CN115141896A - 一种AAV组织分布的qPCR检测方法 - Google Patents

一种AAV组织分布的qPCR检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115141896A
CN115141896A CN202210656821.5A CN202210656821A CN115141896A CN 115141896 A CN115141896 A CN 115141896A CN 202210656821 A CN202210656821 A CN 202210656821A CN 115141896 A CN115141896 A CN 115141896A
Authority
CN
China
Prior art keywords
qpcr
aav
standard
dna
detection method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210656821.5A
Other languages
English (en)
Inventor
郑竹霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Dingxin Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Dingxin Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Dingxin Gene Technology Co ltd filed Critical Shanghai Dingxin Gene Technology Co ltd
Priority to CN202210656821.5A priority Critical patent/CN115141896A/zh
Publication of CN115141896A publication Critical patent/CN115141896A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因治疗领域，涉及一种AAV生物分布qPCR检测方法。通过本发明的优化提供一种灵敏度高、特异性好并且准确可靠的AAV生物分布qPCR检测方法，用于基因治疗产品临床前生物分布研究。

Description

一种AAV组织分布的qPCR检测方法
技术领域
本发明属于基因治疗领域，针对由于Otof基因突变导致的先天遗传性耳聋疾病，使用双载体腺相关病毒（AAV）递送正常Otoferlin蛋白的表达基因，进行耳聋疾病治疗。在临床前实验动物上使用qPCR定量方法对实验动物组织内的AAV分布进行分析。
背景技术
耳是人体的重要器官，由外耳、中耳和内耳构成，其主要功能是感知声音和维持身体平衡。当耳功能异常时会导致一系列身体机能的病变，包括耳聋，耳鸣，眩晕等，每1000个新生婴儿中就有2位先天性耳聋，其中50-60%患者的耳聋均由基因突变引起。其中Otof基因编码了Otoferlin蛋白，是常见的引起耳聋的易突变基因之一。Otoferlin蛋白主要表达在耳蜗的内耳毛细胞中，主要作用是结合钙离子（Ca2+），并启动下游神经递质的释放。Otoferlin基因的突变就会导致神经递质的释放和膜融合过程的阻断，导致声音信号不能正常传递到大脑，从而导致耳聋。
基因治疗是指通过AAV将正常基因表达序列递送到靶组织，使得靶组织表达正常功能的蛋白，从而达到治疗的目的。但由于AAV的包装上限是4.7 kb，具有正常功能的Otoferlin编码核苷酸长度为6 kb，远超于AAV的包装上限，于是需要将Otoferlin编码核苷酸分成两段，用两个AAV载体去分别递送，并在体内实现这两段DNA的重组，形成一个完整的Otoferlin基因并进行表达。
AAV在进入动物和人体后，对组织有不同程度的感染。在靶向组织中的感染，是实现表达和治疗的前提。而在非靶向组织中的感染，可能会引起AAV本身及其表达产物带来的毒性。为了验证AAV在体内的去向，组织分布检测是其重要一步。在本发明中，开发了一种特异性，灵敏性高的AAV基因分布qPCR检测方法。
发明内容
本发明涉及一种Otof基因AAV双载体递送中N端AAV部分片段（SEQ ID NO.1）在组织中分布的qPCR检测方法，所述qPCR检测方法包含qPCR扩增体系，引物以及Taqman探针。
所述引物为SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3。
所述Taqman探针序列为SEQ ID NO.4，探针5’修饰为FAM，探针3’修饰为BHQ1。
所述qPCR扩增体系可以是商业化的也可以是自行开发的扩增试剂，主要包含DNA聚合酶，dNTP，镁离子等成分。优选地，qPCR扩增体系选自Applied Biosystems™ TaqMan™Universal PCR 预混液（货号为4304437）或AceTaq® DNA Polymerase（货号为Q112-02）。
附图说明：
图1 TaqMan Universal PCR Master Mix(4304437)检测准确度和灵敏度
图2AceQ qPCR Probe Master Mix (Q112-02)检测准确度和灵敏度
图3 将梯度浓度标样Spike in到小鼠肝脏gDNA制作标曲得到的检测灵敏度和准确度
图4 将梯度浓度标样Spike in到大鼠肝脏gDNA制作标曲得到的检测灵敏度和准确度
图5 使用AceQ qPCR Probe Master Mix (Q112-02)扩增的基质效应检测
图6 实验小鼠组织AAV分布检测实例
具体实施方式：
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明中的qPCR体系可用于检测Otof基因递送到组织中的检测，涉及的包装和递送系统可以是病毒类载体包括腺病毒，腺相关病毒等，也可以是非病毒类载体，包括脂质纳米颗粒等。
优选地，本发明中递送的载体为AAV病毒，递送的目标组织为耳蜗。
本发明中的qPCR体系可用于检测Otof基因递送到细胞中的检测，进入到细胞中的Otof基因通过各类病毒类载体递送，包括腺病毒，腺相关病毒等，也可以是非病毒载体，包括脂质纳米颗粒等，也可以是质粒。细胞类型可以是原代细胞，例如分离自大鼠或小鼠的原代神经细胞，也可以是细胞系，例如HEK-293T细胞。
以下结合具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1 探针引物扩增灵敏度和特异性验证使用TaqMan Universal PCRMaster Mix(4304437)，将梯度浓度的标准品质粒加入到小鼠和猴的肝脏基因组DNA里检查和验证扩增体系的特异性和灵敏度。使用的标准品质粒利用KpnI酶切后用DNA回收试剂盒纯化，并用NanoDropTM超微量分光光度计定量，按照质粒质量=质粒个数/阿伏伽德罗常数*质粒摩尔质量的换算方式计算质粒个数（之后的实施例都按此方法计算），计算结果如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
空白标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒。小鼠肝脏样品标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒，并加入200ng小鼠肝脏DNA。猴肝脏样品标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒，并加入200ng猴肝脏DNA。如无特殊说明，本发明qPCR体系实施例中相同条件的实验重复数为3。
按照以下qPCR扩增体系配制：本发明体系中正向引物序列为SEQ ID NO.2，正向引物序列为SEQ ID NO.3，taqman探针引物序列为正向引物序列为SEQ ID NO.4,扩增产物为SEQ ID NO.1。
Template: Sample/standard 2μl
正向引物 (10μM) 0.4 μl
反向引物(10μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.4 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μl
RT-PCR grade H2O 6.6 μl
Total 20 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号。
扩增检测结果如图1所示：
使用AceQ qPCR Probe Master Mix (Q112-02)，将梯度浓度的线性化标准品质粒加入到大鼠的肝脏基因组DNA里检查和验证扩增体系的特异性和灵敏度。
空白标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒。小鼠肝脏样品标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒，并加入200ng小鼠肝脏DNA。
按照以下qPCR扩增体系配制：
Template: Sample/standard 2.5 μl
正向引物 (10μM) 0.4 μl
反向引物(10μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.5 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5 μl
RT-PCR grade H2O 8.25 μl
Total 25 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号，扩增结果如图2所示。
使用AceQ qPCR Probe Master Mix (Q112-02)，将梯度浓度的线性化标准品质粒加入 到大鼠的肝脏基因组DNA里检查和验证扩增体系的特异性和灵敏度。
空白标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒。大鼠肝脏样品标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒，并加入200ng大鼠肝脏DNA。
按照以下qPCR扩增体系配制：
Template: Sample/standard 2 μl
正向引物 (10μM) 0.4 μl
反向引物(10μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.4 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μl
RT-PCR grade H2O 6.6 μl
Total 20 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号，扩增结果如下图所示扩增检测结果如下图3：
结论：用筛选的针对Otoflin N端的引物和探针使用AceQ qPCR Probe MasterMix (Q112-02)体系进行扩增显示将梯度浓度标样质粒spike in到大鼠基因组里，通过纯的质粒标样做标曲来定量基因组里的已知浓度靶序列，显示肝脏基因组对扩增定量结果有比较大的影响，定量偏差>25%。
实施例2 探针引物扩增特异性验证，准确性及基质效应验证
标准曲线组：将梯度浓度的线性化标准质粒1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个分别加入到标准曲线的反应孔中，并加入200ng小鼠肝脏DNA。
验证实验组：将线性化标准品质粒1e8，4e6，4e4，4e2，1e1，分别加入QC验证实验组中，并加入200ng 猴肝脏gDNA。
按照以下qPCR扩增体系配制：
Template: Sample/standard 2.5 μl
正向引物 (10μM) 0.4 μl
反向引物(10μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.5 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5 μl
RT-PCR grade H2O 8.25 μl
Total 25 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号，扩增结果如图4所示
通过将梯度浓度质粒标样加入至小鼠肝脏基因组DNA中做标曲，来定量检测小鼠肝脏基因组DNA中已知浓度靶序列，使用AceQ qPCR Probe Master Mix (Q112-02)进行扩增检测，结果显示已优化的探针序列用当前qPCR体系检测回收率结果偏差<25%（最低点<45%）。
标准曲线中的qPCR反应组中加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒。基质选择性验证实验组中，加入将线性化标准品质粒1e7，1e6，1e5个分别加入到反应的体系中并额外分别加入200ng 大鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺，肾，性腺，脑和眼的DNA。
按照以下qPCR扩增体系配制：
Template: Sample/standard 2 μl
正向引物 (10 μM) 0.4 μl
反向引物(10 μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.4 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μl
RT-PCR grade H2O 6.6 μl
Total 20 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号，检测结果如图5所示。同肝脏基因组DNA里检测到的AAV回收率相比，其它各组织检测到的AAV回收率基本在25%以内，其它组织对扩增无明显干扰。
实施例3 实验小鼠组织AAV分布检测
为了检验小鼠中组织分布的情况，5e13个AAV通过圆窗注射的方式注射到了6个月大小鼠耳蜗中。7天后，杀死小鼠并对淋巴，胰腺，胸腺，肝脏，脾脏，肺，肾，性腺和脑取材，提取组织中的DNA。
标准曲线中的qPCR反应组中分别加入1e8，1e7，1e6，1e5，1e4，1e3，1e2，1e1个线性化标准品质粒，并加入200ng小鼠肝脏DNA。检测样品为之前提取的DNA，并稀释至200ng/μl。按照以下qPCR扩增体系配制：
Template: Sample/standard 2 μl
正向引物 (10μM) 0.4 μl
反向引物(10μM) 0.4 μl
taqman探针(10μM) 0.2 μl
Rox dye(type II） 0.4 μl
AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μl
RT-PCR grade H2O 6.6 μl
Total 20 μl
并按照95℃5分钟，（95℃ 15s，60℃ 30s）*40 的qPCR程序进行反应，在每个60℃结束后读取荧光信号，扩增结果如图6所示。5E10 个AAV病毒通过小鼠耳蜗注射，7天后检测的组织分布结果显示在肝脏和大脑组织中AAV分布较高。
序列表
<110> 上海鼎新基因科技有限公司
<120> 一种AAV 组织分布的qPCR检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgaggctgt gccagaactt cctgcagaag ctgcgcttcc tggcggacga ggtaagtatc 60
aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 120
ctcttgcgtt tctgggattt tgc 143
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgaggctgt gccagaact 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaaaatccc agaaacgcaa gag 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctggcgga cgaggtaagt atcaagg 27

Claims (6)

1.一种检测SEQ ID NO.1的qPCR定量检测方法，其特征在于引物所选为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；taqman探针序列为SEQ ID NO.3，taqman探针5’端修饰为FAM，3’端修饰为BHQ1。
2.如权利要求1所述的qPCR体系可用于组织和细胞的qPCR检测。
3.如权利要求2所述的qPCR体系可用于小鼠，大鼠，猴及人样品中的检测。
4.如权利要求3所述的qPCR体系可用于小鼠，大鼠及猴样品中的检测。
5.如权利要求4所述的qPCR体系检测的组织是心，肝，脾，肺，肾，胸腺，淋巴结，胰腺和脑。
6.如权利要求2所述的qPCR体系可用于细胞的qPCR检测。
CN202210656821.5A 2022-09-04 2022-09-04 一种AAV组织分布的qPCR检测方法 Pending CN115141896A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210656821.5A CN115141896A (zh) 2022-09-04 2022-09-04 一种AAV组织分布的qPCR检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210656821.5A CN115141896A (zh) 2022-09-04 2022-09-04 一种AAV组织分布的qPCR检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115141896A true CN115141896A (zh) 2022-10-04

Family

ID=83408913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210656821.5A Pending CN115141896A (zh) 2022-09-04 2022-09-04 一种AAV组织分布的qPCR检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115141896A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115651927B (zh) 编辑rna的方法和组合物
KR20230002401A (ko) C9orf72의 표적화를 위한 조성물 및 방법
EP3329013B1 (en) Methods of analyzing virus-derived therapeutics
CN109402132B (zh) 一种编码scn1a基因突变体的核酸及其应用
US11851648B2 (en) Humanized cell line
TW202113084A (zh) 用於選擇性基因調節的組合物和方法
WO2018093954A1 (en) Stem loop rna mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria
KR20210126680A (ko) 알파-1 항트립신 결핍증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
Yin et al. Enhanced genome editing to ameliorate a genetic metabolic liver disease through co-delivery of adeno-associated virus receptor
PT92506A (pt) Metodo para o enriquecimento e clonagem de dna contendo uma insercao ou correspondendo a uma delecao
Staskus et al. Initiation of DNA synthesis by the avian oncornavirus RNA-directed DNA polymerase: structural and functional localization of the major species of primer RNA on the oncornavirus genome
WO2021083073A1 (zh) 一种基于肝细胞Alb基因的疾病治疗的产品
US20220170910A1 (en) Multiplexing regulatory elements to identify cell-type specific regulatory elements
US20230310555A1 (en) Compositions for genome editing and methods of use thereof
CN115141896A (zh) 一种AAV组织分布的qPCR检测方法
CN111808862A (zh) 一种gaba能神经元特异性启动子及其应用
CN109337928B (zh) 通过过表达腺相关病毒受体提高基因治疗效率的方法
WO2022071890A1 (en) Guide rnas targeting sars-cov-2
KR20240042363A (ko) 뇌전증을 치료하기 위한 방법 및 조성물
Fairman et al. Quantitative RT-PCR to evaluate in vivo expression of multiple transgenes using a common intron
JP2023553422A (ja) ウイルスゲノムを切断するための組成物及び方法
JP2022553205A (ja) 選択的スプライシングを使用して遺伝子療法の特異性を制御するための組成物および方法
Rothgangl et al. Treatment of a genetic liver disease in mice through transient prime editor expression
CN109868288A (zh) 用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法
WO2024020114A2 (en) Genome insertions in cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination