CN115124632A

CN115124632A - 一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法

Info

Publication number: CN115124632A
Application number: CN202210654746.9A
Authority: CN
Inventors: 蒋志国
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN115124632B

Abstract

本发明提供一种对羟基苯甲酸‑壳聚糖接枝物的制备方法，包括以下步骤：(1)将壳聚糖加入复合酸溶液中，所述复合酸由辛二酸和扁桃酸组成，超声，得到复合酸壳聚糖溶液；(2)将对羟基苯甲酸加入癸酸水溶液中，搅拌，得到对羟基苯甲酸癸酸溶液；(3)将复合酸壳聚糖溶液与对羟基苯甲酸癸酸溶液混合，加入维生素C后，排除空气；然后，加入过氧化氢溶液，隔绝空气反应后，透析，冷冻干燥，制得对羟基苯甲酸‑壳聚糖接枝物。该接枝物具有良好的抑菌活性，不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，而且对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有较强的抑菌活性，还具有良好的抗氧化性。

Description

一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法

技术领域

本发明涉及保鲜材料制备技术领域，特别涉及一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法。

背景技术

壳聚糖(CS)是通过几丁质脱乙酰化而产生的阳离子多糖，由于其生物降解性，生物相容性，成膜性，无毒性，抗氧化和抑菌活性，被认为是食用涂料和食品包装膜的极佳生物材料。然而，单纯使用CS作为食品包装膜是不够的，因为它对微生物和氧化的抵抗力较差。这就需要在CS膜中添加抗菌剂和抗氧化剂，以提高其性能，从而扩大其在食品包装中的应用。由于壳聚糖具有两种反应性官能团(氨基和羟基)，因此CS的化学修饰是将新功能引入CS的可行方法。接枝共聚是改变天然聚合物的特性的最重要和最有用的技术。在接枝共聚中，小分子通过共价键与壳聚糖连接起来而形成功能性衍生物。壳聚糖的接枝共聚可以改善其天然性能，并且既能增加新的性能而又不影响其天然性能，例如生物降解性，粘附性和生物相容性。迄今为止，已经进行了许多关于壳聚糖的接枝共聚反应的研究，以制备具有独特生物活性的基于多糖的高级材料，扩大了它们在生物医学和环境领域的应用。酚类化合物的共价结合可以显著提高 CS的抗氧化能力。现有研究表明，接枝率和共轭酚类化合物的种类是影响酚酸枝接壳聚糖膜物理性能和抗氧化能力的重要因素。

对羟基苯甲酸酯是国际公认的广谱高效食品防腐剂。由于其酚羟基结构，其抗菌性能强于苯甲酸和山梨酸。在CS分子中引入对羟基苯甲酸(PA)可以增强其抗氧化和抗菌能力。同时，PA与CS通过酯键连接，表明产物为对羟基苯甲酸壳聚糖酯。它作为一种食品包装材料，在降低食品安全隐患的同时，更能为公众所接受。但现有工艺所制备的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物，抑菌活性以及抗氧化活性欠佳。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，所制备的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物，有效提高对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果，而且对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌也具有较强的抑菌效果，还具有良好的抗氧化性。

本发明的技术方案是这样实现的：一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖加入复合酸溶液中，所述复合酸由辛二酸和扁桃酸组成，超声，得到复合酸壳聚糖溶液；

(2)将对羟基苯甲酸加入癸酸水溶液中，搅拌，得到对羟基苯甲酸癸酸溶液；

(3)将复合酸壳聚糖溶液与对羟基苯甲酸癸酸溶液混合，加入维生素C后，排除空气；然后，加入过氧化氢溶液，隔绝空气反应后，透析，冷冻干燥，制得对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物。

进一步的，步骤(1)，所述复合酸由质量比3-5：1的辛二酸和扁桃酸组成，所述复合酸溶液的质量溶度为0.8-1.2％；所述壳聚糖的添加量为每升复合酸溶液加入2-4mmol。

进一步的，步骤(1)，所述超声功率为120-180W、频率为25-35kHz，超声时间为15-25分钟。

进一步的，步骤(2)，所述癸酸水溶液的体积浓度为0.4-0.6％；所述对羟基苯甲酸的添加量为每升癸酸水溶液加入8-12g。

进一步的，步骤(2)，所述搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为40-50分钟。

进一步的，步骤(3)，所述壳聚糖与对羟基苯甲酸的摩尔比为1：0.8-1.1；所述维生素C与壳聚糖的质量比为1：5-7。

进一步的，步骤(3)，所述过氧化氢溶液的质量浓度为25-35％，所述过氧化氢溶液中过氧化氢与壳聚糖的质量比为1.0-1.2：1。

进一步的，步骤(3)，所述反应时间为9-11h，反应温度为26-28℃。

进一步的，步骤(3)，所述透析是使用8-14kDa透析袋透析反应液，透析 50-60h。

进一步的，步骤(3)，所述冷冻干燥温度为-33～-38℃，时间为10-14h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用由辛二酸和扁桃酸组成复合酸制备壳聚糖溶液，再制备对羟基苯甲酸癸酸溶液，在维生素C和过氧化氢作用下，制备对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物，具有较高的接枝度，具有良好的抑菌活性，不但对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，而且对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有较强的抑菌活性，还具有良好的抗氧化性。

(2)其中，本发明采用由辛二酸和扁桃酸组成复合酸制备壳聚糖溶液，再与癸酸溶液中对羟基苯甲酸反应，利于提高接枝率，有效提高抑菌活性和抗氧化性，而且进一步提高接枝物结构稳定性。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明使用壳聚糖脱乙酰度为95％的壳聚糖，对羟基苯甲酸，福林酚等试剂均购买自麦克林生化科技有限公司。

实施例1对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备

(1)将壳聚糖3mmol加入1.0％wt复合酸溶液1L中，所述复合酸由质量比4：1的辛二酸和扁桃酸组成，超声20分钟，超声功率为150W、频率为 30kHz，得到复合酸壳聚糖溶液。

(2)将对羟基苯甲酸10g加入0.5％v/v癸酸水溶液1L，在25℃下搅拌45 分钟，得到对羟基苯甲酸癸酸溶液；

(3)将复合酸壳聚糖溶液与对羟基苯甲酸癸酸溶液混合，其中，两者混合比例按照壳聚糖与对羟基苯甲酸的摩尔比为1：1，加入维生素C后，所述维生素C与壳聚糖的质量比为1：6，排除空气；然后，加入30％wt过氧化氢溶液，过氧化氢溶液中过氧化氢与壳聚糖的质量比为1.1：1，隔绝空气反应时间为 10h，反应温度为26-28℃，反应后使用8-14kDa透析袋透析反应液，透析56h， -35℃冷冻干燥12h，制得对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物。

实施例2对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法

(1)将壳聚糖2mmol加入0.8％wt复合酸溶液1L中，所述复合酸由质量比5：1的辛二酸和扁桃酸组成，超声15分钟，超声功率为180W、频率为 35kHz，得到复合酸壳聚糖溶液；

(2)将对羟基苯甲酸8g加入0.4％v/v癸酸水溶液1L，在20℃下搅拌50 分钟，得到对羟基苯甲酸癸酸溶液；

实施例3对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法

(1)将壳聚糖4mmol加入1.2％wt复合酸溶液1L中，所述复合酸由质量比3：1的辛二酸和扁桃酸组成，超声25分钟，超声功率为120W、频率为 25kHz，得到复合酸壳聚糖溶液；

(2)将对羟基苯甲酸12g加入0.6％v/v癸酸水溶液1L，在30℃下搅拌40 分钟，得到对羟基苯甲酸癸酸溶液；

试验例1-接枝度检测

采用福林酚法测量实施例1-3接枝物样品中的PA含量。将冻干的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物粉末以1mg/mL的浓度溶解在1％(v/v)的乙酸中。将福林酚试剂稀释5倍后取2.0mL与2.0mL样品溶液的混匀，遮光反应30min。6 mL Na₂CO₃溶液(m/v,20％)加入上述溶液混匀后，室温反应2小时。使用分光光度计在750nm处测量其吸光值。根据对羟基苯甲酸(PA)标准品建立的标准曲线计算对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物样品的接枝度，结果表示为：接枝度＝对羟基苯甲酸重量(mg)/接枝物样品重量(g)。

表1接枝度

	接枝度
		实施例1	138.53±3.09
实施例2	121.52±3.54
		实施例3	125.12±3.27

结果显示，实施例1-3所制备的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的接枝度为121 以上，其中实施例1所制得对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的接枝度最高。

试验例2-抑菌活性

2.1细菌种类和培养条件

将菌株(枯草芽孢杆菌ATCC 11774，铜绿假单胞菌ATCC 25923，金黄色葡萄球菌ATCC 11632和大肠杆菌ATCC 25922)传代培养后，接种到Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基(25g/L，pH 7.2)中，于37℃培养8小时左右。随后，使用MH肉汤将所得培养物稀释至最终的OD₆₀₀为0.1(相当于～10⁸ CFU/mL)，将其用于后续的抑菌活性测定中。

2.2最小抑菌浓度

采用二倍稀释法来确定待测样品的最小抑菌浓度。同时使用María[1]描述的以下公式确定抑菌浓度。

抑菌浓度＝(T_{F sample}-T_{0 sample})-(T_{F blank}-T_{0 blank})＜0.02

其中，T_{0 sample}和T_{F sample}代表培养之前(T₀)和之后(T_F)在PA，CS或PA-g-CS 存在下菌株生长的OD₆₀₀值，并且T_{0 blank}和T_{F blank}代表培养前后，含有待测样品的未接种菌株的MH肉汤的OD₆₀₀值。每个样品进行五次测量，数据以均值表示。

[1]María J M-V，Emma L V-B，Maribel P-J，et al.Functionalization ofchitosan by a free radical reaction：Characterization， antioxidant andantibacterial potential[J].Carbohydrate Polymers，2017,155：117-127

2.3抑菌测试结果

表2抑菌活性

结果显示，实施例1-3所制备的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物样品不但大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，而且对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌具有较强的抑菌活性。

试验例3-抗氧化性

3.1试验方法：参考Xie等[2]的方法，并稍作修改。50μL(0.125mg/mL-4 mg/mL)样品与200μL 0.4mM DPPH乙醇溶液在96孔板中混合均匀，室温下反应30分钟。使用酶标仪在517nm处测量吸光度。DPPH自由基清除率通过以下公式计算：

其中A₀和A₁分别表示对照品和样品管中上清液的吸光度值。

[2]Xie M,Hu B,Wang Y,et al.Grafting of Gallic Acid onto ChitosanEnhances Antioxidant Activities and Alters Rheological Properties of theCopolymer[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2014,62(37):9128-36.

3.2抗氧化测试结果

表3DPPH自由基清除活性

	DPPH自由基清除率(％)
		实施例1	91.1
实施例2	85.8
		实施例3	87.3

结果显示，实施例1-3所制备的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物样品均具有较高的DPPH自由基清除率，具有显著的抗氧化能力，其中，实施例1样品的DPPH 自由基清除率最高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(1)，所述复合酸由质量比3-5：1的辛二酸和扁桃酸组成，所述复合酸溶液的质量溶度为0.8-1.2％；所述壳聚糖的添加量为每升复合酸溶液加入2-4mmol。

3.根据权利要求1或2所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(1)，所述超声功率为120-180W、频率为25-35kHz，超声时间为15-25分钟。

4.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(2)，所述癸酸水溶液的体积浓度为0.4-0.6％；所述对羟基苯甲酸的添加量为每升癸酸水溶液加入8-12g。

5.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(2)，所述搅拌温度为20-30℃，搅拌时间为40-50分钟。

6.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(3)，所述壳聚糖与对羟基苯甲酸的摩尔比为1：0.8-1.1；所述维生素C与壳聚糖的质量比为1：5-7。

7.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(3)，所述过氧化氢溶液的质量浓度为25-35％，所述过氧化氢溶液中过氧化氢与壳聚糖的质量比为1.0-1.2：1。

8.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(3)，所述反应时间为9-11h，反应温度为26-28℃。

9.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(3)，所述透析是使用8-14kDa透析袋透析反应液，透析50-60h。

10.根据权利要求1所述的对羟基苯甲酸-壳聚糖接枝物的制备方法，其特征在于，步骤(3)，所述冷冻干燥温度为-33～-38℃，时间为10-14h。