CN115105485A - 一种纳米疫苗及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米疫苗，通过以下方法制备：S1、纳米化达沙替尼的制备；S2、PLT制备，将新鲜血液分离得到血小板，经脂质体挤出器处理，获得血小板膜液；S3、超声包载，取S1中制备的纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液，充分超声混匀后，进行超声包载；S4、离心收集，将S3中超声包载后的溶液离心，即得所述纳米疫苗。本发明通过对达沙替尼进行纳米化修饰，有利于血小板的包载，提高达沙替尼的治疗效果。

Description

一种纳米疫苗及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
癌症可以引发肿瘤特异性免疫反应，进一步刺激治疗性疫苗的开发。肿瘤疫苗能够提高免疫治疗，具有普遍性、高效杀癌的特点，是实现肿瘤彻底杀灭的有效策略。肿瘤疫苗能够诱导激活细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)，达到提高肿瘤免疫治疗效果。其机理是外源性抗原通过MHC-Ⅰ抗原递呈，将抗原递呈至CD8+T淋巴细胞，激活CTL免疫反应；也可以通过靶向树突状细胞摄取、加工处理和提呈抗原，从而启动适应性免疫应答，提高免疫疗效。由此，肿瘤治疗性疫苗能够在自体诱导癌症特异性免疫反应，做到最小程度的不良自身免疫反应、帮助解除免疫抑制，并与其他免疫疗法形成协同效应。
细胞焦亡是新近报道的有别于细胞凋亡的快速爆发式程序性死亡方式。表现为少部分细胞在药物作用下半胱氨酸蛋白酶(Caspase)高表达，切割Gasdermin家族蛋白(如GSDME)使其活化，发生细胞膜“打孔”，细胞膨胀式的爆破死亡，释放细胞内容物(包括促炎因子)，快速激活机体免疫性T细胞，致使其他相关细胞也发生类似的程序性快速爆发式死亡。调控肿瘤细胞的GSDME蛋白表达，成为激活Caspase-3/GSDME通路，释放促炎因子、调控记忆T细胞的激活成为有效途径。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种能靶向肿瘤激活Caspase-3/GSDME通路，引发细胞焦亡，实现高效的肿瘤免疫治疗效果的疫苗。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种纳米疫苗，通过以下方法制备：
S1、纳米化达沙替尼的制备
将达沙替尼溶解于DMSO中，获得油相-DMSO；取大豆磷脂于纯水中，加热搅拌，滴加油相-DMSO，滴加完毕后，加入BSA，搅拌充分，0.22微米膜过滤，即得纳米化达沙替尼溶液；
S2、PLT制备
将新鲜血液分离得到血小板，经脂质体挤出器处理，获得血小板膜液；
S3、超声包载
取S1中制备的纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液，充分超声混匀后，进行超声包载；
S4、离心收集
将S3中超声包载后的溶液离心，即得所述纳米疫苗。
本发明通过对达沙替尼进行纳米化修饰，能够降低达沙替尼的粒径，同时有利于血小板的包载。
在部分实施例中，为了获得更好的包载效果，S3中纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液的加入量比例为：纳米化达沙替尼溶液中纳米化达沙替尼与加入的血小板膜液的比例为13.7μg：0.5mL～6.3μg：2mL，最佳比例为10±3.7μg：1mL。
在部分实施例中，作为优选的，本发明纳米疫苗的具体制备过程如下：
S1、取10mg达沙替尼，溶解于DMSO中，获得油相-DASA；取大豆磷脂300mg加入10mL纯水中，水温控制在60-70℃，并在磁力搅拌器下不断搅拌，速度2000r·min-1。滴加油相-DASA，10分钟内完毕。随后加入2mL BSA，搅拌5min后，0.22微米膜过滤后即得到Nano-DASA溶液。所获得的Nano-DASA溶液的浓度为10.0±3.7μg/mL。
S2、将新鲜血液分离得到血小板、脂质体挤出器处理，获得血小板膜液；
S3、将Nano-DASA溶液与提取的血小板膜液按照1：0.5～1：2体积比(优选体积比为1:1)充分超声混匀，超声条件：功率100W的浴式超声器、温度为常温，超声10min；并在超声完成后，将溶液在37℃条件下放置孵育30min；进行超声包载。
S4、将S3中得到的溶液置于3000g的条件下，离心10min，即得本发明纳米疫苗DASA@PLT。
本发明还提供了上述纳米疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明获得的纳米疫苗能够激活Caspase-3/GSDME通路，并验证该通路对实现肿瘤细胞焦亡的作用。
进一步，本发明制备的纳米疫苗能够实现部分细胞焦亡，释放促炎因子(IL-1β和LDH等)。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明对达沙替尼纳米化修饰后，并通过血小板进行纳米药物的包载，实现高效靶向给药，调控肺癌细胞焦亡，提高肿瘤抗原提呈，实现肺癌快速免疫治疗。
2、本发明中的纳米疫苗能够提高肿瘤抗原提呈，实现快速肿瘤免疫T改造，提高肿瘤治疗效果、抑制肿瘤转移。
3、本发明中的纳米疫苗能靶向作用于肿瘤细胞，激活Caspase-3/GSDME通路，诱导肿瘤细胞发生焦亡，释放大量促炎因子。为肿瘤免疫治疗提出一种快速、高效的免疫治疗途径，为纳米疫苗治疗临床应用提供基础数据。
4、本发明纳米疫苗的制备工艺方便快捷，载药量大，毒副作用低。
附图说明
图1为本发明纳米疫苗构建过程中粒径的变化图；
图2为达沙替尼纳米化修饰前后的载药量对比图；
图3为达沙替尼纳米化修饰前后的包封率对比图；
图4为Nano-DASA溶液与血小板膜液体积比对包载率的影响对比图；
图5为达沙替尼纳米化修饰后粒径分布图；
图6为达沙替尼纳米化修饰前后的粒径对比图；
图7为本发明纳米疫苗全蛋白分析；
图8为本发明纳米疫苗构建过程中Zeta电势变化；
图9为本发明纳米疫苗的SEM图；
图10为本发明纳米疫苗激活释放药物过程的SEM图；
图11为本发明纳米疫苗激活肿瘤细胞Caspase-3/GSDME通路检测图；
图12为本发明纳米疫苗对细胞作用、流式细胞结果图；
图13为本发明纳米疫苗LDH活性检测图；
图14为本发明纳米疫苗构建过程中LDH活性对比图；
图15为本发明纳米疫苗IL-1β释放量检测图；
图16为本发明纳米疫苗构建过程中IL-1β释放量对比图；
图17为本发明纳米疫苗与其他药物组对肺癌小鼠作用存活时间对比图；
图18为本发明纳米疫苗与其他药物组对肺癌小鼠作用转移灶数量对比图；
图19为本发明纳米疫苗与其他药物组对肺癌小鼠作用的肿瘤切片对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明纳米疫苗进行详细的说明。
实施例1
制备纳米疫苗，其经过以下步骤制得:
(1)完成对药物的纳米化：取10mg达沙替尼，溶解于DMSO中(二甲基亚砜，DMSO的加入量以溶解为宜)，获得油相-DASA；取大豆磷脂300mg加入10mL纯水中，水温控制在60-70℃，并在磁力搅拌器下不断搅拌，速度2000r·min-1。滴加油相-DASA，10分钟内完毕。随后加入2mL BSA(牛血清白蛋白)，搅拌5min后，0.22微米膜过滤后即得到Nano-DASA溶液。获得的Nano-DASA溶液的浓度为10±3.7μg/mL。
(2)血小板提取：将新鲜血液分离得到血小板、脂质体挤出器处理，获得血小板膜液；
(3)将纳米化的达沙替尼溶液与提取的血小板膜液按照不同的体积比充分超声混匀后，在功率100W的浴式超声器、温度为常温，超声10min；并在超声完成后，将溶液在37℃条件下放置孵育30min，并将溶液置于3000g的条件下，离心10min，得到我们所需的纳米疫苗Nano-DASA@PLT。
我们观察了纳米化达沙替尼制备过程中粒径变化结果(如图1所示)，达沙替尼溶解在DMSO中，其粒径减少到20nm左右，随后大豆磷脂和BSA处理后，其粒径稍微增大。从构建纳米疫苗Nano-DASA@PLT后的载药量和包封率(如图2、图3所示)比较可以看出，达沙替尼直接进行包载，其载药量和包封率较低，可能是其粒径较大及水溶性不佳。经过溶解在DMSO中，其溶解度大为增加，但并不稳定，我们进一步修饰大豆磷脂和BSA后，有利于血小板的包载。同时纳米化达沙替尼溶液于血小板膜液的加入比例对包载率也有着显著影响，如图4所示，随着Nano-DASA加入比例的增加，包载率也随之增加，但当Nano-DASA溶液于血小板膜液体积比大于1:1以后，包载率提升不明显，综合考虑制备成本，以纳米化的达沙替尼溶液与提取的血小板膜液以混合体积比1：1进行超声包载为宜。
进一步分析Nano-DASA与Nano-DASA@PLT构建过程中粒径的变化(如图5、图6所示)，发现达沙替尼(DASA)经过纳米化修饰后，粒径为20.6±2.7nm，经过血小板包载后，粒径与自然血小板相差无几，且比未经过纳米化修饰的达沙替尼粒径小许多；并对Nano-DASA@PLT及血小板全蛋白进行分析比较，证明了我们制备的纳米疫苗确实实现了血小板包载(如图7所示)；并比较Nano-DASA@PLT构建过程中Zeta电势变化，发现电位逐步趋于稳定(如图8所示)；同时在对血小板包载纳米药物SEM图像(如图9所示)及血小板包载纳米药物激活、聚集、释放纳米药物SEM图(如图10所示)，记录下来了纳米疫苗处于激活、聚集、释放时的形态特征。
实施例2：
纳米疫苗靶向肺癌组织递送，激活Caspase-3/GSDME通路机制
我们通过用Capase-3、GSDME特异性抗体进行免疫荧光染色，检测是否激活Capase-3、GSDME。通过图11可以看出，选择正常肺上皮细胞(BEAS-2B)及肺癌细胞系(A549)与Nano-DASA@PLT共培养24h后，进行免疫荧光染色并在荧光显微镜下进行观察。可以看见A549细胞有明显的红色荧光与Hoechst染色的细胞核重合，而正常的细胞BEAS-2B只有细胞核的Hoechst染色的蓝色荧光，说明肺癌细胞A549的Capase-3、GSDME都被激活，说明了Caspase-3/GSDME通路机制被激活，诱导了焦亡，而正常细胞BEAS-2B并没有激活Capase-3、GSDME，没有产生焦亡。
实施例3：
纳米疫苗对细胞作用，流式细胞结果
我们用PITC和PI染料对经过纳米疫苗处理的细胞进行染色，然后进行流式细胞术实验，PI能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色，FITC能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光。如图12所示，血小板纳米药物Nano-DASA@PLT对正常肺上皮细胞(BEAS-2B)及肺癌细胞系(A549)作用后，Nano-DASA@PLT能够减少药物对正常组织的损伤，提高对肿瘤细胞的杀伤作用。
实施例4：
靶向激活GSDME蛋白，释放促炎因子
(1)LDH活性检测
细胞焦亡过程中，会导致细胞膜上形成很多孔隙，造成细胞内外内容物流通，会向胞外介质释放一些如乳酸脱氢酶(LDH)之类的酶类。我们测定了Nano-DASA@PLT作用2h的LDH活性，如图13所示，发现LDH活性越来越强，说明了焦亡的发生。
相比较，达沙替尼(DASA)LDH的释放量比较少，血小板包载达沙替尼处理后，LDH的释放量增加，说明血小板靶向肿瘤作用，具有提高LDH释放的作用，但这个作用是有限的。如图14所示。Nano-DASA处理后，LDH释放量明显增加，经过PLT包载后(Nano-DASA@PLT)，血小板的靶向作用提高了Nano-DASA的作用，LDH释放量显著增加(P<0.01)。
(2)IL-1β释放量检测
细胞焦亡导致细胞形成大量孔洞，释放炎症因子如IL-1β，这是焦亡区别于其他死亡方式的一个重要表现。我们测定了Nano-DASA@PLT作用2h内的IL-1β释放量，如图15所示，发现IL-1β释放量越来越高，说明了焦亡的发生。
当然，达沙替尼(DASA)未能在细胞表面形成空洞，2h内的IL-1β释放量较少；血小板包载达沙替尼处理后，未能大幅度提高IL-1β释放量；而Nano-DASA作用后，IL-1β释放量增加；经过PLT包载后(Nano-DASA@PLT)，血小板的靶向作用显著提高了Nano-DASA的作用，IL-1β释放量显著增加(P<0.01)，如图16所示。
实施例5：
动物实验结果
肺癌小鼠建模：选择4-6周龄BALB/c小鼠,饲养环境中适应1周后，通过尾静脉注射人非小细胞肺癌(A549),细胞量为5×106个/200uL。2周后，CT肺部检查，出现影像的即为建模成功的肺癌小鼠。
将建模成功的肺癌小鼠进行分组，分为对照组(Control)、PLT处理组(PLT)、纳米达沙替尼组(Nano-dasa)、血小板包载未经纳米修饰的达沙替尼组(Dasa@PLT)，纳米疫苗组(Nano-dasa@PLT)，每组10只。首先我们比较了各组间的存活时长，如图17所示，对照组、PLT处理组、纳米达沙替尼组(Nano-Dasa)在40天的时候就全部死亡了，而血小板包载未经纳米修饰的达沙替尼组(Dasa@PLT)在三十多天的时候都存活，之后逐只死亡，而纳米疫苗组(Nano-Dasa@PLT)在55天时才开始有死亡出现，60天时仍有6只存活。我们比较了各组间转移灶的数量，如图18所示，对照组、PLT处理组、纳米达沙替尼组(Nano-Dasa)转移灶的数量均在30个左右，血小板包载未经纳米修饰的达沙替尼组(Dasa@PLT)的转移灶的数量均在22个左右，而纳米疫苗组(Nano-Dasa@PLT)的转移灶只在5个左右。并对肿瘤做了切片，如图19所示，可以看出纳米疫苗处理组有明显的好转。
虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (8)

1.一种纳米疫苗，其特征在于，所述纳米疫苗通过以下方法制备：
S1、纳米化达沙替尼的制备
将达沙替尼溶解于DMSO中，获得油相-DMSO；取大豆磷脂于纯水中，加热搅拌，滴加油相-DMSO，滴加完毕后，加入BSA，搅拌充分，0.22微米膜过滤，即得纳米化达沙替尼溶液；
S2、PLT制备
将新鲜血液分离得到血小板，经脂质体挤出器处理，获得血小板膜液；
S3、超声包载
取S1中制备的纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液，充分超声混匀后，进行超声包载；
S4、离心收集
将S3中超声包载后的溶液离心，即得所述纳米疫苗。
2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S3中纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液的加入量比例为：纳米化达沙替尼溶液中纳米化达沙替尼与加入的血小板膜液的比例为13.7μg：0.5mL～6.3μg：2mL。
3.根据权利要求2所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S1中达沙替尼、大豆磷脂、BSA的加入比例为10mg:300mg:2mL。
4.根据权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S3中纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液按照体积比1:0.5～1:2混合。
5.根据权利要求4所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S3中纳米化达沙替尼溶液与血小板膜液的体积比为1:1。
6.根据权利要求5所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S1中纳米化达沙替尼的制备过程如下：取10mg达沙替尼，溶解于DMSO中，获得油相-DASA；取大豆磷脂300mg加入10mL纯水中，水温控制在60～70℃，并在磁力搅拌器下不断搅拌，速度2000r·min-1，滴加油相-DASA，10分钟内滴加完毕；随后加入2mL BSA，搅拌5min后，0.22微米膜过滤后即得到Nano-DASA。
7.根据权利要求6所述的纳米疫苗，其特征在于，所述S3中超声条件为：功率100W的浴式超声器、温度为常温，超声10min；并在超声完成后，将溶液在37℃条件下放置孵育30min。
8.权利要求1至7任一所述纳米疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QINGQING LI 等: "Dasatinib loaded nanostructured lipid carriers for effective treatment of corneal neovascularization" *

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