CN115109067A - 倍半萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及倍半萜类化合物及其制备方法和应用。倍半萜类化合物，包括：式(1)或式(2)所示结构的化合物，或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物。本发明首次提出该化合物，并发现该化合物在农药等领域具有广泛应用。
Figure DDA0003738605270000011

Description

倍半萜类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，尤其涉及倍半萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
植物在长期进化中，为了提高自身竞争力，会向环境中释放一些物质，这些物质会对周围其他植物的生长造成影响，如抑制发芽及根系发育等等，这些物质就是化感物质。化感物质因没有残留或毒性作用，在杂草控制以及可持续发展农业上的应用已经成为备受关注的研究热点。
苣荬菜(Sonchus wightianus)为菊科(Compos itae)苦苣菜属(Sonchus)植物。苣荬菜几遍全球分布，生长在海拔300-2300米的山坡草地、林间草地、潮湿地或近水旁、村边或河边砾石滩等。苣荬菜以全草入药。有清热解毒，利溼排脓，凉血止血之功效。此外，苣荬菜还可以作为一种可食用植物，含有许多膳食纤维、B族维生素以及胡萝卜素,而且含有氨基酸的营养物质,能够促进胃液分泌帮助消化,而且还可以缓解便秘的症状,可以增强人体免疫力和体质,有利于人体健康。
迄今为止，国内外研究者已从苣荬菜植物中分离得到多种结构类型化合物，主要包括萜类(单萜、倍半萜等)、甾体类、苯丙素类以及脂肪酸类等。倍半萜类物质具有抗肿瘤、消炎等生物活性。
目前，未见有本发明化合物的相关报道，更未见有将本发明化合物用于除草和抗植物病原真菌的农用活性的相关报道。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供倍半萜类化合物及其制备方法和应用。该结构的化合物提取自苣荬菜，是新型的倍半萜类化合物，具有很好的农药应用价值，可以为除草和抗植物病原真菌提供更多的药物选择途径，且安全性好，有利于环保。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供倍半萜类化合物，包括：式(1)所示结构的化合物，或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，
Figure BDA0003738605250000021
采用上述方案的有益效果包括：本发明提供的化合物是一种新型的倍半萜类化合物，具有很好的农药应用价值，可以用于除草和抗植物病原真菌。此外，该化合物来源于药食两用植物苣荬菜，相比合成农药来说，该化合物在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，对人类及其他非靶标生物安全、环境相容性好，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要。
本发明提供倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：以苣荬菜为原料，利用乙醇提取，得到乙醇浸膏；将乙醇浸膏采用硅胶柱色谱，以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱得到馏分；将馏分采用硅胶柱色谱，依次以石油醚-乙酸乙酯和石油醚-丙酮洗脱，得到式(1)所示结构的倍半萜类化合物。
所述苣荬菜可以为苣荬菜干燥全草。正己烷-丙酮中，正己烷、丙酮的体积比可以为8:1；石油醚-乙酸乙酯中，石油醚、乙酸乙酯的体积比可以为8:1；石油醚-丙酮中，石油醚、丙酮的体积比可以为15:2。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以成功制备式(1)所示的倍半萜类化合物。
本发明提供倍半萜类化合物，包括：式(2)所示结构的化合物，或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，
Figure BDA0003738605250000031
采用上述方案的有益效果包括：本发明提供的化合物是一种新型的倍半萜类化合物，具有很好的农药应用价值，可以用于除草和抗植物病原真菌。此外，该化合物来源于药食两用植物苣荬菜，相比合成农药来说，该化合物在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，对人类及其他非靶标生物安全、环境相容性好，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要。
本发明提供上述倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：以苣荬菜为原料，利用乙醇提取，得到乙醇浸膏；将乙醇浸膏采用硅胶柱色谱，以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱得到馏分；将馏分采用硅胶柱色谱，依次以正己烷-乙酸乙酯和石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到式(2)所示结构的倍半萜类化合物。
所述苣荬菜可以为苣荬菜干燥全草。正己烷-丙酮中，正己烷、丙酮的体积比可以为3:1；正己烷-乙酸乙酯中，正己烷、乙酸乙酯的体积比可以为13:2；石油醚-乙酸乙酯中，石油醚、乙酸乙酯的体积比可以为11:2。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述方法可以成功制备式(2)所示的倍半萜类化合物。
本发明提供一种农药，包括上述倍半萜类化合物。所述倍半萜类化合物可以为式(1)所示结构的倍半萜类化合物，也可以为式(2)所示结构的倍半萜类化合物，也可以为二者的混合。
采用上述方案的有益效果包括：采用以式(1)、式(2)所示结构的倍半萜类化合物制备的农药，对除草和抗植物病原真菌效果好。本发明提供的式(1)、式(2)所示的化合物由药食两用植物苣荬菜提取分离而获得，对人体比较安全；式(1)、式(2)所示的化合物来源于天然植物，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性。
本发明对于剂型没有特别要求，可以根据实际需要进行选择。在具体应用时，还可以添加辅料。所述辅料可以为药学上可接受的辅料。
进一步，所述农药可以为液体制剂，倍半萜类化合物的质量浓度为0.5-5wt％。例如：式(1)所示结构的倍半萜类化合物在液体制剂中质量浓度可以为0.5-5wt％，式(2)所示结构的倍半萜类化合物在液体制剂中质量浓度可以为0.5-5wt％，式(1)所示结构的倍半萜类化合物与式(2)所示结构的倍半萜类化合物的混合物在液体制剂中质量浓度可以为0.5-5wt％。
采用上述方案的有益效果包括配置简单、对环境几乎没有污染，发挥其除草和抑制植物病原真菌的活性。
进一步，所述农药可以为可湿性粉剂，倍半萜类化合物的质量浓度为15-30wt％。例如：式(1)所示结构的倍半萜类化合物在可湿性粉剂中的含量可以为15-30wt％，式(2)所示结构的倍半萜类化合物在可湿性粉剂中的含量可以为15-30wt％，式(1)所示结构的倍半萜类化合物与式(2)所示结构的倍半萜类化合物的混合物在可湿性粉剂中的含量可以为15-30wt％。
在具体应用时，可以采用以下配方：倍半萜类化合物粉末15-25wt％，白炭黑15-25wt％，十二烷基硫酸钠2-8wt％，CMC十二烷基硫酸钠0.5-2wt％和拉开粉1-6wt％，凹凸棒土余量。
上述倍半萜类化合物粉末可以为式(1)所示结构的倍半萜类化合物粉末和/或式(2)所示结构的倍半萜类化合物粉末。
也可以根据具体的应用的情况调整配方中各组分的种类以及配比。
采用上述方案的有益效果包括：采用上述配比，有利于使化合物结构更加稳定，有利于保存和制备除草剂和杀菌剂，发挥其除草和抑制植物病原真菌的活性。
本发明提供上述倍半萜类化合物在制备农药中的应用。
采用上述方案的有益效果包括：以式(1)、式(2)作为有效成分制备的新型植物源除草剂和杀菌剂，产品毒性低、残留少，使用安全，对环境友好，可极大地减轻对各种天敌的毒害作用，对生态环境的损害和污染较小，可以有效控制作物生产中常见杂草及病原真菌，达到稳产增产、提高品质等效果。
本发明提供上述倍半萜类化合物在防治杂草和/或防治植物病原真菌中的应用。
例如，可以用于防治反枝苋和/或藜，可以用于防治链格孢菌、稻瘟病菌、尖孢镰刀菌、球孢炭疽菌、致病疫霉中的一种或几种，也可以用于防治因链格孢菌、稻瘟菌、尖孢镰刀菌、球孢炭疽菌、致病疫霉中的一种或几种导致的病害。
除草活性的检测结果表明，式(1)所示结构的倍半萜类化合物、式(2)所示结构的倍半萜类化合物均对反枝苋和藜都有不同程度的抑制活性。并且发明人意外的发现式(1)所示结构的倍半萜类化合物对灰藜发芽抑制活性性优于现有商业除草剂醚苯磺隆，式(2)所示结构的倍半萜类化合物对反枝苋发芽抑制活性和对茎生长抑制活性优于现有商业除草剂醚苯磺隆。可以进一步制备成除草农药。
抗植物病原真菌活性的检测结果表明，式(1)所示结构的倍半萜类化合物、式(2)所示结构的倍半萜类化合物对链格孢菌、稻瘟菌、尖孢镰刀菌、球孢炭疽菌和致病疫霉均表现出显著的抗真菌活性(MIC值为32-128μg/mL)。
附图说明
图1为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的1H NMR谱图。
图2为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的13C NMR谱图。
图3为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的核磁共振COSY光谱图。
图4为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的核磁共振HSQC光谱图。
图5为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的核磁共振HMBC光谱图。
图6为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的NOESY信号图。
图7为式(1)所示化合物(Sonarvenolide B)的HRESIMS质谱图。
图8为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的1H NMR谱图。
图9为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的13C NMR谱图。
图10为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的核磁共振COSY光谱图。
图11为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的核磁共振HSQC光谱图。
图12为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的核磁共振HMBC光谱图。
图13为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的NOESY信号图。
图14为式(2)所示化合物(Sonarvenolide C)的HRESIMS质谱图。
具体实施方式
本发明涉及倍半萜类化合物及其制备方法和应用。该化合物具有式(1)、式(2)所示结构。
Figure BDA0003738605250000071
具有式(1)或式(2)所示结构的化合物的晶型、立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂合物、前体药物、代谢产物等均在本发明保护范围内。
上述倍半萜类化合物的制备方法可以包括以下步骤：
(1)将苣荬菜干燥全草利用乙醇提取，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏采用硅胶柱色谱，以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱得到馏分；正己烷-丙酮中，正己烷、丙酮的体积比(15:1)至(3:1)；
(3)将步骤(2)获得的馏分继续采用硅胶柱色谱，依次以石油醚-乙酸乙酯(石油醚、乙酸乙酯体积比8:1)和石油醚-丙酮(石油醚、丙酮体积比15:2)洗脱，得到式(1)所示结构倍半萜类化合物；
将步骤(2)获得的馏分继续采用硅胶柱色谱，依次以正己烷-乙酸乙酯(正己烷、乙酸乙酯体积比13:2)和石油醚-乙酸乙酯(石油醚、乙酸乙酯体积比11:2)洗脱，得到式(2)所示结构倍半萜类化合物。
具体地，可以采用下面的制备方法，包括以下步骤：
(1)取苣荬菜干燥全草，粉碎，用乙醇回流提取，合并提取液减压浓缩得乙醇浸膏；
(2)取步骤(1)所得乙醇浸膏，采用硅胶柱色谱，分别以正己烷-丙酮体积比15:1、8:1、5:1、3:1为洗脱剂进行梯度洗脱，得到四个组分分别为FA-FD，其中，以正己烷-丙酮为洗脱剂(正己烷、丙酮体积比为8:1)进行洗脱所获的洗脱液作为馏分FB，以正己烷-丙酮为洗脱剂(正己烷、丙酮体积比为3:1)进行洗脱所获的洗脱液作为馏分FD，经薄层色谱进行检测，显色，合并相同洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
(3)将步骤(2)中FB组分再经硅胶柱色谱，以体积比为的石油醚-乙酸乙酯溶剂(石油醚、乙酸乙酯的体积比为8:1)洗脱，薄层色谱检测,显色，合并相同洗脱部位，得到五个馏分FBA-FBE，其中FBA馏分为第1个柱体积洗脱馏分，FBB馏分为第2个柱体积洗脱馏分，FBC馏分为第3个柱体积洗脱馏分,FBD馏分为第4-5个柱体积洗脱馏分,FBE馏分为第6-8个柱体积洗脱馏分；取FBB馏分，以石油醚-丙酮溶剂(石油醚、丙酮的体积比为15:2)洗脱，得到式(1)的化合物。
(4)将步骤(2)中FD组分再经硅胶柱色谱，以正己烷-乙酸乙酯溶剂(正己烷、乙酸乙酯体积比为13:2)洗脱，薄层色谱检测，显色，合并相同洗脱部位，得到三个馏分FDA-FDC，其中FDA馏分为第2-3个柱体积洗脱馏分，FDB馏分为第4-5个柱体积洗脱馏分，FDC馏分为第6个柱体积洗脱馏分；取FDB馏分，以石油醚-乙酸乙酯溶剂(石油醚、乙酸乙酯体积比为11:2)洗脱，得到式(2)的化合物。
本发明首次提供上述倍半萜类化合物，并发现上述化合物在农药等领域具有广泛应用。上述从苣荬菜提取分离的化合物可以在除草和抗植物病原真菌中的应用。
以下通过实施例对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明所述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
若无特殊说明，本发明所使用的原料、设备均为已知产品，可以通过购买市售产品获得。
实验材料：
药材：苣荬菜于2017年9月采自黑龙江省鸡西市，鉴定为菊科苦苣菜属植物苣荬菜(Sonchus wightianus DC.)的干燥全草。
试剂和填料：
柱层析硅胶，200-300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶GF254(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于北京化工厂。
商用除草剂醚苯磺隆购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；
马铃薯葡萄糖(PD)培养基购自阿拉丁试剂(上海)有限公司
多菌灵购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。
链格孢菌(Alternaria alternate)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、球孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)均保存于山东省果树研究所，可由公众仅用于非商业目的重复本发明实施例的内容。
实验仪器：Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；Nicolet 5700红外光谱仪(美国Thermo公司)；Perkin-Elmer 341旋光测定仪(美国PerkinElmer)；BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
实施例1制备本发明所述化合物
1、成分的分离纯化：
(1)取苣荬菜干燥全草7.2kg，粉碎后，用乙醇回流提取4次，合并提取液，减压浓缩得到乙醇浸膏300g；
(2)取步骤(1)中所得乙醇浸膏，采用硅胶柱色谱(柱层析硅胶，200-300目(试剂级))，分别以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱，正己烷-丙酮中正己烷、丙酮的体积比分别为15:1、8:1、5:1、3:1，经薄层色谱进行检测，显色，合并相同洗脱部分，得到4个组分，FA-FD。其中，FA为正己烷-丙酮(正己烷、丙酮的体积比15:1)洗脱获得的馏分，FB为正己烷-丙酮(正己烷、丙酮的体积比8:1)洗脱获得的馏分，FC为正己烷-丙酮(正己烷、丙酮的体积比5:1)洗脱获得的馏分，FD为正己烷-丙酮(正己烷、丙酮的体积比3:1)洗脱获得的馏分,共4个组分。
(3)将步骤(2)中FB组分再经硅胶柱色谱(柱层析硅胶，200-300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂，硅胶柱色谱的柱体积约为6L)，以石油醚-乙酸乙酯溶剂(石油醚、乙酸乙酯体积比为8:1)洗脱，薄层色谱检测，10％硫酸乙醇显色剂显色，根据Rf值和显色颜色合并相同洗脱部分，得到五个馏分FBA-FBE，其中FBA馏分为第1个柱体积洗脱馏分，FBB馏分为第2个柱体积洗脱馏分，FBC馏分为第3个柱体积洗脱馏分,FBD馏分为第4-5个柱体积洗脱馏分,FBE馏分为第6-8个柱体积洗脱馏分。
(4)将步骤(3)中所得FBB馏分，采用石油醚-丙酮溶剂(石油醚、丙酮的体积比为15:2)洗脱,得到化合物Sonarvenolide B(也可以称为化合物1)。
(5)将步骤(2)中FD组分再经硅胶柱色谱(柱层析硅胶，200-300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂，硅胶柱色谱的柱体积约为6L)，以正己烷-乙酸乙酯溶剂(正己烷、乙酸乙酯体积比为13:2)洗脱，薄层色谱检测，10％硫酸乙醇显色剂显色，根据Rf值和显色颜色合并相同洗脱部分，得到3个馏分FDA-FDC，其中FDA馏分为第2-3个柱体积洗脱馏分，FDB馏分为第4-5个柱体积洗脱馏分，FDC馏分为第6个柱体积洗脱馏分。
(6)将步骤(5)中所得FDB馏分，以石油醚-乙酸乙酯溶剂(石油醚、乙酸乙酯体积比为11:2)洗脱,得到化合物Sonarvenolide C(也可以称为化合物2)。
2、化合物的鉴定：
在分离得到化合物后，对其理化性质和分子结构进行了鉴定，得到化合物1和化合物2为倍半萜类化合物，化合物1的谱图结果如图1至图7所示，其中，图1为化合物1的核磁氢谱，图2为化合物1的核磁碳谱，图3为化合物1的核磁二维氢氢相关图谱，图4为化合物1的核磁二维碳氢相关图谱，图5为化合物1的核磁二维碳氢远程相关图谱，图6为化合物1的核磁二维氢氢空间远程相关图谱，图7为化合物1的高分辨质谱图谱。化合物2的谱图结果如图8至图14所示,其中，图8为化合物2的核磁氢谱，图9为化合物2的核磁碳谱，图10为化合物2的核磁二维氢氢相关图谱，图11为化合物2的核磁二维碳氢相关图谱，图12为化合物2的核磁二维碳氢远程相关图谱，图13为化合物2的核磁二维氢氢空间远程相关图谱，图14为化合物2的高分辨质谱图谱。
其具体理化性质和波谱数据如下：
Sonarvenolide B(1):黄色不定型固体；[α]25 D＝+32.3(c 0.2,MeOH)；IR(KBr)νmax3448,1777,1634,1381and 1033cm-1；HR-ESI-MS[M+NH4]+m/z 284.1860(calcd,C15H26NO4,284.1862).
Sonarvenolide C(2):黄色不定型固体；[α]25 D＝+8.6(c 0.2,MeOH)；ECD(CH3CN)λmax(Δε)220(+8.3),288(+2.1)nm；IR(KBr)νmax 3423,1777,1652,1384and 1055cm-1；HR-ESI-MS[M+NH4]+m/z 300.1808(calcd,C15H26NO5,300.1811).
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表1。
核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表1。
表1 Sonarvenolide B-C的1H-NMR(600MHz)、13C-NMR(150MHz)核磁数据(测定溶剂：CDCl3；δ：ppm；J：Hz)
Figure BDA0003738605250000121
经上述鉴定，化合物Sonarvenolide B(化合物1)的结构式如式(1)所示，Sonarvenolide C(化合物2)的结构式如式(2)所示。
Figure BDA0003738605250000122
Figure BDA0003738605250000131
为了说明本发明的有益效果，本发明进一步提供以下实施例。
实施例2对反枝苋和灰藜除草活性测定
(1)样品的配制：
分别以化合物Sonarvenolide B和Sonarvenolide C为待测化合物，以商用除草剂醚苯磺隆为对照。
待测化合物及商用除草剂醚苯磺隆分别用丙酮溶解制备成浓度为1000μM的母液。用0.1％(V/V)吐温-80水溶液稀释待测化合物及商用除草剂醚苯磺隆，保证最终待测化合物中有机溶剂含量不超过1％(V/V)。
(2)生物活性测定：
将反枝苋和灰藜的种子在0.6％KMnO4溶液中灭菌15分钟。采用种子萌发测定实验方法，以24孔法评价化合物对反枝苋和灰藜的除草作用。每盘播种10粒种子，每盘代表一个重复。进行了三次实验。将板在25℃下孵育，统计种子发芽率，使用数显卡尺测量枝条和根部的长度。并用SPSS软件计算出药剂的IC50。
(3)生测结果：
表2 Sonarvenolide B-C对反枝苋和藜的除草活性(IC50,μM)
Figure BDA0003738605250000132
试验结果表明，从表2的数据可以看出，Sonarvenolide B-C对反枝苋和藜都有不同程度的抑制活性。并且发明人意外的发现Sonarvenolide B对灰藜发芽抑制活性性优于现有商业除草剂醚苯磺隆，Sonarvenolide C对反枝苋发芽抑制活性和对茎生长抑制活性优于现有商业除草剂醚苯磺隆。可以进一步制备成除草农药。
相对于商业除草剂醚苯磺隆，Sonarvenolide B-C来源于一种药食两用植物苣荬菜，对人体相对安全，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要的优点。
实施例3抗植物病原真菌活性测试
(1)样品的配置：
分别以化合物Sonarvenolide B和Sonarvenolide C为待测化合物，以商用杀菌剂多菌灵为对照。
待测化合物及商用杀菌剂多菌灵分别用有机溶剂丙酮溶解制备成浓度为104μg/mL的母液。用0.1％(V/V)吐温-80水溶液分别稀释待测化合物及商用杀菌剂多菌灵，保证最终待测化合物中有机溶剂含量不超过1％(V/V)。
(2)病原真菌的准备：
链格孢菌(Alternaria alternate)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、球孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)为主要病原菌来测试抗真菌活性。
(3)生物活性测定：
用马铃薯葡萄糖(PD)培养基用微量肉汤稀释法测定96孔板的抗真菌活性。简单地说，每个纯化的化合物从256μg/mL开始依次稀释到含有真菌病原体孢子悬浮液(1×106CFU)的96孔板的孔中，用微量肉汤稀释法测定抗真菌活性。以多菌灵为阳性对照。在28±0.5℃黑暗中培养3d后，以最低抑菌浓度(MIC)作为试验化合物在96孔板中的最低浓度下无微生物生长。在所调查的所有浓度下，对每种化合物进行三次重复测定。
(4)生测结果：
表3 Sonarvenolide B-C抗植物病原真菌活性(MIC,μg/mL)
Figure BDA0003738605250000151
A.a.,Alternaria alternate(链格孢菌)；P.o.,Pyricularia oryzae(稻瘟病菌)；F.o.,Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)；C.g.,Colletotrichum gloeosporioides(胶孢炭疽菌)；P.i.,Phytophthora infestans(马铃薯晚疫病菌)
表3数据表明，化合物Sonarvenolide B-C对链格孢菌、稻瘟菌、尖孢镰刀菌、球孢炭疽菌和致病疫霉均表现出显著的抗真菌活性(MIC值为32-128μg/mL)。尤其，Sonarvenolide B和Sonarvenolide C对马铃薯晚疫病菌的抗菌活性要优于多菌灵。
相对于商业杀菌剂多菌灵，Sonarvenolide B-C来源于一种药食两用植物，对人体相对安全，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要的优点。
实施例4：可湿性粉剂
配方(重量比)：实施例1所得化合物的粉末20％，白炭黑20％，十二烷基硫酸钠5％，CMC十二烷基硫酸钠1％和拉开粉3％，凹凸棒土余量。实施例1所得化合物可以为式(1)所示化合物，也可以为式(2)所示化合物，还可以为式(1)所示化合物和式(2)所示化合物的混合物。
可湿性粉剂制备方法包括以下步骤：
将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机中，粉碎到150目以上，水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5。即可制得含量为20％的实施例1所得化合物的可湿性粉剂。
Sonarvenolide B-C可湿性粉剂对反枝苋和灰藜除草活性测定
(1)样品的配制：
取适量的Sonarvenolide B-C可湿性粉剂，加入水，制备有效成分为1000μM的Sonarvenolide B-C水溶液母液。商用除草剂醚苯磺隆用丙酮溶解制备成浓度为1000μM的母液。活性测定时用适量水将Sonarvenolide B-C可湿性粉剂及商用除草剂醚苯磺隆稀释至所需浓度。
(2)生物活性测定：
将反枝苋和灰藜的种子在0.6％KMnO4溶液中灭菌15分钟。采用种子萌发测定实验方法，以24孔法评价化合物对反枝苋和灰藜的除草作用。每盘播种10粒种子，每盘代表一个重复。进行了三次实验。将板在25℃下孵育，统计种子发芽率，使用数显卡尺测量枝条和根部的长度。并用SPSS软件计算出药剂的IC50。
表4 Sonarvenolide B-C可湿性粉剂对反枝苋和藜的除草活性(IC50,μM)
Figure BDA0003738605250000161
试验结果表明，从表4的数据可以看出，Sonarvenolide B-C可湿性粉剂对反枝苋和藜都有不同程度的抑制活性。并且发明人意外的发现Sonarvenolide B可湿性粉剂对灰藜发芽抑制活性性优于现有商业除草剂醚苯磺隆，Sonarvenolide C可湿性粉剂对反枝苋发芽抑制活性和对茎生长抑制活性优于现有商业除草剂醚苯磺隆。可以进一步制备成除草农药。
相对于商业除草剂醚苯磺隆，Sonarvenolide B-C可湿性粉剂中的主要成分Sonarvenolide B、Sonarvenolide C来源于药食两用植物苣荬菜，对人体相对安全，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要的优点。
Sonarvenolide B-C可湿性粉剂抗植物病原真菌活性测试
(1)样品的配置：
取适量的Sonarvenolide B-C可湿性粉剂，加入水，制备有效成分为104μg/mL的Sonarvenolide B-C水溶液母液。商用除草剂醚苯磺隆用丙酮溶解制备成浓度为104μg/mL的母液。活性测定时用适量水将Sonarvenolide B-C可湿性粉剂及商用除草剂醚苯磺隆稀释至所需浓度。
(2)病原真菌的准备：
链格孢菌(Alternaria alternate)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、球孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)为主要病原菌来测试抗真菌活性。
(3)生物活性测定：
用马铃薯葡萄糖(PD)培养基用微量肉汤稀释法测定96孔板的抗真菌活性。简单地说，每个纯化的化合物从256μg/mL开始依次稀释到含有真菌病原体孢子悬浮液(1×106CFU)的96孔板的孔中，用微量肉汤稀释法测定抗真菌活性。简单地说，每个纯化的化合物从256μg/mL开始依次稀释到含有真菌病原体孢子悬浮液(1×106cfu)的96孔板中。以多菌灵为阳性对照。在28±0.5℃黑暗中培养3d后，以最低抑菌浓度(MIC)作为试验化合物在96孔板中的最低浓度下无微生物生长。在所调查的所有浓度下，对每种化合物进行三次重复测定。
(4)生测结果：
表5 Sonarvenolide B-C可湿性粉剂抗植物病原真菌活性(MIC,μg/mL)
Figure BDA0003738605250000181
A.a.,Alternaria alternate(链格孢菌)；P.o.,Pyricularia oryzae(稻瘟病菌)；F.o.,Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)；C.g.,Colletotrichum gloeosporioides(胶孢炭疽菌)；P.i.,Phytophthora infestans(马铃薯晚疫病菌)
表5数据表明，可湿性粉剂Sonarvenolide B-C对链格孢菌、稻瘟菌、尖孢镰刀菌、球孢炭疽菌和致病疫霉均表现出显著的抗真菌活性(MIC值为32-128μg/mL)。尤其，Sonarvenolide B可湿性粉剂和Sonarvenolide C可湿性粉剂对马铃薯晚疫病菌的抗菌活性要优于多菌灵。
相对于多菌灵，Sonarvenolide B-C可湿性粉剂中的主要成分Sonarvenolide B、Sonarvenolide C来源于药食两用植物苣荬菜，对人体相对安全，在环境中易于降解，具有低毒低残留特性，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要的优点。
本发明提供制剂的水中分散性、稀释液稳定性、冷热贮稳定性符合商品农药制剂的要求。并且经验证具有很好的除草和抑制植物病原真菌能力。
综上所述，本发明提供两种倍半萜类化合物及其提取分离方法，该化合物由于其独特的化学结构，并从常用中药苣荬菜中提取出来，实验结果表明其具有除草和抗植物病原真菌活性，因此作为植物源天然产物在农药领域具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.倍半萜类化合物，其特征在于，包括：式(1)所示结构的化合物，或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，
Figure FDA0003738605240000011
2.权利要求1所述倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以苣荬菜为原料，利用乙醇提取，得到乙醇浸膏；将乙醇浸膏采用硅胶柱色谱，以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱得到馏分；将馏分采用硅胶柱色谱，依次以石油醚-乙酸乙酯和石油醚-丙酮洗脱，得到式(1)所示结构的倍半萜类化合物。
3.倍半萜类化合物，其特征在于，包括：式(2)所示结构的化合物，或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，
Figure FDA0003738605240000012
4.权利要求3所述倍半萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以苣荬菜为原料，利用乙醇提取，得到乙醇浸膏；将乙醇浸膏采用硅胶柱色谱，以正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱得到馏分；将馏分采用硅胶柱色谱，依次以正己烷-乙酸乙酯和石油醚-乙酸乙酯洗脱，得到式(2)所示结构的倍半萜类化合物。
5.一种农药，其特征在于，包括权利要求1所述倍半萜类化合物和/或权利要求3所述倍半萜类化合物。
6.根据权利要求5所述农药，其特征在于，还包括辅料。
7.根据权利要求5或6所述农药，其特征在于，所述农药为液体制剂，倍半萜类化合物的质量浓度为0.5-5wt％。
8.根据权利要求5或6所述农药，其特征在于，所述农药为可湿性粉剂，倍半萜类化合物的质量浓度为15-30wt％。
9.权利要求1所述倍半萜类化合物和/或权利要求3所述倍半萜类化合物在制备农药中的应用。
10.权利要求1所述倍半萜类化合物和/或权利要求3所述倍半萜类化合物在防治杂草和/或防治植物病原真菌中的应用。
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