CN113368047B - 一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束及其制备方法和应用，该方法包括将PCL‑ss‑PEG‑ss‑PCL、疏水性ICG、DSPE‑PEG‑COOH、MnO2、NLG919和TLR4激动剂溶于有机溶剂并超声处理，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；将薄膜干燥后依次进行水化、超声处理和透析，得到纳米粒胶束溶液；活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基，向纳米粒胶束溶液中添加NH2‑RGD进行孵育、透析得到具有靶向作用的共负载免疫佐剂(NLG919和MPLA)与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束；该方法将疏水性药物(ICG和NLG919)有效的包裹在内腔中，磷脂层嵌入免疫激动剂，在载体表面修饰氨基化的多肽精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸，形成有效针对恶性肿瘤光疗联合免疫治疗的纳米药物载体。

Description

一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化 聚合物胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及联合疗法治疗恶性肿瘤技术领域，具体涉及一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是当下人类面临的一个十分具有挑战性的健康问题，目前已成为各国人口死亡的主要原因之一。化疗是一种常用于治疗癌症的手段，在临床上具有显著的治疗效果，但频繁使用化疗药物不仅会对正常细胞产生毒副作用，而且也会诱发机体产生多药耐药性(Multi-drug resistance，MDR)，导致化疗无法取得预期的效果。为了克服传统治疗的障碍，发展有效的癌症治疗新方法迫在眉睫。化疗、放疗(Radiation therapy，RT)和高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound，HIFU)治疗已广泛应用于临床，在抑制肿瘤生长和延长患者生存期方面取得了巨大成功；光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)、光热疗法(Photothermic therapy，PTT)、免疫疗法、基因疗法(Gene therapy， GT)和磁热疗(Magnetic heat treatment，MHT)等在许多实验室和临床前研究中已显示出很高的抗癌功效，这些方法为未来的临床转化提供了巨大的希望。但人们发现仅用一种治疗手段并不能根除肿瘤和有效抑制肿瘤转移。因此，联合治疗成为了当下的研究热点。其中光疗联合免疫治疗已经引起了人们的广泛关注，并成为最有前途的癌症治疗方法之一。
癌症免疫治疗是利用患者自身免疫系统的力量来对抗癌症的一种新的治疗方式。在癌症免疫治疗中，药物被用来促进免疫系统的激活，通过自然机制攻击癌细胞。检查点阻断疗法是迄今为止研究最彻底的一类免疫治疗方法，是解决肿瘤适应性免疫逃避的一种很有前途的策略，已被美国食品和药物管理局 (FDA)批准用于癌症治疗。最常见的两种检查点抑制策略是PD-1/PD-L1阻断和CTLA4抑制。PD-1/PD-L1阻断治疗在大多数肿瘤类型中起作用，与CTLA4 抑制相比，是一种安全和有效的基础治疗方法。PD-1在T细胞表面表达，与肿瘤细胞上表达的PD-L1相互作用，通过抑制细胞毒性T细胞功能和向肿瘤传递抗凋亡信号引起免疫应答终止。免疫检查点阻断治疗通过逆转免疫细胞与肿瘤细胞之间的负调节信号，增强抗肿瘤免疫反应。然而，临床试验表明如果身体的免疫系统不能被完全激活产生大量的免疫细胞，那么大多数肿瘤细胞对检查点阻断所产生的持久反应很低。因此，免疫疗法可与其他治疗方法相结合，以产生协同治疗效果。
光疗法包括光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)，在肿瘤治疗中具有高效、侵袭性小和副作用低等优点。PTT和PDT除了通过光热和活性氧直接杀伤肿瘤细胞外，还可以诱导多种抗肿瘤效应。其潜在机制是被杀死的肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原并激活全身抗肿瘤免疫反应。热疗可以通过激活免疫效应细胞、分泌细胞因子和上调热休克蛋白的表达来调节免疫功能和抑制肿瘤的生长和转移。但PDT治疗后会导致调节性T细胞(Regulatory Tcells，Tregs)增加， PD-L1表达上调，从而抑制T淋巴细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。为了增强免疫细胞介导的抗肿瘤作用，可利用免疫佐剂促进机体激活免疫应答，并增加肿瘤组织中的氧浓度降低免疫系统抑制。同时PD-1/PD-L1检查点阻断疗法能够逆转免疫细胞与肿瘤细胞之间的负调节信号，增强抗肿瘤免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束及其制备方法和应用，该磷脂杂化聚合物胶束将疏水性药物有效的包裹在内腔中，磷脂层嵌入免疫激动剂，并在载体表面修饰氨基化的多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，形成一种有效针对恶性肿瘤光疗联合免疫治疗的纳米药物载体。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL-ss-PEG-ss-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-COOH和免疫佐剂溶于有机溶剂并超声处理，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后依次进行水化、超声处理和透析，得到纳米粒胶束溶液；
(c)活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基，再向纳米粒胶束溶液中添加NH2-RGD进行孵育、透析，得到所述具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束。
优选地，所述有机溶剂选自甲醇、二氯甲烷、DMSO中的一种或多种的混合物；更优选地，有机溶剂的体积与PCL-ss-PEG-ss-PCL的质量比为(4～6) mL∶(15～25)mg。
优选地，所述干燥为真空干燥，干燥时间为8～12h。
优选地，所述步骤(a)中，还包括将MnO2溶于有机溶剂中。
优选地，所述步骤(a)中，PCL-ss-PEG-ss-PCL与MnO2的质量比为 (75～125)∶1。
优选地，PCL-ss-PEG-ss-PCL中的PEG分子量为2000。
优选地，所述免疫佐剂包括吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂和/或TLR4 激动剂。
优选地，所述步骤(a)中，PCL-ss-PEG-ss-PCL与吲哚胺2，3-双加氧酶 -1通路干扰剂的质量比为(15～25)∶1；PCL-ss-PEG-ss-PCL与TLR4激动剂的质量比为(800～1200)∶1；
PCL-ss-PEG-ss-PCL与DSPE-PEG-COOH的质量比为(15～25)∶1； PCL-ss-PEG-ss-PCL与疏水性ICG的质量比为(15～25)∶1。
优选地，疏水性ICG通过如下方法制得：将亲水性ICG与碘化四丁胺按照质量比例1：5.72用二氯甲烷溶解并磁力搅拌12h得到。
优选地，所述吲哚胺2，3-双加氧酶-1(IDO1)通路干扰剂为NLG919；所述TLR4激动剂为MPLA。
优选地，所述步骤(b)中，水化中添加溶剂的体积与PCL-ss-PEG-ss-PCL 的质量比为(4～6)mL∶(15～25)mg，水化温度为60～70℃，时间为5～6h；所述溶剂选为水或PBS溶液；优选地，所述水为去离子水。
超声处理为将水化后的溶液至于冰浴条件下并以超声功率为25％～30％进行超声处理8～12min；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为3～5h。
优选地，所述步骤(c)中，活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基包括：
将NHS和EDC溶解于纳米粒胶束溶液中进行反应，其中NHS的添加量与PCL-ss-PEG-ss-PCL质量比为1∶(30～50)；EDC的添加量与 PCL-ss-PEG-ss-PCL质量比为1∶(40～60)；反应时间为12～20min；
NH2-RGD的添加量与PCL-ss-PEG-ss-PCL质量比为1∶(15～25)；孵育时间为8～12h；优选地，孵育过程中进行搅拌。
透析采用透析袋的分子截流量为8000-14000Da；透析时间为3～5h。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束。
本发明第三方面提供一种上述具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束在制备光疗联合免疫治疗肿瘤药物中的应用。
在本发明中，纳米胶束由两亲性三嵌段聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯 (PCL-ss-PEG-ss-PCL)作为载体材料。该纳米胶束具有亲水性外壳-疏水性内核结构。其内核负载光敏剂吲哚菁绿(ICG)和产氧剂二氧化锰(MnO2)，外壳连接RGD肽。该设计不仅能够有效增溶疏水性药物并提高其生物利用率，同时也能使药物靶向聚集到达肿瘤部位，增强肿瘤治疗效果。吲哚菁绿(ICG) 是美国食品药品监督管理局批准的近红外荧光染料，具有PPT-PDT双重功能，激光照射后可发挥光热联合光动力作用。MnO2具有氧化能力强、催化活性高和生物降解性好等优点，可在癌细胞酸性环境与内源性H2O2反应产生氧气，缓解肿瘤缺氧环境，提高光动力治疗效率。磷脂层中的单磷酰脂A(MPLA)是一种有效的TLR4激动剂，可通过TLR4依赖途径显著促进树突状细胞(DCs) 成熟和相关细胞因子的分泌。激光照射肿瘤部位不但能有效消除原位瘤还能够释放大量肿瘤相关抗原，在MPLA的协同作用下可使小鼠体内产生强烈的免疫反应。NLG919作为吲哚胺2，3-双加氧酶-1(IDO1)通路干扰剂能够阻断色氨酸(Trp)氧化代谢为犬尿氨酸(Kyn)途径，进而抑制调节性T细胞(Tregs) 活性，促进T细胞的增殖，从而增强对肿瘤的杀伤作用，联合抗PD-1检查点阻断疗法将有利于消除肿瘤和预防肿瘤转移。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明利用具有良好生物相容性的PCL-ss-PEG-ss-PCL为载体材料，制得的胶束具有明显的核壳结构，粒径较小，且粒径分布较为均一，通过特有的属性，将疏水性药物有效的包裹在内腔中，磷脂层嵌入TLR4激动剂MPLA；在载体表面修饰氨基化的多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(NH2-RGD)；最终形成一种有效针对恶性肿瘤光疗联合免疫治疗的纳米药物载体。
(2)本发明载体不仅能够有效增溶疏水性药物并提高其生物利用率，同时也能使药物靶向聚集到达肿瘤部位，增强肿瘤治疗效果。吲哚菁绿(ICG) 是美国食品药品监督管理局批准的近红外荧光染料，具有PPT-PDT双重功能，激光照射后可发挥光热联合光动力作用。MnO2具有氧化能力强、催化活性高和生物降解性好等优点，可在癌细胞酸性环境与内源性H2O2反应产生氧气，缓解肿瘤缺氧环境，提高光动力治疗效率。
(3)本发明的药物载体不会对BMDCs产生细胞毒性，且能够显著促进 DCs活化、成熟，上调表面的共刺激分子表达,能够促进产生抗原特异性CD8+ T细胞和CD4+T细胞，下调Tregs细胞比例，增加细胞杀伤因子IFN-γ的分泌，并产生长期免疫记忆效应。通过光热联合光动力治疗有效消除近端瘤，通过免疫作用抑制远端肿瘤的生长，联合aPD-1后远端瘤抑制效果更加显著。。
(4)本发明制备过程简单，制备周期短，成本较低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为实施例1中制备得到的磷脂杂化聚合物胶束的理化表征图。
图2为实施例7中磷脂杂化聚合物胶束在体外的光热效果曲线。
图3为实施例8中磷脂杂化聚合物胶束在808nm，1.5W/cm2激光照射下的体外抗肿瘤效果研究数据柱状图。
图4为实施例9中磷脂杂化聚合物胶束被肿瘤细胞摄取的流式细胞直方图。
图5为实施例9中磷脂杂化聚合物胶束在肿瘤细胞内ROS产生的共聚焦图。
图6为实施例10磷脂杂化聚合物胶束不同时间测定的小鼠活体成像图。
图7为实施例10中小鼠经本发明磷脂杂化聚合物胶束治疗后在体内光热效果图、给药24h后激光照射肿瘤局部5min的温度随时间变化曲线以及激光照射时的肿瘤局部最高温度热成像图(激光功率1.5W/cm2，808nm)。
图8为实施例10中肿瘤部位经过激光治疗后小鼠图和肿瘤组织石蜡切片的H&E染色图。
图9为实施例10中小鼠经磷脂杂化聚合物胶束治疗后主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)的H&E染色图。
图10为实施例11中小鼠经磷脂杂化聚合物胶束诱导BMDCs的共刺激因子CD40、CD80、CD86表达的流式细胞直方图。
图11为实施例12中小鼠经磷脂杂化聚合物胶束治疗后淋巴结树突状细胞 CD40、CD80、CD86表达水平的流式细胞直方图以及柱状统计图。
图12为实施例12中磷脂杂化聚合物胶束诱导肿瘤细胞/脾细胞中CD8+T 细胞和CD4+T细胞的流式细胞散点图和柱状统计图。
图13为实施例12中磷脂杂化聚合物胶束诱导脾细胞中CD8+T细胞和 CD4+T细胞分泌IFN-γ流式细胞散点图和柱状统计图。
图14为实施例12中磷脂杂化聚合物胶束诱导的调节性T细胞的流式细胞散点图和柱状统计图。
图15为实施例12中磷脂杂化聚合物胶束免疫后脾细胞中央型记忆T细胞的流式细胞散点图和柱状统计图。
图16为实施例13中磷脂杂化聚合物胶束治疗小鼠后的左/右侧肿瘤生长曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明提供一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，包括如下步骤：
(a)将PCL-ss-PEG-ss-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-COOH、MnO2和免疫佐剂溶于有机溶剂并超声处理，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后依次进行水化、超声处理和透析，得到纳米粒胶束溶液；
(c)活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基，再向纳米粒胶束溶液中添加NH2-RGD进行孵育、透析，得到所述具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例为一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL-ss-PEG-ss-PCL 20mg、疏水性ICG 1mg、MnO2 0.2mg、 DSPE-PEG-COOH1mg和免疫佐剂溶于5mL的有机溶剂并超声处理，然后，旋转蒸发有机溶剂并在烧瓶上形成一层均匀薄膜，其中，有机溶剂为二氯甲烷； PCL-ss-PEG-ss-PCL中的PEG分子量为2000；免疫佐剂为吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂和TLR4激动剂，PCL-ss-PEG-ss-PCL与吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂的质量比为20∶1；PCL-ss-PEG-ss-PCL与TLR4激动剂的质量比为1000∶1；吲哚胺2，3-双加氧酶-1(IDO1)通路干扰剂为NLG919；TLR4 激动剂为MPLA；
(b)将薄膜真空干燥10h后进行水化，将水化后的溶液至于冰浴条件下并以超声功率为30％进行超声处理10min，再以截留分子量为8000-14000Da 的透析袋透析4h，得到纳米粒胶束溶液，其中，水化中添加去离子水的体积与PCL-ss-PEG-ss-PCL的质量比为5mL∶20mg，水化温度为65℃，时间为5 h；
(c)将NHS和EDC溶解于纳米粒胶束溶液中进行反应，再向纳米粒胶束溶液中添加NH2-RGD进行孵育、透析，得到所述具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束，其中NHS的添加量为0.5mg；EDC 的添加量为0.4mg；反应时间为15min；NH2-RGD的添加量为1mg；孵育时间为10h；透析采用透析袋的分子截流量为8000-14000Da；透析时间为5h。
实施例2
本实施例为一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于步骤(a) 中未添加MnO2。
实施例3
本实施例为一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于步骤(a) 中免疫佐剂为吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂。
实施例4
本实施例为一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，该制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于步骤(a) 中免疫佐剂为TLR4激动剂。
实施例5
分别按照实施例1～4制备得到的具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束；其中实施例1制备得到的胶束记为RIMNA-PMs；实施例2制备得到的胶束记为RINA-PMs；实施例3制备得到的胶束记为 RIMA-PMs；实施例4制备得到的胶束记为RIMN-PMs；
本发明实施例1制备的磷脂杂化聚合物胶束RIMNA-PMs的粒径，粒径分布，电位测定；纳米粒的平均粒径为187.6±2.32nm，粒径分布为0.241±0.01，电位值为-22.3±0.01mV；
将实施例1中的(c)冷冻干燥，取1mg的纳米粒溶于2mL的二甲基亚砜中,均匀混悬，倍比稀释。并用紫外-分光光度计测量吸光度，测量波长为780 nm。采用标准曲线法计算样品中吲哚菁绿的含量。计算吲哚菁绿的载药量。
载药量公式如下：
载药量(％)＝载入纳米粒药物的质量/纳米粒的质量×100％
将实施例1中的(c)冷冻干燥，取1mg的纳米粒溶于2mL的二甲基亚砜中,均匀混悬，倍比稀释。并用高效液相色谱法测量吸光度。测量波长为280 nm。采用标准曲线法计算样品中NLG919的含量，计算NLG919的载药量。
载药量公式如下：
载药量(％)＝载入纳米粒药物的质量/纳米粒的质量×100％
结果证明，对于实施例1中RIMNA-PMs的ICG的载药量为2.38±0.61 wt％；RIMA-PMs的ICG载药量为2.98±1.12wt％；RINA-PMs的ICG载药量为4.00±0.67wt％；对于实施例1中RIMNA-PMs的NLG919的载药量为1.06 ±0.17wt％；RINA-PMs的NLG919的载药量为1.11±0.20wt％。
实施例6
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的理化表征。将制得的聚合物胶束RIMNA-PMs滴加在铜网上自然风干，然后在透射电子显微镜(TEM)下观察纳米粒结构特征。同时，将样品用去离子水稀释为200μg/mL的浓度，连续监测一周的粒径变化。在本次实验中，为了验证聚合物胶束的还原响应性，也检测了聚合物载体在有无谷胱甘肽(GSH)PBS溶液中的粒径变化。
将实施例1方法制得的聚合物胶束RIMNA-PMs分散在去离子水中，并稀释成ICG浓度为10μg/mL，采用不同激光功率照射样品，并用热成像仪测量 5min内样品温度的变化；RIMNA-PMs分散在去离子水中，并稀释成不同浓度，用808nm，1.5W/cm2激光照射样品，用热成像仪测量5min内样品温度的变化；将纳米粒RIMNA-PMs与其它样品分散在去离子水中，并稀释成ICG 浓度为10μg/mL，分别在808nm,1.5W/cm2的激光下照射，并用热成像仪测量5min内样品温度变化。
图1为本发明实施例1中制备的纳米粒RIMNA-PMs的的理化表征。在透射电子显微镜(TEM)下，可以发现得到的RIMNA-PMs大小均匀，表现为具有良好单分散性的球体,核壳结构明显(图1A)。在4℃条件下存放7天未发现粒径明显变化(图1B)，说明该聚合物胶束具有一定的稳定性，低温储存不易降解。如图1C所示，无还原性水溶液中的聚合物胶束保持单峰，表明该纳米载体在正常的生理条件下具有一定的稳定性，聚合物胶束结构完整。然而，在还原性条件下，粒径图呈现出两个宽峰，表明该纳米粒在还原条件下结构被破坏，具有一定的还原敏感性。图1E紫外可见光光谱分别在280nm和780nm 的附近出现吸收峰，表明ICG和NLG919成功被聚合物胶束包载。
实施例7
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束在体外的光热效果曲线。
从图2可以看出光照强度和ICG浓度与光热效果呈线性正相关，ICG浓度越高或光照强度越大，RIMNA-PMs温度变化越大。图2C是不同组别在5min 内的温度变化曲线,RIMNA-PMs，RINA-PMs，Free ICG组最大温度变化值分别为29.6℃，10.9℃和7.4℃，PBS水溶液在激光照射温度未发生明显变化，该实验结果表明，MnO2可以促进光热效果的产生，使RIMNA-PMs更容易在短时间内升到理想光热温度，具有更高的温度响应性和光热转换效率。
实施例8
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束在体外的抗肿瘤研究。
将培养2～3代的CT26细胞用培养基稀释至8×104个/mL，以每孔8000 个CT26细胞的数量接种于96孔板。培养过夜后，吸出旧的培养基。分别以 ICG等效浓度为2.5、5、10、20μg/mL加药,阴性对照组加入同等体积的培养基。然后将96孔板放入培养箱孵育24h。其中激光组在加药2h后照射5min (808nm，1.5W/cm2)。之后取出96孔板，吸去孔中药物培养基，每孔中加入100μL混有MTS的1640培养液(每100μL培养基含20μL MTS)，在37℃， 5％CO2条件下孵育30min。最后在490nm的波长条件下用酶标仪测量每孔的吸光度值细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性组OD值－空白组 OD值)。
图3为聚合物胶束体外的抗肿瘤研究检测结果图。如图3A、B所示，无激光作用时，各组细胞活性均达到80％以上，在一定浓度范围内RIMNA-PMs 和RINA-PMs对细胞没有明显的毒性。然而在激光照射下聚合物胶束对CT26 细胞表现出浓度依赖性的光毒性，随着ICG浓度增加，细胞的存活率降低。 10μg/mL浓度时，RIMNA-PMs组的细胞存活率显著降低，但RINA-PMs的细胞存活率仍在60％左右；在浓度为20μg/mL时，细胞死亡率均高达90％左右。综上所述，RIMNA-PMs不具有明显的肿瘤细胞毒性，但在激光作用下，可以对肿瘤细胞产生明显的杀伤作用。
实施例9
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的细胞摄取研究及活性氧检测。
在12孔培养板中培养细胞过夜，细胞浓度为2×105个/mL。待细胞贴壁后，每个孔内分别加入2mL混有RIMNA-PMs、RINA-PMs、Free ICG的培养基(ICG等效浓度为10μg/mL)。培养2h后，激光组的肿瘤细胞在1.5W/cm2功率下照射5min。之后继续孵育1h，收集细胞，并用流式细胞仪对ICG的摄取量进行检测。
细胞在浓度为6×104个/mL的共聚焦皿上培养过夜。吸出旧培养基，加入药物培养基混合物(ICG等效浓度为10μg/mL)。培养2h后，吸出药物培养基的混合物，用PBS清洗1次。然后在37℃培养条件下，将浓度为6μg/mL 的carboxy-H2DCFDA加入培养皿中15min。用PBS清洗1次，以激光强度为 1.5W/cm2照射5min，然后用4％多聚甲醛在室温下固定10min，PBS清洗2 次。最后，用浓度为8μg/mL的Hoechst将样品染色5min，用PBS洗涤1次进行检测。
图4是CT26细胞对RIMNA-PMs、RINA-PMs、Free ICG的摄取情况。如图4所示，肿瘤细胞对RINA-PMs与Free ICG的摄取并不明显，但在激光的作用下，肿瘤细胞对RINA-PMs与Free ICG的摄取量基本持平，该结果表明激光作用下产生的轻度高温效应能够促使肿瘤细胞膜流动，促进细胞对药物的摄取，从而有利于提高肿瘤的杀伤效果。同时，RIMNA-PMs组在无激光作用时的摄取量较高，而RINA-PMs的摄取仅为4％左右，因此MnO2具有促进细胞对聚合物胶束的摄取能力。RIMNA-PMs+Laser组的摄取能力更强。综上所述，MnO2与激光共同发挥作用时可以显著促进细胞对聚合物胶束的摄取，提高癌症治疗效果。
光敏剂在适当波长的照射下传递光子能量产生活性氧(ROS)，包括I型活性氧(超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢)和II型活性氧(单线态氧)，一般认为II型ROS是引起细胞死亡主要的原因。而常用来测定细胞内产生的 ROS方法是利用DCFH-DA探针。DCFH-DA是一种非荧光分子，可被动扩散到细胞中，通过细胞内的酯酶水解生成DCFH，细胞内的活性氧再将DCFH氧化生成有绿色荧光的DCF。如图5所示，在无激光照射时，给药组产生的绿色荧光极其微弱。相反，RIMNA-PMs组在激光作用后亮绿色荧光信号明显增强，产生的绿色荧光也明显多于RINA-PMs+Laser组。综上所述，RIMNA-PMs 中的MnO2可与肿瘤细胞内H2O2在酸性环境下反应产生O2，并在激光照射下产生更多的ROS。因此MnO2不仅可以提高光热效果，而且也可以改善肿瘤的乏氧环境，促进ROS产生，增强损伤癌细胞的能力,有利于提高PTT-PDT联合治疗效率。
实施例10
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的体内分布、体内光热效果、抑瘤效果研究及生物安全性评价。
选取6～8周的雌性BALB/c小鼠进行实验，肿瘤体积计算公式为：(肿瘤长径)×(肿瘤短径)2/2。在BALB/c小鼠右侧靠近下肢部位皮下接种CT26细胞，当肿瘤细胞增长到200mm3开始实验。随机将小鼠分成三组，并将纳米粒 RIMNA-PMs、Free ICG、PBS分别通过尾静脉注射到小鼠体内，ICG浓度为5 mg/kg。最后分别于6、12、24、48、72h麻醉小鼠进行活体成像观察。
在BALB/c小鼠右侧靠近下肢部位皮下接种CT26细胞，当肿瘤细胞增长到200mm3开始实验。随机将小鼠分成三组。将纳米粒RIMNA-PMs、RINA-PMs、Free ICG、PBS分别通过尾静脉注射到小鼠体内，ICG浓度为5 mg/kg。静脉注射24h后，用激光功率1.5W/cm2照射5min,同时用红外热像仪(T32 fluke，美国)记录温度变化。最后利用绘图软件Graphpad Prism绘出光热曲线。
在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠的右侧靠近下肢部位皮下接种CT26细胞 (106个/只)以建立肿瘤模型。当肿瘤生长到约70～80mm3时，将BALB/c小鼠随机分成四组(n＝3)：PBS+Laser、RIMNA-PMs+Laser、RINA-PMs+ Laser、Free ICG+Laser。静脉注射24h和48h后，对肿瘤部位进行激光照射 (1.5W/cm2，5min)。收集肿瘤及主要器官固定切片后进行H&E染色。
如图6所示，通过尾静脉全身给药,RIMNA-PMs组的小鼠肿瘤部位具有显著的荧光信号，在24h范围内达到较强的荧光强度，明显高于Free ICG组小鼠成像检测的每个时间点。该实验结果表明与Free ICG相比，RIMNA-PMs 可有效促进药物在肿瘤区域富集。同时RIMNA-PMs组在一段时间内可保持较强的荧光信号强度，并且显著高于Free ICG组的荧光信号强度。综上所述， RIMNA-PMs能够明显在肿瘤内蓄积并具有一定的持久性，负载ICG有利于克服游离ICG存在的稳定性差、保留时间短、清除率高等缺点。
如图7A所示，RIMNA-PMs组的肿瘤部位升温速度明显超过其他三组，而且保持一定的稳定性，近红外热像仪显示RIMNA-PMs组的肿瘤最高温度可以达到54.7℃，而Free ICG组小鼠肿瘤部位升温不明显。这是由于游离ICG 具有稳定性差、保留时间短和清除率高的缺点，通过静脉全身循环后蓄积到肿瘤部位的药物较少。该研究表明聚合物胶束具有负载难溶性以及保护药物的优势，使其能够最大限度地到达肿瘤部位，提高药物的生物利用率。另外， RINA-PMs组小鼠肿瘤部位最高温度约为48℃，此温度能够促使蛋白质的折叠与变性，但有文献研究表明只有保持温度超过1h才能对细胞造成不可逆的损伤。综上所述，RIMNA-PMs组升至的温度相对最高，负载MnO2能够提高光热转化效率，增加聚合物胶束在体内的光热效应，实现快速有效的光热治疗。
通过观察激光治疗后小鼠肿瘤体积变化分析聚合物胶束抑制肿瘤的效果，图8A为实验流程图。通过实验结果可以看出小鼠在进行激光治疗后， RIMNA-PMs+Laser组小鼠肿瘤不明显，甚至完全消失，而RINA-PMs+Laser 组的肿瘤体积较小，Free ICG组与PBS组肿瘤体积较大，这表明RIMNA-PMs 在激光作用下具有明显抑制肿瘤的效果，RINA-PMs+Laser也具有一定的抑制作用。同时我们对治疗后的肿瘤组织进行了苏木精-伊红(H&E)染色，RIMNA-PMs+Laser组出现了明显的肿瘤细胞减少、核和膜萎缩的细胞凋亡现象，RINA-PMs+Laser组也有细胞丢失或坏死现象，而其它组的肿瘤细胞无明显异常(图8C)。综上所述，RIMNA-PMs能够对肿瘤部位产生杀伤作用，促进细胞凋亡坏死，进而达到消除肿瘤的目的。
如图9所示，RIMNA-PMs组、Free ICG组与PBS组相比，小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾组织的细胞形态均无明显变化。综上所述，RIMNA-PMs具有良好的生物相容性，使用后不会对机体造成非特异性的损伤，在未来的临床应用中具有广阔的发展前景。
实施例11
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的体外促成熟研究。
从6～8周龄BALB/c小鼠骨髓中分离细胞，并向培养至第6天的BMDCs 中加入药物制剂。5×105个BMDCs分别与PBS、I+N+A、RIMNA-PMs、 RINA-PMs、RIMA-PMs和RIMN-PMs在孔板中孵育24h后，收集下层半贴壁的细胞并以450g转速离心5min，收集细胞沉淀。然后加入PBS洗涤1次，用Anti-CD11c，Anti-CD80，Anti-CD40以及Anti-CD86在4℃下孵育30min。之后再用PBS清洗1次，得到的细胞沉淀用0.3mL PBS重悬，并过200目细胞筛于流式管中。最后使用流式细胞仪检测细胞表面共刺激因子CD80,CD40 和CD86的表达水平。
作为最重要的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APCs)之一，DCs 在先天性免疫应答和适应性免疫应答之间起着关键的作用。未成熟的树突状细胞可以吞噬和处理组织和外周血中的抗原，然后经历成熟并迁移到淋巴结，将抗原呈递给初始T细胞。成熟的树突状细胞可以上调DCs表面的共刺激分子例如CD40、CD80、CD86，激活初始CD8+T细胞和初始CD4+T细胞增殖分化为效应T细胞。因此，我们通过分析CD40、CD80、CD86的上调情况来研究RIMNA-PMs对BMDCs的促成熟作用。如图10所示，与其他组相比， RIMNA-PMs组的CD40、CD80、CD86表达均高于其他组，RIMNA-PMs能够促进树突状细胞成熟，上调抗原提呈细胞(APCs)表面的共刺激分子，这有利于激活细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T细胞，启动强大而持久的肿瘤特异性T细胞反应。虽然I+N+A组的细胞因子上调水平较高，但是这并不能用来解释体内实际细胞因子的上调情况。
实施例12
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的体内免疫机制研究。
在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠的右侧靠近下肢部位皮下注射CT26细胞以构建肿瘤模型(106个/只)。当肿瘤生长到70～80mm3时(第0天)，在小鼠的左侧靠近下肢部位皮下注射CT26细胞(每只小鼠2×105个细胞)，并将小鼠随机分为6组(n＝3)：PBS+Laser、RIMNA-PMs+Laser、RINA-PMs+Laser、 RIMA-PMs+Laser、RIMN-PMs+Laser、I+A+N+Laser。尾静脉给药2次 (ICG:5mg/kg，NLG919：1.5mg/kg，MPLA：0.1μg/kg)，间隔5天。注射后的24h和48h，用808nm近红外激光器照射肿瘤部位。在第21天进行眼球取血并处死小鼠，收集淋巴结细胞染色，并用流式细胞仪分析DCs的成熟水平。同时采集脾脏和肿瘤保存于含有1％青霉素链霉素混合液的培养基中，轻轻研磨过滤，获得单细胞悬液，并离心获得细胞沉淀。之后将细胞沉淀与红细胞裂解缓冲液混合均匀孵育2min，2min后加入10倍体积的PBS对细胞悬液再次离心。最后，PBS重悬细胞并分装到1.5mL的EP管中，便于特异性荧光标记的抗体对细胞染色。
1.淋巴结树突状细胞促成熟水平测定：脱颈处死小鼠并将淋巴结进行研磨以获得淋巴细胞悬液。离心(450g，5min)，小心弃去上清，用Anti-CD11c， Anti-CD80，Anti-CD40以及Anti-CD86在4℃下孵育30min。之后再用PBS 清洗1次，得到的细胞沉淀用300μL PBS重悬，并过200目细胞筛于流式管中。最后使用流式细胞仪检测细胞表面共刺激因子CD80,CD40和CD86的表达水平。
2.抗原特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞测定：脱颈处死小鼠并将脾脏和肿瘤按上述方法研磨后获得脾细胞悬液和肿瘤悬液。离心(450g，5min)，小心弃去上清，经红细胞裂解液处理后，细胞沉淀分别用荧光标记抗体 Anti-CD3，Anti-CD4，Anti-CD8进行染色。在4℃孵育30min后，加入1mL PBS进行离心(450g，5min)。小心弃去上清，之后使用300μL的PBS溶液重悬细胞并过滤于流式管中，通过流式细胞仪分析。
3.脾细胞分泌的IFN-γ水平测定：(1)脱颈处死小鼠并将脾脏按上述方法研磨后获得单细胞悬液。(2)离心(450g，5min)，小心弃去上清，经红细胞裂解液处理后，细胞沉淀用完全培养基重悬铺于24孔板。(3)培养2h后，加入1×PMA和ionomycin继续培养10h。(4)加入1×BFA再孵育6h，然后收集脾细胞，脾细胞用1mL PBS洗涤1次，离心获得的细胞沉淀分别用荧光标记抗体Anti-CD8、Anti-CD4进行染色，4℃孵育30min。(5)加入1mL PBS 进行离心(450g，5min)，小心弃去上清，之后加入100μL胞内固定缓冲液到所有EP管混匀，室温避光孵育20min。(6)每管加入1mL 1×透化液洗涤，离心弃上清，细胞沉淀用1×透化液稀释荧光标记抗体Anti-IFN-γ进行染色，室温下避光孵育20min。(7)加入1mL PBS进行离心(450g，5min)，弃去上清，使用300μL的PBS溶液重悬细胞并过滤于流式管中，通过流式细胞仪分析。
4.调节性T细胞比例的测定：脱颈处死小鼠并将脾脏按上述方法研磨后获得单细胞悬液。离心(450g，5min)，小心弃去上清，经红细胞裂解液处理后，细胞沉淀用荧光标记抗体Anti-CD4进行染色。在4℃孵育30min后，加入1mL PBS进行离心(450g，5min)。小心弃去上清。之后向每个管中加入 0.1mL Foxp3固定/破膜工作溶液并脉冲涡旋，室温避光孵育30～60min。60min 后，每管加入1mL 1×透化液洗涤，离心弃上清。细胞沉淀用荧光标记抗体Anti-Foxp3进行染色，室温下避光孵育30min。之后加入1mL PBS进行离心 (450g，5min)，小心弃去上清。最后，使用300μL的PBS溶液重悬细胞并过滤于流式管中，通过流式细胞仪分析。
5.免疫后小鼠记忆细胞的测定：在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠的右侧靠近下肢部位皮下注射CT26细胞(每只小鼠106个细胞)以构建肿瘤模型。当肿瘤在第0天生长到约70～80mm3时，将小鼠随机分为6组(n＝3)：PBS+ Laser、RIMNA-PMs+Laser、RINA-PMs+Laser、RIMA-PMs+Laser、 RIMN-PMs+Laser、I+A+N+Laser。尾静脉给药2次，间隔5天。注射后的24h和28h，用808nm近红外激光器照射肿瘤部位。第20天，尾静脉注射105个CT26细胞到小鼠体内，第21天处死小鼠，收集脾脏并制备脾细胞悬液，分别用Anti-CD8、Anti-CD4、Anti-CD44、Anti-CD62L染色，然后通过流式细胞仪进行处理分析。
如图11所示为药物对体内淋巴结树突状细胞(DCs)促成熟作用研究。分别将RIMNA-PMs、RINA-PMs、RIMA-PMs、RIMN-PMs、I+N+A、PBS 溶液尾静脉注射到小鼠体内，治疗后分离出小鼠的腹股沟淋巴结。研磨获得细胞悬液后，通过流式细胞仪检测共刺激分子CD40、CD86、CD80的表达。CD40 与活化T细胞表面的CD40L结合可以为特异性免疫应答的启动和调节提供重要的共刺激信号。RIMNA-PMs+Laser组的表达相对较高，分别是I+N+A、 PBS组表达水平的1.8倍和5倍，而RINA-PMs+Laser(44.5％)、RIMA-PMs +Laser组(42.3％)和RIMN-PMs+Laser组(45.3％)表达处于同一水平，均低于RIMNA-PMs+Laser组(53.6％)。CD80和CD86是抗原提呈细胞(APCs) 上表达的两种最具特征的共刺激分子，它们可以为T细胞增殖、细胞因子以及细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的产生提供信号。RIMNA-PMs+Laser组的CD80和CD86表达水平最高，分别为29.5％和36.3％，这表明RIMNA-PMs+Laser 可显著诱导抗原递呈促进免疫细胞成熟，从而提高机体免疫应答。
为了进一步了解多功能纳米聚合物胶束光热联合免疫治疗的抗肿瘤作用机制，在第21天处死小鼠，采集脾脏和肿瘤，研磨获得细胞悬液，用Anti-CD3、 Anti-CD4和Anti-CD8染色后进行流式细胞术评估。细胞毒性T淋巴细胞(CD3+ CD8+T淋巴细胞)可直接杀伤靶向癌细胞，辅助性T细胞(CD3+CD4+T淋巴细胞)在调节适应性免疫中起重要作用。如图12A和B所示，RIMNA-PMs+Laser 组小鼠肿瘤细胞毒性T淋巴细胞的百分比为9.38％，明显高于I+N+A+Laser 组。同时也高于RINA-PMs+Laser组(9.07％)、RIMA-PMs+Laser组(6.62％)、 RIMN-PMs+Laser组(8.91％)。与其他组相比，RIMNA-PMs+Laser组(9.12％) 小鼠肿瘤辅助性T细胞仍表现出较高的百分比,是I+N+A+Laser组的2.6 倍。如图12C和D所示，脾脏中RIMNA-PMs+Laser组细胞毒性T淋巴细胞的百分比为25.3％，辅助性T细胞的百分比为26.2％，分群明显，也均高于其他组别。综上所述，RIMNA-PMs+Laser组治疗后可以引起自身免疫系统发挥作用，促进CD3+CD8+T淋巴细胞和CD3+CD4+T淋巴细胞在肿瘤部位的浸润，抑制肿瘤的生长。
干扰素-γ是参与抗肿瘤免疫的最重要的细胞杀伤因子，在识别和消除突变细胞中有着核心地位。IFN-γ可由CD4+T、CD8+T细胞产生，我们通过胞内细胞因子染色，测定脾细胞分泌的IFN-γ水平。如图13所示，RIMNA-PMs +Laser组CD8+IFN-γ+T细胞百分比为5.21％，RINA-PMs+Laser组、 RIMA-PMs+Laser组、RIMN-PMs+Laser组、I+N+A+Laser组和PBS+ Laser组免疫后的CD8+IFN-γ+T细胞比例分别为1.73％、1.43％、1.82％、1.12％和1.07％。与其他组相比，RIMNA+Laser组能有效诱导CD8+T细胞分泌IFN- γ。同样，RIMNA-PMs+Laser组中CD4+IFN-γ+T细胞百分比为4.69％，高于其他组，为I+N+A+Laser组的8.8倍。IFN-γ能增强巨噬细胞的杀菌活性和CD8+T细胞的细胞毒活性，并诱导感染的巨噬细胞凋亡，这些结果表明RIMNA-PMs+Laser组免疫后的小鼠能诱导出较强的抗肿瘤免疫效应。
以Foxp3为标志，CD4+T细胞可分为促进免疫应答的有效T细胞(CD4+ Foxp3-)和阻碍有效抗肿瘤免疫反应的调节性T细胞(CD4+Foxp3+)。采集脾脏，研磨获得细胞悬液，用Anti-CD4、Anti-Foxp3染色后进行流式细胞术评价。如图14所示，I+N+A+Laser组小鼠脾细胞中调节性T细胞(CD4+ Foxp3+)比例为17.9％,高于RIMNA-PMs+Laser组(15.2％)、RINA-PMs+ Laser组(15.6％)、RIMN-PMs+Laser组(17.2％)，而RIMNA-PMs+Laser组光热联合免疫治疗对Tregs细胞的下调作用最为显著。上述研究表明，NLG919 通过抑制IDO活性介导的必需Trp向免疫抑制性Kyn的转化，联合MPLA可以显著降低免疫抑制的调节性T细胞数量，发挥双重免疫治疗的作用。因此，以RIMNA-PMs为基础的光疗联合免疫治疗能有效降低肿瘤细胞的免疫抑制，有利于增强T细胞抗肿瘤免疫应答。
如图15所示，RIMNA-PMs+Laser组CD8+T细胞中TCM百分比为50.7％，显著高于RIMN-PMs+Laser组、I+N+A+Laser组和PBS+Laser组的CD8+ CD44+CD62L+T细胞数量。同时RIMNA-PMs+Laser组小鼠CD4+T细胞中 TCM百分比为44.4％，明显高于RINA-PMs+Laser组、RIMA-PMs+Laser组、 RIMN-PMs+Laser组、I+N+A+Laser组和PBS+Laser组。综上所述， RIMNA-PMs+Laser能够诱导机体产生更好的免疫记忆效应，有助于抑制肿瘤复发。
实施例13
本发明实施例制备的磷脂杂化聚合物胶束的联合治疗抑制肿瘤生长效果研究。
在6～8周龄的BALB/c雌性小鼠的靠近下肢部位皮下注射CT26细胞以构建肿瘤模型(106个/只)。当右侧肿瘤生长到70～80mm3时(第0天)，在小鼠的左侧靠近下肢部位皮下注射CT26细胞(每只小鼠2×105个细胞)，将BALB/c 小鼠随机分成8组(n＝5)：PBS+Laser、I+N+A+Laser、RIMNA-PMs、RIMN-PMs+Laser、RINA-PMs+Laser、RIMA-PMs+Laser、RIMNA-PMs+Laser、RIMNA-PMs+Laser+aPD-1。静脉注射24h和48h后，对肿瘤部位进行激光照射(1.5W/cm2，5min)。每隔一天监测并记录肿瘤体积和小鼠体重变化。肿瘤体积由如下方程计算，其中L和D分别代表肿瘤的长轴和短轴的长度。
V＝1/2LD^2
为进一步评价RIMNA-PMs以及RIMNA-PMs联合阻断PD-1/PD-L1通路介导的免疫治疗抗肿瘤效果，建立了BALB/c小鼠双肿瘤模型。如图16A所示的方案，仅右侧肿瘤在尾静脉给药后进行激光照射，而左侧肿瘤不做任何处理使其自然生长。如图16B所示，RIMNA-PMs+Laser组、RIMA-PMs+Laser 组、RIMN-PMs+Laser组小鼠右侧瘤明显被抑制，而RINA-PMs+Laser组， I+N+A+Laser组和PBS+Laser组小鼠右侧肿瘤具有明显的生长趋势。 RINA-PMs+Laser组小鼠右侧肿瘤仍然增长是由于RINA-PMs内腔中并未包载MnO2,用相同功率照射肿瘤部位不能升至理想温度，进而无法达到抑制肿瘤的目的。左侧肿瘤主要是用来评价多功能聚合物胶束的免疫效果。RINA-PMs +Laser组、RIMA-PMs+Laser组、RIMN-PMs+Laser组、I+N+A+Laser 组和PBS+Laser组小鼠左侧肿瘤具有明显的生长趋势。与其他组相比， RIMNA-PMs+Laser组具有明显的抑制左侧肿瘤生长的效果，肿瘤体积较小。 RIMNA-PMs+Laser+aPD-1组与RIMNA-PMs+Laser组相比，小鼠治疗后左侧肿瘤更小甚至消失，抑制肿瘤生长的效果更加明显。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (8)

1.一种具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将PCL-ss-PEG-ss-PCL、疏水性ICG、DSPE-PEG-COOH和免疫佐剂溶于有机溶剂并超声处理，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后依次进行水化、超声处理和透析，得到纳米粒胶束溶液；
(c)活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基，再向纳米粒胶束溶液中添加NH2-RGD进行孵育、透析，得到所述具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束；
所述步骤(a)中，还包括将MnO2溶于有机溶剂中；
所述免疫佐剂包括吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂和/或TLR4激动剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，PCL-ss-PEG-ss-PCL与MnO2的质量比为(75～125)∶1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，PCL-ss-PEG-ss-PCL与吲哚胺2，3-双加氧酶-1通路干扰剂的质量比为(15～25)∶1；PCL-ss-PEG-ss-PCL与TLR4激动剂的质量比为(800～1200)∶1；
PCL-ss-PEG-ss-PCL与DSPE-PEG-COOH的质量比为(15～25)∶1；PCL-ss-PEG-ss-PCL与疏水性ICG的质量比为(15～25)∶1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吲哚胺2，3-双加氧酶-1(IDO1)通路干扰剂为NLG919；所述TLR4激动剂为MPLA。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，水化中添加溶剂的体积与PCL-ss-PEG-ss-PCL的质量比为(4～6)mL∶(15～25)mg，水化温度为60～70℃，时间为5～6h；
超声处理为将水化后的溶液至于冰浴条件下并以超声功率为25％～30％进行超声处理8～12min；
透析采用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da；透析时间为3～5h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，活化纳米粒胶束溶液中纳米粒胶束表面的羧基包括：
将NHS和EDC溶解于纳米粒胶束溶液中进行反应，其中NHS的添加量与PCL-ss-PEG-ss-PCL质量比为1∶(30～50)；EDC的添加量与PCL-ss-PEG-ss-PCL质量比为1∶(40～60)；反应时间为12～20min；
NH2-RGD的添加量与PCL-ss-PEG-ss-PCL的质量比为1∶(15～25)；孵育时间为8～12h；
透析采用透析袋的分子截流量为8000-14000Da；透析时间为3～5h。
7.权利要求1～6任一所述的制备方法制得的具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束。
8.权利要求7所述的具有靶向作用的共负载免疫佐剂与吲哚箐绿的磷脂杂化聚合物胶束在制备光疗联合免疫治疗肿瘤药物中的应用。
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