CN115141771A - 一种复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种复合菌剂及其应用。本发明分离得到一种可降解石油的寡氮菌，其属于潘多拉菌属，本发明将其命名为潘多拉菌E5，其本身具备一定降解石油的能力。本发明进一步提供潘多拉菌E5和固氮菌PJ 3‑5的组合，将这两种菌株组合后，可以有效提高潘多拉菌E5降解石油的能力，具体在降解石油中的各类烷烃和芳香烃的效率上显著提高。本发明提供的潘多拉菌E5和固氮菌PJ 3‑5的互生组合可以实现氮素需求的供给，形成持续稳定的碳氮交互微环境，具备较高的石油降解效率，为石油污染的微生物修复技术提供优势菌种资源。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种复合菌剂及其应用。
背景技术
石油烃大量进入环境造成的C/N失衡已成为制约生物修复效率的关键因素之一。养分的可用性在决定碳氢化合物降解群落的性质方面起着重要作用，因此寻找这些外源氮肥的天然替代者，将成为未来生物修复的研究热点。微生物固氮是一种广泛应用的生物技术，作为无机氮改良的替代方法，并克服了修复过程中的营养缺乏等多种问题。将固氮菌引入污染土壤后，通过生物固氮作用可以为石油降解微生物提供所需的氮。固氮菌的这一特性使得此微生物群落适合于原位石油生物修复，而不需要补充外源氮素，是修复石油污染环境的优势菌种资源。
石油烃作为重要的能源物质，在开采或运输中造成环境问题。作为持久性的有机污染物对生态系统造成破坏。环境污染，预防为主，治理为辅，石油污染治理仍是重要关注问题。生物修复是符合绿色发展要求的技术手段，但同时也存在一定的局限，有效氮的相对缺乏是限制生物修复效率的一个重要因素。
发明内容
为了解决现有技术的技术问题，本发明提供一种复合菌剂及其应用，通过组合潘多拉菌E5和具有固氮能力的固氮菌，可以有效降解环境中的石油污染。
第一方面，本发明提供一种复合菌剂，所述复合菌剂包括：潘多拉菌E5和具有固氮能力的微生物。
潘多拉菌E5公开于“李方玲,张雅坤,梁立宝,王小通,杜显元,王磊.石油污染环境中固氮和寡氮营养细菌的分离鉴定及其特性.微生物学报,2022,62(2):661-671。是其中表3涉及的Pandoraea sp.E5。
进一步地，所述具有固氮能力的微生物为固氮菌PJ 3-5。
该微生物保藏编号为CGMCC No.14658，公开于专利CN201810298858.9。
本发明将在石油污染条件下具有高效固氮能力的固氮菌Klebsiella sp.PJ 3-5和能适应石油污染低氮环境的寡氮菌Pandoraea sp.E5进行复配，构建和培育适应贫氮环境的高效降解菌株组合，并探究生物修复主角-微生物的协作机制，为提高生物修复技术的应用效果打下基础。
进一步地，所述潘多拉菌E5和所述具有固氮能力的微生物的菌落数比为(1～3)：(1～3)。
进一步地，所述菌剂中，所述潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa)E5的菌落数为107～108cfu/g；和/或，所述具有固氮能力的微生物的菌落数为107～108cfu/g。
本发明进一步提供所述复合菌剂在促进固氮菌生长中的应用。
本发明进一步提供所述复合菌剂在降解石油中的应用。
本发明进一步提供所述的复合菌剂在降解C17-C36的长链烷烃和芳香烃中的应用。
本发明进一步提供所述的复合菌剂在石油污染土壤的修复中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明构建了两种固氮和寡氮石油降解菌(潘多拉菌E5)的互生组合，这一菌剂组合可以在无外加氮源的情况下仅依靠菌株之间的互作机制实现氮素需求的供给，形成持续稳定的碳氮交互微环境，补偿了氮限制，并消除了石油污染土壤生物修复中对外源氮的需要。本发明提供的菌剂组合可以高效促进石油的降解，对石油中的C17-C36和芳烃组分的去除率分别为46.56％和43.75％，为石油污染的微生物修复技术提供优势菌种资源。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的E5和PJ 3-5在单培养和共培养状态下的生长曲线示意图。
图2为本发明实施例2提供的E5和PJ 3-5在单培养或共培养状态下烷烃降解情况。
图3为本发明实施例2提供的寡氮菌E5和固氮菌PJ 3-5单培养或共培养状态下芳香烃降解情况。
图4为本发明实施例3提供的寡氮菌E5在外加氮源和组合固氮菌PJ 3-5的情况下的石油烃降解率。
图5为本发明实施例4提供的共培养状态下固氮菌PJ 3-5的固氮酶活情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的培养基的配方如下(均为配置1L培养基所需的量，其中固体培养基琼脂含量为15g/L)：
LB培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,去离子水1L，pH 7.0。
改良无氮培养基：K2HPO4 1g，FeSO4·7H2O 0.05g，CaCl2·2H2O0.1g，MgSO4·7H2O0.2g，Na2MoO4·2H2O 0.001g，葡萄糖10g，去离子水1L，pH 7.0。
无机盐培养基：向改良无氮培养基中添加0.7g(NH4)2SO4。
实施例1
固氮菌PJ 3-5和寡氮菌E5的最适生长培养基是LB培养基。在150rpm和30℃的条件下，富集培养至对数期后，8000rpm 5min离心收菌，并用无菌水洗涤3次，制成接种菌悬液。
将菌悬液单独接种或混合接种至三角瓶中，每个三角瓶中含有30mL以1％石油为唯一碳源的无氮液体培养基。调整每个菌株的初始细胞密度OD600为0.2。以不接菌的培养基为对照。
于1、3、5、7、9、15、17、20天，利用活菌计数法绘制菌株寡氮菌E5和固氮菌PJ 3-5在无氮源添加石油中的生长曲线。
1、全基因组DNA提取
使用北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(产品编号：DN1201)(如果样品中含有石油，需在收菌后用灭过菌的滤纸吸去石油，防止石油膜的存在影响DNA的提取效率)。所提取的DNA溶液取1μL用Nanodrop微量分光光度计测试浓度和纯度，剩余样品保存于-20℃冰箱中待用。
2、活菌计数(采用CFU计数)
培养1、3、5、7、9、15、17和20天后的菌液振荡混匀后取100μL至1.5mL EP管中，用无菌水按10倍梯度依次稀释至10-5；取100μL稀释后的菌液接种到相应的固体平板上，涂布均匀。每个样品设置3个平行。30℃培养箱培养，至形成可分辨菌落后计数。
结果表明：如图1所示，固氮菌PJ 3-5单培养处理7天后活菌数趋于0，而与寡氮菌E5复配后，可帮助固氮菌PJ 3-5在石油中稳定存在。同时，发现共培养后寡氮菌E5与固氮菌PJ 3-5菌落数在不同代谢阶段数量比呈现此消彼长的变化态势，表明共培养能够促进菌株生长，同时发现15天后共培养处理有明显的石油乳化效果。
实施例2共生组合石油降解率分析
将寡氮菌、固氮菌、固氮菌和寡氮菌组合分别接种于无氮源添加的1％石油污染物中，培养15天后，以正己烷为溶剂萃取石油中的烷烃，苯和二氯甲烷1:1作溶剂萃取石油中的芳香烃,之后利用气相色谱仪分析石油烃各组分降解情况。
培养基中残留石油的提取的流程如下：
(1)将摇床中培养至取样时间点的三角瓶取出，加入10mL正己烷抽提培养物中的石油，转移至50mL分液漏斗中；
(2)适量正己烷清洗三角瓶，将萃取液合并至分液漏斗中。充分震荡后静置，待有机相与水相完全分层后，弃掉下层水相，将上层有机相倒入干净平皿中；
(3)5mL正己烷充分润洗分液漏斗残余有机相；
(4)用枪头小心吸取有机相至离心管中，避开残余水相和杂质；
(5)将有机相定容至10mL，取1mL加入安捷伦进样瓶中，用于分析烷烃组分含量；
(6)再取1mL于安捷伦进样瓶中，干燥挥发掉正己烷溶剂后，加入苯和二氯甲烷1:1的有机溶剂，用于分析芳香烃组分含量。
气相色谱(GC)检测方法如下：
色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为N2。氢气30ml/min，空气250ml/min，氮气尾吹流量30ml/min。
烷烃程序：进样口温度为300℃，FID检测器温度为250℃，不分流。升温条件：起始温度50℃，保持5min，以40℃/min升温到230℃，以20℃/min升温到320℃，保持20min(自动进样1μL)。
芳香烃程序：进样口温度为250℃，FID检测器温度为300℃，不分流。升温条件：起始温度40℃，保持2min，以10℃/min升温到100℃，以15℃/min升温到250℃，以20℃/min升温到345℃，保持3.25min(自动进样1μL)。
表1E5和PJ 3-5单培养或共培养状态下石油烃降解率
结果表明：从图2可以看出，共培养处理对烷烃各组分的降解能力优于单培养，明确了寡氮菌E5和固氮菌PJ 3-5共培养模式能够促进烷烃降解。同时，以芳香烃峰型图展示寡氮菌E5和固氮菌PJ 3-5各处理培养15天后的芳香烃降解情况，共培养模式同样促进了对芳香烃的降解(图3)。寡氮菌E5和固氮菌PJ 3-5的协同微生物联合体实现了无氮源添加石油15天内的有效处理，对C17-C36和芳烃组分的去除率分别为46.56％和43.75％(表1)。
实施例3共生组合促进石油烃降解上的优势
本发明比较了在外加氮源和固氮菌PJ 3-5提供氮源的条件下寡氮菌E5的石油烃降解能力。
结果表明：培养15天后，固氮菌PJ 3-5提供氮源的条件下，寡氮菌E5烷烃和芳香烃降解率都高于外加氮源形式。其中外加氮源时烷烃降解率为33.68％，而固氮菌PJ 3-5供给氮源时，烷烃降解率提高到71.83％，具有显著差异(图4)。以上结果表明，固氮菌和寡氮菌的互生组合中，固氮菌不但可以有效改善低氮石油污染环境中的氮素水平，帮助寡氮菌E5更好的降解石油烃，并且其促进烷烃和芳香烃降解效率要高于外加氮源形式，推测互生组合中可能存在共代谢的促进或中心代谢上的交互。
实施例4互生组合中固氮菌固氮酶活性检测
1、固氮菌培养
(1)将固氮菌PJ 3-5分别单培养或者与寡氮菌寡氮菌E5共培养于三角瓶中。每个三角瓶中含有100mL无氮液体培养基，并添加1％石油为唯一碳源；
(2)于1、3、5、7、9、11、13、16、19天取菌液1mL于5mL的厌氧血清瓶中；
(3)利用气体置换装置，将血清瓶中的空气置换为惰性气体氩气；
(4)使用气体发生器，利用电石和水制备乙炔气体。用注射器向每个血清瓶中充入10％(V/V)乙炔，30℃培养24h后利用气相色谱仪测试血清瓶中的乙烯含量。
2、固氮酶活性测定(乙炔还原法)
(1)打开气体发生器(GCS-300)，首先打开H2和AIR开关，气体流量稳定在40mL/min时，打开N2开关使气体流量稳定在30mL/min后,开启气相色谱仪(GC522)；
(2)按气相色谱仪上的“起始”键，仪器逐渐升温，柱箱温度需升温至70℃；
(3)打开电脑软件,依次点击：online-通道1-数据采集-查看基线，此时基线平稳；
(4)待“准备”灯亮起后点火,此时基线突升,进行零点校准(每一次进样前都需要零点校准；
(5)使用微量进样器手动进样100μL，点击采集数据，出峰后记录峰面积和保留时间(乙烯出峰时间3min左右)；
固氮酶活(nmoL C2H4)的计算公式为：
结果表明：固氮酶活性动态检测中发现，固氮菌与寡氮菌复配后,固氮酶活在早期均高于单培养(图5)。虽然固氮菌PJ 3-5早期固氮酶活性不高(57nmol C2H4)，但呈现规律性的波动。第1-7天，固氮酶活性逐渐降低，第9天，第21天存在固氮酶活性回升现象，并且随着共培养时间的延长，其固氮酶活性明显高于初期。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂包括：潘多拉菌E5和具有固氮能力的微生物。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述具有固氮能力的微生物为固氮菌PJ 3-5。
3.根据权利要求1或2所述的复合菌剂，其特征在于，所述潘多拉菌E5和所述具有固氮能力的微生物的菌落数比为(1～3)：(1～3)。
4.根据权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa)E5的菌落数为107～108cfu/g；和/或，所述具有固氮能力的微生物的菌落数为107～108cfu/g。
5.权利要求1-4任一项所述的复合菌剂在促进固氮菌生长中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的复合菌剂在降解石油中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的复合菌剂在降解C17-C36的长链烷烃和芳香烃中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的复合菌剂在石油污染土壤的修复中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李方玲等: "石油污染环境中固氮和寡氮营养细菌的分离鉴定及其特性", 微生物学报, vol. 62, no. 2, pages 1 * |
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