CN115119781A - 一种纤毛虫病的生物防治方法 - Google Patents

一种纤毛虫病的生物防治方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种纤毛虫病的生物防治方法，属于生物防治技术领域。本发明的生物防治方法包括：在养殖池中投放贪食纤口虫进行纤毛虫病防治；所述贪食纤口虫包括贪食纤口虫PJ13002。本发明通过引入捕食性原生动物贪食纤口虫PJ13002，在养殖系统中恢复自然界中存在的微生物食物链，实现纤毛虫病的生物防治，同时贪食纤口虫PJ13002可直接被养殖动物摄食而不会引起病害，可形成更加稳定的养殖系统，避免损失并降低成本，增加经济效益，为防治纤毛虫病提供了新思路，具有良好的推广应用前景。

Description

一种纤毛虫病的生物防治方法
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种纤毛虫病的生物防治方法。
背景技术
水产养殖是现代农业的重要组成部分，是推动经济发展的主要产业之一，但水产养殖仍然存在着诸多挑战，尤其是因养殖空间拥挤、水体污染等导致的微生物病害。纤毛虫是一种在养殖水体中极为常见的、浑身长毛的单细胞生物(体长多在20-1000μm之间，体形多样)，部分快速生长种类如盾纤类纤毛虫可以寄生于鱼虾贝等多种水产养殖动物体内，造成大规模的原发性或继发性传染病，给养殖产业带来巨大的经济损失。
现今对于纤毛虫引起养殖动物的寄生性疾病研究较少，对于纤毛虫病还没有较为有效安全的防治方法。纤毛虫病的防治方法大多基于物理及化学防治，如增加更好的过滤系统，定期清洁池塘，添加食盐、高锰酸钾、硫酸铜及螯合铜、辣椒水等化学试剂，部分不法养殖户甚至用甲醛浸泡感染鱼体杀虫。这些方法不仅会耗费大量的人力物力，而且会造成养殖产品的食品安全问题，其流入市场后，体内残留的各种化学成分会对人体产生伤害，引起急慢性疾病。因此，亟需发明一种安全、有效的纤毛虫病的生物防治方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纤毛虫病的生物防治方法，将贪食纤口虫用于纤毛虫病的防治，可形成更加稳定的养殖系统，避免损失并降低成本，增加经济效益。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种纤毛虫病的生物防治方法，在养殖池中投放贪食纤口虫进行纤毛虫病防治；所述贪食纤口虫包括贪食纤口虫PJ13002。
优选的，所述贪食纤口虫PJ13002来源于青岛潮间带。
优选的，所述养殖池的温度为10～20℃，盐度为25～35‰，pH值为6～9。
优选的，以30亩养殖池为标准，所述贪食纤口虫的投放标准包括：当所述纤毛虫密度为0～5只/mL时，投放4000～6000只贪食纤口虫；当所述纤毛虫密度为6～50只/mL时，投放8000～12000只贪食纤口虫；当所述纤毛虫密度为51～200只/mL时，投放25000～35000只贪食纤口虫；当所述纤毛虫密度大于200只/mL时，投放95000～110000只贪食纤口虫。
优选的，所述纤毛虫包括盾纤类纤毛虫。
优选的，所述盾纤类纤毛虫包括海洋尾丝虫。
优选的，所述海洋尾丝虫包括海洋尾丝虫PJ20101A。
优选的，所述海洋尾丝虫PJ20101A来源于青岛潮间带。
优选的，所述养殖池养殖的动物包括大菱鲆、牙鲆、对虾、鲽鱼。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种纤毛虫病的生物防治方法：在养殖池中投放贪食纤口虫PJ13002进行纤毛虫病防治。本发明通过引入捕食性原生动物贪食纤口虫，在养殖系统中恢复自然界中存在的微生物食物链，实现纤毛虫病的生物防治，同时贪食纤口虫可直接被养殖动物摄食而不会引起病害，可形成更加稳定的养殖系统，避免损失并降低成本，增加经济效益，为防治纤毛虫病提供了新思路，具有良好的推广应用前景。
附图说明
图1为海洋尾丝虫PJ20101A和贪食纤口虫PJ13002的显微照片；A为贪食纤口虫PJ13002，比例尺＝50μm；B为海洋尾丝虫PJ20101A，比例尺＝10μm；
图2为14℃下，贪食纤口虫PJ13002对海洋尾丝虫PJ20101A的摄食试验结果；
图3为18℃下，贪食纤口虫PJ13002对海洋尾丝虫PJ20101A的摄食试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种纤毛虫病的生物防治方法：在养殖池中投放贪食纤口虫进行纤毛虫病防治；所述贪食纤口虫包括贪食纤口虫PJ13002。
本发明所述的生物防治，可将养殖池中的“饲料→养殖动物”简单能量传递转变为“饲料→细菌→病害纤毛虫→贪食纤口虫→养殖动物”生物防控路线，创造绿色安全健康的养殖条件，并可以为养殖动物增加多样化的食物来源，减少病害，提高经济收益。
本发明所述贪食纤口虫(Chaenea vorax)PJ13002来源于青岛潮间带，保藏于中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所进化基因组学实验室，株系号为PJ13002，保藏日期为2019年07月13日；保藏地址：山东省青岛市鱼山路5号。贪食纤口虫PJ13002的GenBank登录号为ON989824。
本发明所述贪食纤口虫PJ13002可用于防治水产养殖中盾纤类纤毛虫病，对水产养殖中的纤毛虫进行生物预防和杀灭，同时贪食纤口虫可直接被养殖动物摄食而不会引起病害，可形成一种基于生物防治的绿色养殖模式，减少病害，提高经济收益。
在本发明中，所述养殖池的温度优选为10～20℃，更优选为18℃，盐度优选为25～35‰，更优选为30‰，pH值优选为6～9，更优选为8。本发明所述贪食纤口虫PJ13002对温度、盐度及pH值适应范围广，生长条件与大菱鲆、牙鲆、对虾、鲽鱼的养殖条件相符合，可进行有效的捕食，从而进行生物防治。
本发明优选以30亩养殖池为标准，所述贪食纤口虫的投放标准优选包括：当所述纤毛虫密度为0～5只/mL时，优选投放4000～6000只贪食纤口虫，更优选为5000只；当所述纤毛虫密度为6～50只/mL时，优选投放8000～12000只贪食纤口虫，更优选为10000只；当所述纤毛虫密度为51～200只/mL时，优选投放25000～35000只贪食纤口虫，更优选为30000只；当所述纤毛虫密度大于200只/mL时，优选投放95000～110000只贪食纤口虫，更优选为100000只。
在本发明中，所述纤毛虫优选包括盾纤类纤毛虫；所述盾纤类纤毛虫优选包括海洋尾丝虫；所述海洋尾丝虫为海洋尾丝虫(Uronema marinum)PJ20101A(海洋尾丝虫PJ20101A的GenBank登录号为OP050455)；所述海洋尾丝虫PJ20101A(Uronema marinum)优选来源于青岛潮间带，保藏于中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所进化基因组学实验室，株系号为PJ20101A。
在本发明中，所述养殖池养殖的动物优选包括大菱鲆、牙鲆、对虾、鲽鱼。
本发明贪食纤口虫(Chaenea vorax)PJ13002和海洋尾丝虫(Uronema marinum)PJ20101A可通过https://iemb.ouc.edu.cn/19028/list.htm网站获得，并保证从申请日起二十年内向公众发放。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
病害盾纤类纤毛虫及捕食性纤毛虫分离、培养及鉴定
2017年12月从青岛潮间带分离出病害海洋尾丝虫PJ20101A。2019年7月分离出捕食性纤毛虫贪食纤口虫PJ13002。
采集潮间带的石莼及海水，测定其温度、盐度及pH值，使用口吸管配合解剖镜分离单只纤毛虫。单细胞传代，建立培养体系。
对海洋尾丝虫PJ20101A和贪食纤口虫PJ13002进行显微拍照，显微照片如图1。
进行分子鉴定，扩增18S rDNA(引物EukA5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；EukB5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3')片段后，进行Sanger测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，其分别与海洋尾丝虫及贪食纤口虫最为相似，因此命名。
实施例2
贪食纤口虫PJ13002习性
将贪食纤口虫PJ13002对温度(14-32℃)、盐度(10-40PSU)、pH值(6-11)等的范围进行了测试。
在三种温度(14℃、25℃、32℃)、七种盐度(10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰)及五种pH值(6.6、7.6、8.6、9.6、10.6)下对贪食纤口虫PJ13002进行温度适应范围试验，共有15个处理，每个处理下有3个平行样品，除了处理条件不同外，其他条件均相同，每组均加入3只贪食纤口虫PJ13002。
首先使用1个2L锥形瓶，加入1000ml大肠杆菌菌液(OD＝0.3)，然后加入约100000只海洋尾丝虫PJ20101A，25℃下静置培养4天后，混合均匀液体，准备45个90mm规格的培养皿，每个培养皿中20ml培养液。
1、温度
三种温度(14℃、25℃、32℃)，每个温度下设置三个培养皿，加入20ml培养液后，所有培养皿加入3只贪食纤口虫PJ13002后，放入对应温度，每天观察其长势，根据每个温度下的三个培养皿的观测到的纤口虫数量的平均值进行数据统计，具体结果见表1。
表1不同温度对贪食纤口虫PJ13002数量的影响(只)
Figure BDA0003801607270000051
由表1可知，贪食纤口虫PJ13002在14℃、25℃、32℃三种温度下均可生长，其在14℃下，纤口虫数量增长缓慢，但摄食活动频繁；在25℃时，纤口虫数量的显著增长，摄食活跃；32℃纤口虫数量的显著增长，但摄食不活跃。
2、盐度
七种盐度(10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰)，每个盐度下设置三个培养皿，每个培养皿加入20ml不同盐度的配制好的海水(灭菌海水稀释或者加入海盐配制)，将360ml海洋尾丝虫PJ20101A离心(1500g，5min)富集，等分加入每个培养皿，再在每个培养皿中加入3只贪食纤口虫PJ13002，常温下培养，每天观察其长势。
实验结果表明：贪食纤口虫PJ13002在10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰、40‰七种盐度下均可存活，但其在10‰、15‰、40‰低盐和高盐下，未见纤口虫数量的显著增长，摄食活动较少；在20‰、25‰、30‰盐度下，数量有显著增长，摄食活跃，其中30‰盐度下的纤口虫数量增长最为显著。
3、pH值
五种pH值(6.6、7.6、8.6、9.6、10.6)，每个pH值下设置三个培养皿，加入20ml培养液后，使用酸或碱调节其pH值，使其达到处理浓度，后每个培养皿加入3只贪食纤口虫PJ13002，常温下培养，每天观察其长势。
实验结果表明，贪食纤口虫PJ13002在五种pH值下均可存活，但6.6、10.6未见纤口虫数量的显著增长；7.6、8.6、9.6下纤口虫数量显著增长，摄食活跃。海水本身是一个缓冲系统，会自发恢复因生物生长改变的pH值，为贪食纤口虫PJ13002的存活和分裂提供稳定的pH微环境。
实验结果表明，贪食纤口虫PJ1300对温度、盐度及pH值生理学耐受范围广，生长条件与大菱鲆、牙鲆、对虾、鲽鱼的养殖条件相符合，可进行有效的捕食，从而进行生物防治。
实施例3
贪食纤口虫PJ13002摄食实验
在两种温度(14℃-海水养殖常用温度，18℃-病害纤毛虫爆发时的对应温度)下对贪食纤口虫PJ13002进行摄食试验，分为6组：每个温度下设置3个未加贪食纤口虫PJ13002的对照组和3个分别添加50只贪食纤口虫PJ13002的实验组。
首先使用6瓶100毫升锥形瓶，每个瓶中加入40mL大肠杆菌菌液(OD＝0.3)，然后加入约4000只海洋尾丝虫PJ20101A，14℃或18℃下静置培养2天后，实验组中每个锥形瓶加入50只贪食纤口虫PJ13002，每隔24小时彻底摇匀取样计数，测量海洋尾丝虫PJ20101A和贪食纤口虫PJ13002的密度。
密度的测量方法为：使用浮游生物计数板(Gridded Sedgewick Rafter,1mm2；400μL培养液+100μL波恩固定液)，在解剖镜下吸取100μL混合均匀的固定液体计数(N)。每个锥形瓶使用以下公式计算其密度：密度＝N/80×1000＝12.5N(只/mL)。
对3个对照组及3个实验组分别计算平均值，得到处理组及实验组密度，其中实验组密度为海洋尾丝虫PJ20101A+贪食纤口虫PJ13002的密度。具体结果见表2-3和图2-3。
表2 14℃摄食对照组和实验组的密度统计表
Figure BDA0003801607270000061
Figure BDA0003801607270000071
表3 18℃摄食对照组和实验组的密度统计表
Figure BDA0003801607270000072
由表2-3、图2-3可知，贪食纤口虫PJ13002可有效降低培养体系中海洋尾丝虫PJ20101A的数量，达到生物防治的效果。
实验例1
现场试验
天津一30亩养虾池养殖对虾，爆发盾纤类纤毛虫(密度150-200只/mL)后，在虾池四角各自投入30mL实施例3得到的贪食纤口虫PJ13002液体，7天后观测到发病池中盾纤类纤毛虫数量显著减少(密度1-3只/mL)。每隔7天在虾池四角各投入5mL实施例3得到的贪食纤口虫PJ13002液体，盾纤类纤毛虫一直控制在极低密度下(0-1只/mL)。最终，虾池的产量为850斤/亩。
按照以往经验来讲，未进行防治的虾池在爆发盾纤类病后，全池的对虾都会死亡，得不到产量。
由现场试验可知，本发明生物防治方法可以降低养殖池中盾纤类纤毛虫的数量，达到防治纤毛虫病的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种纤毛虫病的生物防治方法，其特征在于，在养殖池中投放贪食纤口虫进行纤毛虫病防治；所述贪食纤口虫包括贪食纤口虫PJ13002。
2.根据权利要求1所述的生物防治方法，其特征在于，所述贪食纤口虫PJ13002来源于青岛潮间带。
3.根据权利要求1所述的生物防治方法，其特征在于，所述养殖池的温度为10～20℃，盐度为25～35‰，pH值为6～9。
4.根据权利要求1所述的生物防治方法，其特征在于，以30亩养殖池为标准，所述贪食纤口虫的投放标准包括：
当所述纤毛虫密度为0～5只/mL时，投放4000～6000只贪食纤口虫；
当所述纤毛虫密度为6～50只/mL时，投放8000～12000只贪食纤口虫；
当所述纤毛虫密度为51～200只/mL时，投放25000～35000只贪食纤口虫；
当所述纤毛虫密度大于200只/mL时，投放95000～110000只贪食纤口虫。
5.根据权利要求1所述的生物防治方法，其特征在于，所述纤毛虫包括盾纤类纤毛虫。
6.根据权利要求5所述的生物防治方法，其特征在于，所述盾纤类纤毛虫包括海洋尾丝虫。
7.根据权利要求6所述的生物防治方法，其特征在于，所述海洋尾丝虫包括海洋尾丝虫PJ20101A。
8.根据权利要求6所述的生物防治方法，其特征在于，所述海洋尾丝虫PJ20101A来源于青岛潮间带。
9.根据权利要求1所述的生物防治方法，其特征在于，所述养殖池养殖的动物包括大菱鲆、牙鲆、对虾、鲽鱼。
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