CN115109162B - 含有间充质干细胞的药物组合物在减肥中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有间充质干细胞的药物组合物在减肥中的应用。本发明针对DPP4开发了特异性的单克隆抗体，所述抗体能够对胰岛β细胞具有促增殖和抗凋亡效果，将该单克隆抗体与脂肪间充质干细胞联用后能够进一步的增强肥胖小鼠的减肥效果以及降低血糖的效果，具有较好的应用前景和应用价值。

Description

含有间充质干细胞的药物组合物在减肥中的应用
技术领域
本申请涉及生物领域，更具体的涉及含有间充质干细胞的药物组合物在减肥中的应用。
背景技术
随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，人们的饮食结构和生活方式发生了很大的改变，由原来的“不够吃”，到现在的“肆意吃”，餐桌上的主食也由“清淡”转为了“油腻”，长此以往，这给居民健康带来了很多问题，其中慢性病患病率及死亡率呈现明显上升趋势。肥胖以体内脂肪推挤过多和(或)异常分布为特点，早在1948年就被列入国际疾病分类名单(ICD编码E66)。肥胖对人体健康危害的特点表现为渐进性和持续性的损伤。肥胖的治疗并无先进的医疗手段，也没有长期有效的方法。
研究发现肥胖总是伴随着一种慢性低度的炎症，肥胖者的内脏脂肪组织能释放大量的炎症因子，其中包括某些趋化因子如CCL2、CCL5以及IP-10等，也有较多报道肥胖患者血清中有较多的IGF-1、雌二醇、IL-1、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子TNF、瘦素及炎症反应因子等。因此如果能有效地减少或阻断因肥胖而导致的某些细胞因子或趋化因子等信号调控网络的过度活化就能极大地延缓肥胖促进肿瘤发生发展的效应。
脂肪组织中白色脂肪组织的堆积与胰岛素抵抗、血脂紊乱、糖尿病、心血管疾病相关；而棕色脂肪组织则相反，其最突出的生理功能是消耗能量、产生热量，对体温调节起重要作用，褐色脂肪组织与其相似。白色脂肪细胞与棕色脂肪细胞有共同的前体细胞，提高棕色脂肪细胞分化、减少白色脂肪细胞分化将增加能量消耗，有助于减肥，也为糖尿病、高血压等代谢紊乱提供新的治疗途径。因此脂肪组织是一个复杂的内分泌器官，肥胖导致分泌的脂肪因子水平改变及脂肪因子调节受损与代谢综合征的发生、发展密切相关，脂肪组织通过脂肪因子及脂肪代谢影响代谢综合征的发生和发展的全过程。脂肪细胞分泌的细胞因子主要包括瘦素、脂联素、内脂素和和趋化素等；此外，脂肪细胞表面表达多种受体介导其分化、成熟、代谢及凋亡，已知的主要受体包括胰岛素受体、瘦素受体、肿瘤坏死因子α受体、过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)、肾上腺素受体、肾上腺皮质激素受体等。
目前治疗肥胖病的药物按照其作用机制主要有食欲抑制剂和消化吸收阻滞剂，其他还包括降糖药物、代谢刺激剂和局部脂肪分解剂等。食欲抑制剂作用于中枢神经系统，是减肥药中的重要一类。食欲由下丘脑腹内侧的饱中枢与下丘脑外侧区的摄食中枢调节，中枢增强或抑制调节摄食功能主要是通过儿茶酚胺神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺(HT)等的变化。代表药物之一为苯丙胺及其类似物，包括甲基苯丙胺、苄甲苯丙胺、安非拉酮、右苯丙胺等，其作用机制是阻断神经末稍对去甲肾上腺素的再摄取的同时，促进中枢释放去甲肾上腺素，增加突触间隙的去甲肾上腺素含量，从而产生拟去甲肾上腺素的作用。消化吸收阻滞剂主要代表药物是奥利司他(Orlistat)，即赛尼可(xenieal)，目前是美国FDA批准的唯一非中枢作用减肥药，1999年获得FDA上市许可。2年后，CFDA也批准其在中国境内上市。奥利司他是一种强效的选择性胃肠道脂肪酶抑制剂，其作用机制是通过抑制胰酶、胃肠道中脂肪酶的作用，进而降低食物中脂肪的分解吸收。治疗剂量下，结合微低热量膳食，可使脂肪的吸收减少近30％，这种抑制作用可以造成200kcal的能量负平衡，从而使体重下降。α-糖苷酶抑制剂以阿卡波糖为例，阿卡波糖通过竞争性抑制小肠上皮细胞刷状缘上的α-葡萄糖苷酶活性而降低多糖的分解，延缓餐后肠道对葡萄糖吸收，有显著降低餐后血糖的作用，减轻餐后血糖过高对胰岛β细胞的刺激，增加胰岛素敏感性，改善IR。代谢刺激剂包括中枢兴奋药和激素类两种，此类药物的不良反应较多，在临床上应用受限制。其作用机制主要是通过提高代谢率，增加产热和促进脂肪分解。研究发现刺激β肾上腺素能受体的药物可促进人类脂肪细胞的脂解，而刺激α2肾上腺素能受体的药物则抑制脂解：提示β肾上腺素能激动剂和α2肾上腺素能拮抗剂可使局部脂肪组织动员，达到减肥目的。但是这些治疗药物的效果还有待于进一步的改善。
DPP4是一种新发现的脂肪因子，它表达于多种细胞的表面，也有溶解在血清中，近年来研究显示，肥胖的发生往往伴随着血清DPP4的升高，而DPP4的作用是显著促进肥胖及与肥胖相关的代谢综合征的发展。在肝脏疾病方面的研究发现，在病毒性肝炎、肝硬化以及肝癌病人的血清中DPP4浓度明显升高，而在病人的肝癌组织中的活性DPP4显示出异型性，包括扭曲复杂型和缺失型。据此，我们推测在肥胖促进肿瘤的发生发展过程中，血清DPP4活性可能是升高的，并且发挥着一系列生物学效应促进癌症的发生和发展；但其作用究竟是促进了肿瘤的发生以及发展的过程，还是起到了一种天然的抑制效应目前还不得而知。
DPP4抑制剂已经成为了新一代的降糖药，近年来被临床医生广泛接受用以治疗II型糖尿病；在2006年美国食品及药物管理局(FDA)首次批准DPP4抑制剂西格列汀(Sitagliptin)的应用。通常情况下，人体在饮食后小肠可释放胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和肠抑胃肽(GIP)入血，这些激素通过感受血糖进而调节胰岛素的合成与分泌、调节胰高血糖素(Glucagon)释放入学，进而形成一种较为复杂的机制进行负反馈调节血糖；由于一般情况下，胰高血糖素样肽-1和肠抑胃肽在血液内的半衰期极短，其受到DPP4的剪切而灭活，因此不能产生持久的促进胰岛素分泌以及调节血糖的效应；DPP4抑制剂正是通过抑制了DPP4的活性，从而减缓了其对胰高血糖素样肽-1和肠抑胃肽的灭活作用，使血液中的胰高血糖素样肽-1和肠抑胃肽浓度升高进而产生增加血清胰岛素的能力，同时抑制胰高血糖素的释放，达到降低II型糖尿病患者血糖的效果。目前已有5个DPP4抑制剂上市，包括较为常用的西格列汀和维格列汀等。
但是目前，针对DPP4开发的国产抑制剂的种类还不够多，可选的形式还不够丰富，因此，需要急迫的开发新的药物。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种减肥用的药物组合物。
具体的，本发明提供一种包含脂肪间充质干细胞和DPP4抑制剂的减肥用药物组合物。
进一步的，所述DPP4抑制剂是特异性针对DPP4的单克隆抗体。
进一步的，所述DPP4的单克隆抗体是2C9。该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTVSSNEQVYHHHLYWFLQRPGQSPQLLIYCYHNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCTQKLHEIMDFGSGTKLEIK
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
VKPGGSLKLSCAASRSRAEVVPMSWVRQTPDKRLEWVAIGHADASYTYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCQLRDMAGVYCIWGQGTTVTVS。
进一步的，本发明还提供了DPP4的单克隆抗体在制备用于减肥的药物组合物中的用途。
进一步的，本发明还提供了DPP4的单克隆抗体在制备用于减肥的药物组合物中的用途，其中进一步的还可以添加第二治疗剂用于增加减肥效果。
进一步的，本发明还提供了DPP4的单克隆抗体和脂肪间充质干细胞在制备用于减肥的药物组合物中的用途。
进一步的，本发明还提供了DPP4的单克隆抗体和脂肪间充质干细胞在制备用于治疗糖尿病合并肥胖症的减肥用的药物组合物中的用途。
进一步的，本发明的药物组合物还有有药学上可接受的载体。
所述药物组合物还包含一种或多种选自抗肥胖药物，食欲抑制剂，二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)抑制剂，脂肪酶抑制剂和II型糖尿病药物。
进一步的，示例性NSAID包括，但不限于，醋氯芬酸，醋美他辛，对乙酰氨基酚，乙酰苯胺，乙酰水杨酸，阿氯芬酸，阿米诺洛芬，氨基吡啶，氨匹罗昔康，氨托美汀，安替比林，阿帕酮，阿司匹林，氮丙嗪，苯甲酸酯，苯并沙洛芬，溴芬酸，丁氧酸，卡洛芬，塞来昔布，三水杨酸胆碱镁，西唑利林，氯地那酸，氯尼辛，氯吡那酸，考昔布，D-吲哚布芬，达普松，达布非龙，右旋酮洛芬，双氯芬酸，二氟甲磺酸，二吡喃酮，屈昔康，依托度酸，乙基多昔布，氰胺酯，芬布芬，氟虫腈，非诺洛芬，芬替扎克，氟吡腙，氟螨胺，氟虫酰胺酸，氟虫腈，氟虫腈，氟比洛芬，呋虫腈，杂芳基乙酸衍生物，布芬酸，布洛芬，吲哚美辛，吲哚洛芬，异丁基苯基丙酸，异氧杂环庚三烯，异昔康，酮洛芬，酮咯酸，利考非隆，洛莫昔康，洛索洛芬，鲁米考昔，甲氯芬，甲氯芬酸盐，甲氯芬酸，甲芬那敏，甲芬那酸，美洛昔康，水杨酸甲酯，米罗洛芬，莫非唑酸，萘丁酮，萘普生，萘普生钠，尼氟酸，尼美舒利，盐嗪，烯醇酸，奥昔康衍生物，奥昔平酸，奥昔布酮，对-氨基苯酚衍生物，帕瑞昔布，非那西丁，苯丁腙，哌洛芬，吡罗昔康，吡洛芬，匹伏昔康，鬼臼毒素衍生物，普拉洛芬，普拉泊洛芬，丙谷美辛，丙酸衍生物，吡唑啉酮衍生物，罗非考昔，水杨酸盐，水杨酸盐，水杨酸，水杨酸盐，甲氯芬酸钠，舒多昔康，磺胺嘧啶，舒林酸，舒洛芬，替诺昔康，噻洛芬酸，噻匹那酸，噻沙洛芬，替拉考昔，托芬那酸，托美汀，伐地考昔，扎托洛芬，齐度美辛，佐美吡C，其药理学盐，其水合物，及其溶剂化物。
进一步的，该药物组合物可制成注射剂，片剂，胶囊剂，颗粒剂，颗粒剂，口服剂等。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物在约2至约12小时或约1至约24小时的时间间隔内释放。或者，可以在大约3，大约4，大约5，大约6，大约7，大约8，大约9，大约10小时，大约11小时或大约12小时内释放。在其它实施方案中，活性剂在给药后约5至约8小时内释放。
在一些实施例中，本发明的药物组合物制备的缓释制剂包括由一种或多种惰性颗粒组成的活性核，每一个都呈珠状，颗粒，丸剂，颗粒，微胶囊，微球，微粒，纳米胶囊或纳米球在其表面上涂覆有例如含药涂层或成膜组合物形式的药物，所述含药涂层或成膜组合物使用例如流化床技术或本领域技术人员已知的其它方法。惰性颗粒可以是各种尺寸的，只要它足够大以保持溶解不良即可。或者，活性核可以通过将含有药物物质的聚合物组合物造粒和研磨和/或通过挤出和球化来制备。
本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的技术引入到惰性载体中，例如药物分层，粉末包衣，挤出球形化，辊压或造粒。药芯中的药物量将取决于所需的剂量，并且通常在约5-90重量％之间变化。通常，基于包衣颗粒的重量，活性核上的聚合物包衣将为约1-50％，这取决于所需的滞后时间和/或所选择的聚合物和包衣溶剂。本领域技术人员能够选择适当量的药物涂覆在芯上或掺入芯中以达到所需的剂量。在一个实施例中，无源核心可以是糖球或缓冲晶体或封装的缓冲晶体，如碳酸钙，碳酸氢钠，富马酸，酒石酸等。
在一些实施方案中，本发明的释放剂包括通过溶解控制释放来控制释放的聚合物。在一个特定的实施方案中，药物被掺入包含不溶性聚合物和涂覆有不同厚度的聚合物材料的药物颗粒或颗粒的基质中。所述聚合物材料可包含脂质屏障，所述脂质屏障包含蜡质材料，如骆驼蜡，蜂蜡，鲸蜡，烛树蜡，SHALLAC蜡，可可脂，鲸蜡硬脂醇，部分氢化植物油，蜡质，石蜡，蜡质，肉豆蔻醇，硬脂醇，鲸蜡醇和硬脂酸，以及表面活性剂如聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。当与水性介质如生物流体接触时，聚合物涂层在取决于聚合物涂层厚度的预定滞后时间之后乳化或侵蚀。滞后时间独立于胃肠动力，pH或胃滞留。在一些实施方案中，所述缓释制剂为口腔崩解片，粉末或液体悬浮液的形式。然而，一种或多种活性剂存在于包衣颗粒中或包埋于在所需时间内缓慢释放活性剂的颗粒中。
有益效果
本发明针对DPP4开发了特异性的单克隆抗体，所述抗体能够对胰岛β细胞具有促增殖和抗凋亡效果，将该单克隆抗体与脂肪间充质干细胞联用后能够进一步的增强肥胖小鼠的减肥效果以及降低血糖的效果，具有较好的应用前景和应用价值。
附图说明
图1单抗的特异性鉴定结果图
图2单抗的Western blot鉴定图
图3单抗对胰岛β细胞增殖的影响
图4单抗对胰岛β细胞早期凋亡的影响
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1DPP4单克隆抗体的制备
动物免疫：取浓度为1mg/ml的二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)重组蛋白(货号：FS-D3371，上海抚生实业有限公司)与等体积的完全弗氏佐剂混合，免疫3只BALB/c小鼠，0.2ml/只，两周后采用免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂完全混合，加强免疫，尾静脉采血用间接ELISA法检测抗体效价，选择效价较高的2号小鼠2周后腹腔冲击免疫。面冲击免疫后3天的小鼠处理后，取脾细胞进行细胞融合与杂交瘤细胞的筛选：免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞按PEG方法进行融合，置5％CO2，37℃培养。于融合后第9天用间接ELISA法对细胞培养上清进行抗体检测，选择抗体效价高的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆后凡是有细胞生长的孔的抗体检测均为阳性，且OD值(A值)相近，将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转至24孔板内扩大培养，获得了较好的获得了两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为2C9和7E13，ELISA法检测细胞培养上清抗体效价分别为1：20000(2C9株)和1∶40000(7E13株)。
腹水抗体的生产与纯化：将2C9和7E13杂交瘤细胞分别腹腔注射BALB/c小鼠，2×106个/只，10d后小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水，ProteinA亲和层析法对单克隆抗体进行初步纯化，ELISA法鉴定抗体的效价。纯化后的二个抗体效价分别都达到了106。
单克隆抗体特异性测定：包被免疫原DPP4重组蛋白、BSA、正常小鼠血清、大肠杆菌裂解液的酶标板，加入1:4000稀释的抗体。同时设阴性和空白对照孔。酶标仪测定A450nm。P/N[(一定稀释度的纯化抗体A450nm-空白对照A450nm)/(阴性对照A450nm-空白对照A450nm)]≥2.1为阳性。结果如图1所示。
从图1的ELISA体系的特异性鉴定结果可以看出，二株单抗针对DPP4蛋白的P/N值均大于2.1，为阳性，针对其他物质的检测结果为阴性，说明该体系能特异检测靶抗原蛋白。
单克隆抗体IgG亚类鉴定：将杂交瘤细胞上清原液加到已包被重组蛋白的酶标板，50μl/孔，37℃孵育1h。加入稀释的IgG分型二抗.50μl/孔，37℃孵育1h。再加入羊抗鼠HRP(1：5000)，50μl/孔，37℃孵育1h。最后加TMB显色，酶标仪测定A450nm。高值孔为抗体亚类。结果如表1所示。
表1抗体亚型鉴定
Figure BDA0003717333550000071
Figure BDA0003717333550000081
从表1的结果可以看出，2C9单抗是IgG1亚型，7E13单抗是IgG2a亚型，并且二者都是κ链。
实施例2DPP4单克隆抗体2C9特异性鉴定
单克隆抗体特异性鉴定：取重组DPP4蛋白以及对照蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，进行转移电泳，将蛋白条带转印到硝酸纤维素(NC)膜上。转印结束后.将NC膜放人单抗溶液中，37℃温浴lh，再浸人HRP标记的羊抗鼠IgG溶液中，37℃温浴lh，ECL超敏发光液作用3min，暗室曝光显影。结果如图2所示。
从图2的结果可以看出，本发明制备的2C9单克隆抗体具有较好的特异性结合DPP4的能力。
实施例3DPP4单克隆抗体2C9亲和力和序列鉴定
采用fortebio对单克隆抗体2C9的亲和力进行测定。具体地，采用抗鼠抗体Fc段的捕获抗体生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将抗体用PBS缓冲液稀释至4μg/mL，流经AHC探针表面，时间为120s。DPP4重组蛋白作为流动相，浓度分别为1、5、10、15、30、45和60nM。结合时间为100s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，抗原抗体结合的解离常数KD值为4.66nM，具有较好的亲和力。
将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物和Phusion试剂盒扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物；按照T载体克隆试剂盒说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。测序结果显示DPP4单克隆抗体2C9轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.1，重链可变区序列见SEQ ID NO.2所示。
实施例4DPP4单克隆抗体2C9对胰岛β细胞增殖的影响
小鼠胰β细胞株Min6(货号：C0883，上海冠导生物工程有限公司)细胞培养于含10％FBS的RPMI-1640培养基(含11.1mmol/L葡萄糖)中，在37℃、5％CO2环境下生长。当细胞融合度达80％～90％时，弃去培养液，加入0.25％胰酶，37℃消化约30s，加人10％FBS培养基中和胰酶，终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，形成单细胞悬液，吸取细胞悬液，1000转/min离心5min，弃去上清液，培养基重悬，以1：3比例在培养瓶中扩增培养，每2d更换培养液。LPS脂多糖能够诱导胰岛β细胞炎症反应，下述实验以脂多糖作为诱导剂。
实验分组：空白对照组、脂多糖组(1μg/mL)、2C9单抗组(10μg/mL)、阳性对照组(脂多糖(1μg/mL)+西格列汀(10μg/mL))、协同实验组：2C9单抗10μg/mL+脂多糖(1μg/mL)。CCK-8比色法检测细胞增殖：取对数生长期细胞接种于96孔板，待细胞完全贴壁后，按实验分组予不同干预试剂同时处理细胞，继续在37℃、5％CO2环境中培养96h,随后每孔加入1OμlCCK-8试剂，于37℃孵育2h后.使用酶标仪检测450nm的吸光度值。
从图3的结果可以看出，与对照组相比，高浓度的脂多糖组明显抑制Min6细胞的增殖；2C9单抗单独的与Min6细胞作用后，与空白对照相比，也能够明显的促进Min6细胞的增殖；与对照组相比，脂多糖+2C9单抗协同实验组与阳性对照组脂多糖+西格列汀各组一样相对于单独的脂多糖组，均对Min6细胞表现出促增殖效应，差异具有统计学意义(P<0.05)。而且，脂多糖+2C9单抗协同实验组的OD值达到了(0.74±0.03)，比脂多糖组的(0.53±0.04)显著提高。
实施例5DPP4单克隆抗体2C9对胰岛β细胞早期凋亡的影响
膜联蛋白V(AnnexinV)/碘化丙啶(propidiumiodide.PI)染色流式细胞术检测细胞凋亡：取对数生长期的人胰岛β细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后。按实施例5相同的分组以及药物处理96h后，24h后胰酶消化，收集所有细胞.1000转/min离心10min，弃除培养基，PBS漂洗后制备成1×105个/ml的单细胞悬液，加入AnnexinV-FITC室温孵育10min，漂洗后加20μg/ml PI，流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况(AnnexinV+/PI-细胞群)。结果如图4所示。
如图4所示，脂多糖组凋亡率显著高于对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。而采用2C9单抗处理后，细胞凋亡率相对于空白对照组是有下降的，阳性对照组以及2C9单抗和脂多糖组都相对于单独脂多糖处理组也有明显的细胞凋亡率降低的效果，2C9单抗和脂多糖组的凋亡率也只有(8.21±0.03)％。
实施例6DPP4单克隆抗体2C9对胰岛β细胞IL-6表达的影响
RT-PCR检测白细胞介素6(IL-6)mRNA表达情况：取对数生长期人胰岛β细胞细胞接种于6孔板中，按实施例5相同的分组以及药物处理96h后，提取细胞总RNA，酶标仪检测浓度后按试剂盒说明操作逆转录合成cDNA。选用管家基因GAPDH作为对照。建立10ul PCR反应体系，取1μL cDNA模板，加入各引物0.5μL，同时选择GAPDH基因作为内参，实验条件为如下:95℃10min，58℃20s,72℃30s，共循环30次。具体的引物为AFP上游引物：GCTGGTGGTGGATGAAACA，下游引物:TCCTCTGTTATTTGTGGCTTTTG；IL-6上游引物：AAATTCGGTACATCCTCGAC，下游引物：CAGGAACTGGATCAGGACTT；以GAPDH为内参基因，上游引物：AGCCACATCGCTCAGACAC；下游引物：GCCCAATACGACCAAATCC。扩增IL-6及GAPDH后，于琼脂糖凝胶中电泳，而后于紫外透视仪中观察电泳条带并拍照。应用ImageJ软件分析条带光密度.以IL-6与GAPDH条带的光密度比值表示IL-6mRNA水平。结果如表1所示。
表1各组IL-6mRNA水平(IL-6/GAPDH)
各组 IL-6/GAPDH
空白对照组 0.004±0.001
脂多糖组 1.527±0.120
2C9单抗组 0.513±0.006
阳性对照组 0.530±0.063
2C9单抗和脂多糖实验组 0.365±0.022
RT-PCR检测IL-6mRNA结果显示：LPS脂多糖组细胞内IL-6mRNA表达水平高于空白对照组；2C9单抗组、阳性对照组以及2C9单抗和脂多糖实验组明显低于LPS组；阳性对照组和2C9单抗和脂多糖实验组较空白对照组IL-6mRNA表达水平仍升高，差异具有统计学意义，但与LPS组相比明显下降，特别是2C9单抗和脂多糖实验组的表达量下降更为显著。
胰岛IL-6适量升高可能是维持胰岛β细胞功能的生理需要，是抵抗其他炎症因子损伤胰岛β细胞的一种保护机制，西格列汀和本发明的2C9单抗都是作为DPP4抑制剂的一种，可能通过干扰LPS激活NF-κB通路降低IL-6表达而实现对胰岛β细胞的抗炎保护作用。
实施例7脂肪间充质干细胞的制备
人皮下脂肪组织样本由北京协和医院提供，并与患者签署知情同意书。将去除血管、筋膜的脂肪组织置于平皿中，PBS洗3次后剪碎，加人2倍体积胶原蛋白酶I,37℃消化60min，终止消化后于细胞筛上过滤，1500r/min离心5min收集细胞后以2x105个/mL的浓度接种于培养瓶中，置于37℃,5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，根据细胞细胞贴壁情况，12d全量换液1次。待细胞增殖达80％-90％时，按1:3的比例传代记为P1。免疫荧光法检测鉴定hADSCs:将处理好的干净盖片，置入6孔板内。以2x105个/mL浓度将hADSCs接种到盖片上。待细胞汇合达70％-80％时，4％多聚甲醛室温固定20min,1xPBS洗涤5min并重复3次，1％牛血清白蛋白室温封闭30min后，按1:100的比例稀释一抗CD90,CD105,CD34,CD45覆盖盖玻片表面并置人湿盒内，4℃过夜后，1xPBS洗涤5min。二抗室温孵育1h后，DAPI染色1min,95％甘油封片，置于荧光显微镜下观察。结果显示，95％以上的hADSCs表达CD90和CD105。但几乎不表达CD45，CD34，表明分离制备脂肪间充质干细胞成功。
实施例8脂肪间充质干细胞联合2C9单抗降低血糖、体重实验
体重约为20g健康的昆明小鼠，适应性饲养一周后，每日上午给予腹腔注射浓度为5mg/ml的STZ溶液，按体重每天注射35mg/kg，连续注射3天，小鼠饮用自来水，饲以小鼠高脂高糖饲料。对照组小鼠，每日腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。小鼠饮用自来水，饲以小鼠常规饲料。每天观察饮水进食情况，造模后每天检测一次体重，造模每周检测一次血糖，选择小鼠血糖值达到11.1mmol/L时，且总胆固醇水平明显升高的小鼠作为模型组。
(1)正常对照组：昆明小鼠10只正常饮食，不做处理。
(2)模型组：模型组昆明小鼠10只正常饮食，每周腹腔注射生理盐水200μl，共3次。不做处理。
(3)脂肪间充质干细胞治疗组：模型组昆明小鼠10只正常饮食，每周腹腔注射脂肪间充质干细胞1.0×106，200μl(生理盐水作为溶剂)，共3次治疗。
(4)脂肪间充质干细胞联合单抗治疗组：模型组昆明小鼠10只正常饮食，每周腹腔注射脂肪间充质干细胞1.0×106，200μl(生理盐水作为溶剂)，共3次治疗；间隔2h后注射单克隆抗体2C9 100μg/只，共3次治疗。
(5)脂肪间充质干细胞联合西格列汀治疗组：模型组昆明小鼠10只正常饮食，每周腹腔注射脂肪间充质干细胞1.0×106，200μl(生理盐水作为溶剂)，共3次治疗；间隔2h后注射西格列汀100μg/只，共3次治疗。以上各组治疗后的小鼠，治疗1周后称量小鼠体重，减去治疗前的体重，得到整个治疗期间的净增重量，结果如下表2所示。
表2各组小鼠净增重量(g)
各组 增重量(g)
正常对照组 8.24±0.12
模型组 16.56±0.24
脂肪间充质干细胞治疗组 10.76±0.17
脂肪间充质干细胞联合单抗治疗组 8.52±0.07
脂肪间充质干细胞联合西格列汀治疗组 9.25±0.13
结果如表2所示，经AD-MSC移植治疗组小鼠与模型组相比体重明显减轻(P<0.05)，而且脂肪间充质干细胞联合单抗治疗组比脂肪间充质干细胞联合西格列汀治疗组具有更好的减重效果。
将治疗后的小鼠，禁食10小时后，尾部取血，滴在血糖试纸的反应端，通过血糖测试仪显示出血糖浓度。
表3各组小鼠血糖值
Figure BDA0003717333550000121
Figure BDA0003717333550000131
从表3的结果可以看出，采用脂肪间充质干细胞联合单抗或者西格列汀都可以导致模型组表现出显著的降低小鼠血糖的作用，与模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。其中AD-MSC联合单抗的治疗效果也要好于AD-MSC联合西格列汀。这充分说明，本发明的单抗与脂肪间充质干细胞具有较好的协同作用，能够显著的提高干细胞的治疗效果。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
序列表
<110> 北京仁立竞合生物科技有限公司
<120> 含有间充质干细胞的药物组合物在减肥中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Val Ser Ser Asn Glu Gln
            20                  25                  30
Val Tyr His His His Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Cys Tyr His Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Gln Lys
                85                  90                  95
Leu His Glu Ile Met Asp Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser
1               5                   10                  15
Arg Ala Glu Val Val Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys
            20                  25                  30
Arg Leu Glu Trp Val Ala Ile Gly His Ala Asp Ala Ser Tyr Thr Tyr
        35                  40                  45
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Asp
    50                  55                  60
Lys Gln Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
65                  70                  75                  80
Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Asp Met Ala Gly Val Tyr Cys Ile
                85                  90                  95
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
            100                 105

Claims (5)

1.一种针对DPP4的单克隆抗体2C9，其特征在于该抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：
DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTVSSNEQVYHHHLYWFLQRPGQSPQLLIYCYHNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCTQKLHEIMDFGSGTKLEIK
重链可变区的氨基酸序列为：
VKPGGSLKLSCAASRSRAEVVPMSWVRQTPDKRLEWVAIGHADASYTYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCQLRDMAGVYCIWGQGTTVTVS。
2.权利要求1所述的针对DPP4的单克隆抗体2C9在制备用于治疗糖尿病合并肥胖症的减肥用的药物组合物中的用途。
3.权利要求1所述的针对DPP4的单克隆抗体2C9和脂肪间充质干细胞在制备用于治疗糖尿病合并肥胖症的减肥用的药物组合物中的用途。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于药物组合物含有药学上可接受的载体。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于药物组合物制成注射剂型。
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