CN115137829A - 用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物 - Google Patents

用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对GABAA受体具有抑制作用的物质用于减轻放疗诱导的肠道损伤的方法，以及使用对GABAA受体具有抑制作用的物质在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。为癌症患者放疗后引起的肠道损伤提供新的治疗方案，提高患者治疗获益的可能性。

Description

用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及对GABAA受体具有抑制作用的物质用于减轻放疗诱导的肠道损伤的方法，以及使用对GABAA受体具有抑制作用的物质在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
背景技术
现代癌症治疗强烈地依赖于单独或与外科手术或化学疗法联合的作为用于治疗多种类型的恶性肿瘤的主要策略的电离辐照的使用。电离辐射(radiation)在多种细胞类型中诱发多种不同的生化事件，所述生化事件决定细胞幸免于辐射攻击的能力。
在癌症治疗中用电离辐射治疗肿瘤和过度增生性疾病被广泛地使用。此类治疗的目标是推测通过DNA损害来引起肿瘤细胞的破坏并抑制肿瘤细胞生长，同时试图对非肿瘤细胞和组织造成最小的损害。对邻近组织的附带损害往往限制应用的辐射剂量，从而限制某些肿瘤诸如脑瘤和腹腔和颈部中的肿瘤的放射疗法的效果。由于肠道快速的更新增殖能力，胃肠道毒性是放疗中常见的副作用和剂量限制因素。即使采用先进的调强放射治疗，小肠也有明显的毒性反应。放疗患者通常会经历严重的恶心、呕吐、食欲不振等胃肠道损伤反应，大大降低了肿瘤患者的生存质量。
γ-氨基丁酸(简称GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，约30％的中枢神经突触部位以GABA为递质。在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用。当人体内GABA缺乏时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪，一般长久处于高压力族群如身处竞争环境中的人群、运动员、上班族等，都很容易缺乏GABA需要及时补充以便舒缓情绪。GABAA受体是一类配体门控型离子通道，介导前脑大多数快速突触抑制，存在由许多不同亚基组成的亚型，它们以不同的细胞特异类型方式分布在不同区域。GABAA受体可由不同亚基组合构成，进而产生不同受体组合的差异性、药理学性质和内在的受体特性，其是由GABA识别点、苯二氮卓(BDZ)识别点和氯离子门控通道三部分组成的大分子蛋白复合体。
发明内容
发明要解决的问题
寻找一种可以减轻放疗引起的胃肠道副作用的放疗保护佐剂，在选择性保护正常细胞的同时不影响肿瘤的治疗，对于现代癌症治疗具有极其重要的临床意义，这将大大提高放疗的使用最大剂量，并减轻病人的痛苦，提高患者生活质量。
用于解决问题的方案
一方面，本发明涉及对GABAA受体具有抑制作用的物质在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
进一步地，所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为抑制GABAA受体的表达或下调GABAA受体的物质。
进一步地，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为GABAA受体拮抗剂化合物。
进一步地，其中所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱(Bicuculline)、氟马西尼(Flumazenil)、一叶萩碱、木防己苦毒素或其药学上可接受的盐。
进一步地，其中所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱、氟马西尼或其药学上可接受的盐。
进一步地，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为用于沉默、敲除或敲减表达GABAA受体的基因的物质。
进一步地，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为靶向表达GABAA受体的基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
另一方面，本发明涉及含有荷包牡丹碱或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
另一方面，本发明涉及含有氟马西尼或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
发明的效果
本发明发现抑制或敲除GABAA受体可有效防止辐射诱导的p53依赖性细胞凋亡，但不会影响它们对在体肿瘤的杀伤。此外，本发明还发现GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱、氟马西尼能有效缓解放疗引起的肠道损伤。再则，本发明还发现GABAA受体缺失能有效缓解放疗引起的肠道损伤。
附图说明
图1为肠上皮细胞GABAA受体缺失的小鼠经辐射诱导后小肠损伤的情况。
图2为Lgr5阳性肠干细胞GABAA受体缺失的小鼠经辐射诱导后小肠损伤的情况。
图3为Lgr5阳性肠干细胞GABAA受体缺失的小鼠经腹部放射诱导后小肠上皮细胞凋亡的情况。
图4为Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体缺失的小鼠经辐射诱导后小肠类器官的损伤情况。
图5为荷包牡丹碱用药后的小鼠经辐射诱导后小肠上皮细胞DNA损伤相关性凋亡的情况。
图6为荷包牡丹碱用药后的小鼠经辐射诱导后小肠类器官的损伤情况。
图7为氟马西尼用药后的小鼠经放疗引起的肠道的损伤情况。
图8为荷包牡丹碱处理后辐射对路易斯肺癌荷瘤小鼠和自发肠道腺瘤的APCMin/+小鼠肿瘤的杀伤情况。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。其中，附图不一定是按比例绘制的，局部特征可以被放大或缩小，以更加清楚的显示局部特征的细节；除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
一方面，本发明涉及对GABAA受体具有抑制作用的物质在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
在某些实施例中，所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为抑制GABAA受体的表达或下调GABAA受体的物质。
在某些实施例中，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为GABAA受体拮抗剂化合物。
在某些实施例中，其中所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱(Bicuculline)、氟马西尼(Flumazenil)、一叶萩碱、木防己苦毒素或其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，其中所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱、氟马西尼或其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为用于沉默、敲除或敲减表达GABAA受体的基因的物质。
在某些实施例中，其中所述对GABAA受体具有抑制作用的物质为靶向表达GABAA受体的基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
另一方面，本发明涉及在受试者中减轻放疗诱导的肠道损伤的方法，包括抑制GABAA受体的表达或下调GABAA受体的步骤。
在某些实施例中，本发明所述治疗方法中，包括沉默、敲除或敲减表达GABAA受体的基因的步骤。其中，优选地，通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)或CRISPR基因编辑技术进行所述沉默、敲除或敲减；进一步优选地，利用靶向表达GABAA受体的基因的siRNA、sgRNA或构建有shRNA的载体进行所述沉默、敲除或敲减。
在某些实施例中，本发明所述治疗方法中，包括将有效量的GABAA受体拮抗剂化合物施用于所述受试者的步骤。
在某些实施例中，所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱(Bicuculline)、氟马西尼(Flumazenil)、一叶萩碱、木防己苦毒素或其药学上可接受的盐。进一步优选地，所述GABAA受体拮抗剂化合物选自荷包牡丹碱(Bicuculline)、氟马西尼(Flumazenil)或其药学上可接受的盐。进一步优选地，荷包牡丹碱(Bicuculline)或氟马西尼(Flumazenil)还可与上述其他的GABAA受体拮抗剂化合物或其药学上可接受的盐组合施用。
另一方面，本发明涉及含有荷包牡丹碱或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
另一方面，本发明涉及含有氟马西尼或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
荷包牡丹碱(Bicuculline)是一种GABAA受体拮抗剂，CAS号为28832-07-7，结构如下：
Figure BDA0003787613210000041
氟马西尼(Flumazenil)是一种GABAA受体拮抗剂，CAS号为78755-81-4，结构如下：
Figure BDA0003787613210000042
一叶萩碱(Securinine)是一种GABAA受体拮抗剂，CAS号为5610-40-2，结构如下：
Figure BDA0003787613210000043
木防己苦毒素(Picrotoxin)是一种GABAA受体拮抗剂，CAS号为124-87-8，结构如下：
Figure BDA0003787613210000051
术语药物的“组合”、“联合”是指由多于一种活性成分混合或组合产生的产品；包括活性成分的固定和非固定组合。“固定组合”是指，活性成分以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。“非固定组合”是指活性成分和其他活性药剂，分别作为单独的实体或剂量，同时、分别或依次施用于患者，其间没有特定的时间间隔的限制。非固定组合也适用于混合疗法(cocktail)，例如三种或更多种活性成分的给药。
术语“施用”或“给药”是指，在患者体内提供有效水平的所述活性化合物。
术语“治疗有效量”是指足以引起目标生物反应的数量。如本领域技术人员理解，本发明化合物的有效量可根据下列因素而改变：如生物学目标、化合物的药代动力学、所治疗的疾病、给药模式及受试者的年龄健康情况和症状。除非另作说明，否则，本文使用的化合物的“治疗有效量”是在治疗疾病、障碍或病症的过程中足以提供治疗益处的量，或使与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状延迟或最小化的量。化合物的治疗有效量是指单独使用或与其它疗法联用时，治疗剂的量，它在治疗疾病、障碍或病症的过程中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可包括改善总体治疗、降低或避免疾病或病症的症状或病因，或增强其它治疗剂的治疗效果的量。
术语“药学上可接受的盐”是指，本发明化合物的盐，其在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等。盐可能包括药学上可接受的碱加成盐，通过与金属或胺生成的，例如碱金属与碱土金属氢氧化物或有机胺。用作阳离子的金属的实例有钠、锂、钾、镁、钙等。胺的实例有四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、三乙胺、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。或者可以是从无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物等。此类盐的实例包括但不限于：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。或者从有机酸制备的盐，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。此类盐的实例包括但不限于：乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还可以是氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。
本发明的药物化合物或其药学上可接受的盐，或其他形式，施用于受试者，可使用任何合适的递送方法，包括表面、经肠、胃肠外、经皮、经黏膜、经由吸入、脑池内、硬膜、阴道内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内及玻璃体内将本文所述的化合物或其药学上可接受的盐施用于受试者。
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
如图1,本发明检测了肠上皮GABAA受体缺失在6Gy全身辐照后，对小肠上皮细胞的潜在影响(图1A)。与野生(gabra1flox/flox)组相比，上皮GABAA受体缺失
Figure BDA0003787613210000061
组小鼠在暴露于辐射后受到的肠道损伤症状要轻得多，包括小肠绒毛更长(图1B)、过渡扩增细胞数目更多(图1C)以及增殖能力更强(图1D)。此外，在
Figure BDA0003787613210000062
组中，辐射诱导的Olfm4阳性小肠干细胞数量的减少也显着减轻(图1E)。通过检测γ-H2AX、p-P53和Cleaved Caspase 3的表达水平，发现
Figure BDA0003787613210000063
小鼠小肠上皮细胞中的DNA损伤更轻(图1F-G)。此外，在10Gy的全身辐照后，与gabra1flox/flox小鼠相比，
Figure BDA0003787613210000064
小鼠的存活率更高(图1H)。以上数据表明，肠上皮细胞上的GABAA受体缺失显着改变了放疗后肠道增殖和细胞凋亡状态，从而响应了放疗诱导的DNA损伤。
实施例2
Lgr5阳性肠道干细胞在辐射诱导的肠毒性和肠道再生中起着至关重要的作用。如图2，本发明研究了Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体的缺失在6Gy全身辐照引起的肠道损伤中的作用(图2A)。结果显示Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体缺失(gabra1 Lgr5-KO)小鼠对辐射引起的肠道损伤表现出明显的抵抗力，包括绒毛缩短更少(图2B)、过渡扩增细胞数目更多(图2C)、增殖能力更强(图2D)以及Olfm4阳性干细胞损失更少(图2E-F)。p-P53、γ-H2AX和Cleaved Caspase 3的表达水平在gabra1 Lgr5-KO组中明显降低(图2G)。此外，10Gy的全身辐照后，gabra1 Lgr5-KO组小鼠存活率更高(图2H)。
接下来，本发明研究Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体的缺失在15Gy全身辐照诱导的肠道上皮细胞凋亡的情况(图3A)。结果显示，15Gy腹部照射后2天后，gabra1 Lgr5-KO小鼠小肠的平均绒毛长度和隐窝深度是对照组的1.3倍和1.4倍(图3B)。在15Gy腹部照射24小时和48小时后，Lgr5阳性肠道干细胞在gabra1 Lgr5-KO组中减少的更少(图3C)。此外，15Gy腹部照射24小时后，gabra1 Lgr5-KO小鼠隐窝细胞凋亡更少(图3D)。
随后，本发明在体外类器官水平对Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体缺失对肠道的放疗保护进行了进一步的验证。结果显示肠干细胞GABAA受体的缺失明显缓解了辐射(1Gy)诱导小鼠小肠类器官毒性，表现为类器官存活更多，生长面积更大(图4A)。此外，GABAA受体缺失的缺失明显降低了p-P53、γ-H2AX和Cleaved Caspase 3的表达(图4B)，并抑制了辐射诱导的Lgr5阳性小肠干细胞的丢失(图4C)。
以上结果表明，Lgr5阳性肠道干细胞GABAA受体的缺失在减少辐射引起的肠道损伤中发挥了重要作用。
实施例3
本发明研究了GABAA受体抑制剂荷包牡丹碱(Bicuculline)在辐射诱导的肠道损伤中的作用。首先给予8周龄的C57/BL6J雄性小鼠，2mg/kg的荷包牡丹碱腹腔注射6天(对照组注射相应量的生理盐水)，随后一次性给予6Gy全身照射，之后继续腹腔注射2mg/kg的bicuculline(对照组注射相应量的生理盐水)，持续4天(图5A)。结果显示，荷包牡丹碱处理组的小鼠表现出了更轻的肠道损伤状态，主要表现为绒毛长度更长(图5B),过渡扩增细胞数目更多(图5C)，且其增殖能力更强(图5D)。此外，辐射造成的小肠干细胞数目的减少(图5E)以及小肠隐窝区细胞DNA损伤水平的增加(图5F)，在荷包牡丹碱组中得到了明显的抑制。同时荷包牡丹碱处理组的小肠组织中p-P53、γ-H2AX和Cleaved Caspase 3的表达出现了明显的下调(图5G)。
此外，荷包牡丹碱明显抑制了辐射(1Gy)诱导类器官毒性，改善了隐窝内肠上皮细胞的生长(图6A)。此外，在辐射处理下，荷包牡丹碱处理组的类器官与对照组相比，p-P53、γ-H2AX和Cleaved Caspase 3的蛋白质水平明显降低(图6B)，这个结果进一步说明GABAA受体的抑制可以减少p53依赖的隐窝细胞凋亡，从而减轻辐射诱导的肠道毒性。
实施例4
本发明研究了已获得国家食品药品监督管理局批准的GABAA受体拮抗剂氟马西尼(Flumazenil)在6Gy全身辐照诱导的肠道损伤中的潜在作用(图7A)。结果显示，氟马西尼减轻了辐射诱导的绒毛缩短(图7B)、过渡扩增细胞数量减少(图7C)和增殖能力减弱(图7D)。此外，氟马西尼组小鼠小肠隐窝中Olfm4阳性小肠干细胞的数量也更多(图7E),DNA损伤程度更轻(图7F)。此外，10Gy的全身辐照后，氟马西尼组小鼠存活率更高(图7G)。通过使用了人类肠道类器官体外培养系统发现，在1Gy辐射处理前施加1μM氟马西尼，能有效减少人类肠道类器官受到的放疗毒性，表现为类器官数目更多以及生长更快(图7H)。以上结果表明氟马西尼可以很好地缓解辐射诱导的小鼠小肠损伤。
实施例5
为了确定GABAA受体抑制剂荷包牡丹碱(Bicuculline)是否会影响癌细胞对放疗的敏感性，本发明首先使用具有自发性肠腺瘤模型的ApcMin/+小鼠(图8A)。结果显示，仅用荷包牡丹碱(2mg/kg i.p.)处理4月龄的ApcMin/+小鼠在肿瘤数量(图8B)和绒毛长度(图8C)方面与对照组没有区别。重要的是，在腹部放疗(15Gy，WAI)的条件下，荷包牡丹碱处理显示出与IR组相同的肿瘤反应(图8B)，但对辐射诱导的肠道结构损伤具有高度抗性(图8C)。
接下来本发明建立了移植瘤模型，研究了荷包牡丹碱是否会影响辐射对肿瘤组织的杀伤。当荷瘤体积生长至100立方毫米时，每隔两天对小鼠进行生理盐水或者bicuculline(2mg/kg)腹腔注射，同时每隔三天对小鼠进行3Gy的全身辐射(对照组不进行辐射处理)(图8D)。结果显示，bicuculline对肿瘤生长(图8E)、肿瘤组织PCNA蛋白水平(图8F)和肿瘤重量(图8G)方面与对照组没有区别。然而重要的是，在放疗条件下，IR+Bicuculline组显示出与IR组相似的肿瘤反应(图8E)，但对辐射诱导的肠道结构损伤具有高度抵抗力，表现为较高的绒毛高度(图8H)。这些结果表明了，荷包牡丹碱减弱了辐射诱导的肠毒性，但既不会加速肿瘤的发展，也不会使肿瘤对放疗脱敏。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (8)

1.对GABAA受体具有抑制作用的物质在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述物质为抑制GABAA受体的表达或下调GABAA受体的物质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述物质为GABAA受体拮抗剂化合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述GABAA受体拮抗剂化合物选自下组的化合物或其组合：荷包牡丹碱、氟马西尼、一叶萩碱、木防己苦毒素或其药学上可接受的盐；优选为荷包牡丹碱、氟马西尼或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述物质为用于沉默、敲除或敲减表达GABAA受体的基因的物质。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述物质为靶向表达GABAA受体的基因的siRNA、sgRNA或shRNA。
7.含有荷包牡丹碱或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
8.含有氟马西尼或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于减轻放疗诱导的肠道损伤的药物中的应用。
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