CN115141265A - 四元变构丙酮酸同工酶m2型激活肽及其在逆转沃伯格效应和肿瘤化疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种四聚体变构丙酮酸同工酶M2激活肽及其用于改变沃伯格效应和生物医学领域肿瘤化疗定义的用途。丙酮酸同工酶M2四聚体的变构激活肽含有一种丝氨酸模式，该模式涂有N‑乙酰糖苷，这是一种能够形成疏水纳米复合物的自组装机制，具有荧光信号机制和凝聚功能。该多肽可与肾癌区合成的OGA酶反应，吸收N‑乙酰氨基葡萄糖，从而表达丙酮酸同工酶M2四聚体的丝氨酸激活剂，促进丙酮酸同工酶M2从双边向四重转化，启动自组装运动。在纳米复合材料的自聚集过程中，可以在无水的情况下形成纳米复合物，增加丝氨酸相的保留时间和荧光AIE信号的强度，从而完成了改变沃伯格现象和提高化学敏感性的工作。本发明是一种治疗肾细胞癌的新方法。

Description

四元变构丙酮酸同工酶M2型激活肽及其在逆转沃伯格效应和 肿瘤化疗中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽及其在肿瘤中逆转沃伯格效应和化疗增敏中的应用。
背景技术
肾细胞癌(RCC)是十大常见恶性肿瘤之一，也是泌尿系统死亡率最高的恶性肿瘤。它具有进展快、易早期转移、对化疗、放疗等治疗方法不敏感等特点，被认为是治疗失败的主要原因。超过30％的肾癌患者在诊断时已经转移，错过了最好的手术机会。在化疗中，即使最初对治疗有反应的患者也会在10-14个月内产生耐药性。这些因素导致肾细胞癌的高死亡率，对人类生命健康构成严重威胁。
研究表明，癌症转移和化疗耐药性是由异常的饮食代谢和基因转录引起的。在肿瘤细胞中，即使存在足够的氧气来支持线粒体氧化磷酸化，肿瘤细胞也倾向于氧化葡萄糖以代谢为乳酸，这种代谢模式被称为Warburg效应。Warburg效应产生的乳酸与肿瘤增殖、转移和血管生成等多种生物学功能密切相关，导致恶性肿瘤的进展。此外，由于肾癌中VHL基因的异常表达，肾癌比其他肿瘤具有更强的Warburg效应。因此，抑制Warburg效应是肾癌治疗的关键策略。
丙酮酸激酶M2(丙酮酸同功酶M2)是Warburg效应和转录激活的重要调节因子，在肿瘤进展、转移和化疗耐药性中起着关键作用。丙酮酸同功酶M2可以在二聚体和四聚体之间转换，并在各种癌症中以二聚体的形式出现。丙酮酸同功酶M2二聚体的丙酮酸激酶活性低于四聚体，导致更强的Warburg效应。同时，丙酮酸同功酶M2的四聚体被限制在细胞质中，而二聚体可以迁移到细胞核中参与转录激活，最终诱导化疗耐药性。丙酮酸同功酶M2的天然配体丝氨酸已被证明可激活丙酮酸同功酶M2的四聚体，但不能维持丙酮酸同功酶M2变构效应的持续性。因此，持续刺激丙酮酸同功酶M2的四聚体对肿瘤抑制至关重要。然而，目前还没有关于丙酮酸同功酶M2变构激活剂的持续维持及其在肿瘤抑制中的应用的研究报告。
发明内容
本发明的目的是提供丙酮酸同功酶M2四聚体的变构激活肽及其在逆转肿瘤的Warburg效应和化疗致敏中的应用，以解决上述现有技术中存在的问题，该多肽通过原位自组织实现肾癌丙酮酸同功酶M2二聚体转化为四聚体的功能，并实现丝氨酸的长期保留，具有永久逆转Warburg效应和耐药效应的双重作用。为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种丙酮酸同功酶M2四聚体变构激活肽，其包含涂覆有N-乙酰葡萄糖的丝氨酸基序、能够形成疏水纳米复合物的自组织基序和聚集诱导基序。
优选地，可形成具有疏水性的复合物的自组织基序来自β-淀粉样蛋白中的KLVFF肽基序列。
优选地，其结构式如下：
Figure BDA0003723743840000021
本发明还提供所述的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的是，所述肿瘤为高表达OGA酶的肿瘤，所述丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽具有逆转所述肿瘤沃伯格效应的作用。
优选的是，所述肿瘤包括肾细胞癌、急性髓细胞样白血病、胆管癌和头颈鳞状细胞癌。
本发明还提供所述的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽在制备肿瘤中逆转沃伯格效应和化疗增敏方面的药物中应用。
优选的是，所述肿瘤包括肾细胞癌、急性髓细胞样白血病、胆管癌和头颈鳞状细胞癌。
优选的是，所述肿瘤为肾细胞癌。
本发明公开了以下技术效果：
本发明的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽(PAC)可与肾细胞癌(RCC)区域过表达OGA酶反应去除保护性N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)，进而暴露丙酮酸同工酶M2四聚体激活剂丝氨酸，促使丙酮酸同工酶M2二聚体向四聚体形式转变，并触发KLVFF多肽的原位自组装，形成不溶于水的纳米纤维，这有助于增强丝氨酸的积累并持续激发丙酮酸同工酶M2的四聚体化，具有逆转沃伯格效应和化疗增敏的双重作用。经实验证明，肾癌细胞786-O及ACHN的增殖能力被多肽PAC显著抑制，其中786-O和ACHN迁移能力被分别抑制71.9±4.6％和55.8±3.5％；侵袭能力被分别抑制64.6±3.5％和64.7±3.5％；同时，PAC显著抑制了肿瘤细胞的沃伯格效应，使786-O细胞的葡萄糖消耗减少49.3±15％，乳酸产量减少64.8±20.2％，在ACHN细胞中也发生了同样的变化。最终，在小鼠体内实验中PAC抑制了肿瘤生长和转移；另一方面，CCK-8实验发现PAC对舒尼替尼耐药细胞系(786O-R)具有明显杀伤作用并通过小鼠体内实验证实了PAC对肾癌耐药细胞有抑制作用。因此，本发明的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽可通过抑制肿瘤的沃伯格效应及增加化疗敏感性发挥抗癌作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为多肽PAC和对照组多肽PAC-C的分子结构式；a：PAC的分子结构模式图，b：PAC-C的分子结构模式图；
图2为验证多肽PAC在OGA水溶液中可变构、自组装形成疏水性纳米纤维：a：PAC在加入到OGA溶液后进行透射电镜检查；b：PAC-C在加入到OGA溶液后进行透射电镜检查；标尺：50nm；
图3为多肽PAC加入到OGA溶液中共孵育后的硫代黄素T(ThT)荧光强度；
图4为多肽PAC及PAC-C对肾癌细胞786-O、ACHN及HK2(人肾皮质近曲小管上皮细胞)的杀伤作用；a：PAC及PAC-C对786-O细胞的杀伤作用；b：PAC及PAC-C对ACHN细胞的杀伤作用；c：PAC及PAC-C对HK2细胞的杀伤作用；
图5为注射PAC及PAC-C小鼠的主要器官H&E染色，验证材料生物安全性；
图6为PAC及PAC-C对肾癌细胞786-O和ACHN迁移和侵袭能力的影响；a：PAC及PAC-C对786-O细胞的迁移和侵袭能力的影响；b：PAC及PAC-C对ACHN细胞的迁移和侵袭能力的影响；
图7为多肽PAC及PAC-C对786-O、ACHN细胞的滞留情况影响；a：PAC及PAC-C对786-O细胞的滞留情况影响；b：PAC及PAC-C对ACHN细胞的滞留情况影响；标尺：20μm；
图8为western blot实验检测多肽PAC、PAC-C及PBS对786-O、ACHN细胞内丙酮酸同工酶M2的四聚体和二聚体的影响；a：PAC、PAC-C及PBS对786-O细胞内丙酮酸同工酶M2的四聚体和二聚体的影响；b：PAC、PAC-C及PBS对ACHN细胞内丙酮酸同工酶M2的四聚体和二聚体的影响；
图9为多肽PAC及PAC-C对786-O及ACHN细胞的葡萄糖消耗的影响；a：PAC及PAC-C对786-O细胞的葡萄糖消耗的影响；b：PAC及PAC-C对ACHN细胞的葡萄糖消耗的影响；
图10为多肽PAC及PAC-C对786-O及ACHN细胞的细胞外乳酸生成的影响；a：PAC及PAC-C对786-O细胞的细胞外乳酸生成的影响；b：PAC及PAC-C对ACHN细胞的细胞外乳酸生成的影响；
具体实施方式
现在详细描述本发明的各种示例性实施例，其中该详细描述不应解释为本发明的限制，而应解释为本发明的某些方面、特征和实施例的更详细描述。
应当理解，本发明中描述的术语仅用于描述某些实施例，而不用于限制本发明。此外，对于本发明中的数字范围，应理解，还具体公开了范围上限和下限之间的每个中间值。本发明还涵盖规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的任何较小范围。这些较小区域的上边界和下边界可以相互独立地包含或排除在该区域之外。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所涉及领域的普通专业人员通常理解的含义相同。尽管此处仅描述优选方法和材料，但与本文所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明。本说明中提及的所有文件均以引用方式包含，以披露和描述引用文件的程序和/或材料。如果与随附文件有冲突，以本规范的内容为准。
本领域技术人员显然可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下对本发明的特定实施例进行各种修改和变化。根据本发明的描述，其他实施例对本领域技术人员来说是显而易见的。本申请的描述和示例仅供参考。
如本文所用，“综合”、“包括”、“展示”、“包含”等是指包括但不限于的开放式术语。
实施例1丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽的制备及分子结构
1、丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽PAC((S(GlcNAc)-K(TPA-1)LVFF)的制备，PAC可与肾细胞癌(RCC)区域过量的OGA酶反应去除N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)暴露丝氨酸，促进丙酮酸同工酶M2由二聚体向四聚体形式转换，并原位自组装形成水不溶性纳米纤维，实现长效滞留并产生荧光信号，所述的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽由以下三部分组成：
1)N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)包覆的丝氨酸功能基序，其氨基酸序列如式I所示，可与肾细胞癌(RCC)区域OGA酶反应而去除N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)进而暴露丝氨酸，促进丙酮酸同工酶M2由二聚体形式向四聚体形式转换；
Figure BDA0003723743840000051
2)可自组装成β-sheet纳米纤维的氨基酸序列，源自β淀粉样蛋白中的KLVFF(SEQID NO：1)肽基序列，由于氢键的相互作用，可自组装成β-sheet二级结构的水不溶性纳米纤维；
3)具有聚集诱导发光功能(AIE)的荧光信号基序，可产生荧光放大信号。
2、不可变构自组装的对照组多肽PAC-C(S(GlcNAc)-K(TPA-1)AAGG)。
采用固相合成法，由C端到N端人工合成多肽PAC((S(GlcNAc)-K(TPA-1)LVFF)及PAC-C(S(GlcNAc)-K(TPA-1)AAGG)。具体步骤如下，首先用10mLDMF溶胀200mg树脂至少1小时，之后进行抽滤并去除液体，分别使用DCM和DMF冲洗树脂3次。然后在多肽固相合成管中加入10ml脱保护剂(DMF溶液含20％六氢吡啶)，脱去Fmoc保护基团；重复进行抽滤并去除液体，DCM和DMF冲洗树脂3次；使用茚三酮方法检测。配备Kaiser检测试剂，其由A、B、C三种试剂共同组成，配备方法：1)A试剂：20mL乙醇溶解0.5g水合茚三酮；2)B试剂：20mL乙醇中溶解0.4g抗坏血酸；3)C试剂：20mL乙醇中溶解80g苯酚；取三种试剂每种一滴于离心管中，之后将离心管置入沸水中水浴加热1分钟，若树脂变为紫黑色则说明脱保护成功，如果树脂未变成紫黑色则重复脱保护。取10倍过量的相对应氨基酸与HBTU，在DMF溶液中加入4％氮甲基吗啉配制成偶联剂，将氨基酸与HBTU加入到10mL偶联剂中活化10分钟，置于摇床上反应至少1小时。再次抽滤并去除液体，使用DCM和DMF交替3次冲洗树脂，将其置于离心管内，取三种试剂滴于离心管，置入沸水中水浴加热1分钟，如果树脂不变颜色则说明成功，否则重复进行上述步骤。对反应得到的多肽树脂重复上述“脱保护——偶联”反应步骤，到最后的氨基酸反应完成。使用DMF与DCM交替冲洗3次，再使用甲醇充分冲洗3次，然后抽干15-30min；在冰水浴下，使用三氟乙酸裂解两小时。进行抽滤并用氮气吹至液体挥发，加入乙醚，以10000rpm离心，用冰乙醚洗涤两次，将最终得到的固体置入真空干燥箱中过夜后收集。
多肽PAC及PAC-C的分子结构模式图如图1所示。
实施例2多肽PAC经OGA酶反应去除N-乙酰氨基葡萄糖(GLcNAc)暴露丝氨酸后发生变构、自组装成水不溶性纳米纤维。
1、配制磷酸盐溶液并逐渐溶解OGA到PH为6.5，将PAC及PAC-C加入到含OGA酶的溶液中，使PAC和PAC-C终浓度为100μM，2小时后，使用透射电镜观察PAC及PAC-C溶液样品。
结果如图2所示，从该结果可以看出多肽PAC在含OGA酶的溶液中可变构、自组装形成疏水性纳米纤维，而PAC-C在含OGA酶的溶液中不可发生变构及自组装行为。
2、配置磷酸盐溶液并逐渐溶解OGA到PH为6.5，将PAC加入到含OGA酶的溶液中，使PAC终浓度为100μM，共孵育1小时后，加入ThT溶液至浓度为20μM，继续孵育30分钟，使用荧光酶标仪测量荧光强度。
结果如图3所示，从该结果可以看出PAC与OGA酶反应后发生变构行为，产生β-sheet结构，ThT试剂与β-sheet结构结合后发出荧光。
实施例3细胞实验给药方法
选取OGA酶高表达的人源性肾癌细胞786-O及ACHN细胞和正常肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)作为对照组细胞。将PAC与PAC-C多肽溶于DMSO溶剂中，配制溶液浓度为10mM的多肽纳米材料溶液。采用状态良好呈对数生长的实验细胞，随机分为PAC、PAC-C及PBS(磷酸盐缓冲液)组，将PAC、PAC-C及PBS以实验浓度加入到培养基中，分别验证PAC、PAC-C及PBS溶液对细胞生存状态的影响。
实施例4多肽PAC对786-O、ACHN细胞及HK-2细胞的杀伤作用及生物安全性
采用状态良好呈对数生长的786-O、ACHN细胞以及HK-2细胞以每孔1×104个细胞、总体积100μL加入到96孔板中，置于37℃细胞培养箱中，24小时后随机分为PAC、PAC-C组，将PAC、PAC溶液分别以0、10、20、50、100、200μM的浓度加入到细胞培养基中，共培养1小时后，更换新鲜培养基，置于37℃细胞培养箱中，48小时后弃掉培养基并加入配制好的CCK-8溶液，置于37℃细胞培养箱中4小时，测量吸光度，分别验证PAC及PAC-C对细胞生存状态的影响。
三组小鼠分别给予PAC、PAC-C及PBS，每48小时一次，静脉给药5次，在第5次注射后48小时验证了材料的全身毒性，取小鼠主要器官进行H&E检查。
结果如图4所示，从该结果可以看出，PAC在50μM浓度时对786-O、ACHN细胞均有杀伤作用，而对于正常细胞系HK-2无毒副作用；而PAC-C(50μM)虽然对786-O、ACHN细胞有杀伤作用，但其杀伤作用远小于PAC组。
如图5所示，H&E染色检查结果表明，三组小鼠不存在显著差异，说明PAC及PAC-C具有生物安全性。
实施例5PAC及PAC-C对肾癌细胞786-O和ACHN迁移和侵袭能力的影响；
为探究PAC和PAC-C对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响，使用200μL无胎牛血清的培养基将1×105个/孔786-O和ACHN细胞接种在含有PBS、PAC-C、PAC(50μM，培养基:DMSO＝99.5:0.5v/v)的Transwell上室中(侵袭实验需预先在上室中涂入基质胶)，将含10％胎牛血清的700μL培养基加入下室，37℃培养24小时。用4％多聚甲醛将上室底面上的细胞固定15分钟，0.05％结晶紫染色20min，计数底表面细胞数。
结果如图6所示，肾癌细胞786-O迁移能力被PAC抑制71.9±4.6％；侵袭能力被抑制64.6±3.5％；肾癌细胞ACHN迁移能力被PAC抑制55.8±3.5％；侵袭能力被抑制64.7±3.5％；
实施例6多肽PAC对786-O及ACHN细胞的滞留情况影响
为探究PAC和PAC-C在肿瘤细胞中的滞留作用，将786-O、ACHN及HK-2细胞用胰酶消化为单细胞悬液后均匀地接种在共聚焦专用培养皿中，随后转移至细胞培养箱中以37℃、5％CO2的条件下培养至细胞贴壁。待细胞完全贴壁后，更换新鲜的完全培养液，并加入PAC及PAC-C进行处理，使PAC和PAC-C终浓度为50μM，分别于1、4、8、12和24小时使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM700，卡尔蔡司，德国)进行荧光图像采集。
结果如图7所示，从该结果看出PAC的长期滞留能力高于PAC-C组。
实施例7western blot实验检测多肽PAC、PAC-C及PBS对786-O、ACHN细胞内丙酮酸同工酶M2的四聚体和二聚体的影响
将786-O、ACHN细胞接种于培养皿中，待其贴壁后，加入PAC、PAC-C及PBS溶液，使PAC和PAC-C终浓度为50μM，共孵育1小时后，更换新鲜培养基，置于37℃细胞培养箱中培养，48小时后，使用RIPA裂解液裂解细胞提取细胞蛋白并通过BCA试剂盒测定浓度后，采用western blot实验检测细胞内丙酮酸同工酶M2的四聚体和二聚体水平。
结果如图8所示，从该结果可以看出，PAC显著抑制了丙酮酸同工酶M2的二聚体化。
实施例8多肽PAC及PAC-C对786-O及ACHN细胞的葡萄糖消耗的影响
将1×105个786-O和ACHN细胞接种于6孔板中。加入PAC、PAC-C和PBS，使PAC和PAC-C终浓度为50μM，处理细胞24小时后从培养的细胞中收集培养基用于葡萄糖测定。通过使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖水平。葡萄糖消耗的计算方法是从原始葡萄糖浓度中减去培养基中测得的葡萄糖浓度。
结果如图9所示，PAC处理786-O细胞的葡萄糖消耗减少49.3±15％，PAC处理ACHN细胞的葡萄糖消耗减少47.1±1.7％。
实施例9多肽PAC及PAC-C对786-O及ACHN细胞的细胞外乳酸生成的影响
将1×105个786-O和ACHN细胞接种于6孔板中。加入PAC、PAC-C和PBS至终浓度为50μM，处理细胞24小时后从培养的细胞中收集培养基用于乳酸测定。按照说明书的方法使用乳酸检测试剂盒测定乳酸生产水平。在荧光酶标仪下测量荧光强度。
结果如图10所示，PAC处理的786-O细胞中乳酸生成减少64.8±20.2％，PAC处理的ACHN细胞中乳酸生成减少60.5±1.4％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽，其特征在于，其包括N-乙酰基葡萄糖包覆的丝氨酸基序、可形成具有疏水性纳米复合物的自组装基序以及具有聚集诱导发光功能的荧光信号基序。
2.根据权利要求1所述的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽，其特征在于，所述可形成具有疏水性复合物的自组装基序源自于β淀粉样蛋白中的KLVFF肽基序列。
3.根据权利要求1所述的丙酮酸同工酶M2四聚体变构激活肽，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure FDA0003723743830000011
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的变构激活肽四聚体丙酮酸同工酶M2在抗癌药物制造中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述肿瘤为高表达OGA酶的肿瘤，四聚体热解同功酶M2的变构激活肽具有逆转肿瘤Warburg效应的能力。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述肿瘤包括肾癌、急性髓细胞白血病、胆管癌和头颈部鳞状细胞癌。
7.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的四聚体丙酮酸同功酶M2变构激活肽在制造用于逆转Warburg现象的医药产品中的用途，以及肿瘤化疗敏感性。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述肿瘤包括肾癌、急性髓系白血病、胆管癌和头颈部鳞状细胞癌。
9.如请求项8之用途，其中肿瘤系肾癌。
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