微孔板，还提供了相应的检测试剂盒。采用本发明提供的生物传感芯片、芯片微孔板和检测试剂盒，只需要一步即可完成基因递送载体的检测，检测灵敏度高，检测速度快且高通量，可用于基因递送领域的高通量定量或筛选质控。
附图说明
图1为实施例1中7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的检测全光谱图；
图2为基于图1获得的7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的OD值；
图3为实施例1获得的标准曲线；
图4为实施例2中7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的检测全光谱图；
图5为基于图4获得的7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的OD值；
图6为实施例3中7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的检测全光谱图；
图7为基于图6获得的7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的OD值；
图8为实施例3获得的标准曲线；
图9为实施例4中7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的检测全光谱图；
图10为基于图8获得的7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的OD值；
图11为实施例4获得的标准曲线；
图12为实施例5中7个浓度梯度的外泌体纯化参考品的检测全光谱图；
图13为基于图10获得的7个浓度梯度的外泌体纯化参考品的OD值；
图14为实施例5获得的标准曲线；
图15为实施例6中7个浓度梯度的外泌体纯化参考品的检测全光谱图；
图16为基于图12获得的7个浓度梯度的外泌体纯化参考品的OD值；图17为实施例6获得的标准曲线；
图18为对比例1中7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的检测全光谱图；
图19为基于图15获得的7个浓度梯度的腺病毒纯化参考品的OD值；
图20为对比例1获得的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例中，所用的柯萨奇病毒腺病毒受体(CAR蛋白)采购自北京百普赛斯生物科技有限公司，FactorX凝血因子(Fx蛋白)、CD9抗体、CD63抗体采购自北京义翘神舟公司；牛血清白蛋白采购自武汉千泽穗生物科技有限公司；保护液是将蔗糖溶解在PBST溶液中配制而成，浓度为100μg/ml。所用的CAR蛋白、Fx蛋白溶液是将上述CAR蛋白、Fx蛋白用CBS溶液稀释至相应的浓度后制备而成。
PBST溶液的原料和配制方法为：十二水磷酸氢二钠2.5g/L、磷酸二氢钠0.3g/L、氯化钾0.2g/L、氯化钠7.5g/L、Tween-20 0.8ml/L、防腐剂Proclin300 0.8ml/L，加双蒸水混合搅拌均匀即可。
CBS溶液由碳酸钾5.5g/L、碳酸氢钠8.5g/L、防腐剂Proclin300 4ml/L，加纯化水混合搅拌配制而成。
洗涤液选用PBST溶液；腺病毒纯化参考品采购自山东维真生物科技有限公司；外泌体纯化参考品采购自和元生物技术(上海)股份有限公司。
实施例1：使用CAR蛋白包被芯片微孔板进行一步式无标记法检测腺病毒
本实施例中，纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板(96孔)的制备方法为：(1)在氧化硅片上进行光刻即可制作出纳米孔模具；(2)通过纳米压印方法将12寸硅晶圆纳米模具上的纳米结构转印到高分子柔性材料基底(PET薄板基底)上形成反相的晶圆级纳米器件结构；(3)在其表面依次镀上钛膜层(厚度为15nm)、银膜层(厚度为70nm)、金膜层(厚度为20nm)，即变为集成了等离子体传感芯片基片的96孔芯片微孔板；
1、修饰制备生物传感芯片
(1)清洗芯片微孔板基片，每个孔滴加10μg/ml CAR蛋白溶液50μl；37℃孵育12h，再用PBST溶液多次清洗已包被CAR蛋白的基片；
(2)以150μl/孔的用量在基片表面滴加封闭液，37℃烘箱中孵育1h，用PBST溶液清洗去除多余封闭液；
(3)以150μl/孔的用量滴加保护液，37℃烘箱中孵育30min，用PBST溶液清洗去除多余保护液，继续在37℃烘箱中放置10min，保证芯片表面干燥后，制得生物传感芯片。
2、无标记法检测标准样本绘制标准曲线
(1)使用移液器向96微孔芯片板的每孔中分别加入150μl PBST溶液清洗三次，再加入50μl PBST溶液，放入酶标仪中，记录初始值，弃去孔内液体；
(2)用稀释液稀释不同浓度的腺病毒纯化参考品，取50μl稀释样本加入孔中，37°振板反应30分钟，弃去孔内液体；
稀释液配方为1％NaCl、0.8％蔗糖、2.5％PEG、0.1％P300，pH值＝5.3；腺病毒纯化参考品稀释后的浓度为：3×106、6.26×106、12.5×106、25×106、50×106、100×106、200×106TCID50/ml这7个浓度梯度(4倍浓度稀释)，稀释液作为空白对照；
(3)再向芯片微孔板的每孔中分别加入150μl PBST溶液洗板、拍板、甩干，重复清洗三次；此时将上述7个浓度梯度的芯片微孔板(未加入胶体金)送入全光谱酶标仪中，获得相应的全光谱图和OD值，如图1、2所示；绘制标准曲线，如图3所示。标准曲线方程为Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；A＝0.21105，B＝-1.02018，C＝12.66572，D＝-0.00074，r2＝0.99938。
图1中，横坐标为光的波长，纵坐标为吸光度。图2中，横坐标为不同的浓度梯度，纵坐标为OD值，图2的OD值为图1中每个稀释浓度的腺病毒纯化参考品的曲线波峰与波谷的差值；图3为标准曲线。
实施例2：使用Fx蛋白包被芯片微孔板进行无标记法检测
本实施例与实施例1的方法步骤基本相同，唯一区别在于，将修饰制备生物传感芯片的抗体用Fx蛋白替换了实施例1的CAR蛋白；并且腺病毒纯化参考品的稀释浓度为0.245×104、0.98×104、3.9×104、15.6×104、62.5×104、250×104、1000×104TCID50/ml，稀释液作为空白对照。
所获得的7个浓度梯度的芯片微孔板(未加入胶体金)送入全光谱酶标仪中，获得相应的全光谱图和OD值如图4、5所示。
实施例3：使用Fx蛋白包被芯片微孔板进行夹心法检测
本实施例中修饰制备生物传感芯片，以及制备纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板(96孔)的方法，与实施例1相同；唯一区别是将修饰制备生物传感芯片的抗体用Fx蛋白替换了实施例1的CAR蛋白；
(1)与实施例1的步骤(1)相同；
(2)与实施例1的步骤(2)相同；稀释浓度为0.245×104、0.98×104、3.9×104、15.6×104、62.5×104、250×104、1000×104TCID50/ml这7个浓度梯度(4倍浓度稀释)，稀释液作为空白对照；
(3)向芯片微孔板的每孔中分别加入100-200μl洗涤液，洗板、拍板、甩干；
(4)在芯片微孔板的每孔中分别加入30μl稀释后的胶体金溶液(25μl PBST溶液溶解5μl金颗粒)，以700rpm的转速振板反应15min；此时将上述7个浓度梯度的芯片微孔板(加入胶体金)送入中，获得相应的全光谱图和OD值，如图6、7所示；将芯片微孔板放入酶标仪中，记录终点值。绘制标准曲线，如图8所示。标准曲线方程为Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；A＝0.90862，B＝-1.69968，C＝4867.44126，D＝0.41422，r2＝0.99097。
实施例4：腺病毒六邻体蛋白抗体包被芯片微孔板进行夹心法检测
本实施例与实施例3的方法步骤基本相同，唯一区别在于，将Fx蛋白替换成腺病毒六邻体蛋白抗体(Abcam)。
所获得的7个浓度梯度的芯片微孔板(加入胶体金)送入全光谱酶标仪中，获得相应的全光谱图和OD值如图9、10所示。所获得的标准曲线方程如图11所示，标准曲线方程为Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；A＝0.17102，B＝-0.48030，C＝25.24172，D＝-0.00144，r2＝0.98987。
实施例5：使用CD9抗体包被芯片微孔板进行一步式无标记法检测外泌体
本实施例中，纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板(96孔)的制备方法为：(1)在氧化硅片上进行光刻即可制作出纳米孔模具；(2)通过纳米压印方法将12寸硅晶圆纳米模具上的纳米结构转印到高分子柔性材料基底(PET薄板基底)上形成反相的晶圆级纳米器件结构；(3)在其表面依次镀上钛膜层(厚度为15nm)、银膜层(厚度为70nm)、金膜层(厚度为20nm)，即变为集成了等离子体传感芯片基片的96孔芯片微孔板；
1、修饰制备生物传感芯片
(1)清洗芯片微孔板基片，每个孔滴加15μg/ml CD9抗体溶液50μl；37℃孵育12h，再用PBST溶液多次清洗已包被CD9抗体的基片；
(2)以150μl/孔的用量在基片表面滴加封闭液，37℃烘箱中孵育1h，用PBST溶液清洗去除多余封闭液；
(3)以150μl/孔的用量滴加保护液，37℃烘箱中孵育30min，用PBST溶液清洗去除多余保护液，继续在37℃烘箱中放置10min，保证芯片表面干燥后，制得生物传感芯片。
2、一步式无标记法检测外泌体纯化标准样本并绘制标准曲线
用稀释液稀释不同浓度的外泌体纯化参考品，取50μl稀释样本加入孔中，立即放入酶标仪中进行动力学检测，检测时间5min；
稀释液配方为PBST溶液、0.5％蔗糖、4％PEG、0.5％P300，pH值＝7.4；外泌体纯化参考品稀释后的浓度为：1.0×108、0.5×108、0.25×108、0.125×108、0.0625×108、0.03125×108、0.015625×108exosomes/mL这7个浓度梯度(2倍浓度稀释)，稀释液作为空白对照；
获得相应的动力学图和OD值柱状图，如图12、13所示；绘制标准曲线如图14所示，方程为Y＝A+(B-A)/[1+e^(-a*x+b)]；A＝-0.05406，B＝0.07984，a＝7.65925，b＝0.47089，r2＝0.99905。
实施例6：使用CD9抗体包被芯片微孔板，CD63抗体标记胶体金进行夹心法检测外泌体
本实施例中修饰制备生物传感芯片，以及制备纳米等离子共振生物芯片的芯片微孔板(96孔)的方法，与实施例5相同；唯一区别在于，加入样本检测的同时加入CD63抗体标记的胶体金溶液5ul；
用稀释液稀释不同浓度的外泌体纯化参考品，取50μl稀释样本加入孔中，同时加入5ul CD63抗体标记的胶体金溶液，立即放入酶标仪中进行动力学检测，检测时间5min；
稀释液配方为PBST溶液、0.5％蔗糖、4％PEG、0.0.5％P300，pH值＝7.4；外泌体纯化参考品稀释后的浓度为：1.0×106、0.5×106、0.25×106、0.125×106、0.0625×106、0.03125×106、0.015625×106exosomes/mL这7个浓度梯度(2倍浓度稀释)，稀释液作为空白对照；
获得相应的动力学图和OD值柱状图，如图15、16所示；绘制标准曲线，如图17所示。标准曲线方程为Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；A＝0.29959，B＝-1.17405，C＝0.12844，D＝-0.01748，r2＝0.99660。采用本实施例的夹心法的检测灵敏度可以提高两个数量级。
对比例1：替换稀释腺病毒标准品的稀释液，进行夹心法检测
本实施例与实施例2的方法步骤基本相同，唯一区别在于，将稀释腺病毒标准品的稀释液配方替换成10mM Tris、0.02％PEG20000、0.03％P300；并且腺病毒标准品的稀释浓度为0.25×100、1×100、4×100、16×100、64×100、250×100、1000×100TCID50/ml。
夹心法检测结果：所获得的7个浓度梯度的芯片微孔板放入酶标仪中，获得相应的全光谱图和OD值如图18、19所示。所获得的标准曲线方程如图20所示，标准曲线方程为，Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D；A＝0.17102，B＝-0.48030，C＝25.24172，D＝-0.00144，r2＝0.98987。
通过上述实施例1-5的检测结果，可以得知，当选用CAR蛋白或Fx蛋白或腺病毒六邻体蛋白抗体包被芯片时，对腺病毒均具有非常高的准确度和特异性。

Claims (10)

1.基于NanoSPR技术的生物传感芯片，其特征在于，包括基片和修饰在所述基片上的蛋白、抗体或功能基团；所述基片从下至上依次包括基底、钛膜、银膜和金膜，所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述纳米孔直径为50-800nm，高度为100-800nm，相邻两个所述纳米孔的间距为200-1000nm；所述钛膜的厚度为2-30nm，所述银膜的厚度为5-100nm，所述金膜的厚度为2-100nm；所述蛋白、抗体或功能基团具体是指与基因递送载体特异性结合的蛋白、抗体或功能基团。
2.根据权利要求1所述的基于NanoSPR技术的生物传感芯片，其特征在于，所述钛膜的厚度为15nm，所述银膜的厚度为70nm，所述金膜的厚度为20nm。
3.权利要求1或2所述的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、清洗所述基片，滴加5-50μg/ml CAR蛋白和/或Fx蛋白溶液1-50μl；4-37℃孵育1.5-24h，再用PBST溶液多次清洗已包被CAR蛋白和/或Fx蛋白的基片；
S2、在步骤S1所得基片表面滴加封闭液，25-37℃孵育1-4h，去除多余封闭液；
S3、在步骤S2所得基片表面滴加保护液，25-37℃孵育0.5-1h，去除多余保护液，干燥后制得生物传感芯片。
4.根据权利要求3所述的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，所述封闭液是将牛血清白蛋白溶解于CBS溶液中配制而成的浓度10μg/ml的复合液；所述CBS溶液中含有碳酸钾4-6g/L、碳酸氢钠7.5-10g/L、防腐剂Proclin300 2.5-5ml/L；
所述保护液是将糖类溶解于PBST溶液中配制而成的浓度10-200μg/ml的复合液；所述糖类为葡聚糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种。
5.根据权利要求3或4所述的基于NanoSPR技术的生物传感芯片的修饰制备方法，其特征在于，所述PBST溶液中含有十二水磷酸氢二钠2-3g/L、磷酸二氢钠0.2-0.5g/L、氯化钾0.1-0.3g/L、氯化钠6-8g/L、Tween-20 0.5-1ml/L、防腐剂Proclin300 0.5-1ml/L。
6.一种集成了权利要求1或2所述的生物传感芯片的芯片微孔板。
7.一种基因递送载体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的生物传感芯片，或者包括权利要求6所述的芯片微孔板。
8.根据权利要求7所述的基因递送载体检测试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液、基因递送载体纯化参考品、胶体金溶液、基因递送载体样品。
9.一种不以诊断和治疗为目的的基因递送载体的检测方法，其特征在于，使用权利要求6所述的芯片微孔板，或者使用权利要求7或8所述的基因递送载体的检测试剂盒进行检测，具体步骤为：
P1、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～50μL洗涤液，放入酶标仪中，记录初始值，然后弃去孔内液体；
P2、用稀释液稀释获得不同浓度的基因递送载体纯化参考标准品，每个孔中分别加入30-200μl不同稀释倍数的稀释样本加入孔中，振板反应，弃去孔内液体；
P3、再向芯片微孔板的每孔中分别加入100-200μl洗涤液，洗板、拍板、甩干；振板反应后放入酶标仪中，记录终点值，绘制标准曲线；
P4、另取按照步骤P1操作后的新的芯片微孔板，重复按照步骤P2-P4的操作方法在芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl稀释后的待测样本，再次记录终点值，对照标准曲线进行读取，即可得到待测样本的浓度。
10.一种不以诊断和治疗为目的的基因递送载体的检测方法，其特征在于，使用权利要求6所述的芯片微孔板，或者使用权利要求7或8所述的基因递送载体的检测试剂盒进行检测，具体步骤为：
Q1、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～50μL洗涤液，放入酶标仪中，记录初始值，然后弃去孔内液体；
Q2、向芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl基因递送载体纯化参考品，振板反应0.5-1h，弃去孔内液体；
Q3、向芯片微孔板的每孔中分别加入100-200μl洗涤液，洗板、拍板、甩干；
Q4、在经步骤P3处理后的芯片微孔板的每孔中分别加入30-50μl稀释后的胶体金溶液，以500-700rpm的转速振板反应5-15min，放入酶标仪中，记录终点值，绘制标准曲线；
Q5、另取按照步骤P1操作后的新的芯片微孔板，向芯片微孔板的每孔中分别加入30～200μl稀释后的待测样本，重复步骤P2-P4的操作方法，再次记录终点值，对照标准曲线进行读取，即可得到待测样本的浓度。
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