CN114796492B - 一种超声驱动纳米声敏疫苗及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

一种超声驱动的纳米声敏疫苗及制备和应用，属于医药技术领域。本发明构建一种超声驱动的纳米声敏疫苗，采用二氢卟吩e6（CHC）作为声敏剂，通过酰胺反应连接于G5表面；以R848作为免疫调节剂，通过串联的硝基还原酶敏感短臂、双功能PEG与G5相连，该设计可以实现R848在肿瘤微环境中酶触发的定点释放。该纳米声敏疫苗在超声驱动下，通过“声敏直接杀伤‑多重免疫干预”机制，实现对深层肿瘤及转移病灶的声动力‑免疫联合治疗。在对肿瘤细胞杀伤的同时，调控免疫抑制肿瘤微环境，发挥协同的抗肿瘤作用。与此同时SDT疗法又具有非侵入性、穿透深层组织达10厘米且无毒副作用小，为彻底根治肿瘤奠定基础。

Description

一种超声驱动纳米声敏疫苗及其制备和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及基于自由场声动力疗法和免疫疗法相结合的纳米声敏疫苗的制备及其治疗原位及转移性肿瘤的应用。
背景技术
胰腺癌是世界范围内致死率极高的重度恶性消化系统癌症，具有高度侵袭性和转移性，患者的5年生存率仅为7％。目前临床上缺乏有效的胰腺癌治疗手段，手术切除是唯一可能治愈胰腺癌的方法。但是胰腺处于深度的腹膜后位置，为早期诊断带来挑战，导致多数患者在发现时已达中晚期，丧失手术治疗的最佳时机。吉西他滨等作为治疗胰腺癌一线药物，极易产生耐药导致治疗失败。近年来新兴的免疫疗法也被用于胰腺癌的治疗研究，但疗效甚微，这与胰腺癌独特的肿瘤微环境密切相关。
以致密基质结构和高度免疫抑制为典型特征的肿瘤微环境是导致胰腺癌多种治疗手段欠佳的主要原因。一方面，致密基质结构发挥“壁垒效应”形成封闭的“免疫冷”肿瘤微环境，限制药物、外周免疫效应细胞等进入肿瘤组织发挥作用；另一方面，由于肿瘤微环境中存在大量免疫抑制的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)以及髓源性抑制细胞(MDSCs)，不仅大大削弱抗肿瘤免疫应答，同时辅助肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进肿瘤转移。
声动力疗法(SDT)是基于光动力疗法(PDT)发展起来的肿瘤二次元靶向治疗方法，具有组织穿透性强、特异性好、副作用小等诸多优势，在肿瘤治疗领域展现出良好的临床应用前景。由于超声波在组织中穿透深度可达7-10cm，相比于PDT(光穿透组织深度小于1cm)，SDT在杀伤深层肿瘤(如胰腺癌)方面展现出绝对优势。SDT过程是利用临床安全的低强度超声(US)激活聚集在肿瘤部位的声敏剂产生活性氧(ROS)，从而诱导肿瘤细胞凋亡或者坏死。超声空化作用也可产生剪切力，对肿瘤细胞进行机械损伤。上述过程导致大量肿瘤抗原释放。同时SDT诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)，触发损伤相关分子模式(DAMPs)的表达，协助启动T细胞依赖的抗肿瘤免疫应答。尽管如此，“免疫冷”肿瘤微环境的存在将显著抑制这部分有益的抗肿瘤免疫应答。因此，仅利用SDT针对胰腺癌细胞进行杀伤往往无法阻断疾病进展，从根本上改造胰腺癌肿瘤微环境至关重要。
雷西莫特(Resiquimod，又名R848)是一种作用于Toll样受体7和8(TLR7/8)的激动剂，不仅可以招募并激活抗原提呈细胞(APCs)，释放促炎细胞因子和趋化因子，还可以调控免疫抑制细胞的表型，如下调MDSCs的比例、将TAMs从肿瘤促进的M2型极化为肿瘤抑制的M1型。然而，游离的R848在体内药代动力学特性差，容易引起机体非特异性免疫应答。因此采用纳米材料对R848进行肿瘤靶向递送、并定点释放将是一个有效策略，既可以规避R848引起全身毒副作用的风险，又可以调控免疫抑制细胞、有效改造胰腺癌微环境，进而高效启动抗肿瘤免疫应答。
第五代聚酰胺-胺(PAMAM，G5)是一种高度支化的纳米级树枝状聚合物材料(6-10nm)，分子呈现球形，具有单分散性、稳定性好等优质特性。此外，G5的小尺度效应可有效避开肾脏及网状内皮系统的快速清除、显著延长体内循环时间，更易穿透胰腺癌致密结构向肿瘤深部蓄积。G5表面大量氨基可将免疫调节剂、光敏剂、声敏剂及化疗药物等高效负载于其表面，在药物递送方面具有独特优势和巨大的应用价值。
发明内容
本发明旨在利用PAMAM(G5)作为纳米载体双递送声敏剂与免疫调节剂，构建一种超声驱动的纳米声敏疫苗。在超声驱动下，通过“声敏直接杀伤-多重免疫干预”机制，实现对深层肿瘤及转移病灶的声动力-免疫联合治疗。本发明采用二氢卟吩e6(CHC)作为声敏剂，通过酰胺反应连接于G5表面；以R848作为免疫调节剂，通过串联的硝基还原酶敏感短臂、双功能PEG与G5相连，该设计可以实现R848在肿瘤微环境中酶触发的定点释放。我们基于自由场超声模式提出“周身超声治疗”新理念，并成功研制小动物周身超声治疗装置。以原位胰腺癌小鼠模型为例，静脉给予多功能纳米声敏疫苗，在周身超声装置辐照下，在肿瘤部位富集的纳米声敏疫苗产生ROS直接杀伤肿瘤细胞，产生的细胞碎片及内溶物外流，实现抗原释放；定点释放的免疫调控药物R848诱导免疫“冷”肿瘤微环境向“热”肿瘤微环境转变，成功启动长效的抗肿瘤免疫应答。多功能纳米声敏疫苗治疗肿瘤的有效性，证实通过SDT联合免疫疗法在治疗癌症及预防转移方面具有巨大的临床转化潜力。
本发明的技术方案：一种超声驱动纳米声敏疫苗，所述纳米声敏疫苗包括纳米载体、与纳米载体连接的声敏剂和与纳米载体通过硝基还原酶敏感Linker连接的免疫调节剂。
所述纳米载体为第五代聚酰胺-胺树枝状大分子(G5)。
所述声敏剂为二氢卟吩e6(CHC)。
所述免疫调节剂为雷西莫特(R848)。
所述硝基还原酶敏感Linker的结构如下：
Figure BDA0003639956640000031
其中，n为44-46的数。
所述纳米声敏疫苗还包括与纳米载体通过酰胺键连接的改善剂，所述改善剂的结构为
Figure BDA0003639956640000032
其中，n为44-46的数。
所述纳米声敏疫苗的水合粒径约为10.66-12.26nm，具体的所述纳米声敏疫苗的水合粒径可为12.26nm。
所述纳米声敏疫苗的一种具体结构如下：
Figure BDA0003639956640000033
m、b各自独立的为大于零的整数，m、b和p的和为不大于128的整数，n为44-46的数。所述的超声驱动纳米声敏疫苗的制备方法，包括如下步骤：
合成连接免疫调节剂的硝基还原酶敏感Linker：
Figure BDA0003639956640000034
n为44-46的数。
声敏剂和纳米载体通过酰胺化反应合成连接声敏剂的纳米载体；
连接免疫调节剂的硝基还原酶敏感Linker和连接声敏剂的纳米载体反应合成连接免疫调节剂和声敏剂的纳米声敏疫苗；
对于包含改善剂的纳米声敏疫苗还包含以下步骤：
连接免疫调节剂和声敏剂的纳米声敏疫苗和改善剂反应合成连接免疫调节剂、声敏剂和改善剂的纳米声敏疫苗G5-CHC-R。
激发所述纳米声敏疫苗的超声频率为1MHz，超声强度为2W/cm2或3W/cm2，超声时间为20或30min。
所述的超声驱动纳米声敏疫苗在制备抗肿瘤药物、制剂或者疫苗中的应用。
所述的超声驱动纳米声敏疫苗在制备抗肿瘤免疫调节药物中的应用。
所述肿瘤包括淋巴癌、肺癌、肾癌、结肠癌(肝转移)、乳腺癌(肺转移)、肝癌、胰腺癌。所述肿瘤为优选乳腺癌(肺转移)、胰腺癌。
所述纳米声敏疫苗用于制备调节肿瘤微环境中M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞，CD8+T细胞群增加，髓源性抑制细胞下调的药物。
本发明一种超声驱动纳米声敏疫苗的具体制备方法，包括以下步骤：
①以3-羟基-4-硝基苯甲醛、3-溴丙炔、对硝基苯基氯甲酸酯和R848为原料，制备硝基还原酶敏感的触发靶头。合成路线如下：
Figure BDA0003639956640000041
②将上述步骤所得到的化合物4与N3-PEG2K-COOH通过“点击化学”反应，得到目标产物，合成路线如下：
Figure BDA0003639956640000051
③将声敏剂Chlorin e6(CHC)、第五代聚酰胺-胺(PAMAM，G5)树枝状聚合物为原料，溶解于DMSO溶液，通过酰胺反应，将CHC偶联在G5表面。声敏剂CHC作为第二代声敏剂，在超声驱动下具有强大的声动力活性，并且暗毒性低，毒副作用小。G5树枝状聚合物表面具有大量氨基易被化学修饰，且小尺寸可渗透到肿瘤组织深部。
④将步骤③得到的连接声敏剂的纳米载体，与步骤②所得化合物5，再次通过酰胺反应偶联在G5表面，再加入MPEG2K-COOH修饰剩余氨基，得到G5-CHC-R纳米声敏疫苗。MPEG2K-COOH是由聚乙二醇构成，具有亲水性。是一种生物兼容性和降解性都较好的聚合物，具有无毒、安全的特点，可改善血液循环时间和稳定纳米载体。具体实施路线如下：
Figure BDA0003639956640000052
反应式中，m、b各自独立的为大于零的整数，m、b和p的和为不大于128的整数。
进一步，本发明证明了，将声敏剂(CHC)和免疫调节剂(R848)通过G5共同递送实现调控肿瘤免疫抑制微环境，所述纳米声敏疫苗G5-CHC-R调控肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+CD11b+)的下调，促炎型M1巨噬细胞(F4/80+CD86+CD11b+)上调，同时引起髓源性抑制细胞(MDSCs，CD45+CD11b+Gr-1+)下调。促炎型M1巨噬细胞(F4/80+CD86+CD11b+)群体的增加，具有调控肿瘤免疫抑制微环境以及抗肿瘤的潜力。
本发明中，超声驱动纳米声敏疫苗G5-CHC-R诱发胰腺癌肿瘤细胞表面CRT蛋白的高表达和HMGB1的释放，濒死胰腺癌细胞上的CRT蛋白作为“eating me”信号引起DC吞噬，HMGB1作为危险信号诱导DC成熟，引起强烈的ICD效应。因此，超声驱动纳米声敏疫苗G5-CHC-R诱导的ICD效应可以将肿瘤细胞转化为原位疫苗。另一方面，在肿瘤中CD8+T细胞群体的增加，启动抗原特异性T细胞反应，即此具有杀伤肿瘤的潜力以及防止肿瘤向远端组织转移。
在本发明中，肿瘤为恶性实体瘤，优选胰腺癌；另一优选自发乳腺癌肺转移。进一步通过超声驱动纳米声敏疫苗G5-CHC-R调控胰腺癌免疫微环境以及抑制乳腺癌肺转移的发生。本发明的有益效果：本发明构建了一种超声驱动的纳米声敏疫苗，该超声驱动纳米声敏疫苗在肿瘤部位富集产生ROS直接杀伤肿瘤细胞，同时可用于逆转免疫抑制肿瘤微环境。结果表明超声驱动纳米声敏疫苗G5-CHC-R重塑原位胰腺癌小鼠模型中免疫抑制肿瘤微环境。超声驱动纳米声敏疫苗G5-CHC-R诱发胰腺癌肿瘤细胞释放“eating me”信号引起DC吞噬以及诱导DC成熟，引起强烈的ICD效应，进而肿瘤细胞转化为原位疫苗。免疫抑制的肿瘤微环境存在大量M2型巨噬细胞以及MDSCs，抑制CD8+T细胞的活化和增殖，削弱ICD引起的免疫治疗效果。本发明中的免疫调节剂R848可实现将M2型巨噬细胞重新极化为M1型巨噬细胞，增强肿瘤免疫应答，并重新编程免疫抑制肿瘤微环境。结果表明，G5-CHC-R治疗后，促炎型M1巨噬细胞在肿瘤微环境中比例显著增加，免疫抑制型M2巨噬细胞比例下降；同时促进CD8+T细胞向肿瘤区域浸润，启动抗原特异性T细胞反应；G5-CHC-R降低肿瘤组织中MDSCs数量，预防T细胞功能障碍。与此同时，本发明的纳米声敏疫苗还可以实现对淋巴癌、肺癌、肾癌、结肠癌(肝转移)、乳腺癌(肺转移)、肝癌的有效治疗。
综上，本发明优点明确，应用具有临床前景，可实现SDT和免疫联合治疗。在对肿瘤细胞杀伤的同时，调控免疫抑制肿瘤微环境，发挥协同的抗肿瘤作用。与此同时SDT疗法又具有非侵入性、穿透深层组织达10厘米且无毒副作用小，为彻底根治肿瘤奠定基础。
附图说明
图1是纳米声敏疫苗G5-CHC-R的表征以及性能研究图。
其中，(a)是G5-CHC-R的TEM图像；
(b)是G5,G5-R,G5-CHC和G5-CHC-R的水合粒径图；
(c)是G5,G5-R,G5-CHC和G5-CHC-R的zeta电位图；
(d)是G5-R,G5-CHC和G5-CHC-R在水中7天稳定性图；
(e)是Free CHC,G5-R,G5-CHC和G5-CHC-R的紫外可见吸收谱图；
(f)是超声下G5-CHC-R产生ROS的能力图；
(g)是G5-CHC-R在硝基还原酶下R848的释放图。
图2A-2B是纳米声敏疫苗G5-CHC-R体外性能考察图。
其中，(a)是共聚焦荧光显微镜分析三维肿瘤球对G5-CHC-R和Free CHC的摄取图；(b)是MTT法评价G5-CHC和G5-CHC-R超声细胞毒性作用图；
(c)是在超声条件下G5-CHC对线粒体氧化损伤图；
(d)是在超声条件下G5-CHC-R引起胞内ROS产生图；
(e)是Western blot检测在SDT(1MHz,3W/cm2)作用后，CRT表达图；
(f)是SDT(1MHz,3W/cm2)作用后，培养上清中细胞ATP水平的分析图；
(g)是R848释放后对巨噬细胞体外极化情况分析图；
(h)是M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的比值图。
图3A-3B是原位胰腺癌模型的构建及SDT抗肿瘤评价图。
其中，(a)是验证G5-CHC-R的肿瘤靶向效应以及活体成像分析图；
(b)是原位胰腺癌模型超声示意图；
(c)是治疗结束后从原位胰腺癌小鼠体内分离出的肿瘤图像；
(d)是治疗期间小鼠体重变化图；
(e)是治疗结束后小鼠胰腺肿瘤的肿瘤变化图；
(f)是PET/CT无创监测小鼠原位胰腺癌图；
(g)是治疗结束后对肿瘤区H&E及TUNEL染色图；
(h)是治疗后肿瘤区域CRT和HMGB1表达图。
图4A-4B是肿瘤微环境免疫细胞分析图。
其中，(a)是治疗后肿瘤微环境中M2型巨噬细胞分析图；
(b)是治疗后肿瘤微环境中M1型巨噬细胞分析图；
(c)是M2型巨噬细胞百分比变化图；
(d)是M1型巨噬细胞百分比变化图；
(e)是治疗后肿瘤微环境中MDSCs细胞分析图；
(f)是治疗后肿瘤微环境中CD8+T细胞分析图；
(g)是MDSCs细胞百分比变化图；
(h)是CD8+T细胞百分比变化图。
图5是肿瘤引流淋巴结免疫细胞分析图。
其中，(a)是肿瘤引流淋巴结DCs细胞成熟度分析图；
(b)是肿瘤引流淋巴结DCs细胞抗原交叉提呈能力的分析图；
(c)是成熟DCs细胞百分比变化图；
(d)是抗原交叉提呈DCs细胞百分比变化图。
图6是脾脏免疫细胞分析图。
其中，(a)是脾脏中CD8+T细胞分析图；
(b)是CD8+T细胞百分比变化图；
(c)是激活型CD69+CD8+T细胞百分比变化图；
(d)是治疗后脾脏中TEM和TCM细胞分析图；
(e)是TEM型CD8+T细胞百分比变化图；
(f)是TCM型CD8+T细胞百分比变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施对本发明进行详细描述。本发明的范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求的范围加以限定。实施例所用HOOC-PEG2K-N3和MPEG2K-COOH购于芃硕生物。
实施例一
(1)硝基还原酶触发的R848制备：
采用反应步骤如(Ⅰ)式所示：
Figure BDA0003639956640000091
1)3-羟基-4-硝基苯甲醛(0.5013g,3mmol)、K2CO3(0.800g,6mmol)加入到10mL DMF中，在室温下搅拌30min；加入溴化丙炔(0.535g,4.5mmol)，60℃下继续反应2h。使用薄层色谱(TLC)监测反应，待反应完全，最终的混合物使用真空泵过滤K2CO3，滤液用旋转蒸发仪浓缩；所得粗品以乙酸乙酯/正己烷(V/V,3:10)为洗脱剂，通过柱色谱最终纯化分离得到淡黄色固体化合物1(0.5852g，收率95％)。
2)将化合物1(0.4114g,2.0mmol)溶于10mL甲醇中，在冰水浴条件下加入NaBH4(0.1513g,4.0mmol)，薄层色谱(TLC)监测。反应完成后，用旋转蒸发器除去甲醇。粗品用乙酸乙酯溶解，并加入10mL水，用乙酸乙酯萃取三次，用无水Na2SO4干燥有机层，旋转蒸发除去溶剂。进一步纯化采用硅胶柱层析(乙酸乙酯:正己烷＝1:1)，纯化分离得到白色固体化合物2(0.4012g，收率97％)。
3)将化合物2(0.0414g,0.2mmol)溶于4mL无水二氯甲烷中，加入TFA(80μL)，在冰水浴中搅拌30min。加入4-硝基苯氯甲酸酯(0.0605g,0.3mmol)，TLC监测反应。
反应完成后，化合物3直接用于下一步的合成，无需进一步纯化。
4)将化合物3溶于5mL无水二氯甲烷中，加入TEA(150μL)，室温下逐滴加入2mL溶有R848(0.0628g)的二氯甲烷/DMF(V/V，4/1)溶液。用薄层色谱硅胶板进行反应监测。反应结束时，用旋转蒸发仪将溶剂去除，得到黄色的油状物。进一步纯化采用硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝50:1)得到淡黄色固体化合物4(0.0828g)。
(2)HOOC-PEG2K-R848的制备：
Figure BDA0003639956640000101
为得到化合物5，采用铜(I)催化叠氮-炔环加成(CuAAC)点击反应，将化合物4与HOOC-PEG2K-N3偶联。将化合物4(30mg)和HOOC-PEG2K-N3(100mg)溶于1mL无水DMSO和叔丁醇(v:v＝3:1)混合溶液中，再加入抗坏血酸钠(50mg)、TBTA(40mg)和CuI(5mg)，在氮气保护下继续室温搅拌24h；完成后，用含10mM EDTA-2Na(pH＝7.4)的PBS缓冲液透析12h(截留分子量为1000Da)；3000rpm，15min离心去除沉淀，继续使用去离子水透析24h，然后冷冻干燥，最终得到化合物5(93.8mg)。
(3)基于PAMAM(G5)树枝状聚合物材料的纳米声敏剂G5-CHC的制备：
Figure BDA0003639956640000102
将CHC(5mg)、EDC(10mg)和HOBt(8mg)加入到1mL无水DMSO(1mL)
中，在室温下搅拌2h，然后将溶解在无水DMSO中的G5(10mg)和DMAP(11mg)加入到上述溶液中。在室温下，继续反应24h。将MPEG2K-COOH(Mw＝2000,40mg)、EDC(11mg)和NHS(7mg)溶解于1mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将反应混合物加入上述G5-CHC溶液中，并补加20μL DIPEA。在避光条件继续反应24h。最后，将反应混合物用PBS进行透析(截留分子量为12000-14000Da)，去除未反应的试剂和副产物。所得水溶液经0.22μm过滤器过滤后得到目标产物。
(4)基于PAMAM(G5)树枝状聚合物材料的G5-R的制备：
Figure BDA0003639956640000111
将化合物5(20mg)、EDC(6mg)和NHS(4mg)加入到1mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将溶解在无水DMSO中的G5(10mg)和DMAP(11mg)加入上述溶液中。在室温下，继续反应24h。将MPEG2K-COOH(Mw＝2000,40mg)、EDC(11mg)和NHS(7mg)溶解于1mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将该混合物加入到G5-R溶液中，并补加20μL DIPEA。室温下继续反应24h。最后，将反应混合物用PBS进行透析(截留分子量为12000-14000Da)，去除未反应的试剂和副产物。所得水溶液经0.22μm过滤器过滤后为目标产物。
(5)基于PAMAM(G5)树枝状聚合物材料的G5-CHC-R的制备：
Figure BDA0003639956640000121
将CHC(5mg)、EDC(10mg)和HOBt(8mg)加入到1mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将溶解在无水DMSO中的G5(10mg)和DMAP(11mg)加入到上述溶液中。在室温下，继续反应24h。然后，将化合物5(20mg)、EDC(6mg)和NHS(4mg)在1mL无水DMSO中搅拌2h，然后将该混合物加入到上述溶液中，并补加20μL DIPEA。将MPEG2K-COOH(Mw＝2000,40mg)、EDC(11mg)和NHS(7mg)溶解于1mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将该混合物加入上述反应液中，并补加20μL DIPEA。室温下继续反应24h。用PBS对反应混合物进行透析(透析袋截留分子量为12000-14000Da)，透析36h，每12h换PBS一次，以去除未反应的试剂和副产物。所得水溶液经0.22μm过滤器过滤后为目标产物，利用紫外吸收测定搭载率。
实施例二
纳米声敏疫苗2-G5-CHC-R的制备：
将CHC(10mg)、EDC(20mg)和HOBt(16mg)加入到2mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将溶解在无水DMSO中的G5(20mg)和DMAP(22mg)加入到上述溶液中。在室温下，继续反应24h。然后，将化合物5(40mg)、EDC(12mg)和NHS(8mg)在2mL无水DMSO中搅拌2h，然后将该混合物加入到上述溶液中，并补加20μL DIPEA。将MPEG2K-COOH(Mw＝2000,80mg)、EDC(22mg)和NHS(14mg)溶解于2mL无水DMSO中，在室温下搅拌2h，然后将该混合物加入上述反应液中，并补加20μL DIPEA。室温下继续反应24h。用PBS对反应混合物进行透析(透析袋截留分子量为12000-14000Da)，透析36h，每12h换PBS一次，以去除未反应的试剂和副产物。所得水溶液经0.22μm过滤器过滤后为目标产物，利用紫外吸收测定搭载率。
实施例三
对实施例一制得的G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R进行基本表征：
(1)表征测试实验1：通过透射电镜获得G5-CHC-R纳米声敏疫苗的TEM图像，如图1(a)
所示；说明制备纳米声敏疫苗G5-CHC-R呈现球形且尺寸均匀。
(2)表征测试实验2：G5、G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R的粒径，电位以及稳定性分析。
分别取100μL G5、G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R母液，分散用于1mL的去离子水中，通过Zeta电位与粒径分析仪(Malvern Zetasizer，Nanozs90)测得G5、G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R分散在液体中的粒径，电位。如图1(b)所示，G5在水中的粒径为9.82nm，而G5-CHC-R经修饰后增加到12.26nm，更小的体积有利于通过EPR效应深入肿瘤。如图1(c)所示，对比G5、G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R修饰前后G5表面的电位变化，发现G5表面电荷为+6.16，而G5-CHC-R经修饰后表面电荷降至-3.50mV，电位转变有利于G5-CHC-R在体内长循环。通过相同方法测试G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R在水中7天内的粒径变化，如图1(d)所示，说明纳米声敏疫苗在7天内较为稳定。通过对比Free CHC、G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R的紫外-可见吸收光谱，如图1(e)所示，在G5-CHC-R的紫外-可见吸收光谱中均有明显的R848(325nm)和CHC(404nm和660nm)的特征吸收峰，表明改性成功。
(3)表征测试实验3：超声条件下G5-CHC-R的ROS生成。
为了验证纳米声敏疫苗在超声条件下产生ROS，将G5-CHC-R(CHC 15μg/mL)与15μg/mL的DPBF[1mL乙醇/水(1:1,v/v)]混合。超声(1MHz,3W/cm2)刺激后，测定DPBF在410nm处的吸光度变化，如图1(f)所示，表明G5-CHC-R在声动力作用下产生ROS。其中CHC量的确定，采用UV-vis法确定G5-CHC或者G5-CHC-R中CHC的浓度。将不同浓度的游离CHC(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20ug/mL)溶于DMSO/DI水4:1(V/V)中，测定CHC656 nm处的紫外光谱。通过绘制标准吸收曲线计算G5-CHC-R或G5-CHC溶液中CHC的含量。
(4)表征测试实验4：
采用高效液相色谱法(Agilent 1260infinity)分析前药的体外激活情况。首先，将G5-CHC-R(250μL)和NADH(100μM)溶于pH＝7.4的PBS缓冲溶液中；然后，用氮气去除溶液中的空气。加入硝基还原酶(100μg/mL)，37℃孵育6h，用0.22μm聚偏氟乙烯注射器过滤。采用70％甲醇梯度洗脱，检测波长280nm。如图1(g)所示，在4.873min有R848对应的洗脱峰，表明在NRT的作用下纳米声敏疫苗G5-CHC-R可释放出R848。
实施例四
对实例一制备的G5-R、G5-CHC、G5-CHC-R纳米声敏疫苗进行体外细胞摄取、声动力杀伤以及硝基还原酶作用下释放R848对M2型巨噬细胞复极化评价
(1)共聚焦荧光显微镜分析三维肿瘤球对G5-CHC-R和Free CHC的摄取：
将10mL DMEM(高糖)培养基与0.1g琼脂糖混合，得到1％的琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液加热至70℃以上，然后将100μL琼脂糖溶液加入96孔板中。37℃孵育板至少1h，同时使用胰蛋白酶消化处理4T1细胞。用血细胞计数板测定悬浮液中的细胞浓度。将细胞悬液稀释至1000个细胞/孔，并将100μL的稀释液加入含有固化琼脂糖的孔中。将样品放在培养箱中，置于37℃和5％CO2的培养箱中过夜。第7天，球形细胞与Free CHC、G5-CHC-R(等量CHC,50μg/mL)在37℃和5％CO2条件下孵4h。如图2A(a)所示，通过共聚焦荧光显微镜观察3D肿瘤模型(FV1000，日本)。G5-CHC-R可以有效渗透到4T1肿瘤球的深层，说明制备的纳米声敏疫苗G5-CHC-R具有较强的渗透能力。
(2)MTT法评价纳米声敏疫苗的体外超声细胞毒性：
将4T1细胞接种于5mL流式管中(2×105细胞)中，在完全培养液中培养12h。所有培养管随机分为G5-CHC组、G5-CHC+US组、G5-CHC-R组和G5-CHC-R+US组。在DMEM培养基中加入不同浓度的药物(0、12.5、25、50、100和200μg/mL)。在暗处孵育4h，PBS洗涤2次。然后将细胞重悬于1mL无血清DMEM中，超声(1MHz,3W/cm2,20min)处理，继续培养4h。1mg/mL的MTT试剂(Yeasen)加入到上述4组中，37℃孵育4h。移除含MTT培养基并加入DMSO(100μL)。使用酶标仪在490nm下测量每个孔的吸光度(OD)。按下面的公式计算细胞的相对存活率：(实验组OD490/对照组OD490)×100％。如图2A中(b)所示，可以看出随着药物的浓度增大，在超声条件下G5-CHC和G5-CHC-R产生的ROS具有明显杀伤细胞的作用；相反在无超声的情况下药物浓度无明显杀伤细胞的作用。
(3)超声激活G5-CHC和G5-CHC-R在细胞内ROS生成和线粒体损伤：
将4T1细胞按1×106细胞的密度接种在5mL流式管中。继续培养12h后,培养基更换为含有G5-CHC-R(CHC 100μg/mL)或G5-CHC(CHC 100μg/mL)，37℃和5％CO2条件下孵育4h，然后加入20μM DCFH-DA(Sigma-Aldrich)孵育30min，PBS洗3次，SDT处理(1MHz,3W/cm2)20min；转移到24孔板中进行成像分析，如图2A(d)所示。ROS的产生可引起线粒体损伤，使用线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123(Beyotime Biotechnology))检测线粒体损伤；在超声处理后，在明场条件下可以清晰看出细胞形态的变化，如图2A(c)所示，G5-CHC在超声作用下，产生的ROS对线粒体造成损伤。
(4)体外超声引起的ICD效应：
用western blot法分析CRT的暴露情况。将4T1细胞调整细胞数为6×105于无血清培养基中。分别用Free CHC、G5-CHC、G5-CHC-R(CHC 100μg/mL)和G5-R(30μg/mL)处理细胞。暗处孵育4h，PBS洗涤2次。超声(1MHz,3W/cm2,20min)，暗处继续孵育4h，离心去除培养基，每孔加入100μL的RIPA缓冲液(Solarbio)，冰摇裂解5min，裂解液4℃下12000rpm离心5min；所得上清加入上样缓冲液，95℃下加热5min，制备完成的蛋白样品经电泳分离。然后将分离的蛋白转移到PVDF膜上(Millipore,Billerica,MA,USA)，用溶解在PBST(0.05％Tween20in PBS)中的脱脂牛奶在室温下封闭1h。根据marker条带(10kDa-180kDa)裁剪出55kDa的条带，使用一抗CRT进行孵育(1:2000,Abcam)和裁剪出42kDa的条带，使用β-actin进行孵育(1:1000,Cell Signaling Technology)，以上均在4℃条件下过夜。PBST冲洗3次后，用HRP标记的山羊抗兔二抗(1:2000；Proteintech)在室温下孵育2h，然后用ECL基质成像(Bio-Rad)，如图2A(e)所示。培养基上清测定ATP分泌量，使用增强型ATP检测试剂盒(BeyotimeBiotechnology)测量细胞培养基中的ATP水平，如图2B(f)所示。经超声治疗后，肿瘤细胞分泌的CRT和ATP显著增高，因此超声驱动下的G5-CHC-R诱导的ICD效应可以将肿瘤转化为原位疫苗，增强肿瘤免疫应答。
(5)C5-R释放R848对体外巨噬细胞(M2)的复极化：
骨髓来源巨噬细胞的提取和培养：C57鼠颈椎脱臼，乙醇消毒，分离股骨和胫骨并清除附着的肌肉。用剪刀剪开股骨和胫骨露出骨髓腔。用装有1640培养基的无菌注射器(10mL)吹出骨髓细胞。1800rpm离心5min，收集骨髓细胞。细胞计数，调整细胞数为1×105接种于24孔板中；用含20ng/mL M-CSF的LCM培养基在24孔培养板中培养6天，第3天补充新鲜的培养基。第7天加入IL-4(20ng/ml)诱导24h分化为M2型巨噬细胞。
将M2型巨噬细胞与G5-R(30μg/mL)、NADH(100μM)和G5-R(30μg/mL)+NTR(100μg/mL,sigma)+NADH(100μM,Aladdin)在培养箱中培养24h，收集细胞，采用流式细胞术(ThermoFisher Scientific,Attune NxT)检测M1相关标志物(F4/80+CD86+CD206-)和M2相关标志物(F4/80+CD86-CD206+)的表达情况。如图2B(g)和(h)所示，G5-R+NRT+NADH对体外M2型细胞有明显的复极化效果。
实施例五
对实例一制备的纳米声敏疫苗G5-CHC-R和对照组的PBS、Free CHC、G5-CHC和G5-R纳米制剂进行小鼠胰腺癌原位模型评价。
(1)胰腺癌原位模型建立
1)细胞准备：选取新复苏，生长状态良好的Pan02细胞，细胞传至第3代，经胰酶消化得到单细胞悬液，接种细胞数为5×105cell/只，所得细胞悬液与基质胶按照1:1(体积比)混匀后置于冰盒中备用；
2)麻醉小鼠：使用阿佛丁按照小鼠(C57BL/6J)体重(240mg/kg)进行腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠侧卧脾脏位朝上置于37℃保温垫上；
3)处理小鼠：将小鼠腹部脱毛并用碘伏消毒；
4)在胸骨下腹中区腹膜切开约1厘米，平头镊子取出胰腺，将Pan02细胞5×105(25μL)注射到胰腺尾部；等待1min基质胶凝固，缓慢取出注射器，腹部用4-0缝合针进行双层缝合，并涂抹抗生素软膏；皮下注射200μL氨苄青霉素，连续3天。
(2)活体成像分析
为进一步评价纳米声敏疫苗G5-CHC-R的靶向效应和蓄积深层肿瘤的能力，利用体内成像系统(IVIS)对G5-CHC-R纳米声敏疫苗进行了近红外荧光成像。如图3A(a)所示，原位胰腺癌部位G5-CHC-R纳米声敏疫苗中CHC荧光在1小时后开始向肿瘤区域蓄积，在注射12h后收集肿瘤和正常脏器进行体外成像，表明G5-CHC-R具有明显的肿瘤靶向效应；在给药3次后，可以看到G5-CHC-R具有明显向肿瘤蓄积的能力。
(3)纳米声敏疫苗G5-CHC-R体内抗肿瘤效果评价
当种瘤7天后，将小鼠随机分为5组(n＝5)，分别为PBS、Free CHC、G5-CHC、G5-R以及G5-CHC-R。静脉给药4h后开始声动力治疗(1.0MHz,2W/cm2,20min)。在整个实验过程中，所有的老鼠都被放置在远离光线的地方。在治疗期间小鼠体重保持稳定，如图3A(d)所示，表明G5-CHC-R具有良好的生物相容性和生物安全性。在治疗终点，对肿瘤重量以及大小进行统计分析，如图3A(c)和(e)所示，肿瘤重量统计显示，与PBS和Free CHC组相比，G5-R和G5-CHC治疗组的小鼠可以在一定程度上延缓肿瘤，但仍不能抑制肿瘤进展。然而G5-CHC-R与其他治疗组相比，G5-CHC-R处理的小鼠经过SDT治疗后，抑制肿瘤的作用明显增强，从而说明G5-CHC-R具有较强的抗肿瘤能力，这主要由于G5-CHC-R的SDT和R848的两种协同作用。
(4)PET/CT无创监测小鼠原位胰腺癌
在治疗后的第24天，PET/CT测量评估肿瘤进展情况。所有扫描均使用Super Nova小动物PET/CT扫描仪(PINGSENG Healthcare)进行。实验小鼠需进行禁食24h，仅供水，使用18F-FAPI成像剂进行PET/CT监测的原位胰腺癌模型。用Avertin麻醉小鼠，尾静脉注射5.5～7.4Mbq/0.1mL 18F-FAPI。腹部进行CT扫描。PET数据在延迟30分钟后采集15分钟，以保证FAPI的摄取。如图3B(f)所示，PBS、G5-R、G5-CHC具有明显PET信号，表明均不能抑制肿瘤生长。相比之下，G5-CHC-R对肿瘤生长明显抑制。这些结果再一次表明，G5-CHC-R介导的SDT与免疫调节剂R848协同作用可有效抑制肿瘤生长。
(5)治疗结束后对肿瘤区H&E分析
为了进一步评价免疫调节剂R848和SDT的治疗效果，采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,H&E)和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对治疗后小鼠的肿瘤切片进行染色。如图3B(g)TUNEL染色的肿瘤切片显示PBS、Free CHC、G5-R、G5-CHC中仅有少量凋亡细胞。相反，G5-CHC-R中细胞凋亡明显增加。H&E染色的肿瘤切片显示PBS、free-CHC、G5-R和G5-CHC组中肿瘤细胞形态变化很小，而G5-CHC-R组中肿瘤细胞发生显著性的形态变化，细胞核固缩、核碎裂和核溶解，肿瘤坏死区域面积大。值得注意的是，由于R848的释放，G5-CHC-R治疗后的肿瘤区域淋巴细胞浸润明显增加。这些实验结果说明免疫疗法和SDT联合治疗可有效抑制胰腺癌的进展。
(6)治疗结束后对肿瘤区CRT和HMGB1分析
取肿瘤固定于Tissue-Tek(OCT)中，-80℃冷冻保存。组织切片(厚度10μm)，使用4％多聚甲醛室温固定切片组织30min，PBS洗涤3次，增强型免疫染色通透液(BeyotimeBiotechnology)通透30min，PBS洗涤3次，用封闭液(Beyotime Biotechnology)封闭1h，PBS洗涤3次。切片与CRT或者HMGB1一抗在4℃下孵育过夜。PBS洗3次，与山羊抗兔AF488二抗暗处孵育1h，PBS洗3次，DAPI染色细胞20min。使用徕卡DMi8显微镜进行荧光图像分析。从图3B(h)中可以清楚地观察到，G5-CHC-R+US组肿瘤组织表面CRT和HMGB1表达量明显增加。因此，在声动力治疗后可诱导肿瘤细胞发生ICD效应，危险信号分子进一步可呈递给DCs，有效促进DCs的成熟。
实施例六
考察对实例一制备的纳米声敏疫苗G5-CHC-R和对照组PBS、Free CHC、G5-CHC、G5-R进行肿瘤微环境、肿瘤引流淋巴结以及脾脏免疫细胞分析。
(1)纳米声敏疫苗G5-CHC-R对肿瘤微环境免疫细胞的影响
治疗后收集小鼠胰腺癌肿瘤组织，将肿瘤置于DMEM培养基中，其培养基中包含0.5mg/mL胶原酶IV(Yeasen)、0.5mg/mL胶原酶I(Yeasen)和25μg/mL DNAse 1(Aladdin)。样品在上述培养基中剪碎处理，并在37℃下消化1h，研磨组织，经70μM滤网过滤，4℃下1800rpm离心5min。将制备的单细胞悬液立即染色进行流式细胞术检测。如图4A(a)-(d)所示，G5-CHC-R可有效极化M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞的比例由0.49％增加到9.77％，M2型巨噬细胞的比例由6.44％减少到0.22％。G5-R组M2型巨噬细胞占2.79％，M1型巨噬细胞占1.46％，G5-CHC组M2型巨噬细胞占1.72％，M1型巨噬细胞占3.14％。由此可以得出当声动力疗法与免疫疗法相结合时，M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞能力得到显著性的改善。
肿瘤微环境中髓源抑制细胞(MDSCs)是典型免疫抑制；因此，本发明也研究了G5-CHC-R+US对肿瘤微环境中MDSCs的影响。如图4B(e)和(g)所示,G5-CHC-R+US组小鼠肿瘤组织中MDSCs的比例仅为9.85％；而Free CHC+US组中MDSC占比45.2％，G5-R组中占比22.6％，G5-CHC+US组中占比29.7％；因此，G5-CHC-R+US显著性低于其他4组小鼠肿瘤组织中MDSCs的比例。
M2型巨噬细胞以及MDSCs，抑制细胞毒性T淋巴细胞浸润和活性。因此，为了进一步验证G5-CHC-R+US的免疫治疗作用，本发明还研究了不同治疗方式小鼠肿瘤组织中T细胞的浸润情况。如图4B(f)和(h)所示，G5-R、G5-CHC-R+US组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润明显升高，其中G5-CHC-R+US组小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润率最高(16.2％)。免疫治疗和SDT联合治疗可有效调控肿瘤免疫抑制微环境。
(2)纳米声敏疫苗G5-CHC-R对肿瘤引流淋巴结(TDLN)免疫细胞的影响
TDLN作为重要的外周淋巴器官，为成熟的树突状细胞向T淋巴细胞提供抗原并诱导系统免疫应答提供了空间。通过收集各治疗组中TDLN来评估被激活的树突状细胞。如图5(a)和(c)所示，G5-CHC-R+US组中成熟DCs(CD11c+CD80+CD86+)的百分比为22.9％，明显高于其他组治疗组，表明G5-CHC-R+US可诱导强烈的免疫刺激作用。另一方面，G5-CHC-R+US可以促进DCs细胞MHC-I分子的表达，增强DCs的抗原呈递能力，有利于T细胞对肿瘤细胞的识别。如图5(b)和(d)所示，G5-CHC-R+US显著提高CD8+MHC-I+DC11c+DCs细胞比例(19.5％)，同样显著性高于其他各组。这表明G5-CHC-R+US可增强DCs细胞交叉呈递肿瘤抗原的能力。
(3)纳米声敏疫苗G5-CHC-R对脾脏免疫细胞的影响
进一步探究了DCs细胞抗原呈递后脾脏淋巴细胞的活化情况。如图6(a)和(b)所示，G5-CHC-R+US组CD8+T细胞数量百分比达到18.7％，显著性高于其他组。进一步还分析证实T细胞的激活情况，如图6(c)所示，G5-CHC-R显著上调脾脏CD8+T细胞中CD69的表达，明显高于其他治疗组。通过分析中央记忆T细胞(TCM,CD44+CD62L+CD8+CD3+)和效应记忆T细胞(TEM,CD44+CD62L-CD8+CD3+)，验证适应性免疫的建立。如图6(d)-(f)所示，G5-CHC-R+US组小鼠脾中TCM和TEM百分比显著升高，显著性高于其余各治疗组小鼠脾中TCM和TEM。这些结果表明，G5-CHC-R可诱导长期免疫记忆，可有效的消除残留肿瘤细胞。

Claims (10)

1.一种超声驱动纳米声敏疫苗，其特征在于：所述纳米声敏疫苗包括纳米载体、与纳米载体连接的声敏剂和与纳米载体通过硝基还原酶敏感Linker连接的免疫调节剂；
所述纳米载体为第五代聚酰胺-胺树枝状大分子；
所述声敏剂为二氢卟吩e6；
所述免疫调节剂为雷西莫特；
所述硝基还原酶敏感Linker的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
其中，n为44-46的数；
所述硝基还原酶敏感Linker通过酰胺键连接纳米载体。
2.根据权利要求1所述的一种超声驱动纳米声敏疫苗，其特征在于：所述纳米声敏疫苗还包括与纳米载体通过酰胺键连接的改善剂，所述改善剂的结构为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
其中，n为44-46的数。
3.根据权利要求1所述的超声驱动纳米声敏疫苗，其特征在于：所述纳米声敏疫苗的水合粒径为10.66-12.26nm。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的超声驱动纳米声敏疫苗，其特征在于：激发所述纳米声敏疫苗的超声频率为1 MHz，超声强度为2 W/cm2或3 W/cm2，超声时间为20或30min。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的超声驱动纳米声敏疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成连接免疫调节剂的硝基还原酶敏感Linker；
声敏剂和纳米载体通过酰胺化反应合成连接声敏剂的纳米载体；
连接免疫调节剂的硝基还原酶敏感Linker和连接声敏剂的纳米载体反应合成连接免疫调节剂和声敏剂的纳米声敏疫苗；
包含改善剂的纳米声敏疫苗还包含以下步骤：
连接免疫调节剂和声敏剂的纳米声敏疫苗和改善剂反应合成连接免疫调节剂、声敏剂和改善剂的纳米声敏疫苗。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的超声驱动纳米声敏疫苗在制备抗肿瘤药物、制剂或者疫苗中的应用。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的超声驱动纳米声敏疫苗在制备抗肿瘤免疫调节药物中的应用。
8.根据权利要求6或者7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括淋巴癌、肺癌、肾癌、结肠癌伴肝转移、乳腺癌伴肺转移、肝癌、胰腺癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为胰腺癌、乳腺癌伴肺转移。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的超声驱动纳米声敏疫苗的应用，其特征在于：所述纳米声敏疫苗用于制备调节肿瘤微环境中M2型巨噬细胞复极化为M1型巨噬细胞，CD8+T细胞群增加，髓源性抑制细胞下调的药物。
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