CN107260680A - 达沙替尼脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种达沙替尼脂质体制剂及其制备方法。本发明提供的达沙替尼脂质体制剂的生物相容性好、可进行靶向性修饰、可实现达沙替尼的缓控释，有利于在较长时间内维持较高的血药浓度，改善药物分布，提高药物的生物利用度。本发明利用达沙替尼具有较好的亲脂性，可以以分子形式通过磷脂双分子层，进入内水相这一特性；脂质体内水相中pH较低，达沙替尼分子结合氢离子形成达沙替尼离子，进而与铵盐溶液中的阴离子形成不溶性盐，使得内水相中的达沙替尼不会扩散到外水相中，从而达到将达沙替尼稳定包封在脂质体内水相中的目的；并提高了包封率、存储稳定性以及获得良好的体外缓释效果。

Description

达沙替尼脂质体制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米药物输送技术领域，特别是涉及一种达沙替尼脂质体制剂及其制备方法。
背景技术
达沙替尼(dasatinib)，化学名称为N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺一水合物，是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂。达沙替尼被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于治疗对之前治疗耐药或无法耐受的成人慢性期、加速期、髓系或淋巴系慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)，主要是抑制患者骨髓中白细胞的过量增殖,常用于治疗由BCR-ABL激酶突变引起的白血病。
目前已上市的达沙替尼产品只有口服片剂。对于Ph+慢性期CML的患者推荐起始剂量为100mg，每日1次。作为口服片剂而言，其起效剂量大且用药频率高，生物利用度有限，有相关文献表明其临床治疗AUC0-t值为409.2ng*h/mL，Amax为122.5ng/mL。
达沙替尼在临床治疗中出现的血液学不良反应主要表现为贫血、白细胞尤其是中性粒细胞(ANC)减少以及血小板减少。非血液学不良反应主要表现为液体潴留、胃肠道反应、心血管不良反应、流感样症状以及生化代谢的异常。达沙替尼的不良反应与给药剂量有关。临床应用中，出现较严重的不良反应时，应立即停止服用药物，待症状恢复后再降低药物剂量进行治疗。
基于上述原因，需要发展一种达沙替尼等药物的静脉注射剂，通过提高达沙替尼在体内的生物利用度，特别是在肿瘤部位的浓度，从而减小全身给药的剂量，降低毒副作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供药物输送载体，达沙替尼制剂及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种达沙替尼脂质体制剂，含有达沙替尼脂质体，所述沙替尼脂质体包括：达沙替尼和脂质体载体以及位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述达沙替尼被包封于所述内水相中；所述脂质体膜内的内水相和膜外的外水相之间存在铵盐梯度。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体为单室脂质体。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的粒径范围是30nm～200nm。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的粒径范围是50～100nm。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的粒径是70nm～90nm。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的D95为小于等于120nm；其中，D95为所述脂质体从小到大累积分布百分数达到95％时对应的粒径值，即所述脂质体中，粒径小于D95的脂质体颗粒数占所述脂质体总颗粒数的95％。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的D95小于等于100nm；其中，D95为所述脂质体从小到大累积分布百分数达到95％时对应的粒径值，即所述脂质体中，粒径小于D95的脂质体颗粒数占所述脂质体总颗粒数的95％.。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的D95小于等于90nm；其中，D95为所述脂质体从小到大累积分布百分数达到95％时对应的粒径值，即所述脂质体中，粒径小于D95的脂质体颗粒数占所述脂质体总颗粒数的95％。
于本发明的一个实施例中，所述内水相包括铵盐水溶液；所述外水相为生理等渗溶液。
于本发明的一个实施例中，所述内水相中的达沙替尼的阳离子与铵盐的阴离子形成不溶性盐。
于本发明的一个实施例中，所述铵盐选自氯化铵、甲基磺酸铵、羟乙基磺酸铵、硫酸铵、磷酸铵、硫糖铵中的一种或多种。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相中铵根离子浓度为100mM～800mM。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相中铵根离子浓度为200mM～700mM。
于本发明的一个实施例中，所述生理等渗溶液选自5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相的pH值为4.0～9.0。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体内水相的pH值为4.5～8.0。
于本发明的一个实施例中，在所述达沙替尼脂质体制剂中，所述达沙替尼的浓度大于等于0.1mg/ml。
于本发明的一个实施例中，所述达沙替尼和所述脂质体之间的药脂摩尔比为1:4～1:65。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体的组分包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。
于本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇化磷脂中的聚乙二醇的分子量为50～10000。
于本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇化磷脂中的聚乙二醇的分子量为2000。
于本发明的一个实施例中，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。
于本发明的一个实施例中，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为55:40:5。
于本发明的一个实施例中，所述脂质体外水相为质量浓度10％的蔗糖溶液。
本发明还提供了一种上文所述的达沙替尼脂质体制剂的制备方法，所述方法为主动载药法；所述主动载药法包括以下步骤：
(1)制备内水相和外水相均含铵盐水溶液的空白脂质体；
(2)制备内水相含有铵盐水溶液、外水相含有生理等渗溶液的空白脂质体，以形成空白脂质体内外水相铵盐浓度梯度；
(3)将步骤(2)所得空白脂质体与达沙替尼可溶性盐水溶液混合，孵育，去除游离达沙替尼可溶性盐，获得达沙替尼脂质体。
于本发明的一个实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中的铵盐浓度为50mM～500mM。
于本发明的一个实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液的pH值为3.0～7.0。
于本发明的一个实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度是300～900mM。
于本发明的一个实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中阴离子的浓度是300～500mM。
于本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述生理等渗溶液可选自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。
于本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述外水相的pH是5.0～8.0。
于本发明的一个实施例中，步骤(3)中，药脂比大于等于0.006。
于本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述达沙替尼可溶性盐选自达沙替尼盐酸盐、达沙替尼环拉酸盐、达沙替尼氢溴酸盐、达沙替尼甲磺酸盐或达沙替尼甲苯磺酸盐。
本发明提供了一种上文所述达沙替尼脂质体制剂的制备方法制备获得的达沙替尼脂质体制剂。
本发明提供了一种上文所述的达沙替尼脂质体制剂在制备前列腺癌、结直肠癌或黑色素瘤治疗药物中的用途。
本发明提供的达沙替尼脂质体及其制备方法，生物相容性好、可进行靶向性修饰、可实现达沙替尼的缓控释，有利于在较长时间内维持较高的血药浓度，改善药物分布，提高药物的生物利用度，并且可能通过EPR(Enhanced Permeation Retention)效应，富集于肿瘤组织，从而提高达沙替尼在肿瘤组织的局部浓度。本发明利用达沙替尼具有较好的亲脂性，可以以分子形式通过磷脂双分子层，进入内水相这一特性；在脂质体内水相中，达沙替尼分子与铵根离子电离所释放出的氢离子结合，形成达沙替尼离子，进而与铵盐溶液中的阴离子形成不溶性盐，使得内水相中的达沙替尼不会扩散到外水相中，从而达到将达沙替尼稳定包封在脂质体内水相中的目的；并且，随着铵根离子电离所产生的氨气不断从脂质体内水相逸出，使得脂质体内水相中可以维持一定的氢离子浓度，使达沙替尼分子可持续不断地与氢离子结合，形成达沙替尼离子，进而与铵盐阴离子形成不溶性盐，直到外水相中几乎全部的达沙替尼均被包封到脂质体内水相中。提高了包封率、存储稳定性以及良好的体外缓释效果。
附图说明
图1为达沙替尼盐酸盐水溶液标准曲线图；
图2为以硫酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体冷冻透射电镜图；
图3以不同铵盐溶液内水相的达沙替尼脂质体体外释放速率图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索实验发现，脂质体内水相中的铵盐的阴离子可以与达沙替尼形成不溶盐，进而将达沙替尼稳定包封在脂质体的内水相中，在此基础上完成了本发明。
达沙替尼脂质体制剂
本发明的达沙替尼脂质体制剂，含有达沙替尼脂质体，所述沙替尼脂质体包括：达沙替尼和脂质体载体。
所述脂质体具有呈双分子层结构的脂质体膜。所述脂质体膜类似于生物膜。
所述脂质体的载体材料含有磷脂和胆固醇。本发明对于脂质体的载体材料及含量并无特别的限制，只要能够形成稳定的、无泄漏的呈双分子层结构的脂质体膜即可。这些均在本领域技术人员所能知晓的知识范围内。
本发明实施例中列举了：所述磷脂选用氢化豆磷脂(HSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。但是，并不仅限于此。
所述DSPE-PEG中PEG的分子量范围可以是50～10000。例如，所述DSPE-PEG中PEG的分子量是2000。
HSPC、CHOL、DSPE-PEG之间的摩尔比例范围可以是(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。例如，HSPC、CHOL、DSPE-PEG之间的摩尔比例范围可以是55:40:5。
所述达沙替尼脂质制剂还包括：位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相。所述达沙替尼被包封于所述内水相中。
所述脂质体膜内的内水相和膜外的外水相之间存在铵盐梯度。
所述铵盐梯度是指存在铵盐浓度梯度与pH的差异。
所述内水相为铵盐水溶液，所述达沙替尼的阳离子与所述铵盐的阴离子形成不溶性盐，从而被包封于所述内水相中，所述外水相为生理等渗溶液。
所述生理等渗溶液选自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。
％(w/w)是指质量质量百分浓度，亦即每100g的溶液中含有的溶质的质量。
％(w/v)是指质量体积百分浓度，亦即每100ml的溶液中含有的溶质的质量。
所述达沙替尼脂质体制剂可以为注射给药制剂。
所述注射给药制剂可选自皮下注射剂型、静脉注射剂型、肌肉注射剂型或盆腔注射剂型。
所述铵盐的阴离子选自氯离子、磺酸根离子、羟乙基磺酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子或硫糖根离子。
所述磺酸根离子优选甲基磺酸根。
亦即，所述铵盐选自氯化铵、甲基磺酸铵、羟乙基磺酸铵、硫酸铵、磷酸铵、硫糖铵中的任一种或多种。
所述内水相的pH可以是4.0～9.0。进一步可以是4.5～8.0。
所述内水相中铵根离子的浓度可以是100～800mM。进一步还可以是200mM～700mM。
所述内水相中达沙替尼的浓度可以是0.1mg/ml以上。
达沙替尼脂质体制剂的制备方法
本发明的达沙替尼脂质体制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备内水相和外水相均含铵盐水溶液的空白脂质体；
(2)制备内水相含有铵盐水溶液、外水相含有生理等渗溶液的空白脂质体；
(3)将步骤(2)所得空白脂质体与达沙替尼可溶性盐水溶液混合，孵育，去除游离达沙替尼可溶性盐，获得达沙替尼脂质体。
步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中铵盐的浓度可以是50～500mM。所述铵盐水溶液中铵盐的浓度还可以是50～300mM。所述铵盐水溶液中铵盐的浓度还可以是300～500mM。
所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度可以是500～900mM。所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度还可以是500～800mM。所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度还可以是500～600mM。所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度还可以是600～900mM。所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度可以是600～800mM。
所述铵盐水溶液中阴离子的浓度可以是300～500mM。所述铵盐水溶液中阴离子的浓度可以是300～400mM。所述铵盐水溶液中阴离子的浓度可以是400～500mM。
所述铵盐可以选自硫酸铵、硫糖铵、磷酸铵、氯化铵、甲基磺酸铵或羟乙基磺酸铵。
所述铵盐水溶液的pH可以是3.0～7.0。进一步地，所述铵盐水溶液的pH可以是4.0～6.0。
步骤(2)中，所述生理等渗溶液可选自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。
％(w/w)是指质量百分浓度，亦即每100g的溶液中含有的溶质的质量。
％(w/v)是指质量体积百分浓度，亦即每100ml的溶液中含有的溶质的质量。
所述外水相的pH可以是5.0～8.0。
步骤(3)中，药脂比(亦即达沙替尼与脂质体之间的摩尔比)可以是0.006以上。药脂比还可以是0.012以上。药脂比还可以是0.03以上。药脂比还可以是0.06以上。药脂比还可以是0.12以上。药脂比还可以是0.24以上。药脂比还可以是0.006～0.24。药脂比还可以是0.006～0.12。药脂比还可以是0.006～0.06。药脂比还可以是0.006～0.03。药脂比还可以是0.006～0.012。药脂比还可以是0.012～0.24。药脂比还可以是0.012～0.12。药脂比还可以是0.012～0.06。药脂比还可以是0.012～0.03。药脂比还可以是0.03～0.24。药脂比还可以是0.03～0.12。药脂比还可以是0.03～0.06。药脂比还可以是0.06～0.24。药脂比还可以是0.06～0.12。
所述达沙替尼可溶性盐为达沙替尼的可溶性盐。所述达沙替尼可溶性盐可选自达沙替尼盐酸盐、达沙替尼环拉酸盐、达沙替尼氢溴酸盐、达沙替尼甲磺酸盐或达沙替尼甲苯磺酸盐。
所述达沙替尼可溶性盐水溶液中，达沙替尼的浓度可以是0.1mg/ml以上。达沙替尼的浓度可以是0.2mg/ml以上。达沙替尼的浓度可以是0.5mg/ml以上。达沙替尼的浓度可以是1mg/ml以上。达沙替尼的浓度可以是2mg/ml以上。达沙替尼的浓度可以是0.1～2mg/ml。达沙替尼的浓度可以是0.1～0.5mg/ml。达沙替尼的浓度可以是0.1～0.2mg/ml。达沙替尼的浓度可以是0.2～2mg/ml。达沙替尼的浓度可以是0.2～0.5mg/ml。达沙替尼的浓度可以是0.5～2mg/ml。
本发明利用主动载药原理：脂质体内外水相之间形成铵盐离子梯度，扩散进入脂质体内水相的达沙替尼分子与内水相中铵根离子电离所产生的氢离子结合，，形成达沙替尼离子，进而与铵盐的反离子(阴离子)形成晶体或无定型不溶性盐，从而包封在脂质体内水相中。同时，脂质体内水相中的铵根离子电离所产生的氨气不断从脂质体内水相逸出，从而维持了脂质体内水相中氢离子的浓度，使脂质体内水相中的达沙替尼分子持续不断地与氢离子结合，形成达沙替尼离子，并与铵盐的反离子形成沉淀，直到外水相中几乎所有的达沙替尼被包封到脂质体内水相中。该脂质体具有高载药量，高稳定性，并且具备优异的缓释效果。
达沙替尼脂质体制剂的用途
达沙替尼是一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，可用于包括前列腺癌、结直肠癌和黑色素瘤的SRC高表达的肿瘤治疗。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的药剂学，药物分析学，药物化学，分析化学，分子生物学、生物化学及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。
实施例1、建立达沙替尼检测方法
本实施例中建立达沙替尼标准曲线，具体如下。
采用紫外(ultraviolet，UV)检测分析方法：检测仪器为TECAN200PRO；检测波长为325nm；检测温度为24℃；检测孔板为96well plates,UV-transparent；检测体积为200μl。
精密称量2.5002mg达沙替尼盐酸盐溶解于25ml容量瓶中得到浓度为0.1000mg/ml的达沙替尼盐酸盐水溶液；将达沙替尼盐酸盐水溶液与超纯水混合，梯度稀释，得到浓度为25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、7.5μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml一系列达沙替尼盐酸盐标准溶液。采用UV检测分析方法检测上述浓度的达沙替尼盐酸盐标准溶液，检测结果如表1所示。
表1不同浓度的达沙替尼盐酸盐水溶液UV检测值
根据表1所示的结果建立标准曲线并考察回收率。工作曲线如图1所示。达沙替尼盐酸盐水溶液标曲为Y＝0.0331X-0.0352(n＝7)，R2＝0.9998，回收率均在95％～105％，标曲拟合良好。
实施例2、考察不同盐溶液与达沙替尼的沉淀反应
本实施例使用的柠檬酸钠、醋酸钠、硫酸钠、氯化钠、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、醋酸铵均购自国药集团化学试剂有限公司；使用的硫糖铵、甲基磺酸铵、羟乙基磺酸铵购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
本实施例考察钠盐溶液和达沙替尼的沉淀反应，具体过程如下：
(1)精密称量0.8823g柠檬酸钠溶解于10ml双蒸水(ddH2O)中，得到浓度为300mM的柠檬酸钠水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的柠檬酸钠水溶液中；
(2)精密称量0.4082g醋酸钠溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的醋酸钠水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的醋酸钠水溶液中；
(3)精密称量0.4262g硫酸钠溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的硫酸钠水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的硫酸钠水溶液中；
(4)精密称量0.1753g氯化钠溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的氯化钠水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的氯化钠水溶液中。
将上述达沙替尼盐酸盐与钠盐的混合溶液，涡旋(vortex)5min后，37℃1000rpm震荡30min。而后12000g离心15min，观察溶液底部是否有沉淀。结果如表2所示；其中，(+)代表有肉眼可见沉淀，(－)代表无肉眼可见沉淀。
本实施例考察铵盐溶液和达沙替尼的沉淀反应，具体过程如下：
(1)精密称量0.3972g硫酸铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的硫酸铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的硫酸铵水溶液中；
(2)精密称量0.6094g磷酸铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的磷酸铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的磷酸铵水溶液中；
(3)精密称量2.9484g硫糖铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的硫糖铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的硫糖铵水溶液中；
(4)精密称量0.1605g氯化铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的氯化铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的氯化铵水溶液中；
(5)精密称量0.2312g醋酸铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的醋酸铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的醋酸铵水溶液中
(6)精密称量0.3394g甲基磺酸铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的甲基磺酸铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的甲基磺酸铵水溶液中；
(7)精密称量0.3783g羟乙基硫酸铵溶解于10ml ddH2O中，得到浓度为300mM的羟乙基硫酸铵水溶液；精密称量5.06mg达沙替尼盐酸盐溶解于1ml 300mM的羟乙基硫酸铵水溶液中；
将上述达沙替尼盐酸盐与铵盐的混合溶液，涡旋5min后，37℃1000rpm震荡30min。而后12000g离心15min，观察溶液底部是否有沉淀。结果如表2所示；其中，(+)代表有肉眼可见沉淀，(－)代表无肉眼可见沉淀。
表2不同铵盐溶液与达沙替尼的沉淀反应结果
表2表明，盐的种类对达沙替尼的沉淀反应有显著的影响。对沉淀反应起主要作用的是盐的阴离子种类，而与阳离子(即表中的钠离子和铵根离子)无关。硫酸根、柠檬酸根、磷酸根离子和硫糖根离子，均可与达沙替尼形成沉淀；而氯离子、甲基磺酸根离子和羟乙基磺酸根离子可与达沙替尼形成类似水凝胶的半固体；所以，以这些离子作为脂质体内水相中铵盐溶液的阴离子时，可与脂质体内水相中的达沙替尼离子形成晶型或无定型结构的不溶性盐，实现达沙替尼的稳定包封，并增加达沙替尼脂质体的储存稳定性。
实施例3、以硫酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的磷脂具体为氢化豆磷脂(HSPC，分子量783.8)，购自日本油脂公司(NOF Corporation)；使用的聚乙二醇化磷脂具体为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)购自美国Avanti Polar Lipids公司；使用的胆固醇(CHOL，分子量386.7)购自美国Avanti Polar Lipids公司；使用的达沙替尼盐酸盐购自ApexBio公司；使用的硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司。
需要说明的是，在后续的实施例中所使用的磷脂均为日本油脂公司的氢化豆磷脂；所使用的聚乙二醇化磷脂均为美国Avanti Polar Lipids公司的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；所使用的胆固醇均购自美国Avanti Polar Lipids公司；所使用的达沙替尼盐酸盐均购自ApexBio公司。
3.1、达沙替尼脂质体的制备。
具体制备过程如下：
步骤(1)，精密称量479.9mg胆固醇，160.9mg氢化豆磷脂和160.8mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，加入适量乙醇充分溶解混合，得到脂质的乙醇混合溶液；
步骤(2)，将步骤(1)所得乙醇混合溶液加入10ml pH为4.0～6.0的300mM硫酸铵缓冲液，并置于70摄氏度中搅拌水浴30分钟，充分水合脂质，得到较均匀的脂质体混悬液；
步骤(3)，利用脂质体挤出仪，将步骤(2)所得脂质体混悬液依次挤压通过孔径为200nm，100nm，80nm，50nm聚碳酯膜各10次，最终得到粒径大小约为70nm左右，粒径分布均匀的空白脂质体；
步骤(4)，将步骤(3)所制得的脂质体置于截留分子量为10000的透析袋中，以与人体等渗的10％的蔗糖水溶液作为透析介质，样品与透析介质体积比为1:1000，透析期间换三次透析液，完全除去脂质体外水相中的硫酸铵，得到由10％的蔗糖组成的外水相，以及由硫酸铵溶液组成的内水相，和磷脂双分子层构成空白脂质体，脂质体内外水相具有一定的pH和硫酸铵浓度梯度。具体地，空白脂质体内水相为硫酸铵水溶液(pH4.0～6.0，硫酸铵浓度300mM)、空白脂质体外水相为质量分数10％蔗糖水溶液。
步骤(5)，将步骤(4)中所得的内水相为硫酸铵溶液的空白脂质体混悬液，与含量为4mg/ml的达沙替尼盐酸盐水溶液，按照体积比为1:1混合，并于50-60摄氏度中孵育10-30分钟，得到内水相含达沙替尼的脂质体；
步骤(6)，将脂质体置于截留分子量为10000的透析袋中，以与人体等渗的10％的蔗糖水溶液作为透析介质，透析法除去未进入内水相的达沙替尼，得到达沙替尼脂质体。
3.2、达沙替尼脂质体的表征。
3.2.1、达沙替尼脂质体的粒径测定。
将本实施例得的达沙替尼脂质体，用ddH2O稀释50倍，利用Zetasizer ZS90(马尔文公司)对粒径进行分析，具体结果如表3所示。表3表明，载药后的脂质体粒径均在70nm左右，粒度分布(PDI)均小于0.1。此外，载药前空白脂质体的粒径也在70nm左右，粒度分布(PDI)均小于0.1。
3.2.2、达沙替尼脂质体包封率的测定。
将道威克斯(Dowex)树脂(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司)吸附前后的达沙替尼脂质体制剂静置，取上清，采用UV检测分析方法进行检测，样品体积为200μl。
达沙替尼脂质体的包封率(EE)按以下公式计算：
其中，Minter是树脂吸附游离药物后的脂质体制剂中达沙替尼的含量，即被脂质体包封的达沙替尼的含量；Mtotal是树脂吸附前的达沙替尼脂质体制剂中达沙替尼的含量，即达沙替尼的投药量。结果如表3所示。表3表明，按照本方法制备的达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表3以硫酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
此外，当药脂比高达0.24时，包封率仍接近100％。
3.2.3、冷冻透射电镜(Cryo-TEM)表征。
将以硫酸铵为内水相的达沙替尼脂质体用水稀释至合适的浓度，取约6μl加至铜网(300mesh，Ted Pella公司，美国)，迅速将铜网置于液氮中降温(Leica Microsystems,Wetzlar，德国)，于冷冻透射电镜(FEI Tecnai 12G2TWIN TEM，电压120kv，低剂量模式)下观察脂质体形态。结果如图2所示。图2表明，达沙替尼脂质体外观为椭球形、大小较为均匀；脂质体内部有呈棒状结晶形态的药物-硫酸盐。
实施例4、以硫酸钠溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH为4.0～6.0的300mM硫酸钠缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表4所示。表4表明，实施例4制备的达沙替尼脂质体的包封率约在30％左右。与实施例3结果相比，以硫酸钠作为脂质体内水相其包封率有显著下降，说明铵盐离子浓度梯度在主动载药中是必不可少的。铵离子浓度梯度是载药过程中的“动力泵”：铵根离子电离产生氨气并释放氢离子。随着氨气不断从脂质体内水相逸出，铵根离子持续释放氢离子，从而维持脂质内水相中的氢离子浓度，使扩散进入脂质体内水相中的达沙替尼分子可以持续不断地结合氢离子而形成达沙替尼阳离子，并与铵盐的阴离子形成沉淀，直到外水相中几乎所有的达沙替尼被包封到脂质体内水相中。
表4以硫酸钠溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
实施例5、以硫糖铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的硫糖铵购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH为4.0～6.0的50mM硫糖铵缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。需要说明的是，硫糖铵是含八个硫酸根的硫酸蔗糖复合离子，为了使硫酸根离子浓度和铵根离子浓度近似于硫酸铵梯度中的浓度，故硫糖铵浓度为50mM。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表5所示。表5表明，实施例5制备得达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表5以硫糖铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
实施例6、以磷酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的磷酸铵购自国药集团化学试剂有限公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH为4.0～6.0的300mM磷酸铵缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表6所示。表6表明，实施例6制备得达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表6以磷酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
实施例7、以氯化铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的氯化铵购自国药集团化学试剂有限公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH值为4.0～6.0的500mM氯化铵缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表7所示。表7表明，实施例7制备得达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表7以氯化铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
实施例8、以甲基磺酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的甲基磺酸铵购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH值为4.0～6.0的500mM甲基磺酸缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表8所示。表8表明，实施例8制备得达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表8以甲基磺酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
此外，当药脂比高达0.24时，包封率仍接近100％。
实施例9、以羟乙基磺酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体的制备和表征
本实施例中使用的羟乙基磺酸铵购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
制备达沙替尼脂质体，具体制备过程参照实施例3中制备达沙替尼脂质体的过程，不同之处在于，在步骤(2)往步骤(1)所得到的乙醇混合溶液加入10ml、pH为4.0～6.0的500mM羟乙基磺酸缓冲液，而不加入硫酸铵缓冲液。
表征达沙替尼脂质体的方法参照实施例3，结果如表9所示。表9表明，实施例9制备得达沙替尼脂质体的包封率约在95％以上。
表9以羟乙基磺酸铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体粒径和包封率
此外，当药脂比高达0.24时，包封率仍接近100％。
由于不同药脂比时，脂质体内水相中药物的浓度不同，因此药物与铵根离子的阴离子所形成的不溶性盐很可能具有不同的结构。为了比较以不同的铵盐为内水相所制备的达沙替尼脂质体的基本性质、内水相成分和pH值以及体外释放速率和储存稳定性，因此，实施例10-12中所制备的达沙替尼脂质体均具有相同的药脂比(0.12)，载药浓度均为2mg/ml。
实施例10、相同药脂比的、以不同铵盐溶液为内水相制备的达沙替尼脂质体的表征
根据实施例3、5、6、7、8、9，以不同铵盐溶液为内水相制备达沙替尼脂质体(载药浓度均为2mg/ml、药脂比均为0.12)，测定或计算以下参数：
(1)脂质体粒径：
载药后脂质体粒径的测定方法同实施例3，结果如表10所示；
(2)脂质体的包封率：
载药后脂质体的包封率测定方法同实施例3，结果如表10所示；
(3)内水相pH值：
采用[14C]-甲胺分布法测定达沙替尼脂质内外水相pH差(ΔpH)，计算内水相pH值：在上述达沙替尼脂质体中加入[14C]-甲胺。在55摄氏度孵育20分钟后，将脂质体分成两份；取其中一份超滤(Ultra超滤管，截止分子量为100K，美国Millipore公司)，并收集超滤后的滤液。用Opti-Fluor(美国Perkin Elmer公司)处理超滤后的滤液以及另一份未超滤的达沙替尼脂质体，摇匀，用Beta计数仪读数，测定超滤液和稀释后的达沙替尼脂质体中[14C]-甲胺的浓度。计算脂质体内外水相的pH值差。计算公式如下：
达沙替尼脂质体内水相pH＝外水相pH+ΔpH，结果如表10所示。
(4)内水相中达沙替尼的浓度计算：
采用离子交换色谱法测定载药前空白脂质体内水相中铵盐阴离子的浓度。计算脂质体内水相的总体积占脂质体混悬液总体积的百分比(Entrapped volume)。根据Entrapped volume(％)计算脂质体内水相中达沙替尼的浓度。
脂质体内水相中达沙替尼浓度＝达沙替尼脂质体载药浓度/Entrapped volume(％)。结果如表10所示。需要说明的是，在表10中，entrapped volume为1.5％；脂质体载药浓度为2mg/ml，相当于达沙替尼浓度为4.098mM。
(5)内水相中铵根离子浓度的计算：
根据载药过程中，一分子达沙替尼置换一分子氨气的原理，通过计算载药后达沙替尼脂质体内水相中剩余的铵根离子的浓度。
载药后脂质体内水相中铵根离子浓度＝内水相中铵根离子起始浓度—内水相中达沙替尼浓度
其中，内水相中铵根离子起始浓度等于制备空白脂质体时所采用的铵盐溶液中的铵根离子浓度。
计算结果如表10所示。
表10药脂比为0.12时以不同铵盐溶液为内水相所制备的达沙替尼脂质体的表征
亦即，根据上述表10中试验数据可知，载药后达沙替尼脂质体内水相，pH4.5～8.0，铵根离子浓度200mM～700mM，达沙替尼的浓度为273mM。
采用上述相同的方法，根据实施例3、5、6、7、8、9，以不同铵盐溶液为内水相制备达沙替尼脂质体(载药浓度为0.1、0.2、0.5、1mg/ml、药脂比为0.006、0.012、0.06、0.24)时，获得的载药后达沙替尼脂质体进行表征。
结果获得的沙替尼脂质体均满足以下条件：
载药后达沙替尼脂质体内水相pH4.0～9.0，内水相中达沙替尼浓度为13～273mM，[NH4+]浓度为100～800mM。
实施例11、药脂比为0.12的、以不同铵盐溶液内水相的达沙替尼脂质体体外释放
氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；道威克斯(Dowex)树脂购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。
药脂比为0.12的以不同铵盐溶液为内水相的达沙替尼脂质体体外释放实验，具体过程如下：
步骤(1)，精密称量0.9g氯化钠固体，溶解于100ml ddH2O中，配制成质量浓度为0.9％的生理盐水；
步骤(2)，取实施例3、5、6、7、8、9中以不同铵盐溶液(pH为4.0～6.0)为内水相制备的达沙替尼脂质体；其中，药物浓度为2mg/ml、药脂比(药物和脂质的摩尔比)均为0.12。
步骤(3)，用生理盐水溶液将脂质体稀释40倍，加入足量的Dowex树脂吸附游离药物，形成漏槽条件，于37℃110rpm摇床中震荡，考察达沙替尼脂质体的释放曲线。考察结果如图3所示。
图3表明，在生理盐水中的释放实验结果表明，以氯化铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体释放较快；其他的组均具备较好的体外缓释效果。
此外，采用上述相同的方法，根据实施例3、5、6、7、8、9，以不同铵盐溶液为内水相制备达沙替尼脂质体(载药浓度为0.1、0.2、0.5、1mg/ml、药脂比为0.006、0.012、0.06、0.24)时，获得的载药后达沙替尼脂质体进行体外释放表征。
结果获得的沙替尼脂质体，以氯化铵溶液为内水相的达沙替尼脂质体释放较快；其他的组均具备较好的体外缓释效果。
实施例12、药脂比为0.12的以不同铵盐溶液内水相的达沙替尼脂质体存储稳定性
步骤(1)，取实施例3、5、6、7、8、9中制备的药物浓度为2mg/ml的达沙替尼脂质体。
步骤(2)，分别于5d，10d，20d，40d，60d取样检测达沙替尼脂质体的粒径、PDI和包封率。具体检测方法参照实施例3的相关内容。检测结果如表11.1和表11.2所示。
表11.1和表11.2表明，以不同铵盐溶液作为内水相的达沙替尼脂质体，除了氯化铵外均能保持较好的储存稳定性。扩散进入脂质体内水相中的达沙替尼药物分子，电离后与相应的铵盐的阴离子结合，形成相对稳定的结构，实现药物稳定包封，因此在储存过程中不会发生泄漏。
表11.1以不同铵盐溶液内水相的达沙替尼脂质体存储稳定性1
表11.1以不同铵盐溶液内水相的达沙替尼脂质体存储稳定性2
此外，采用上述相同的方法，根据实施例3、5、6、7、8、9，以不同铵盐溶液为内水相制备达沙替尼脂质体(载药浓度为0.1、0.2、0.5、1mg/ml、药脂比为0.006、0.012、0.06、0.24)时，获得的载药后达沙替尼脂质体进行体外稳定性表征。
结果获得的沙替尼脂质体，除了氯化铵外均能保持较好的储存稳定性。扩散进入脂质体内水相中的达沙替尼药物分子，电离后与相应的铵盐的阴离子结合，形成相对稳定的结构，实现药物稳定包封，因此在储存过程中不会发生泄漏。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (20)

1.一种达沙替尼脂质体制剂，含有达沙替尼脂质体，所述沙替尼脂质体包括：达沙替尼和脂质体载体以及位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述达沙替尼被包封于所述内水相中；所述脂质体膜内的内水相和膜外的外水相之间存在铵盐梯度。
2.根据权利要求1所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述内水相包括铵盐水溶液；所述外水相为生理等渗溶液。
3.根据权利要求2所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述内水相中的达沙替尼的阳离子与所述铵盐的阴离子形成不溶性盐。
4.根据权利要求2所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述铵盐选自氯化铵、甲基磺酸铵、羟乙基磺酸铵、硫酸铵、磷酸铵、硫糖铵中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述内水相中铵根离子浓度为100mM～800mM。
6.根据权利要求2所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述生理等渗溶液选自5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。
7.根据权利要求1所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体内水相的pH值为4.0～9.0。
8.根据权利要求1所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，在所述达沙替尼脂质体制剂中，达沙替尼的浓度大于等于0.1mg/ml。
9.根据权利要求1所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体的组分包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂。
10.根据权利要求9所述的达沙替尼脂质体制剂，其特征在于，所述磷脂、所述胆固醇和所述聚乙二醇化磷脂之间的摩尔比为(30～80)：(0.1～40)：(0.1～30)。
11.一种如权利要求1-10任一项所述的达沙替尼脂质体制剂的制备方法，其特征在于，所述方法为主动载药法，所述主动载药法包括以下步骤：
(1)制备内水相和外水相均含铵盐水溶液的空白脂质体；
(2)制备内水相含有铵盐水溶液、外水相含有生理等渗溶液的空白脂质体，以形成空白脂质体内外水相铵盐浓度梯度；
(3)将步骤(2)所得空白脂质体与达沙替尼可溶性盐水溶液混合，孵育，去除游离达沙替尼可溶性盐，获得达沙替尼脂质体。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中的铵盐浓度为50mM～500mM。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液的pH值为3.0～7.0。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中铵根离子的浓度是500～900mM。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述铵盐水溶液中阴离子的浓度是300～500mM。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生理等渗溶液可选自：5％(w/v)葡萄糖水溶液、10％(w/v)蔗糖水溶液或0.9％(w/v)氯化钠水溶液。16、根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述外水相的pH是5.0～8.0。
17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，药脂比大于等于0.006。
18.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述达沙替尼可溶性盐选自达沙替尼盐酸盐、达沙替尼环拉酸盐、达沙替尼氢溴酸盐、达沙替尼甲磺酸盐或达沙替尼甲苯磺酸盐。
19.一种由如权利要求11-18任一项所述方法制备获得的达沙替尼脂质体制剂。
20.如权利要求1-10或19任一项所述达沙替尼脂质体制剂在制备前列腺癌、结直肠癌或黑色素瘤治疗药物中的用途。
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