CN115108998B - 用于抗乙型肝炎病毒的化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新筛到的化合物AD80、WS3及其衍生物在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用。还公开了NTRK2作为药物靶点在制备药物中的用途，所述药物用于治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症，以及NTRK2作为药物作用靶点在筛选治疗治疗乙型肝炎感染性疾病或病症的药物中的应用。本发明筛选到的化合物有望应用于靶向cccDNA的药物，使患者达到乙肝临床治愈，具有重要意义。并且本发明经实验证实AD80通过抑制NTRK2活性，从而抑制HBV复制，NTRK2可作为抗HBV的一种新靶点，为研发抗乙型肝炎病毒的药物提供了新的思路。

Description

用于抗乙型肝炎病毒的化合物及其应用
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，具体涉及一种用于抗乙型肝炎病毒的化合物及其应用。
背景技术
尽管乙肝疫苗的接种，已使得全球乙肝病毒(HBV)感染者数量大为减少，但我国目前仍有慢性感染者约7000万，其中需要治疗的乙肝患者约2000-3000万。现有乙肝治疗药物，包括长效干扰素和6种核苷类似物，能有效控制病情进展，然而，在有限疗程内达到临床治愈(或功能性治愈)者仍然极少。从HBsAg阴转这一临床治愈的核心指标来看，单独使用核苷类似物治疗，HBsAg的年阴转率(非累积阴转率)通常不到1％，仅与未经治疗者的自然年阴转率接近。基于现有各种抗乙肝药物，形成的联合、序贯等优化治疗方案，对临床治愈率的提高同样很有限。大幅度提高乙肝治愈率，需要依靠新型抗乙肝药物的开发。
达到乙肝临床治愈的最关键点，是清除或者失活HBV cccDNA。这是因为，cccDNA是病毒感染细胞后进行复制的起点，是HBV各种mRNA的转录模板，其持续存在正是慢乙肝难以治愈的根本原因。现有的药物，核苷类似物的靶点是逆转录过程，对cccDNA无直接影响；干扰素据报道可以促进cccDNA降解，抑制其转录，但作用微弱。
发明内容
靶向cccDNA的策略，可以是清除cccDNA，或者使cccDNA失活，前者涉及数量，后者涉及功能。从功能上看，cccDNA最主要的功能，是作为HBV RNA的转录模板。因此，抑制cccDNA的功能，很大程度上是抑制其转录功能。为了筛选抑制cccDNA转录的药物，发明人前期构建了一种模拟cccDNA转录的细胞模型，即核心启动子驱动的染色体外稳定表达模型(中国发明专利申请202110351152.6)。利用该模型，通过多轮筛选，我们从化合物库中，筛选到两种能有效抑制HBV转录的化合物，Triciribin(TCN)和5-Iodotubercidine(5-IT)。本发明以这两种化合物的功能为出发点，继续获得了一系列具有较好抗乙肝病毒效果的化合物。基于此，本申请保护如下技术方案：
一种化合物，其选自以下化合物中的一种:
Figure BDA0003752907040000021
本发明还保护一种药物组合物，含有作为活性成分的上述的化合物及药学上可接受的载体。
本发明还保护上述的化合物或药物组合物在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用。
本发明还保护式I所示的化合物在在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用，
Figure BDA0003752907040000031
本发明还保护式II所示的化合物在在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用，
Figure BDA0003752907040000032
在上述的应用中，上述的化合物1-9通过作用于HBV RNA转录过程抑制HBVDNA复制。
在上述的应用中，式I所示的化合物或式II所示的化合物通过抑制HBV RNA转录过程来抑制HBV复制。
式II所示的化合物通过抑制NTRK2活性抑制HBV复制。
本发明还保护NTRK2作为药物靶点在制备药物中的用途，所述药物用于治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症。
本发明还保护NTRK2作为药物作用靶点在筛选治疗乙型肝炎感染性疾病或病症的药物中的应用，所述的应用为非治疗目的。
本发明的有益效果是：筛选到作用于HBV RNA转录过程来抑制HBV复制的化合物WS3，在WS3的基础上合成了其9种衍生物，发现其中8种都具有良好的抗HBV活性，其中化合物6的SI达到2242，具有很好的应用前景，化合物2、4的SI也达到了298、322。通过研究分析WS3的抗HBV作用机理，对183种酪氨酸激酶抑制剂进行多轮筛选，获得了一个新的抗HBV分子AD80，经实验证实AD80通过抑制核心启动子的转录活性来抑制HBV复制，AD80对细胞内HBV DNA抑制的IC50为5.3nM(CC50>50μM)，也具有良好的应用前景。本发明筛选到的化合物有望应用于靶向cccDNA的药物，使患者达到乙肝临床治愈，具有重要意义。并且本发明经实验证实AD80通过抑制NTRK2活性，从而抑制HBV复制，NTRK2可作为抗HBV的一种新靶点，为研发抗乙型肝炎病毒的药物提供了新的思路。
附图说明
图1是其他4种Akt抑制剂对HBV核心启动子转录的影响结果。
图2是8种被用做腺苷激酶抑制剂的化合物对Hep-pcore-Gluc细胞中的荧光素酶活性的影响。
图3是78种不同激酶抑制剂对Hep-pcore-Gluc细胞中的荧光素酶活性的影响的筛选。
图4是用不同浓度的WS3处理HepG2.2.15细胞对细胞内HBVDNA和HBVpgRNA的影响(a)及对上清中的HBsAg和HBeAg的影响(b)。
图5是WS3处理的Southern blot和Northern blot检测结果。
图6是WS3对不同启动子的表达抑制作用。
图7是WS3和5-IT的激酶扫描分析结果。
图8是酪氨酸激酶筛选结果(HBeAg)。
图9是AD80对HepG2.2.15细胞模型中HBV复制的影响。
图10是AD80对NTCP-HepG2细胞模型中HBV复制的影响。
图11是AD80对HepG2.2.15细胞内HBVRNA降解速率的作用。
图12是AD80对HepAD38细胞中HBVRNA降解速率的作用。
图13是AD80对不同启动子的抑制作用。
图14是AD80与4种阴性药物的酪氨酸激酶谱交叉分析。
图15是7种酪氨酸激酶基因敲低对HBV复制指标的影响。
图16是AD80对体外NTRK2活性的抑制实验。
图17是NTRK2敲低抑制HBV复制实验结果。
图18是Altiratinib抑制HBV复制实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂。
实施例1
1、TCN的抗乙肝病毒作用靶点并非Akt
我们之前已发现TCN具有抗HBV活性(中国发明专利申请202110351152.6)。由于TCN常常被用做蛋白激酶Akt的抑制剂，因此我们推测TCN的抗HBV作用可能通过抑制Akt来进行。为了验证这一假设，我们又测试了其他4种被用做Akt抑制剂的化合物，分别为GSK690693,MK-2206,Ipatasertib,CCT128930。然而，这四种化合物并不能抑制Hep-pcore-Gluc细胞(参考中国发明专利ZL 201710493255.X)中的荧光素酶活性，其中MK-2206处理HepG2.2.15细胞后，甚至增强了HBV的复制(图1)。这些结果提示，TCN抑制HBV复制的作用，与其抑制Akt的活性无关。
2、5-IT的抗乙肝病毒作用靶点并非腺苷激酶
我们之前发现TCN的结构类似物5-IT也具有较好的抗HBV活性(中国发明专利申请202110351152.6)。由于5-IT常被用做腺苷激酶的抑制剂，因此我们推测其抗HBV作用可能与腺苷激酶有关。为了验证这一假设，我们又测试了其他8种被用做腺苷激酶抑制剂的化合物，分别为Theophylline-7-acetic acid,Aminophyline,Proxyphylline,CGS21680 HCl,ZM241385,A2AR antagonist 1,Adenosine dialdehyde,Adenosine。然而，这8种化合物并不能显著抑制Hep-pcore-Gluc细胞中的荧光素酶活性(图2)。这些结果提示，5-IT抑制HBV复制的作用，与其抑制腺苷激酶的活性无关。
3、以TCN和5-IT的药理作用为线索，筛选到抗乙肝分子WS3
根据5-IT和TCN的结构，它们属于I型激酶抑制剂。也就是说，二者抑制HBV的活性，有可能是通过抑制某种激酶来实现的，虽然并非前述的Akt和腺苷激酶。基于这种假设，我们又对78针对不同激酶的抑制剂进行了筛选。结果发现，其中一种化合物WS3，在处理Hep-pcore-Gluc细胞后，能较强地抑制荧光素酶(Gluc)活性，且表现出剂量依赖性，而其他化合物无此效果(图3)。
4、WS3的抗HBV活性测试
为了进一步验证筛选到的化合物WS3的抗HBV效应，用不同浓度的WS3处理HepG2.2.15细胞，然后检测各种HBV复制指标的变化。化合物WS3的化学结构式如式I所示，化学名称为：N-(6-(4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙基甲酰胺,英文名称为：
N-(6-(4-(3-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-3-(trifluoromethyl)phenyl)ureido)phenoxy)pyrimidin-4-yl)cyclopropanecarboxamide.
Figure BDA0003752907040000061
结果如图4所示，随着WS3浓度增加，细胞内HBV DNA(IC50＝2.3nM)和HBV pgRNA被显著抑制，这种抑制效应并非细胞毒性所致(CC50＝6.8μM)。同时，细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg也能被剂量依赖性地抑制。我们提取了细胞内的核心颗粒相关HBV DNA，并用Southern blot检测，结果显示HBVDNA的确被显著抑制(图5a)。提取细胞内总RNA，然后用Northern blot检测HBV RNA,结果显示，各种HBV RNA均能被WS3剂量依赖性地抑制(图5b)，说明WS3抑制HBV转录；而作为对照的恩替卡韦(ETV)，能显著抑制HBV DNA，但对HBV RNA无显著影响。这些结果提示，在HepG2.2.15细胞中，WS3的确具有良好的抗HBV活性，且其作用机制显然不同于恩替卡韦，可能作用于HBVRNA转录过程。
为了进一步确定WS3的作用环节，我们将3种由不同启动子驱动的3xFlag-HBc表达质粒(参见中国专利ZL 201810198418.6)转染HepG2细胞，然后用不同浓度WS3处理48小时，然后用Western blot检测3xFlag-HBc表达情况。结果如图6所示，200nM浓度范围内，WS3能剂量依赖性地降低由HBV核心启动子驱动的3xFlag-HBc表达，而对另外两种启动子，pCMV和pSV40，驱动的表达则抑制作用较弱或无显著抑制作用，提示WS3的确作用于启动子的转录过程，并且具有一定的启动子特异性。
实施例2WS3衍生物的合成与抗HBV效果评价
为了发现抗HBV效果更好的分子，我们合成了9种WS3的衍生物，并评价了这些衍生物的抗HBV活性。
一、化合物1的合成
(1)N-(6-氯嘧啶-4-基)环丙甲酰胺的合成
Figure BDA0003752907040000062
取6-氯嘧啶-4-胺(10.0g,77.19mmol)溶于120mL无水四氢呋喃中，加入19mL N,N-二甲基异丙胺，搅拌并在冰浴下慢慢滴加环丙甲酰氯(9.68g,92.68mmol)。滴加完毕后常温反应12h。反应完毕后减压蒸馏浓缩反应液，加水并快速搅拌，过滤所得悬浊液，干燥滤饼得灰白色固体即为目标产物N-(6-氯嘧啶-4-基)环丙甲酰胺(12.6g,63.76mmol)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),8.75(d,J＝1.0Hz,1H),8.11(d,J＝1.0Hz,1H),2.05(tt,J＝7.6,4.7Hz,1H),0.92–0.88(m,4H)。
(2)N-(6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺的合成
Figure BDA0003752907040000071
取4-氨基苯酚4.4g(40.48mmol)溶于无水四氢呋喃中，加入叔丁醇钾4.09g(36.43mmol)在60℃下搅拌0.5h，加入N-(6-氯嘧啶-4-基)环丙甲酰胺6g(30.36mmol)，回流反应过夜，然后将反应液浓缩，用NaOH-水-乙醇混合溶液溶解，低温下(-20℃)结晶，过滤并干燥，得褐色固体5.37g，目标产物N-(6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺不经进一步纯化直接投入下一步使用。
(3)N-(6-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺(本发明化合物1)的制备
Figure BDA0003752907040000072
取N-(6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺100mg溶于8mL二氯甲烷中，加入4-氯-3-三氟甲基异氰酸苯酯81.97mg和1滴N,N-二异丙基乙胺，常温下搅拌反应6h，过滤反应液得白色固体107mg，即为目标产物N-(6-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),9.19(s,1H),8.94(s,1H),8.51(d,J＝1.0Hz,1H),8.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.66(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),7.56–7.49(m,3H),7.17–7.10(m,2H),2.03(tt,J＝7.4,4.9Hz,1H),0.89–0.81(m,4H).
二、化合物2(N-(6-(4-(3-(4-甲氧基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙烷甲酰胺))的合成
Figure BDA0003752907040000073
称取155mg三光气溶于二氯甲烷，冰浴搅拌并加入100mg 4-甲氧基-3-三氟甲基苯胺和519μL N,N-二异丙基乙胺，反应2h，减压蒸馏除去溶剂，再次溶于二氯甲烷并加入141mgN-(6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺,常温反应6h，过滤反应液，得到目标产物(化合物2)136mg，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),8.80(s,2H),8.51(d,J＝1.0Hz,1H),7.85(d,J＝2.6Hz,1H),7.59(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),7.54–7.48(m,3H),7.22(d,J＝9.0Hz,1H),7.15–7.09(m,2H),3.86(s,3H),2.02(ddt,J＝12.6,10.2,5.1Hz,1H),0.89–0.81(m,4H).
三、化合物3-6的合成
(1)4-硝基苯基(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯的合成
Figure BDA0003752907040000081
取N-(6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺2g溶于二氯甲烷中，加入4-硝基氯甲酸苯酯1.57g(7.77mmol),吡啶833μL，常温下下搅拌反应24h，溶液变成白色悬浊液，过滤得白色固体，即为目标产物4-硝基苯基(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯。
(2)N-(6-(4-(3-(4-甲基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺(本发明化合物3)的合成
Figure BDA0003752907040000082
称取200mg 4-硝基苯基(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯溶于二氯甲烷并搅拌，加入88.5mg 4-甲基-3-三氟甲基苯胺和72mgN,N-二异丙基乙胺，常温反应8h，过滤反应液得白色固体83mg即为目标产物N-(6-(4-(3-(4-甲基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),9.41(s,1H),9.27(s,1H),8.51(d,J＝1.0Hz,1H),7.94(d,J＝2.3Hz,1H),7.55–7.43(m,8H),7.40(dd,J＝8.2,2.3Hz,2H),7.34(d,J＝8.3Hz,1H),7.14–7.10(m,2H),2.38(d,J＝1.9Hz,3H),2.03(ddd,J＝7.3,5.8,3.7Hz,1H),0.84(td,J＝4.5,3.1Hz,4H).
以与本发明化合物3同样的制备方法制得本发明化合物4-6，其结构和1H NMR如表1中所示。化合物4为N-(6-(4-(3-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙烷甲酰胺、化合物5为4-(3-(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)脲基)-2-(三氟甲基)苯甲酸、化合物6为4-(3-(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)脲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺。
其中，4-(3-(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)脲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(本发明化合物6)的合成方法如下：
Figure BDA0003752907040000083
称取200mg 4-硝基苯基(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)氨基甲酸酯溶于二氯甲烷并搅拌，加入95.3mg 4-氨基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺和83mgN,N-二异丙基乙胺，常温反应8h，过滤反应液得白色固体95mg即为目标产物4-(3-(4-((6-(环丙烷甲酰胺基)嘧啶-4-基)氧基)苯基)脲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),9.01(s,1H),8.52(d,J＝1.0Hz,1H),7.58–7.43(m,4H),7.24(d,J＝8.3Hz,1H),7.19–7.07(m,3H),6.89(d,J＝2.3Hz,1H),6.73(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),5.79(s,2H),2.02(ddd,J＝10.5,7.3,5.1Hz,1H),0.91–0.78(m,4H).
表1化合物4-6的化学结构式和1H NMR
Figure BDA0003752907040000091
四、化合物7的合成
Figure BDA0003752907040000092
取100mg N-(6-(4-(3-(4-羧基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺、25mg N-乙基哌嗪、83mg HATU溶于二氯甲烷，搅拌并加入30mg N,N-二异丙基乙胺，常温下反应10h。反应完成后减压蒸馏除去溶剂，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，经过柱层析得到目标产物N-(6-(4-(3-(4-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)环丙甲酰胺(化合物7)109mg，为白色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.25(s,1H),9.83(s,1H),9.52(s,1H),8.51(d,J＝0.9Hz,1H),8.06(d,J＝2.2Hz,1H),7.67(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.61–7.45(m,3H),7.35(d,J＝8.3Hz,1H),7.22–7.07(m,2H),3.61(t,J＝14.5Hz,2H),3.23–3.02(m,2H),2.44(d,J＝6.4Hz,1H),2.38–2.29(m,4H),2.21(d,J＝11.1Hz,1H),2.03(tt,J＝7.2,5.2Hz,1H),0.99(td,J＝7.2,5.0Hz,3H),0.91–0.76(m,4H).
五、化合物8-9的合成
(1)6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-胺的合成
Figure BDA0003752907040000101
取4氨基苯酚5.05g溶于无水四氢呋喃，加入6.5g叔丁醇钾，60℃下搅拌0.5h，加入4-氨基-6-氯嘧啶5g，回流反应过夜，反应完成后，蒸馏除去溶剂，残渣经过柱层析得目标产物6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-胺。
(2)1-(4-((6-氨基嘧啶-4-基)氧基)苯基)-3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲的合成
Figure BDA0003752907040000102
取3-三氟甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]苯胺1.5g(5.49mmol)溶于二氯甲烷中，加入4-硝基氯甲酸苯酯1.16g(5.76mmol),吡啶618μL，常温下下搅拌反应4h，待反应完成后不进行进一步处理直接加入6-(4-氨基苯氧基)嘧啶-4-胺1.16g,继续反应24h，待反应完成后，减压蒸馏除去大部分溶剂，残渣经过柱层析得到目标产物1-(4-((6-氨基嘧啶-4-基)氧基)苯基)-3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲483mg，为淡黄色固体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.18(s,1H),9.00(s,1H),8.07(d,J＝0.8Hz,1H),7.98(d,J＝2.2Hz,1H),7.63–7.58(m,2H),7.54–7.49(m,2H),7.11–7.04(m,2H),6.81(s,2H),5.68(d,J＝0.9Hz,1H),3.53(s,2H),3.05(s,2H),2.39(dt,J＝4.0,1.9Hz,8H),2.16(s,3H).
(3)叔丁基3-((6-(4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(本发明化合物8)的合成
Figure BDA0003752907040000103
取1-(4-((6-氨基嘧啶-4-基)氧基)苯基)-3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲300mg、1-叔丁氧羰基-3-羧基氮杂环丁烷120mg、N,N,N',N'-四甲基氯甲脒六氟磷酸盐(TCFH)201mg，N-甲基咪唑123mg溶于乙腈中，搅拌并在常温下反应12h，反应完成后减压蒸馏除去溶剂，乙酸乙酯萃取3次，有机相经过柱层析得到白色固体，即为目标产物叔丁基3-((6-(4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)氨基甲酰基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(本发明化合物8)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.06(s,1H),9.08(s,1H),8.92(s,1H),8.51(d,J＝1.0Hz,1H),7.98(d,J＝2.2Hz,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,1H),7.60–7.50(m,4H),7.16–7.11(m,2H),3.94(d,J＝36.5Hz,4H),3.61(tt,J＝8.8,5.8Hz,1H),3.53(s,2H),2.42(s,8H),2.16(s,3H),1.38(s,9H).
采用制备化合物8类似的方法制得本发明化合物9，化合物9为白色固体。化合物9为N-(6-(4-(3-(4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)嘧啶-4-基)乙酰胺。
六、化合物1-9的抗HBV效应评价
在合成上述化合物后，在HepG2.2.15细胞模型中，检测其对HBV DNA复制的抑制效果以及细胞毒性，结果如表2所示。
表2 9种WS衍生物的抗HBV活性测试结果
Figure BDA0003752907040000111
从表2的结果可知，除了化合物5外，其余化合物都表现出对HBV的抑制作用，具有一定的应用前景，化合物6的SI值最高，为2242。
实施例3
1、WS3及5-IT激酶扫描分析
如前所述，TCN、5-IT和WS3均为激酶抑制剂。然而，TCN、5-IT和WS3对HBV的抑制作用，很可能并非通过通常认为的靶激酶来抑制HBV复制。通常而言，绝大多数激酶抑制剂均不具有高度特异性，即可能同时抑制多种激酶。为了弄清这些药物的作用靶点，我们对抗HBV效果较好的WS3和5-IT进行了激酶扫描。也就是逐一测试WS3(100nM)和5-IT(1μM)对373种激酶活性的抑制率，然后分析二者分别或者共同对哪些类型的激酶有较高的抑制活性。激酶扫描实验委托法国eurofins公司完成。
激酶结果显示(图7)，5-IT的靶激酶(抑制率>50％)相对分散，包括CMGC、TK、TKL、STE、CK1等，除了CMGC类稍多以外，其余几类无显著集中趋势。WS3的激酶谱集中趋势明显，虽然CMGC、STE及TKL类激酶中有少量激酶可被抑制，但大多数集中在TK类。由于WS3的抗HBV效应较强，因此我们认为，WS3的抗HBV作用，有可能与抑制了某些酪氨酸激酶(TK)有关。
2、酪氨酸激酶抑制剂的富集筛选
上述激酶扫描分析结果提示，抗HBV效应较强的WS3，在100nM浓度下的主要靶激酶集中到酪氨酸激酶(TK)这一类。这一方面使靶点筛选范围缩小到TK(约90种)，另一方面，也为筛选性质得到改善的其他药物分子提供了方向。因此，我们接下来又在酪氨酸激酶抑制剂中进行了富集筛选。我们挑选了183种酪氨酸激酶抑制剂，并在HepG2.2.15细胞模型中对其进行了筛选。筛选浓度为100nM和500nM，检测指标为HBeAg和HBsAg。图8显示了HBeAg的检测结果，可见数种化合物能剂量依赖性地抑制HBeAg水平。
3、AD80的抗HBV活性评价
通过对上述183种酪氨酸激酶抑制剂的多轮筛选，我们最终获得了一个新的抗HBV分子AD80，化学名称是1-(4-(4-氨基-1-异丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯基)-3-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲，其化学结构式如式II所示：
Figure BDA0003752907040000121
为了评价该分子的抗HBV效应，我们用不同浓度AD80处理HepG2.2.15细胞，然后检测各种指标的变化情况。结果如图9所示，随着AD80浓度增加，细胞培养上清中HBsAg，HBeAg逐渐降低(图9a)；细胞内HBV DNA和HBV RNA水平也呈剂量依赖性降低(图9b)。
我们又用另一种细胞模型，即NTCP-HepG2乙肝病毒感染模型来评价了AD80的抗HBV效果。结果显示(图10)，随着AD80浓度增加，细胞培养上清中HBsAg，HBeAg以及细胞内HBV DNA和HBVRNA水平均呈现剂量依赖性降低。对细胞内HBV DNA抑制的IC50为5.3nM(CC50>50μM)。这些结果提示，AD80的确能抑制细胞模型中HBV的复制，并且这种效应可能是通过抑制HBV转录过程来实现的。
为了明确AD80对HBV RNA的抑制作用机制，我们用7-Aminoactinomycin D(7-氨基放线菌素D)处理HepG2.2.15细胞后，检测细胞内HBV RNA的衰减情况。结果显示(图11)，用AD80(200nM)处理的细胞与对照(DMSO处理)相比，HBV RNA的衰减速度并无明显变化。这一结果提示，AD80并不能加快HBV RNA降解速度。进一步，我们用四环素处理HepAD38细胞，使源于细胞基因组的HBVpgRNA转录停止，然后检测细胞内HBV RNA的降解情况。结果显示(图12)，与对照组相比，AD80并不能加速HBV RNA的降解。作为阳性对照，RG7834则能加快HBVRNA的降解速度，与文献报道一致。这些结果表明，AD80并不能加速HBV RNA的降解，其作用机制不同于另一种已经公开的抗HBV药物RG7834。
为了检测AD80对不同启动子转录活性的影响，我们将HepG2细胞分别转染由3种不同启动子驱动的3xFlag-HBc表达质粒，然后用AD80处理48小时，再检测细胞内3xFlag-HBc表达情况。结果如图13所示，随着AD80浓度增加，由pCore驱动的3xFlag-HBc表达呈剂量依赖性降低，而由pCMV和pSV40启动子驱动的3xFlag-HBc表达则未受明显影响。综合前述结果，AD80应通过抑制核心启动子的转录活性来抑制HBV复制。
4、AD80通过抑制NTRK2来抑制HBVRNA转录
如前所述，AD80是一种酪氨酸激酶抑制剂。为了弄清AD80抑制HBV复制的作用是通过抑制哪种酪氨酸激酶来实现的，我们采取了如下策略：选取4种在1μM浓度下对HBV复制无显著抑制作用的酪氨酸激酶抑制剂，分别为Sorafenib(索拉菲尼),Dasatinib(达沙替尼),Imatinib(伊马替尼),Erlotinib(厄洛替尼)。将这4种化合物与AD80的酪氨酸激酶谱做交叉分析(根据文献Chemical genetic discovery of targets and anti-targets forcancer polypharmacology(Arvin等，Nature,2012)中的激酶谱数据)，选取那些仅能被AD80显著抑制，而不能被4种阴性化合物显著抑制的激酶(抑制率差异均大于70％)，作为候选靶激酶。结果显示(图14)，符合该条件的酪氨酸激酶共有7种，分别为AXL,PTK2B,PTK2,INSRR,NTRK1,TKE,NTRK2。
为了验证这7种激酶是否与HBV复制有关，我们用siRNA分别敲低这7种激酶基因，然后检测HepG2.2.15细胞中HBV pgRNA及培养上清中HBeAg的变化。结果显示(图15)，敲低NTRK2基因后，HBV pgRNA和HBeAg的水平降低最为明显。
为了进一步验证AD80对NTRK2抑制作用，我们委托上海睿铂赛公司进行体外激酶活性抑制实验。结果显示，AD80对人NTRK2活性具有很高的抑制活性，IC50＝4.5nM(图16)。同时，我们将不同剂量si-NTRK2转染HepG2.2.15细胞，然后检测HBV复制指标的变化。结果显示，si-NTRK2能显著降低HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg，HBeAg水平，也能剂量依赖性地降低细胞内HBV RNA和HBV DNA水平。在NTCP-HepG2感染模型上，敲低NTRK2同样能降低培养上清中HBsAg，HBeAg水平(图17)。此外，我们用另一种NTRK2抑制剂Altiratinib(DCC-2701)处理HepG2.2.15细胞，同样发现其能抑制HBV复制(图18)。以上这些结果提示，AD80通过抑制NTRK2活性，从而抑制HBV复制，NTRK2可作为抗HBV的一种新靶点。

Claims (5)

1.一种化合物，其选自以下化合物中的一种:
Figure QLYQS_1
2.药物组合物，含有作为活性成分的权利要求1所述的化合物及药学上可接受的载体。
3.一种化合物或药物组合物在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用，所述化合物或所述药物组合物含有作为活性成分的所述化合物选自以下化合物中的一种：
Figure QLYQS_2
Figure QLYQS_3
4.式I所示的化合物在在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用，
Figure QLYQS_4
5.式II所示的化合物在在制备HBV抑制剂或者制备治疗乙型肝炎病毒感染性疾病或病症的药物中的应用，
Figure QLYQS_5
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