CN115104029A - 用于检测和监测全身性炎症的非侵入性测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测和监测全身性炎症的测定法和方法。具体来说,本发明在其实施方式中涉及尿液生物标志物用于非侵入性确定炎症水平的用途。
Description
技术领域
本发明提供了用于检测和监测全身性炎症的测定法和方法。具体来说,本发明在其实施方式中涉及尿液生物标志物用于非侵入性评估炎症水平的用途。
背景技术
身体组织对损伤、感染或刺激的生物学反应通常以炎症为特征,炎症是一种先天免疫反应,其中一系列细胞和微血管事件用于根除感染、去除受损组织并产生新组织。在此过程中,微血管通透性的提高允许嗜中性粒细胞和单核细胞离开血管内区室并执行各种不同的抗微生物活动以根除损伤。根据具体病因和病程,炎症可以被表征为局部或全身性的,以及急性或慢性的。
脓毒症是一种并发严重感染的临床综合征,其以失调的全身性炎症为特征,并可能发展为越来越严重的组织损伤、器官衰竭和死亡。脓毒性休克是脓毒症的一种重症形式,由于循环和/或细胞代谢异常的增加而造成死亡率显著提高。脓毒症的早期识别和治疗是提高生存率的关键,因为感染源(最通常是细菌)应该被尽早控制。
由生命体征和实验室结果的某些异常定义的全身炎症反应综合征(SIRS)的概念于1992年引入,用于定义对非特异性损伤的临床反应,其中伴随有记录或推测的感染的SIRS被定义为脓毒症。然而,已发现SIRS判据对高死亡风险缺乏灵敏度和特异性,这是使用这种概念模型的主要考虑因素。某些细胞因子和急性期蛋白(APP)、特别是C反应蛋白(CRP)的血液水平也被用于评估全身性炎症的水平。
APP是血浆蛋白质,其合成和循环浓度对大多数形式的炎症、感染和组织损伤做出响应进行适应性调节。急性期反应被认为是先天免疫系统的一部分,并且APP在介导诸如发热、白细胞增多、皮质醇增加、甲状腺素降低、血清铁降低等全身性效应中发挥作用。APP可以被分类为阳性(例如CRP、补体因子、血清淀粉样蛋白A和铁蛋白的血清浓度升高)或阴性(例如白蛋白、转铁蛋白和转甲状腺素蛋白的血清浓度降低)。
用于评估受试者中的炎症载量的方法、包括检查血液样品中蛋白质标志物水平的免疫测定法的开发是一项持续的努力,并且正在开发各种不同的诊断测定法。
WO 2019/027910提出了一种用于炎性疾病评估,特别是用于类风湿性关节炎的调整过的多生物标志物疾病活动评分。具体来说,提供了用于评估对炎性疾病疗法的反应的方法。所述方法包括进行免疫测定以在炎性生物标志物表达的定量数据的基础上生成评分,以评估炎性疾病例如类风湿性关节炎中的疾病活动。
US 9,200,324涉及可用于诊断和评估炎性疾病、特别是类风湿性关节炎的生物标志物,以及用于测量它们的表达的试剂盒。还提供了基于所述生物标志物的预测模型,以及所述模型的计算机系统和软件实施方式,用于对样品进行评分和任选的分类。
EP 1836493涉及一种为被诊断为患有或怀疑患有SIRS、脓毒症、重症脓毒症、脓毒性休克或MODS的受试者指派治疗方案和/或指派预后的方法,所述方法包括:对来自所述受试者的样品执行测定方法,以提供与一种或多种受试者来源的标志物的存在或量相关的一个或多个可检测信号,和将从所述测定方法获得的信号与为所述受试者确定或排除治疗方案和/或为所述受试者指派预后关联起来。具体来说,所述出版物公开了各种不同血液标志物组的评估。
Ashkenazi-Hoffnung等,2018(Eur J Clin Microbiol Infect Dis.Jul;37(7):1361-1371)公开了一种用于鉴别患有呼吸道感染和未知来源的发热患者中的细菌和病毒疾病的宿主蛋白签名,其基于三种血液蛋白的组合:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)和C反应蛋白(CRP)。US 2017/0269081涉及一种确定受试者中感染类型的方法,包括测量源自所述受试者的样品中选自第一组决定因子的第一决定因子和选自第二组决定因子的第二决定因子的浓度,其中所述浓度指示了感染类型。具体来说,所述出版物公开了鉴定在血清样品中测量到的多种决定因子包括TRAIL、IP-10和CRP的表达谱。
还已研究了将尿液生物标志物用于诊断应用,特别是用于检测或评估肾损伤或疾病。例如,US 2015/0038595涉及用于肾损伤和肾衰竭的诊断和预后的方法和组合物,并且Rodríguez-Ortiz等(2018,Sci Rep 8(1):15940)涉及用于慢性肾病的尿液生物标志物。也评估了某些尿蛋白作为感染性疾病背景下的标志物,例如在EP 2711710,Jortani等(2004,J Clin Lab Anal.;18(6):289-95),Denz等(1990,KlinWochenschr.2月15日;68(4):218-22)和Whetton等(2020,J Proteome Res acs.jproteome.0c00326)中。例如,Reisinger等(PLoS One 9.3(2014))已报道了尿蛋白在新生儿中作为潜在生物标志物的评估,提出了将尿SAA作为在新生儿中区分重度坏死性小肠结肠炎(NEC)和中度NEC的标志物,特别是与血清血小板计数相结合时。这些发现在新生儿NEC和功能不成熟的新生儿肾脏背景之外的意义尚不清楚。
然而,尽管需要开发简单且非侵入性的诊断测定法,但目前在临床实践中还没有在成年受试者中基于尿蛋白的鉴定来评估炎症的测试。具体来说,血液蛋白、包括那些被提议作为炎症病症的生物标志物的血液蛋白的水平,与它们在尿液中的水平并不密切相关。这可能归因于成熟肾脏中诸如肾小球滤过和肾小管吸收的过程,这些过程负责限制大多数血浆蛋白释放到血液中。
对用于在受试者中确定全身性炎症水平的非侵入性且快速的方法,仍存在着未满足的需求。通过适合于自己使用的简单测定法,确定治疗紧迫性并立即治疗急需治疗的患者以及在治疗期间确定治疗效率的能力,将是非常有利的。
发明内容
本发明提供了用于检测和监测全身性炎症的测定法和方法。具体来说,本发明在其实施方式中涉及尿液生物标志物用于早期非侵入性确定炎症等级或强度和用于评估与其相关的风险的用途。
本发明部分是基于独特的蛋白质组学签名的惊人发现,所述签名是基于测量尿液中被确定对评估全身性炎症出人意料有效的蛋白生物标志物。令人惊讶的是,正如在本文中证实的,开发了能够鉴定重度全身性炎症的诊断标志物和分类器。此外,正如本文中证实的,构建了高度预测性模型,其能够不仅在高等级重度病例中,而且在表现出轻度和中度炎症体征的患者中评估全身性炎症的水平。相比之下,迄今为止用作或建议作为血液标志物的其他蛋白质,包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和CXCL10(IP-10)在内,被发现不适合用作尿液标志物。
本发明还部分基于下述发现,即某些基因产物以内源肽的形式而不是作为可以在其他样品例如血液中发现的全长多肽存在于尿液样品中。令人惊讶的是,鉴定到血清淀粉样蛋白A2(SAA2)衍生的肽,其能够以高准确率反映全身性炎症的水平。
因此,所述结果提供了全身性炎症水平变化的检测和监测,可用于例如疾病预后、早期鉴定处于发生疾病并发症高风险下的受试者以及评估治疗效果。本文呈现的结果使有发生急性期炎症反应风险的患者能够自我检测而无需抽血,例如脓毒症患者以及患有例如有发生炎症爆发和疾病复发风险的风湿病和自身免疫性疾病的患者。
因此,本文公开了可用于全身性炎症和与其相关的病症的诊断、预后、监测和管理的非侵入性诊断测定法和方法。
根据本发明的实施方式,提供了分析尿液样品的方法。在某些实施方式中,本发明的方法包括确定受试者的尿液样品中选自下文详述的表1的至少一种、通常为多种蛋白质标志物(例如三种或更多种基因产物)的水平的步骤。表4-6和9-14提供了选自表1的基因产物的特定生物标志物组合的详情,正如在下文的实施例部分中详述的。
表1–尿液生物标志物
在本发明的实施方式中确定了多种标志物的水平,从而确定所述受试者关于所述多种标志物的尿液蛋白质组学签名。然后可以将每种标志物的水平与参比值进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与对照受试者的尿液蛋白质组学签名进行比较。
因此,在某些实施方式中,提供了用于分析尿液样品的方法,包括:
a.确定所述样品中选自表1的至少三种(例如3-5、5-10或10-15种)基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而获得与所述对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
根据示例性实施方式,所述基因产物选自表4-6或9-14中的任一者,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在特定实施方式中,所述基因产物是SAA2、SAA1和GUCA2B基因产物。
一方面,提供了一种检测有需要的受试者存在或不存在全身性炎症的方法,包括:
a.确定所述受试者的尿液样品中选自表6和10-14中的任一者中呈现的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,
b.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而获得与所述参比对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
在一个实施方式中,所述对照样品对应于健康对照受试者。在另一个实施方式中,与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。在另一个实施方式中,所述对照样品对应于健康对照受试者,并且以所述基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。在另一个实施方式中,所述对照样品对应于具有预定炎症水平(例如轻度、中度或重度)的受试者。在另一个实施方式中,所述对照样品在先于从所述受试者获得所述尿液样品的时间的时间点从所述受试者获得(例如用于监测所述受试者的炎症状态的改变)。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少五种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少五种基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表6中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述至少三种基因产物选自表10-14中的任一者中列出的基因产物。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表10、表11、表12、表13或表14中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,以SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在另一个实施方式中,所述方法还包括确定所述受试者中全身性炎症的水平。在各种不同实施方式中,所述炎症选自轻度、中度和重度。在另一个实施方式中,所述方法还包括在所述确定的全身性炎症水平的基础上为所述受试者确定治疗。例如,本发明的方法可用于评估对住院或其他类型的治疗或医学干预的需求。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述受试者提供适合于所述确定的全身性炎症水平的治疗。根据某些非限制性实例,所述治疗可以包括抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂或皮质类固醇。例如但非限制性的,确定治疗可以包括确定适合的剂量,其中例如与中度炎症相比在重度炎症中使用更高的剂量,和对于轻度炎症病例来说可以进一步降低剂量。在另一个非限制性实例中,与不太严重的病例相比,在严重病例中使用更强力的免疫抑制药物。
在另一个实施方式中,本发明的方法可用于为所述受试者提供疾病预后。在另一个实施方式中,本发明的方法可用于评估发生炎症相关并发症(例如中风或心血管疾病)的风险。在另一个实施方式中,本发明的方法用于在所述受试者中评估治疗效果和/或安全性。例如,在一个实施方式中,所述受试者已接受免疫刺激性治疗,并且所述方法用于评估细胞因子释放综合征(CRS)的存在或发病风险。在另一个实施方式中,所述受试者已接受免疫抑制性治疗,并且所述方法用于确定治疗效果(例如炎症或自身免疫的抑制)。在另一个实施方式中,所述方法用于感染的早期检测,例如在经历放疗或化疗的癌症患者中。
另一方面,提供了一种监测有需要的受试者中全身性炎症的方法,包括:
a.在第一时间点从所述受试者获得第一尿液样品并在第二时间点获得第二尿液样品,其中所述第一时间点先于所述第二时间点,
b.确定每个样品中选自表6和10-14中的任一者中呈现的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得在所述第一和第二时间点时所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,
c.将所述第一时间点时每种基因产物的水平与对应于它在所述第二时间点时的水平的相应值进行比较,从而比较所述第一和第二时间点时所述受试者的尿液蛋白质组学签名,
其中在所述第二时间点时以所述至少三种基因产物的水平与它们在第一时间点时的相应水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的加重,并且在所述第二时间点时以所述至少三种基因产物的水平与它们在第一时间点时的相应水平相比显著降低为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的改善。
在其他实施方式中,本发明的方法用于为患有与血液CRP水平升高相关的病症的受试者进行非侵入性预后、评估其疾病进展、确定和/或调整治疗。
另一方面,提供了一种非侵入性监测有需要的受试者中与血液CRP水平升高相关的病症的进展的方法,包括:
a.在第一时间点从所述受试者获得第一尿液样品并在第二时间点获得第二尿液样品,其中所述第一时间点先于所述第二时间点,
b.确定每个样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得在所述第一和第二时间点时所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,
c.将所述第一时间点时每种基因产物的水平与对应于它在所述第二时间点时的水平的相应值进行比较,从而比较所述第一和第二时间点时所述受试者的尿液蛋白质组学签名,
其中在所述第二时间点时以所述至少三种基因产物的水平与它们在第一时间点时的相应水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中所述病症的加重,并且在所述第二时间点时以所述至少三种基因产物的水平与它们在第一时间点时的相应水平相比显著降低为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中所述病症的改善。
另一方面,本发明提供了一种检测存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定受试者的尿液样品中选自表4、5和9中的任一者中呈现的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,从而获得与所述健康对照受试者的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
在另一个实施方式中,与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,以所述基因产物的水平与它们的对照水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在一个实施方式中,所述基因产物选自表4中呈现的基因产物,例如表4中呈现的至少3、4或5种基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物选自表5中呈现的基因产物,例如表5中呈现的至少3、4、5、6、7、8、9或10种基因产物。在特定实施方式中,所述基因产物包括SAA2。在另一个特定实施方式中,所述基因产物包括SAA1。在另一个特定实施方式中,所述基因产物包括SAA1和SAA2。在另一个实施方式中,所述基因产物选自CHGA、PLAU、SAA1和SAA2基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物包括CHGA、PLAU、SAA1和SAA2基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物包括CHGA、PLAU和SAA1基因产物。
在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>120mg/L,并且所述基因产物选自表4中呈现的基因产物。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表4中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>100mg/L,并且所述基因产物选自表5中呈现的基因产物。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表5中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>100mg/L,并且所述基因产物选自表5或9中列出的基因产物。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表9中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在本发明的方法的其他实施方式中,所述受试者表现出至少两个全身炎症反应综合征(SIRS)判据。在另一个实施方式中,所述受试者被怀疑患有脓毒症。在另一个实施方式中,所述炎症是急性的。在另一个实施方式中,所述炎症是慢性的。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染(例如细菌或病毒感染)。在另一个实施方式中,所述受试者患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在本发明的方法的另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在各种不同实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条(dipstick)、ELISA(包括各种不同的多重ELISA技术)、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过质谱法或使用分光光度计来进行。
在本发明方法的另一个实施方式中,步骤b.使用学习和模式识别算法来进行。例如,所述算法可以包括但不限于监督分类算法,其包括但不限于梯度提升树、随机森林、正则化回归、多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、判别函数分析(DFA)包括线性判别分析(LDA)、最近邻法、人工神经网络、多层感知器(MLP)、广义回归神经网络(GRNN)及其组合,或非监督聚类算法,其包括但不限于K-均值、谱聚类、层次聚类、高斯混合模型及其组合。在特定实施方式中,所述算法选自梯度提升树、随机森林、正则化回归及其组合。在另一个实施方式中,步骤b.通过计算机执行的方法来进行,例如使用利用本文公开的算法提供数据分析的系统。
在本发明的方法的另一个实施方式中,步骤b.包括将每种基因产物的水平与预定截止值进行比较。在另一个实施方式中,所述对照水平从被诊断为患有相关病症的至少一位受试者(例如健康受试者或特定炎症等级的受试者)的尿液样品,从被诊断为患有所述病症的一组受试者获得的一组对照样品,或从被诊断为患有所述病症的受试者的一组储存的数据集来确定。
通常,根据本发明方法的受试者是人类。在另一个实施方式中,所述受试者为至少两岁。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。
另一方面,本发明提供了一种检测至少两岁的人类受试者存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定所述受试者的尿液样品中选自SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物的水平,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,
其中所述一种或多种基因产物的水平与它们在健康对照受试者中的水平相比的显著提高指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在特定实施方式中,所述基因产物是SAA2。在另一个特定实施方式中,所述基因产物是具有氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)的肽。在另一个特定实施方式中,所述基因产物是SAA1。在又一个特定实施方式中,所述基因产物是GUCA2B。在另一个实施方式中,至少两种基因产物的水平与它们在健康对照中的相应水平相比的显著提高指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个特定实施方式中,所述至少两种基因产物包括SAA2。在另一个特定实施方式中,所述至少两种基因产物包括SAA1。在另一个特定实施方式中,所述至少两种基因产物是SAA1和SAA2。在又一个实施方式中,SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平与它们在健康对照中的相应水平相比的显著提高(例如提高至少30%-50%)指示了所述受试者患有重度全身性炎症。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在另一个实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染。在另一个实施方式中,所述受试者患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。在另一个实施方式中,所述方法还包括为被检测为患有重度全身性炎症的受试者提供治疗,其中所述治疗选自抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂和皮质类固醇。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。
正如本文中公开的,根据本发明的实施方式的方法为炎性病症提供了早期治疗,因为可以在症状出现起数小时内做出正确诊断和治疗指派,而无需等待确认性测试结果。例如,表现出本文所公开的全身性炎症或病症的体征或症状的受试者,可以使用根据本发明的实施方式的可以有利地提供及时答案(例如在数分钟内)的测定法和方法进行测试。因此,可以有利地在疾病过程的早期(例如在疾病症状发作的1-4小时或1-24小时内),在所述疾病发展到更严重和潜在危及生命的阶段之前提供正确的治疗指派。
另一方面,本发明提供了一种制品,其包含用于特异性检测和/或确定尿液样品中至少三种基因产物的水平的装置,所述至少三种基因产物选自表1和4-6中列出的基因产物,或选自表9-14中的任一者。在一个实施方式中,所述装置包括特异性针对所述基因产物的抗体。在另一个实施方式中,所述基因产物是在表1、4、5、6和9-14中的至少一者中阐述的所有基因产物,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在一个特定实施方式中,所述基因产物是SAA2、SAA1和GUCA2B基因产物。在另一个特定实施方式中,所述装置包括针对SEQ ID NO:1的肽的抗体。在各种不同实施方式中,所述制品为试纸条、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试等的形式。
另一方面,提供了一种诊断试剂盒,其包含所述制品。在一个实施方式中,所述装置包含特异性针对所述基因产物的抗体。在另一个实施方式中,所述试剂盒包含用于收集所述尿液样品的容器。在另一个实施方式中,所述试剂盒还包含用于将所述样品中每种基因产物的水平与对应于它在对照样品中的尿液水平的相应值进行比较的装置。在另一个实施方式中,所述试剂盒还包含使用说明书,例如用于将每种基因产物的水平与对应于它在对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与所述对照样品的尿液蛋白质组学签名进行比较,并检测、评估或监测全身性炎症的说明书。在另一个实施方式中,所述试剂盒还包含参比对照。在另一个实施方式中,所述试剂盒还包含例如本文中所描述的适合的治疗。在另一个实施方式中,所述试剂盒包含针对选自SAA2、SAA1和GUCA2B的一种或多种基因产物的抗体。在另一个实施方式中,所述试剂盒包含针对SEQ ID NO:1的SAA2基因产物的抗体。
另一方面,提供了一种具有氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)的分离的肽。在另一个实施方式中,提供了一种偶联物,其包含所述分离的肽和异源部分(例如载体蛋白或标记物)。在另一个实施方式中,提供了一种编码所述分离的肽的核酸分子。在另一个实施方式中,提供了一种产生针对所述肽的抗体的方法,包括用所述肽免疫并分离得到的抗体。
本发明的其他目的、特点和优点将从下面的描述和附图变得清晰。
附图说明
图1A-1C.描绘了能够鉴定以血液CRP>120mg/L为特征的重度全身性炎症的尿液蛋白的单参数分析。结果表示成在每位受试者中测量到的尿液水平的以2为底的对数(log2(强度))。图1A-GUCA2B;图1B-SAA1;图1C-SAA2。
图2.示出了可以鉴定以血液CRP>120mg/L为特征的重度全身性炎症的使用XGBOOST算法的多参数分析。指明了所述模型中每种尿液生物标志物的相对重要性。
图3.示出了可以鉴定以血液CRP>100mg/L为特征的重度全身性炎症的使用XGBOOST算法的多参数分析。指明了所述模型中每种尿液生物标志物的相对重要性。
图4.示出了测量到的血液CRP水平与通过尿液生物标志物签名预测的血液CRP水平之间的相关曲线。
图5.呈现了使用尿液蛋白标志物SRGN、IGLV3-12和ASGR1来鉴定以血液CRP>100mg/L为特征的重度全身性炎症的受试者工作特征(ROC)曲线。
图6.示出了使用尿液蛋白标志物SRGN、IGLV3-12和ASGR1来鉴定以血液CRP>100mg/L为特征的重度全身性炎症的决策树分析。
具体实施方式
本发明提供了用于检测和监测全身性炎症的测定法、试剂盒和方法。具体来说,在某些实施方式中,本发明涉及尿液生物标志物用于非侵入性评估炎症水平的用途。在某些实施方式中,本发明还涉及用于在非侵入性评估所述水平和/或发生炎症并发症的风险的基础上为受试者确定和调整治疗的装置。
一方面,提供了一种检测有需要的受试者存在或不存在全身性炎症的方法,包括:
a.确定来自所述受试者的尿液样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而获得与所述参比对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
在某些实施方式中,检测有需要的受试者中全身性炎症的方法,包括:
a.从所述受试者获得尿液样品,
b.确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
c.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与所述参比对照样品的尿液蛋白质组学签名进行比较。
在一个实施方式中,所述参比对照样品对应于健康对照受试者,并且与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。在另一个实施方式中,所述参比对照样品对应于健康对照受试者,并且以所述基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。
在另一个实施方式中,所述方法还包括确定所述受试者中全身性炎症的水平。在另一个实施方式中,所述炎症选自轻度、中度和重度。在另一个实施方式中,所述参比对照样品已在先于从所述受试者获得所述尿液样品的时间的时间点从所述受试者获得,并且所述方法进一步用于监测所述受试者的炎症状态的改变。在另一个实施方式中,所述受试者的尿液样品是在第一时间点从所述受试者获得的第一尿液样品,并且所述参比对照样品是在先于从所述受试者获得所述第一尿液样品的时间的时间点从同一受试者获得的第二尿液样品,其中所述方法用于监测所述受试者的炎症状态的改变。在另一个实施方式中,以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比的显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的加重,并且以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比的显著降低为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的改善。
在另一个实施方式中,所述方法还包括调整为所述受试者提供的治疗,其中所述受试者中全身性炎症的加重指示了应该调整所述治疗。在另一个实施方式中,所述方法还包括在所述确定的全身性炎症的水平的基础上为所述受试者确定治疗。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述受试者提供所述治疗。在另一个实施方式中,所述治疗选自抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂和皮质类固醇。
在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中选自表6中列出的基因产物的至少五种基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述至少五种基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表6中列出的所有基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少五种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少五种基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述至少三种基因产物选自表10-14中的任一者中列出的基因产物。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表10、表11、表12、表13或表14中列出的所有基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,以SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在另一个实施方式中,步骤b.使用学习和模式识别算法来进行。在另一个实施方式中,所述受试者是人类。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在另一个实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染。在另一个实施方式中,所述受试者患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述受试者提供疾病预后。在另一个实施方式中,所述受试者已接受免疫刺激性治疗,并且所述方法用于评估细胞因子释放综合征(CRS)的存在或发病风险。在另一个实施方式中,所述受试者已接受免疫抑制性治疗,并且所述方法用于确定治疗效果。在另一个实施方式中,所述方法包括为被检测为患有所述炎症的所述受试者提供疾病预后和/或相应的治疗。
另一方面,提供了一种检测存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定受试者的尿液样品中选自表4、5和9中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,从而获得与所述健康对照受试者的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
在某些实施方式中,检测重度全身性炎症的方法包括:
a.从所述受试者获得尿液样品,
b.确定所述样品中选自表4、5和9中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
c.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与所述健康对照受试者的尿液蛋白质组学签名进行比较。
在另一个实施方式中,其中与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,以所述基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>120mg/L,并且所述基因产物选自表4中列出的基因产物。在特定实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表4中列出的所有基因产物的水平,从而确定(或获得)所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>100mg/L,并且所述基因产物选自表5或9中列出的基因产物。在特定实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表5中列出的所有基因产物的水平,从而确定(或获得)所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表9中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述方法包括确定所述样品中表5中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
在另一个实施方式中,步骤b.使用学习和模式识别算法来进行。在另一个实施方式中,所述受试者是人类。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在另一个实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染。在另一个实施方式中,所述受试者患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述受试者提供疾病预后。在另一个实施方式中,所述受试者已接受免疫刺激性治疗,并且所述方法用于评估CRS的存在或发病风险。在另一个实施方式中,所述受试者已接受免疫抑制性治疗,并且所述方法用于确定治疗效果。在另一个实施方式中,所述方法包括为被检测为患有所述炎症的所述受试者提供疾病预后和/或相应的治疗。
另一方面,提供了一种检测至少两岁的人类受试者存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定所述受试者的尿液样品中选自SAA2、SAA1和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物的水平,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,
其中所述一种或多种基因产物的水平与其健康对照水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在某些实施方式中,检测至少两岁的人类受试者重度全身性炎症的方法包括:
a.从所述受试者获得尿液样品,
b.确定所述样品中选自SAA2、SAA1和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物的水平,和
c.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,
其中所述一种或多种基因产物的水平与其在健康对照受试者中的水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在另一个实施方式中,至少两种基因产物的水平与其在健康对照中的相应水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,至少两种基因产物的水平与其相应的健康对照水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,所述至少两种基因产物是SAA1和SAA2。在另一个实施方式中,SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平与其在健康对照中相应的水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平与其相应的健康对照水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,所述基因产物是SAA2基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物是具有氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)的肽。在另一个实施方式中,所述基因产物是SAA1基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物是GUCA2B基因产物。在另一个实施方式中,所述样品中所述标志物(例如SAA1)的水平与其在健康对照受试者中的水平相比提高至少50%,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在另一个实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染或选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述受试者提供疾病预后。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。在另一个实施方式中,所述方法还包括向被检测为患有重度全身性炎症的受试者提供治疗,其中所述治疗选自抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂和皮质类固醇。
另一方面,提供了一种用于分析尿液样品的方法,所述方法包括:
a.确定所述样品中选自表1的至少三种基因产物的水平,从而获得所述样品关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的尿液水平的相应值进行比较,从而获得与所述对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述样品的尿液蛋白质组学签名。
在一个实施方式中,步骤b.使用学习和模式识别算法来进行。在另一个实施方式中,所述受试者是人类。在另一个实施方式中,所述受试者是成年人类。在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。在另一个实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。在另一个实施方式中,所述受试者患有感染或选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。在另一个实施方式中,所述方法还包括为所述被检测为患有所述炎症的受试者提供疾病预后和/或相应的治疗。
另一方面,本发明提供了一种制品,其包含用于特异性检测和/或确定尿液样品中至少三种基因产物的水平的装置,所述基因产物选自表1和4-6中列出的基因产物,或表9-14中的任一者。在另一个实施方式中,所述基因产物是在表1、4、5、6中的至少一者中阐述的所有基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物是在表9-14中的至少一者中阐述的所有基因产物。在另一个实施方式中,所述制品为试纸条、抗体阵列、抗体芯片或侧流测试的形式。
在另一个实施方式中,提供了一种包含所述制品的诊断试剂盒。另一方面,提供了一种诊断试剂盒,其包含用于特异性检测和确定尿液样品中至少三种基因产物的水平的装置,所述基因产物选自表1和4-6中列出的基因产物,或表9-14中的任一者。在另一个实施方式中,所述装置包含特异性针对所述基因产物的抗体。在另一个实施方式中,所述基因产物是表1、4、5和6中的至少一者或表9-14中的至少一者中阐述的所有基因产物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在另一个实施方式中,所述试剂盒还包含用于收集所述尿液样品的容器,和/或用于将所述样品中每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较的装置。在另一个实施方式中,所述基因产物包括选自SAA2、SAA1和GUCA2B的一种或多种基因产物。在另一个实施方式中,所述试剂盒包含针对的SEQ ID NO:1的SAA2基因产物的抗体。
另一方面,提供了一种具有氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)的分离的肽。在另一个实施方式中,提供了一种偶联物,其包含所述分离的肽和异源部分。在另一个实施方式中,提供了一种编码所述分离的肽的核酸分子。在另一个实施方式中,提供了一种产生针对所述肽的抗体的方法,所述方法包括用所述肽免疫并分离得到的抗体。
受试者和样品
根据本发明的方法和测定法的各种不同实施方式,尿液样品从受试者获得。根据本发明的方法的受试者通常是人类受试者。根据某些实施方式,所述受试者的年龄为至少两岁,或者在其他实施方式中是成年人类受试者。
根据本发明的实施方式,本文公开的方法和测定法可用于在被诊断为或患有可能与炎症相关的各种不同病症的受试者中检测、定量或监测全身性炎症。在一个实施方式中,所述受试者患有感染。在其他实施方式中,所述受试者可能患有非感染性炎性病症。例如,所述受试者可能患有(或怀疑患有)自身免疫性疾病、风湿病或慢性炎性疾病。在另一个实施方式中,所述受试者患有癌症。
在各种不同实施方式中,所述感染可以是细菌、病毒或寄生虫感染,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。例如但非限制性的,所述受试者可能患有细菌或病毒感染,其选自Epstein-Barr病毒(EBV)感染、巨细胞病毒(CMV)感染、麻疹、副流感支气管炎、上呼吸道感染(URTI)、下呼吸道感染、皮疹、水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染、胸骨炎、腹膜炎、肺炎、立克次氏体感染、蜂窝组织炎、毛囊炎、憩室炎、结肠炎、牙齿感染、细菌性心内膜炎、肌炎、菌血症、上行性胆管炎、脓肿(例如腹部、肝、肺或肛周脓肿)、细菌性咽炎、胆囊炎(例如坏疽性胆囊炎)、积脓、骨髓炎、腮腺炎、与哮喘加重相关的病毒感染、支气管炎、登革热感染、带状疱疹感染、传染性单核细胞增多症、流感、脑膜炎,及其组合。在其他示例性实施方式中,所述受试者可能患有细菌或病毒感染,其选自EBV感染、CMV感染、麻疹、副流感支气管炎、URTI、下呼吸道感染、皮疹、VZV感染、胸骨炎、腹膜炎、肺炎、立克次氏体感染、蜂窝组织炎、毛囊炎、憩室炎、结肠炎、牙齿感染、细菌性心内膜炎、肌炎、菌血症、上行性胆管炎、脓肿、细菌性咽炎、胆囊炎、积脓、骨髓炎、腮腺炎、支气管炎、登革热感染、带状疱疹感染、传染性单核细胞增多症、流感、脑膜炎,及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。因此,通过根据本发明的方法确定的是炎症的水平而不是感染的病因。在其他实施方式中,所述受试者未患本文所公开的感染。
在另一个实施方式中,所述病症是自身免疫性疾病,其中受试者的免疫系统攻击受试者自己的组织。示例性的自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎症性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)。这些病症通常由以宿主特异性抗体和/或T细胞的存在为特征的自身免疫炎症反应介导,其与疾病的严重程度相关。
在另一个实施方式中,所述病症包括作为炎症性关节病的风湿病。炎症性关节病是指一个或多个关节的任何部分(包括结缔组织和软骨)的损伤或部分或完全破坏,其中损伤包括任何原因的结构和/或功能损伤,其特征是关节炎症,并且可能会或可能不会引起关节疼痛(关节痛)。在一个实例中,炎症性关节损伤由关节炎例如类风湿性关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎或银屑病关节炎引起。
在另一个实施方式中,所述紊乱是慢性炎性疾病。慢性炎性疾病以具有病理后遗症的持续炎症反应为特征。这种状态通常伴有单核细胞浸润、成纤维细胞和小血管增殖、结缔组织增加和组织破坏。非限制性实例包括特发性或非感染性慢性病症,例如心包炎或牙周炎。
在其他实施方式中,所述病症是肿瘤性紊乱(癌症)。在各种不同实施方式中,所述癌症选自神经胶质瘤、白血病、子宫癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌、透明细胞肾癌、结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌以及黑色素瘤。在此类病症中,所述受试者可能由于化疗、放疗或其他免疫抑制性治疗而易于发生感染,或由于其他免疫调节性治疗而表现出炎症症状。例如,免疫疗法(例如通过CAR T细胞)或免疫刺激性治疗可能与细胞因子释放综合征(CRS)的发生相关。
在某些实施方式中,所述受试者未患肾损伤或疾病,例如慢性肾病。在某些实施方式中,所述受试者未患(或尚未被诊断为患有)尿路感染。在其他实施方式中,所述受试者未表现出白细胞尿。在其他实施方式中,所述受试者未表现出肾脏或泌尿生殖系统症状或体征。在其他实施方式中,所述受试者未表现出肾小球滤过受损或肾小球滤过进行性恶化。在其他特定实施方式中,所述受试者未被诊断患有或怀疑患有结核病或坏死性小肠结肠炎。在另一个特定实施方式中,所述受试者未被诊断患有或怀疑患有COVID-19。在又一个实施方式中,所述受试者患有或怀疑患有COVID-19。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
正如本领域中已知的,待用于本发明实施方式的尿液样品从受试者获得或收集。通常,所述尿液样品是如本文中所公开的非侵入性获得的。在一个实施方式中,所述尿液样品是排泄的尿液样品。在特定实施方式中,所述样品无需预先的膀胱刮擦或洗涤步骤从所述受试者获得。在另一个实施方式中,所述方法还包括在确定基因产物水平的步骤之前将得到的尿液样品冷冻和将样品解冻的步骤。方便的是,可以将尿液样品保持在-20℃或-80℃下直至进行分析。而在其他实施方式中,本发明涉及快速诊断和预后方法,其中所述样品在收集后的数小时(例如1-4小时或少于24小时)或数分钟(例如至多15、30或45分钟)内测定。在一个实施方式中,所述样品是非沉淀的尿液样品。在另一个实施方式中,所述尿液样品基本上不含残留细胞。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在各种不同实施方式中,本发明的方法还包括在确定标志物的水平之前稀释所述尿液样品。在一个实施方式中,使用PBS将所述样品在例如1:2至1:20的范围内稀释。在另一个实施方式中,将所述样品1:4、1:6、1:8、1:10、1:15或1:20稀释,例如在对样品进行免疫测定法之前。在另一个实施方式中,所述尿液样品经历浓缩或过滤。在优选实施方式中,所述样品经历超滤,例如使用MILLIPORE Amicon Ultra。正如本领域中已知的,超滤涉及各种不同的膜过滤,其中静水压力迫使液体紧靠半透膜。所述膜的截留值可以选自3KD、10KD、30KD或更大。在另一个实施方式中,所述样品被重构(例如用PBS)。在另一个实施方式中,在重构后,将所述尿液样品在2倍至10倍的范围内稀释(例如在对样品进行免疫测定法之前)。在其他示例性实施方式中(例如使用质谱术进行分析),可以将所述样品通过过滤(例如使用3kDa截留分子量的滤器)浓缩,然后进行溶液内胰蛋白酶消化,之后进行脱盐步骤。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
测定法和试剂盒
根据各种不同实施方式,本发明的方法和测定法涉及确定尿液样品中本文所公开的基因产物的水平。
在某些实施方式中,本发明的方法通过免疫测定法,使用特异性针对本发明的基因产物的抗体来进行。
当在本文中使用时,针对(或特异性针对)抗原的抗体是能够特异性结合所述抗原的抗体。当在本文中使用时,术语“特异性结合”意味着抗体与抗原探针的结合不被不相关分子的存在竞争性抑制。
应该理解,当使用术语“抗体”时,它旨在包括完整抗体例如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)及其蛋白水解片段例如Fab或F(ab')2片段。在本发明的范围内还包括嵌合抗体、重组和工程化抗体及其片段。
包含轻链和重链两者的全部或基本上全部可变区的示例性的功能性抗体片段定义如下:
(i)Fv,其定义为由作为两条链表达的轻链可变区和重链可变区组成的基因工程片段;
(ii)单链Fv(“scFv”),其是基因工程单链分子,包括通过适合的多肽接头连接的轻链可变区和重链可变区。
(iii)Fab,其是抗体分子的片段,含有抗体分子的单价抗原结合部分,通过用木瓜蛋白酶处理完整抗体以得到完整的轻链和重链的Fd片段来获得,所述Fd片段由重链的可变结构域和CH1结构域组成;
(iv)Fab’,其是抗体分子的片段,含有抗体分子的单价抗原结合部分,通过用胃蛋白酶处理完整抗体然后还原来获得(每个抗体分子获得两个Fab’片段);和
(v)F(ab’)2,其是抗体分子的片段,含有抗体分子的单价抗原结合部分,通过用胃蛋白酶处理完整抗体来获得(即通过两个二硫键保持在一起的Fab’片段的二聚体)。
当在本文中使用时,术语“抗原”是能够被抗体结合的分子或分子的一部分。抗原通常能够诱导动物产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。上面提到的特异性反应是指抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应,而不与可能由其他抗原引发的大量其他抗体反应。
在某些实施方式中,确定所述样品中本发明的基因产物的水平通过下述过程来进行,所述过程包括将所述样品在使得可以形成特异性抗原-抗体复合物的条件下与针对感兴趣的基因产物的抗体接触,并对为每个基因产物形成的抗原-抗体复合物的量进行定量,从而确定(或获得)所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
在各种不同实施方式中,所述免疫测定法选自试纸条、ELISA(包括各种不同的多重ELISA技术)、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。
根据本发明的原理,可以使用任何适合的免疫测定法。此类技术对于普通技术人员来说是公知的,并且已在许多标准的免疫学手册和教科书中描述。在某些实施方式中,确定抗体特异性结合基因产物的能力使用基于抗体阵列的方法来进行,包括但不限于抗体阵列或抗体芯片。在某些实施方式中,将所述阵列与受试者的任选被稀释的尿液样品温育,以便允许包含在所述样品中的基因产物与固定化的抗体之间的特异性结合,从所述阵列上洗掉未结合的组分,将所述清洗过的阵列与可检测标记偶联的所需同型的抗体温育,从阵列上洗掉未结合的标记物,并测量结合到每个基因产物的标记物的水平。
其他的示例性测定法可以基于试纸条技术,正如在例如美国专利号4,632,901、4,313,734和4,786,589、5,656,448以及EP 0125118中所演示的。例如,美国专利号4,632,901公开了一种流通式免疫测定装置,其包含与添加有液体样品的多孔膜或滤器结合的抗体(特异性针对靶抗原分析物)。当液体流过膜时,靶分析物与所述抗体结合。在添加样品后添加标记的抗体。标记抗体的目测检测为样品中靶抗原分析物的存在提供了指示。EP0125118公开了一种夹心型试纸条免疫测定法,其中将免疫化学组分例如抗体结合到固相。所述测定装置被“浸泡”在怀疑含有未知抗原分析物的样品中以便温育。然后在温育期同时或之后添加酶标记的抗体。接下来将装置清洗,然后插入到含有所述酶的底物的第二溶液中。酶标记物如果存在的话,则与底物相互作用,导致形成有色产物,其作为沉淀物沉积在固相上或在底物溶液中产生可见的颜色变化。
在某些实施方式中,生物标志物(基因产物)的检测可以使用其他免疫测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试试剂盒来进行。在此类测定法中,例如,通常将样品在能够特异性结合所述生物标志物的固定化的第一特异性结合剂(例如抗体)存在下温育。生物标志物与所述第一特异性结合剂的结合可以使用各种不同的已知方法中的任一者来测量,例如使用标记的第二特异性结合剂,其能够特异性结合所述生物标志物(在不同表位处)或所述第一特异性结合剂。示例性的特异性结合剂包括例如单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段例如重组抗体片段、单链抗体(scFv)等。在某些实施方式中,可以使用各种不同的常规标签或标记物,例如放射性同位素、酶、发色团或荧光团。典型的放射性同位素是碘-125或硫-35。用于这一目的的典型的酶包括辣根过氧化物酶、辣根半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
任选地,可以使用其他免疫测定法,此类技术对于普通技术人员来说是公知的,并且已在许多标准的免疫学手册和教科书中描述。在某些实施方式中,本发明的方法适合于自动或半自动分析,并且可以对多个样品进行临床中通量或高通量筛选。例如,自动化ELISA系统如Biotest的ELISA处理器、Maxmat自动微孔板ELISA分析仪(MaxmatS.A.,法国)或DSXTM四板系统(Dynex Technologies)可以被方便地使用,并用于各种不同的方法包括但不限于多重ELISA方法中。其他适合的测定法包括例如流式细胞术测定法(例如单重和多重基于珠子的测定法(Invitrogen))或本领域中可用的其他多重珠免疫测定法。
侧流测试以与上述ELISA测定法相同的原理运行。从本质上讲,这些测试将样品沿着带有反应性分子的垫表面运行,显示出视觉上的阳性或阴性结果。所述垫是基于一系列毛细管床,例如多孔纸片、微结构化聚合物或烧结聚合物。这些垫中的每一者都具有自发运输流体(例如尿液)的能力。样品垫充当海绵并容纳过量的样品流体。在浸泡后,所述流体流向第二偶联物垫,其中将被称为偶联物的冷冻干燥的生物活性粒子储存在盐-糖基质中。所述偶联物垫含有靶分子(例如本文公开的基因产物)与其已固定在粒子表面上的化学配偶体(例如抗体)之间的优化化学反应所需的所有试剂。这在靶粒子通过所述垫并继续穿过测试线和对照线时对其进行标记。所述测试线显示信号,通常是颜色。所述对照线含有亲和配体,其显示样品是否已流过以及偶联垫中的生物分子是否有活性。在通过这些反应区后,流体进入仅仅充当废物容器的最终的多孔材料芯。
在另一个实施方式中,确定所述基因产物的水平通过质谱或使用微型光谱仪来进行。例如,可以使用基于质谱的靶向蛋白质组学,例如对所述基因产物的蛋白水解肽使用重标记的合成内标。可以使用质谱仪测量天然肽和标准品,并将来自内标的信号参比到天然肽,它们代表了尿液样品中的原始基因产物。在非限制性实例中,可以使用适合的设备例如SCIO近红外微型光谱仪。
本发明的另外实施方式涉及制品,其包含用于特异性检测和/或确定尿液样品中本文所公开的基因产物的水平的装置。在各种不同实施方式中,所述制品包含用于特异性检测和确定本文所公开的基因产物集的水平的装置。在某些实施方式中,所述装置包含特异性针对本文所公开的基因产物集的基因产物的抗体、由所述抗体组成或基本上包括所述抗体。在某些实施方式中,所述制品被配置成本文所公开的免疫测定法的形式,包括但不限于试纸条、抗体阵列、抗体芯片或侧流测试。在其他实施方式中,所述制品适合与本文所公开的免疫测定法一起使用,包括但不限于试纸条、抗体阵列、抗体芯片或侧流测试。
根据其他方面,本发明提供了适合用于本发明方法的试剂盒。在某些实施方式中,提供了一种包含所述制品的诊断试剂盒。在某些实施方式中,所述试剂盒还包含用于收集尿液样品的合适容器或其他装置。在其他实施方式中,所述试剂盒还包含用于将样品中每种基因产物的水平与对应于它在对照样品中的尿液水平的相应值进行比较的装置。在某些实施方式中,提供了一种诊断试剂盒,其包含i)用于从受试者收集尿液样品的装置,和ii)用于确定样品中本发明基因产物的水平的装置。
在其他实施方式中,所述试剂盒还可以含有用于确定基因产物水平的其他装置,包括但不限于可用于测量抗体与本发明的标记物抗原的特异性结合的试剂、可检测标记物和/或容器。在其他实施方式中,所述试剂盒还可以包含用于将尿液蛋白质组学签名与对照蛋白质组学签名进行比较的装置。在某些实施方式中,所述试剂盒含有阴性和/或阳性对照样品。例如,对照样品可以含有来自至少一位健康个体的样品。在其他实施方式中,所述对照样品可以包括来自一组健康个体或本文中公开的患病个体的一组对照样品,或对应于对照个体的一组储存的数据。任选地,所述试剂盒还可以包含用于在测量标志物水平之前制备或处理样品的装置。在各种不同实施方式中,所述对照样品对应于被诊断为患有全身性炎症、例如本文所描述的重度全身性炎症的受试者。在示例性实施方式中,本文公开的基因产物(例如肽)可以作为阳性对照包括在所述试剂盒中,以确认所述测定法的灵敏度和特异性。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在进一步的实施方式中,所述试剂盒还包含使用说明书,例如在本文公开的诊断或分析方法中使用所述试剂盒的说明书。在其他实施方式中,所述试剂盒还包含根据本文公开的方法指派治疗或治疗受试者的说明书。在某些实施方式中,所述试剂盒还包含用于所述被诊断的受试者的治疗,例如皮质类固醇或其他抗炎或免疫抑制性药物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在各种不同实施方式中,本发明涉及在尿液样品中检测或定量的基因产物的组合,在本文中也被称为标志物集或子集。在某些实施方式中,尿液蛋白质组学签名关于本文所公开的标志物集来确定。在各种不同实施方式中,所述标志物集包括在本文表1中列出的基因产物或其本文所公开的其子集。在各种不同实施方式中,所述标志物集包括本文表1中列出的至少3种基因产物,例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15种或在其他实施方式中多达约9、10、12、13、15或20种基因产物。当在本文中示例时,所述标志物集可以包括3-15种基因产物,例如3-5种(表4、9、12、14和实施例1和3)、5-10种(表4、5、12、14和实施例1和3)或10-15种(表5、6、10、11、实施例1-3)基因产物,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中,所述基因产物包括或选自表4、5、6、9、10、11、12、13或14中阐述的基因产物,或包括SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在特定实施方式中,所述基因产物包括SAA基因产物,例如SAA2基因产物。在另一个特定实施方式中,所述SAA2基因产物是本文所公开的SAA2肽或片段。在又一个实施方式中,所述基因产物不包括SAA2基因产物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在某些实施方式中,所述基因产物不包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和/或CXCL10(IP-10)基因产物。在另一个实施方式中,所述基因产物不包括C反应蛋白(CRP)。在其他实施方式中,所述基因产物不包括人类嗜中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)、sCD14-ST(可溶性CD14抗原亚型;presepsin)、尿胰蛋白酶抑制剂(uTi)和/或新蝶呤。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在另一个实施方式中,与本发明的制品、试剂盒和测定法相结合使用的标志物(基因产物)包含本文所公开的标志物集、由所述标志物集组成或基本上包括所述标志物集。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
诊断应用
根据本发明的方法和测定法的各种不同实施方式,将每种基因产物的水平与对应于对照尿液样品的相应值进行比较。在某些实施方式中,所述对照尿液样品对应于健康对照受试者。在其他实施方式中,所述对照尿液样品对应于在先于从所述受试者获得尿液样品的时间的时间点从所述受试者获得的样品(并且可用于例如监测所述受试者的炎症状态的改变)。在其他实施方式中(例如在确定全身性炎症的水平的方法中),所述对照尿液样品对应于具有预定炎症水平的受试者。此类对照样品在本文中也被合称为参比对照样品。
在一个实施方式中,本发明的方法用于评估有需要的受试者中的全身性炎症,包括检测(诊断)所述炎症状态,确定其水平(分级或定量),和监测其变化(将患者中全身性炎症的水平与其在以前时间点的水平进行比较)。
在一个实施方式中,本发明的方法用于(或包括)检测有需要的受试者中的全身性炎症。当在本文中使用时,术语“全身性炎症”是指影响身体的多个部分或器官的免疫介导的炎症状态。相比之下,局部炎症被局限于特定位置或器官。全身性炎症可以是感染性炎症(例如当受试者患有本文所公开的感染时)或无菌性炎症(无菌性全身性炎症,例如当受试者患有非感染性炎性病症例如自身免疫性疾病、风湿病或其他类型的慢性炎性疾病时)。
全身性炎症的症状的非限制性实例包括:体温改变(例如低于36℃或高于38℃),心率加快(例如大于90次/分钟),呼吸急促(例如大于20次呼吸/分钟),CO2动脉压降低(例如低于4.3kPa),白细胞计数改变(例如小于4,000个细胞/mm3或大于12,000个细胞/mm3),组胺水平升高(例如血液中大于60ng/mL),白三烯B4水平升高(例如血液中大于30pg/mL或大于35pg/mL),前列腺素水平升高(例如血液中大于3.0ng/mL),促炎性细胞因子水平升高(例如TNF-α大于20ng/mL和/或IL-6大于10pg/mL)。
在另一个实施方式中,所述方法用于(或包括)确定有需要的受试者中全身性炎症的水平。在各种不同实施方式中,所述炎症选自轻度(低等级或慢性)、中度和重度。急性全身性炎症通常是中度(中等级)或重度(高等级,通常蔓延到更多器官和系统)。一种类型的高等级全身性炎症是全身炎症反应综合征(SIRS)。SIRS的表现包括异常高或低的体温、心率加快、呼吸频率升高和白细胞计数异常。通常,SIRS被定义为满足至少两个下述判据(后文中的“SIRS判据”)的病症:发热>38℃或<36℃;心率>90次/分钟;呼吸频率>20次/分钟或PaCO2<32mm Hg;和白细胞计数异常(>12,000/mm3或<4,000/mm3或>10%的条带)。
全身性炎症传统上通过测量血液标志物来评估,例如红细胞沉降率(ESR)和CRP,其中CRP水平升高指示了更严重等级的炎症。例如,分别以血液CRP水平为10-39、40-100或超过100mg/L为特征,可以将全身性炎症的水平确定为轻度、中度和重度。相比之下,健康受试者(或炎症被适合的治疗所抑制的受试者)的特征在于血液CRP水平至多为10mg/L,尽管某些个体受试者可能表现出高达30mg/L的血液CRP水平而没有明显的临床表现。在特定实施方式中,所述方法用于(或包括)检测重度全身性炎症(例如以血液CRP水平超过100mg/L或120mg/L为特征)。
在某些实施方式中,所述对照尿液样品对应于具有预定炎症水平(例如本文所公开的轻度、中度或重度)的受试者,并且确定全身性炎症的水平包括将每种基因产物的水平与对应于其在一个或多个此类参比样品中的水平的相应值或与预定截止值进行比较,所述预定截止值在所述基因产物在健康对照受试者和患有全身性炎症的受试者中的尿液水平之间和/或全身性炎症的预定水平之间做出区分。
在另一个实施方式中,所述方法用于(或包括)监测有需要的受试者的炎症状态的变化(例如当所述参比对照样品在先于从所述受试者获得所述尿液样品的时间的时间点从所述受试者获取时)。因此,可以确定全身性炎症的加重(加剧)或改善(减轻)(例如分别与血液CRP水平的显著提高或显著降低相关)。在某些实施方式中,受试者炎症状态的加重或改善通常将分别引起本文公开的全身性炎症的一种或多种症状的加重或改善。本发明的实施方式的方法和测定法提供了炎症状态的迅速评估,从而预测炎症水平的改变,甚至是在临床上可以观察到症状改变之前。
在另一个实施方式中,所述方法用于(或包括)为所述受试者提供疾病预后。根据示例性实施方式,高等级炎症或炎症状态的加重可以指示不良预后,而轻度或无感染或炎症状态的改善可以指示有利的疾病状况或预后。
在另一个实施方式中,所述方法用于(或包括)评估细胞因子释放综合征(CRS)的存在或发病风险。CRS是一种形式的全身炎症反应综合征(SIRS),其可以由各种不同因素例如感染和某些药物触发。当大量白细胞被激活并释放炎性细胞因子时发生CRS,其进而激活更多白细胞。当作为治疗(例如某些单克隆抗体药物、过继性T细胞疗法或其他免疫刺激性治疗)的结果发生时,CRS症状可能延迟到治疗后数天或数周。即发性CRS和CRS的重症病例也可被称为细胞因子风暴(CSS)。根据示例性实施方式,高等级炎症或炎症状态的加重可以指示CRS的存在或风险。
在另一个实施方式中,所述方法用于(或包括)确定治疗效果,正如将在下文中更详细描述的。在另一个示例性实施方式中,所述方法用于(或包括)与感染相关的炎症的早期检测,例如在经历放疗或化疗的癌症患者中。
在其他实施方式中,本发明的方法用于患有与血液CRP水平升高相关的病症的受试者的非侵入性预后,评估其疾病进展,为其确定和/或调整治疗。
另一方面,提供了一种非侵入性监测有需要的受试者中与血液CRP水平升高相关的病症的进展的方法。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在某些实施方式中,与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。在其他实施方式中,与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在其他实施方式中,以基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名,指示了所述受试者患有全身性炎症。在另一个实施方式中,以基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在另一个实施方式中,以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比的显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的加重,并且以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比的显著降低为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的改善。在另一个实施方式中,本文所公开的一种或多种基因产物的水平与它们在健康对照受试者中的水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
在检测、确定其水平和监测全身性炎症的方法的某些实施方式中,所述基因产物可以选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少五种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少五种基因产物的尿液蛋白质组学签名,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表6中列出的基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表10、表11、表12、表13或表14中列出的基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在另一个实施方式中,正如本文中证实的,表11和12中列出的基因产物特别适用于检测或确定血液CRP水平高于30mg/L的受试者的炎症水平,并因此在中度和重度全身性炎症中特别有用。在特定实施方式中,所述基因产物包括或选自LRG1、UMOD、DDT、DDTL和FCN2基因产物。
在另一个实施方式中,正如本文中证实的,表13和14的基因产物能够在它们在尿液样品中的存在或不存在的基础上准确鉴定炎症状态,并且不需要精确定量它们的水平。因此,这些基因产物在旨在由患者自行诊断的免疫测定法例如试纸条测定法中特别有用。在特定实施方式中,所述基因产物包括或选自MATN4、LGALS1、CRHBP和DLK1基因产物。
在本发明的检测重度全身性炎症的某些实施方式中,所述基因产物选自表4、5和9中的任一者中列出的基因产物,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在检测重度全身性炎症的方法的其他实施方式中,所述基因产物包括选自SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物。在检测重度全身性炎症的其他实施方式中,所述基因产物包括选自SRGN、ASGR1和IGLV3-12基因产物的一种或多种基因产物。
在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>120mg/L,并且所述基因产物选自表4中列出的基因产物。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表4中列出的基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述炎症伴有血液CRP水平>100mg/L,并且所述基因产物选自表5或9中列出的基因产物,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表5中列出的基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表9中列出的基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。在另一个实施方式中,所述确定步骤包括确定所述样品中表9中列出的一种或多种基因产物的水平,其中所述一种或多种基因产物的水平的显著提高指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在另一个实施方式中,选自SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物的水平与它们在健康对照受试者中的水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据本发明的实施方式,蛋白质组学签名的显著不同或相似性考虑所述签名的基因产物的集体水平来确定。在某些实施方式中,与对照相比显著不同的尿液蛋白质组学签名包括本文所公开的一组基因产物的水平与它们相应的对照水平相比显著提高。在其他实施方式中,与对照相比显著不同的尿液蛋白质组学签名包括本文所公开的一组基因产物的水平与它们相应的对照水平相比显著降低。在又一些实施方式中,与对照相比显著不同的尿液蛋白质组学签名包括与相应的对照水平相比本文所公开的一种或多种标志物的水平显著提高和本文所公开的一种或多种另外的标志物的水平显著降低两者。每种可能性代表本发明的独立实施方式。当在本文中使用时,“显著提高”和“显著降低”的水平分别是指统计学显著的提高/降低。
在某些实施方式中,比较蛋白质组学签名可以使用适合的分类器或算法包括但不限于学习和模式识别算法、监督分类器等来进行。与对照水平的显著差异通常且方便地可以考虑阴性和阳性对照组两者(例如分别为健康对照受试者和患有全身性炎症的受试者)的相应值来确定。根据本发明的实施方式的方法可以包括在阴性和/或阳性对照样品中确定本文所公开的基因产物的相应水平的步骤,或者可以利用在测试样品中测量到的值与相应的预定值或储存数据的比较。因此,可以将测试样品分类为对应于(显著相似于或不显著不同于)本文所公开的阳性或阴性对照组中的任一者。本文中提到的阳性和阴性对照通常且方便地表示对照集,例如来自于一组健康或诊断相似的个体的一组对照样品,或从健康或诊断相似的个体获得的一组储存的数据。
因此,在本发明的方法的某些实施方式中,所述比较步骤使用本文中公开的学习和模式识别算法来进行。在特定实施方式中,所述算法选自选自梯度提升树、随机森林、正则化回归及其组合,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在本发明的方法的另一个实施方式中,所述比较步骤包括将每种基因产物的水平与预定截止值进行比较,所述预定截止值在健康对照受试者和患有全身性炎症的受试者中所述基因产物的尿液水平之间(或全身性炎症的预定水平之间)做出区分。
在某些实施方式中,所述确定和比较步骤包括确定所述样品中每种标志物的存在或不存在,其中所述尿液蛋白质组学签名反映出所述样品中所述每种标志物的存在或不存在。根据另外的实施方式,比较尿蛋白质签名还包括将每种基因产物的水平(包括所述基因产物的存在或不存在)与其对照尿液水平以特定的顺序或等级进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与对照尿液蛋白质组学签名进行比较。例如,本文的实施例3演示了使用决策树算法进行的尿液蛋白质组学签名的比较,其中以特定等级考虑标志物的存在或不存在(SRGN、IGLV3-12和ASGR1)。
在各种不同实施方式中,本发明涉及在现有的测定法不存在、在时间长度或其他方面不适合或不建议的情况下可用于评估炎症的方法。本发明在其实施方式中通过以迅速和非侵入性方式测定所述受试者的尿液样品,克服了本文公开的这些和其他挑战。在某些实施方式中,本发明的方法用于感染性疾病的早期治疗,因为正确的诊断和治疗指派(特别是抗生素治疗的指派)可以在症状出现的数小时(例如1-4小时或少于24小时)内做出。在本发明的方法的某些实施方式中,所述确定和比较步骤在合计15分钟、30分钟、60分钟、1-4小时、3-6小时或最多24小时内进行,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。
治疗评估和指派
在某些实施方式中,本发明的方法提供了治疗指派方法和治疗方法,包括例如调整、确定和/或提供治疗,其中每种可能性代表本发明的独立实施方式。在所述治疗指派方法的各种不同实施方式中,所述受试者可能患有本文所公开的感染性或非感染性炎性病症。因此,所述待调整、确定和/或提供给受试者的治疗是用于相应病症(包括用于相关的炎性反应)的治疗。
在一个实施方式中,本发明的方法包括调整提供给所述受试者的治疗(例如本文所公开的药物或药剂)。在另一个实施方式中,所述受试者中全身性炎症的加重指示了应该调整所述治疗。在某些实施方式中,调整治疗可以包括替换所述治疗,提供额外的治疗,和/或改变(通常为提高)所述治疗的给药剂量或持续时间,使得所述调整的治疗对应于所述疾病的更严重形式或等级。
在另一个实施方式中,本发明的方法包括在受试者中确定的全身性炎症的水平的基础上为所述受试者确定(选择)治疗。例如但非限制性的,确定治疗可以包括确定适合的剂量,其中例如与中度炎症相比在重度炎症中使用更高的剂量,和对于轻度炎症病例可以进一步降低剂量。在另一个非限制性实例中,与不太严重的病例相比,在严重病例中使用更强力的免疫抑制性药物。示例性剂量和具有各种不同效力的药物在下文中提供。
在另一个实施方式中,本发明的方法还包括为所述受试者提供治疗。因此,在某些实施方式中,提供了一种治疗有需要的受试者的方法,包括:
a.从所述受试者获得尿液样品,
b.确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而确定所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
c.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而将所述受试者的尿液蛋白质组学签名与所述参比对照样品的尿液蛋白质组学签名进行比较,
d.确定所述受试者中的全身性炎症水平(例如为轻度、中度或重度),
e.在确定的全身性炎症的水平的基础上为所述受试者确定治疗,和
f.为所述受试者提供所述治疗。
在各种不同实施方式中,所述在本发明的方法中待调整、确定和/或提供的治疗(例如在非感染性炎性病症的情况下)可以是抗炎药物、免疫抑制剂或皮质类固醇。例如,抗炎药物包括但不限于非甾类消炎药(NSAID)和抗细胞因子药剂例如抗IL6 mAb(例如托株单抗(Actemra))、抗IL-1mAb(例如阿那白滞素(Anakinra))和抗TNF mAb(例如英夫利昔单抗(Remicade));免疫抑制剂或免疫抑制性药剂具有负免疫调节活性,并包括例如环孢素和甲氨蝶呤。皮质类固醇具有抗炎和免疫调节两种活性,并包括例如泼尼松、地塞米松和氢化可的松。
因此,在示例性实施方式中(例如在IBD或类似病症的治疗中),皮质类固醇或其他强力治疗可以提供给确定患有重度全身性炎症的受试者,效力较低的免疫抑制剂可以提供给患有中度全身性炎症的受试者,温和的抗炎药物例如NSAID可以提供给患有轻度炎症的受试者,或者在中度和重度病例中与其他治疗相组合。
在另一个实施方式中,所述治疗可以是抗生素药物(例如当在感染性病症中确定了炎症的存在或水平时)。例如,所述抗生素治疗可以包括例如广谱革兰氏阳性抗生素、广谱革兰氏阴性抗生素及其组合。例如,广谱革兰氏阳性抗生素可以包括但不限于万古霉素或利奈唑胺。广谱革兰氏阴性抗生素可以包括但不限于广谱青霉素类例如哌拉西林和他唑巴坦、第三代或第四代头孢菌素、亚胺培南和氨基糖苷。在又一个实施方式中,所述治疗不包括抗生素药物。
用于例如上文所列出的疾病特异性治疗的剂量和治疗方案在本领域中是已知的,且可以由专业技术人员(例如治疗医师)根据患者的特征和疾病表现来确定和调整。
例如,NSAID通过阻断环加氧酶COX-1和COX-2来抑制前列腺素的产生。这些药剂的主要作用是减轻急性炎症,从而减轻疼痛并改善功能。所有这些药物还具有与其抗炎作用无关的轻度至中度镇痛特性。存在大量NSAID,一些非处方药包括布洛芬和萘普生,以及许多其他处方药包括美洛昔康、依托度酸、萘丁美酮、舒林酸、托美丁、胆碱水杨酸镁、双氯芬酸、二氟尼柳、吲哚美辛、酮洛芬、美洛昔康、奥沙普秦和吡罗昔康。允许每天一次或每天两次给药的长效NSAID可以提高依从性。NSAID类别还包括称为COX-2抑制剂的药物,它们也有效控制炎症,例如塞来昔布、依托考昔和鲁米昔布。用于治疗各种不同自身免疫和炎症病症的NSAID剂量在本领域中是已知的。例如,对于SLE的治疗来说,布洛芬可根据需要或以高达每天3000mg的剂量使用,而萘普生通常使用500mg,每天两次。
皮质类固醇(包括但不限于泼尼松、甲基强的松龙)具有抗炎和免疫调节两种活性。它们可以口服、静脉内、肌肉内给药,或者可以直接注射到关节中。例如,在轻度SLE中,泼尼松龙的给药剂量从0.1-0.3mg/kg/天开始,然后根据临床反应实施逐渐减量的剂量方案。在中度疾病中剂量上升到0.4-0.6mg/kg/天,在非常严重的疾病中高达0.7-1.5mg/kg/天。在如此高的剂量下,许多医生认为使用静脉内(IV)甲基强的松龙(MP;500-1000mg,一到三次)进行脉冲治疗更安全,相关副作用更少。在对口服治疗无反应和/或具有SLE的严重表现例如狼疮性肾炎、神经精神疾病、严重难治性血小板减少症、溶血性贫血、严重血管炎和心肺疾病的患者中,考虑IV治疗。
硫唑嘌呤是一种免疫抑制剂,通常用于诱导缓解,并在轻度至中度自身免疫性疾病中作为甾类节约剂。它通过抑制淋巴细胞增殖、减少抗体产生和抑制自然杀伤细胞活性来影响细胞介导的和体液免疫应答而起作用。在严重疾病中它被用作维持疗法,并且来自狼疮肾炎试验的数据显示,在使用环磷酰胺或霉酚酸酯的诱导疗法后,疾病活动有显著改善。
其他生物药剂和免疫抑制剂包括例如靶向B细胞上几种表面分子的单克隆抗体,以减少自身抗体的形成。此类示例性药物包括利妥昔单抗(抗CD20抗体)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)(人源化抗CD20抗体)、贝利木单抗(belimumab)(抗BAFF/BLyS抗体)、阿塞西普(atacicept)(抗BLys/APRIL抗)和依帕珠单抗(epratuzumab)(人源化抗CD22抗体)。此外,已开发了其他关键的细胞表面标志物来干扰共刺激分子例如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(阿巴西普)。此外,来氟米特(原商品名Arava)是一种免疫抑制性嘧啶合成抑制剂,通过抑制二氢乳清酸脱氢酶起作用。来氟米特是一种免疫调节药物,可抑制快速分裂的细胞的繁殖,特别是淋巴细胞。此外,在某些情况下可以使用TNF-α抑制剂例如依那西普或英夫利昔单抗(Infliximab)。
在其他实施方式中,本发明的方法可用于评估受试者对各种不同治疗的响应,例如免疫刺激性治疗或免疫抑制性治疗。
在某些实施方式中,所述方法用于评估与免疫刺激性治疗相关的副作用。此类治疗包括各种不同的癌症免疫疗法,包括但不限于CAR T细胞和过继转移细胞疗法以及检查点抑制剂(例如PD-1和PDL-1抑制剂)。在示例性实施方式中,所述受试者已接受免疫刺激性治疗,并且所述方法用于评估细胞因子释放综合征(CRS)的存在或发病风险。
在其他实施方式中,本发明的方法用于评估免疫抑制性治疗的治疗效果,例如本文公开的表现出负免疫调节作用的一种或多种药物或药剂。在某些实施方式中,所述受试者已接受免疫抑制性治疗,并且所述方法用于确定治疗效果(例如炎症或自身免疫的抑制,其表现为本文所公开的炎症状态的降低)。
SAA基因产物
血清淀粉样蛋白A(SAA)是与血浆中高密度脂蛋白(HDL)相关的载脂蛋白家族,包含不同的组成型表达的和诱导型的亚型。这些蛋白主要由肝脏产生。在本文表1和4-6中列出的SAA1和SAA2是高度同源的。正如本文所公开的,SAA1和SAA2是特别有用的预后标志物,可用于在下文中进一步详细描述的本发明的各种不同实施方式中。
正如在本文中进一步公开的,本发明的基因产物可以以片段或肽的形式而不是作为完整多肽存在于人类尿液样品中。因此,本文中公开的尿源性基因产物,由于缺少了相应天然多肽的一部分,与可在血液或身体组织中发现的相应基因产物可能在结构上不同。应该理解,本文中提到的术语“基因产物”明确包括了这些部分片段和肽,例如C-端截短和/或N-端截短的片段。正如本文中进一步公开的,这些肽可以特别包括SAA基因产物的N-端截短的片段。在其他实施方式中,本文中提到的基因产物是完整(或基本上完整)的多肽。
例如,出人意料地发现在炎症期间SAA1和SAA2两者均作为内源肽存在于尿液样品中,正如本文的实施例5中所述。具体来说,SAA2衍生肽GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)与血液CRP水平表现出引人注目的相关性(0.78),并发现作为炎症标志物特别有用。
因此,本发明的另一方面涉及一种具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的分离的肽。
本发明的肽可以是分离的,或者可以是使用本领域中已知的任何重组或合成方法合成的,包括但不限于固相(例如Boc或f-Moc化学)和液相合成方法。例如,所述肽可以通过Merrifield的固相肽合成方法(1963J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156)来合成。或者,本发明的肽可以使用本领域中公知的标准溶液方法(参见例如Bodanszky,1984,《肽合成原理(The Principles of Peptide Synthesis)》,Springer-Verlag,纽约)或通过本领域中已知的用于肽合成的任何其他方法来合成。
在可选实施方式中,所述肽可以通过重组技术产生。用于设计、表达和纯化蛋白质和肽的重组方法在本领域中是已知的(参见例如Sambrook等,《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,Cold Springs Harbor Laboratory,纽约,2001)。根据本发明的核酸分子可以包括DNA、RNA或DNA或RNA中任一者的衍生物。编码肽的分离的核酸序列可以从其天然来源作为整个(即完整)基因或其一部分获得。核酸分子也可以使用重组DNA技术(例如聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成来产生。核酸序列包括天然核酸序列及其同源物,包括但不限于天然等位基因变体和修饰的核酸序列,在所述修饰的核酸序列中核苷酸已被插入、缺失、替换和/或倒置,其方式使得此类修饰基本上不干扰核酸分子编码本发明有功能的肽的能力。多核苷酸或寡核苷酸序列可以从蛋白质的遗传密码推衍,然而必须考虑到密码的简并性,以及在密码子的第三位中允许经典碱基配对的例外情况,正如由所谓的“摆动规则”所给出的。此外,包括更多更少核苷酸的多核苷酸可以产生相同或等效的蛋白质。因此,根据其他实施方式,本发明提供了编码本发明肽的核酸及其重组构建体、表达载体和药物组合物,正如本领域中已知的(参见例如Sambrook等,2001)。
在本发明的方法中,术语“肽”是指通过肽键连接的7-40个、优选10-20个连续氨基酸的序列。肽可以包括“L”和“D”氨基酸两者以及本领域中已知的非天然和化学衍生的氨基酸。优选地,本发明的肽具有12-18个氨基酸(aa)的长度,更优选约14aa的长度。
当在本文中使用时,术语“分离的肽”是指合成的肽或已“通过人工改变的”肽并且与其在天然状态下共存的材料分开。分离的肽通过合成方法产生或改变或从其原始环境中取出,通常两者兼而有之。
在本发明中每当提到肽时,也设想了其盐和有功能的衍生物,只要它们保留了相应的免疫反应性即可。因此,本发明涵盖了含有非天然氨基酸衍生物或非蛋白质侧链的肽。具有末端羧酸的本发明的肽,可以作为羧酰胺,作为还原的末端醇或作为任何可药用盐,例如作为金属盐包括钠、钾、锂或钙盐,或作为与有机碱的盐,或作为与无机酸包括硫酸、盐酸或磷酸或与有机酸例如乙酸或马来酸的盐使用。
本文描述的氨基酸残基优选为“L”异构体形式。然而,“D”异构体形式的残基可以替换L-氨基酸残基,只要所述肽基本上保留所需的功能特性(例如免疫反应性)即可。所述肽的N’和C’任选地可以用本领域中已知的稳定化化学基团衍生,所述衍生基本上不影响所述肽的结构或构象,例如酰胺化、乙酰化、脂肪酸的偶联等。
本发明的实施方式还涵盖了通过所述序列的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的类似物肽,任选地包括使用化学衍生的残基取代未衍生的残基。这些类似物可以认为与对应于SEQ ID NO:1的肽等同,只要它们保留高的序列同源性(至少70%,通常为80%、90%或更高)并保留相应的免疫反应性(即在生理条件下与针对SEQ ID NO:1的抗体交叉反应)即可。
在某些实施方式中,本发明的试剂盒和测定法有利地合并了使用针对本文公开的SAA2片段的抗体。
在其他实施方式中,提供了一种产生针对本发明的SAA片段的抗体的方法,包括用所述肽免疫受试者(例如非人类动物)。所述肽可以以免疫原性偶联物的形式用于免疫,其中所述分离的肽与异源序列例如载体蛋白连接(例如通过直接共价键或通过接头)。
在其他实施方式中,本发明涉及所述分离的肽与异源部分(例如载体或标记物)的偶联物。在某些实施方式中,所述偶联物也可以以多聚体偶联物的形式提供,其包含直接或通过接头连接的所述肽的多个拷贝。然后可以从被免疫动物的血清分离抗体,例如直接获取,或将其通过本领域中已知的方法进一步分离。
另一方面,本发明涉及特异性针对SEQ ID NO:1的肽的抗体或其抗原结合部分。在各种不同实施方式中,所述抗体是如本文中描述的单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。在另一个实施方式中,所述抗体已通过包括用所述肽免疫和分离得到的抗体的方法产生。
产生单克隆和多克隆抗体的方法在本领域中是公知的。抗体可以通过几种已知方法中的任一种来产生,可以采用诱导体内产生抗体分子,免疫球蛋白文库的筛选,或通过连续细胞系在培养中产生单克隆抗体分子。这些方法包括但不限于杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术和Epstein-Barr病毒(EBV)杂交瘤技术。
在体内产生抗体时靶抗原过小而不能引发足够的免疫原性应答的情况下,可以将此类抗原(被称为“半抗原”)偶联到抗原中性的载体例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA))载体(参见例如美国专利号5,189,178和5,239,078)。获得的抗血清可以直接使用(例如作为稀释的血清或作为纯化的多克隆抗体),或者可以获得单克隆抗体,如本文所述。
单克隆抗体(mAb)是针对特定抗原的抗体的基本上均质的群体。当在本文中使用时,术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体(通常是完整的),即构成所述群体的各个抗体除了可能少量存在的可能自然发生的突变之外是一致的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原。此外,与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反,每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应被解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。mAb可以通过本领域技术人员已知的方法来获得。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法来制备,或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以从噬菌体抗体文库分离。参见例如美国专利4,376,110、Ausubel等(《分子生物学现代方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,第I-III卷,John Wiley&Sons,巴尔的摩,马里兰州,1994)。
抗体片段可以使用本领域中公知的方法来获得(参见例如Harlow,E.和Lane,D.,(1988),《抗体实验指南(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室,纽约)。例如,根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过编码所述片段的DNA在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养或其他蛋白质表达系统)中的表达来制备。
除了在体内产生抗体的常规方法之外,抗体可以在体外使用噬菌体展示技术来产生。用于噬菌体文库构建和重组抗体的选择的方案提供在公知的参考书《免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology》,Colligan等主编,John Wiley&Sons,Inc.(1992-2000),第17章17.1节)中。
另一方面,提供了一种分析受试者的尿液样品的方法,包括确定所述样品中SAA2基因产物的水平,并将所述水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,或与在先于从所述受试者获得尿液样品的时间的时间点从所述受试者获得的对照样品进行比较。在特定实施方式中,所述基因产物具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施方式中,所述方法还包括确定所述样品中至少一种另外的基因产物的水平,例如表1、4、5或6中阐述的一种或多种基因产物(例如SAA1和GUCA2B),并将它们的水平与在所述对照样品中的相应水平进行比较。
另一方面,提供了一种用于检测有需要的受试者中全身性炎症的方法,包括:
a.从所述受试者获得尿液样品,
b.确定所述样品中SAA2基因产物的水平,和
c.将所述水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,
其中所述一种或多种基因产物的水平与它们在健康对照受试者中的水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。在特定实施方式中,所述基因产物具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施方式中,所述方法还包括确定所述样品中至少一种另外的基因产物的水平,例如表1、4、5或6中阐述的一种或多种基因产物(例如SAA1和/或GUCA2B),并将它们的水平与在所述对照样品中的相应水平进行比较。
数据分析
在某些实施方式中,本发明的方法可以利用学习和模式识别分析器、聚类算法等,以便区分本文所公开的样品或受试者的蛋白质组学签名与对照蛋白质组学签名。例如,所述方法可以包括确定尿液样品中本文公开的至少三种基因产物的水平,并使用此类算法和/或分析器将得到的尿液蛋白质组学签名与健康对照的尿液蛋白质组学签名进行比较。
在某些实施方式中,可以使用一种或多种算法或计算机程序将尿液样品中定量的每种基因产物的量与预定截止值(或多个预定截止值)进行比较。或者,可以提供用于通过人手动执行必要步骤的一个或多个指令。
用于确定和比较尿液蛋白质组学签名的算法包括但不限于监督分类算法,其包括但不限于梯度提升树、随机森林、正则化回归、多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、判别函数分析(DFA)包括线性判别分析(LDA)、最近邻法、人工神经网络、多层感知器(MLP)、广义回归神经网络(GRNN)及其组合,或非监督聚类算法,其包括但不限于K-均值、谱聚类、层次聚类、高斯混合模型及其组合。在特定实施方式中,所述算法选自梯度提升树、随机森林、正则化回归及其组合。
许多算法是基于神经网络的算法。神经网络具有输入层、处理层和输出层。神经网络中的信息分布在整个处理层中。处理层由节点组成,这些节点通过与其节点的互连来模拟神经元。类似于揭示数据集合中的潜在模式的统计分析,神经网络基于预先确定的判据在数据集合中定位一致的模式。
在其他实施方式中,使用了主成分分析。主成分分析(PCA)涉及一种将多个相关变量转换为数量较少的不相关变量的数学技术。数量较少的不相关变量被称为主成分。第一主成分或特征向量尽可能多地解释数据的可变性,每个后续成分尽可能多地解释剩余的可变性。PCA的主要目标是降低数据集的维数并鉴定新的基础变量。
在另一个实施方式中,所述算法是分类器。一种类型的分类器通过使用来自于训练集的数据“训练”所述算法来创建,并使用测试集数据评估其性能。与本发明相结合使用的分类器的实例是判别分析、决策树分析、受试者工作曲线或拆分和评分分析。
术语“决策树”是指一种具有用于分类的流程图状树结构的分类器。决策树由将数据集重复拆分为子集组成。每个拆分由应用于一个变量的简单规则组成,例如,“如果“变量1”的值大于“阈值1”则向左,否则向右”。因此,给定的特征空间被分隔成一组矩形,每个矩形分配给一个类。
术语“测试集”或“未知”或“验证集”是指整个可用数据集的一个子集,其由未包含在训练集中的条目组成。测试数据用于评估分类器性能。
术语“训练集”或“已知集”或“参比集”是指相应的整个可用数据集的一个子集。该子集通常是随机选择的,并且仅用于分类器构建的目的。
提供下述实施例是为了更全面地说明本发明的某些实施方式。然而,它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
实施例1.用于检测重度全身性炎症的尿液生物标志物
A.患者和方法
患者特征
本研究包括总共76位成年参与者,包括56位患有急性感染的患者和作为对照组的20位健康志愿者。在感染患者中,25位被诊断为患有细菌感染,9为患者被确认病毒诊断,7位被标记为不确定病因,15位被排除在外)。排除判据包括白细胞尿(n=7),诊断为尿路感染(UTI;n=2),不发热患者(n=3)和具有非感染性病因的患者(n=3)。
被诊断为患有细菌感染的患者与病毒患者和对照相比年龄更大并且血脂异常的频率更高。患者组群在性别、BMI和既往高血压诊断方面是平衡的。
患者特征概述在下表2中。下表3中列出了患者的感染病因和临床诊断,以及确认诊断的测试的概述。
表2–患者特征概述
表3–患者诊断
样品制备
住院时从患者收集血液和尿液。立即分析常规化学,将血清和尿液的等分试样冷冻在-80℃。对于蛋白质组学分析来说,使用3kDa截留分子量滤器浓缩样品,然后进行溶液内胰蛋白酶消化,之后进行脱盐步骤。
液相色谱质谱(LC-MS)
使用与高分辨率、高质量准确度质谱(Fusion Lumos)偶联的纳流液相色谱(nanoAcquity)对得到的肽进行分析。在发现模式下以随机顺序分别分析每个样品。
数据处理
原始数据用MaxQuant v1.6.6.0处理。使用Andromeda搜索引擎针对附有常见实验室蛋白质污染物的人类蛋白质组数据库来搜索数据。定量基于无标记物定量(LFQ)方法,基于独特的肽来进行。
差异表达分析使用limma软件包来计算。基于多数规则处理缺失值。在三个平行样之一为零的情况下,它被处理为Na(即不包括在统计中),如果三个平行样中的两个为零,则将它更改为恒定的低值(即包括在统计中)。错误发现率(padj)使用Benjamini和Hochberg(BH)来进行。显著性是基于+/-2倍的变化和p.adj<0.05。
广范围C反应蛋白(wrCRP)测量通过ADVIA(Siemens Healthcare DiagnosticsInc.,塔里敦,NY 10591-5097USA)来进行。化学wrCRP法通过乳胶增强免疫比浊法测量血清和血浆中的CRP。
B.结果
对包括被诊断为患有细菌或病毒感染的受试者和无感染受试者在内的54位人类受试者(列于表3中)的尿液样品进行蛋白质组学分析。总的来说,在尿液样品中检测到1307种蛋白质。在对年龄和性别进行调整后,发现感染组(细菌和病毒)中的患者与健康对照组相比在170种蛋白质的尿液水平上存在差异。进一步测量了血液CRP水平,并将其用作参比生物标志物以评估全身性炎症的水平。
令人惊讶的是,鉴定到三种蛋白质能够区分以血液CRP>120mg/L为特征的患有重度(和可能危及生命的)全身性炎症的患者和其余受试者。图1A-1C示出了在两个组中这些蛋白质即鸟苷酸环化酶激活物2B、血清淀粉样蛋白A-1和血清淀粉样蛋白A-2各自的尿液水平的分布(单参数分析,呈现为以2为底的对数)。此外,使用R软件包glmnet,使用带有L1正则化的线性回归进行了多参数分析,并对正则化参数进行选择以最小化10倍交叉验证中的预测误差。所述分析揭示出这三种蛋白质的组合识别约75%的重度全身性炎症病例。
使用XGBOOST算法进行了多参数分析,以鉴定良好地区分患有重度全身性炎症的受试者和患有非重度炎症或没有炎症的受试者的尿液蛋白的其他组合。所述分析使用R软件包xgboost完成,树的深度为2,并使用留一法交叉验证来评估样本外预测误差。
所述分析揭示出能够以提高的准确度鉴定以血液CRP>120mg/L为特征的重度全身性炎症的蛋白质签名。这些蛋白质的详细情况提供在表4中。图2示出了每种尿液生物标志物在所述模型中的相对重要性。
表4–用于重度全身性炎症(血液CRP>120mg/L)的标志物
使用血液CRP>100mg/L的截止值作为参比标志物重复了所述分析。如表5中呈现的,鉴定了能够将该患者组与其余受试者区分开的蛋白质签名。图3示出了每种尿液生物标志物在所述模型中的相对重要性。
表5–用于重度全身性炎症(血液CRP>100mg/L)的标志物
因此,结果证实了以非侵入性方式鉴定需要医学干预的患有高等级全身性炎症的患者的能力。
实施例2.用于监测炎症状态的尿液蛋白质签名
使用Lasso算法测试了实施例1中在尿液中鉴定到的所有蛋白质构建与血清CRP水平表现出高度相关性的预测模型的能力。所述评估使用留一法交叉验证完成,其中将算法在除一个样品之外的所有样品上依次训练,并用于预测留出的样品。正则化参数使用第二个嵌套的10倍交叉验证来选择。
引人注目的是,鉴定到能够以0.8的相关性(R-平方0.64)正确预测在测试受试者中测量到的血清CRP水平的蛋白质签名。所述签名蛋白质的详细情况列于表6中。测量到的血液CRP水平与通过所述尿液生物标志物签名预测的血液CRP水平之间的相关曲线在图4中示出。
表6–用于监测炎性状态的标志物
结果证实了高度预测性模型的构建,能够不仅在高等级重症病例中,而且在表现出轻度和中度炎症体征的患者中评估全身性炎症的水平。因此,所述结果提供了全身性炎症水平变化的检测和监测,可用于例如疾病预后,用于早期鉴定处于发生疾病并发症的高风险下的受试者,和用于评估治疗效果。
实施例3.用于重度全身性炎症的其他尿液生物标志物
对380位个体的第二个组群进行了另一项研究,其中包括健康的人类对照受试者和患有各种不同炎症和感染性疾病的患者。由3或4名独立医师在审查数据后做出诊断(病毒或细菌感染)。使用倾向评分法来选择用于蛋白质组学分析的患者。在根据年龄、性别和估计的肾小球滤过率(eGFR)对各组进行最佳匹配后,病毒组和对照组中的受试者比细菌组的受试者年轻10-16岁。因此,制备了90个样品并使用基于质谱的蛋白质组学方法在发现模式下进行分析,其中基本上如实施例1中所述测量了1,879种蛋白质的水平。
患者特征概述在下表7中。患者的感染病因和临床诊断以及确认诊断所使用的测试的概述列于下表8中。
表7-患者特征的概述
表8-第二组群中的患者诊断
根据每组中具有可检测水平的每种蛋白质的样品的比例,选择检测比例差异最为显著的基因产物(在过滤掉LC-MS中小于3肽的蛋白质后)进行进一步分析。对于分析,使用了Lasso算法,正如在R软件包glmnet中实现的,使用了L-1惩罚(α=1)。使用交叉验证选择收缩参数(lambda)。
引人注目的是,这些蛋白质、即SRGN、IGLV3-12和ASGR1基因产物的蛋白质签名(下表9)能够区分以血液CRP>100mg/L为特征的患有重度全身性炎症的患者和其余受试者。正如可以在图5中看到的,所述签名能够鉴定所有血液CRP>100的患者,假阳性读数仅为5%。
表9–用于重度全身性炎症(血液CRP>100mg/L)的标志物
此外,图6呈现的决策树分析证实了使用表9中列出的基因产物对以血液CRP>100mg/L为特征的重度全身性炎症的检测。在图6中,每个拆分代表在节点下方的文本中描述的决策标准。每个节点的颜色代表符合此标准的血液CRP>100的患者的比例,从白色(重度全身性炎症)到深色(代表其余的测试受试者,在本文中也称为“轻度炎症”)。在每个框中,上方的文字表示这一叶中大多数人所处的位置(假—叶中的大多数人没有发炎,真—大多数人发炎)。小数点后两位数字分别代表节点内总群体中健康/轻度炎症(左侧)、或重度全身性炎症(右侧)的比例。最下方的数字代表落在这个节点中的总群体的比例。分支按等级来组织,因此越高越重要。
正如可以在图6中看到的,顶部的框描述了整个组群,其中78%的受试者血液CRP水平<100mg/L,22%的受试者血液CRP<100mg/L。第一叶标准是基于尿液不存在SRGN,其中左侧代表整个群体的75%没有可检测到的SRGN水平。在这个组中,95%的受试者属于轻度炎症组。另一方面(右侧)是具有可检测到的尿液SRGN的受试者,呈现出71%的机会患有重度全身性炎症。最后一叶在IGLV3-12或ASGR1的不存在的基础上分组。
正如可以看到的,尿液中这些基因产物即SRGN、IGLV3-12和ASGR1的存在与重度全身性炎症呈正相关。正如可以进一步看到的,从作为排名最高的参数SRGN开始使用尿液标志物进行的层次聚类,与基于血液CRP水平的分析高度相关。综上,所述结果证实,使用尿液标志物SRGN、IGLV3-12和ASGR1的决策树分析,可以以高准确度正确鉴定患者是否患有重度全身性炎症。
实施例4–用于监测炎症状态的其他蛋白质组学签名
将正则化回归(glmnet)应用于在实施例3中在尿液中鉴定到的所有蛋白质。为此,将血液CRP值针对尿液蛋白值进行Lasso回归,其中提高收缩参数直至保留一小部分蛋白质。
表10至14示出了如下文详述的被鉴定为能够以连续方式正确预测在测试受试者中测量到的血清CRP水平的基因产物签名的详细情况。还显示了每种标志物对预测的CRP水平的贡献的β系数。
具体来说,表10中列出的基因产物代表了12种基因产物的尿液签名,其在所有测试受试者中提供了与血液CRP的线性相关性(r=0.92)。
表10–用于获得和监测炎症状态的标志物
接下来,选择以血液CRP水平高于30mg/L为特征的患有全身性炎症的患者组用于进一步分析。表11和12中列出的基因产物分别代表了15和5种基因产物的尿液签名,其能够以高相关性正确预测这些患者中的血清CRP水平(分别为r=0.95和0.83)。因此,这些标志物对评估中度和重度全身性炎症特别有用。
表11–用于评估较高水平的全身性炎症的标志物
表12–用于评估较高水平的全身性炎症的标志物
此外,评估了基于标志物的存在或不存在而不是它们的量来预测炎症水平的能力。下表13和14分别代表了9和5种基因产物的尿液签名,它们能够使用这种方法以高相关性正确预测血清CRP水平(分别为r=0.94和0.8)。
表13–用于基于存在或不存在9种尿液标志物评估全身性炎症的签名
表14-用于基于存在或不存在5种尿液标志物评估全身性炎症的签名
基因 | 基因产物 | β系数 |
MATN4 | 母系蛋白-4 | -28.38477 |
LGALS1 | 半乳糖凝集素-1 | 9.659388 |
CRHBP | 促肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白 | 36.61007 |
DLK1 | Dleta蛋白质同源物1;胎儿抗原1 | -0.403149 |
MYOZ1 | Myozenin-1 | 5.738796 |
实施例5.新鉴定的SAA片段作为炎症的尿液标志物
进行了一系列实验以表征在尿液样品中鉴定的SAA1和SAA2基因产物的氨基酸序列。为此,对来自实施例3中描述的患者的尿液样品进行肽组学分析。将样品用截留分子量为10kDa的膜过滤,并收集低分子量级分。然后将它用C18柱脱盐并通过质谱进行分析。
出人意料的是,发现SAA1和SAA2两者均作为内源肽而不是完整蛋白存在于所述样品中。所述SAA1和SAA2片段的特征在于N'截短,其范围超出信号肽。
引人注目的是,所述肽之一即SAA2衍生肽GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1),与血液CRP水平表现出高相关性(0.78)。因此,这种独特的新鉴定的肽可以在本发明的实施方式中用作炎症标志物。
实施例6.在尿液中未鉴定到已知的血液标志物
基本上如实施例3中所述,进一步测量了健康受试者和患有各种不同感染的受试者的尿液样品中TRAIL、CXCL10(IP-10)和CRP的水平。对总共91个样品进行了靶向蛋白质组学实验:32个健康对照,59个来自患有炎性病症的患者(30名患有病毒感染,29名患有细菌感染)的样品。
在尿液样品中检测到与CRP对应的基因产物如下:32个对照样品中的14个(43.8%)、30个病毒样品中的26个(86.7%)和29个细菌样品中的28个(96.6%)含有CRP基因产物。与健康受试者相比在患有炎性病症的患者中尿CRP的丰度提高达到统计学显著性(卡方<0.001),但在将患有病毒感染的受试者与患有细菌感染的受试者相比时没有达到统计学显著性(卡方p=0.173)。当比较三个组中尿液CRP的水平时,在患有炎性病症的患者与健康对照之间鉴定到显著性差异(IQR中位数在对照中为0[0-1,771,063],在病毒感染中为6,191,530[1,742,375-14,390,560],在细菌感染中为15,081,115[2,886,969-47,985,575],p<0.001,Kruskal-Wallis H检验)。在对多重比较进行校正后,病毒与细菌患者之间的差异不保持显著性(p=0.011,用于病毒与对照之间比较的Mann-Whitney检验)。
形成鲜明对比的是,TRAIL和CXCL10基因产物两者在任何尿液样品中均未检测到。换句话说,尽管TRAIL或CXCL10基因产物在血液样品中、包括在患有各种不同感染的受试者中的报告丰度高,但在健康受试者或任一患者组的尿液中未能测量到它们。
因此,所述结果示例说明了在血液蛋白水平与它们的尿液对应物水平之间缺少通常观察到的相关性,包括迄今为止在血液中测量时建议或公认作为诊断生物标志物的那些血液蛋白。相比之下,与作为尿液生物标志物的用途相容的可检测且一致的水平,是本发明所选的基因产物和诊断签名的出人意料的特征。
上文具体实施方式的描述如此充分地揭示了本发明的一般性质,使得其他人可以通过应用当前知识,容易地修改和/或改编此类具体实施方式以适应于各种不同应用,而无需过度实验并且不背离一般性概念,并且因此,此类改编和修改应该并且旨在被理解为在所公开的实施方式的等同物的含义和范围之内。应当理解,本文使用的短语或术语是出于描述而非限制的目的。在不背离本发明的情况下,用于执行各种所公开的功能的装置、材料和步骤可以采用各种不同的替代形式。
序列表
<110> 伊契洛夫科技有限公司
耶达研究及发展有限公司
S·申哈尔-沙法提
S·A·伯利纳
O·罗戈夫斯基
E·费舍尔
A·西尔贝曼
Y·莱温
<120> 用于检测和监测全身性炎症的非侵入性测定法
<130> SMC/019 PCT
<150> 62/946438
<151> 2019-12-11
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic peptide
<400> 1
Gly Asn Tyr Asp Ala Ala Lys Arg Gly Pro Gly Gly Ala Trp
1 5 10
Claims (60)
1.一种检测至少两岁的人类受试者存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定所述受试者的尿液样品中选自SAA2、SAA1和GUCA2B基因产物的一种或多种基因产物的水平,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,
其中所述一种或多种基因产物的水平与其健康对照水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
2.权利要求1所述的方法,其中至少两种基因产物的水平与其相应的健康对照水平相比的显著提高,指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
3.权利要求2所述的方法,其中所述至少两种基因产物是SAA2和SAA1。
4.权利要求1所述的方法,其中SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平与其相应的健康对照水平相比的显著提高指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
5.权利要求1所述的方法,其中所述基因产物是SAA2基因产物。
6.权利要求5所述的方法,其中所述基因产物是具有氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQID NO:1)的肽。
7.权利要求1所述的方法,其中SAA1在所述样品中的水平与其在健康对照受试者中的水平相比提高至少50%指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法,其中确定所述基因产物的水平通过免疫测定法来进行。
9.权利要求8所述的方法,其中所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法,其中所述受试者患有感染。
11.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法,其中所述受试者患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。
12.权利要求11所述的方法,其还包括为被检测为患有重度全身性炎症的受试者提供治疗,其中所述治疗选自抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂和皮质类固醇。
13.权利要求1-12中的任一项所述的方法,其中所述受试者是成年人类。
14.一种制品,其包含用于特异性检测和/或确定尿液样品中至少三种基因产物的水平的装置,所述基因产物选自表1和4-6中列出的基因产物,或表9-14中的任一者。
15.权利要求14所述的制品,其中所述基因产物是表1、4、5、6和9-14中的至少一者中阐述的所有基因产物。
16.权利要求14或15所述的制品,其为试纸条(dipstick)、抗体阵列、抗体芯片或侧流测试的形式。
17.一种诊断试剂盒,其包含权利要求13-16中的任一项所述的制品。
18.权利要求17所述的试剂盒,其还包含用于收集所述尿液样品的容器和/或用于将所述样品中每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较的装置。
19.权利要求17所述的试剂盒,其中所述装置包括特异性针对所述基因产物的抗体。
20.权利要求17所述的试剂盒,其中所述基因产物包含选自SAA2、SAA1和GUCA2B的一种或多种基因产物。
21.权利要求20所述的试剂盒,其包含针对SEQ ID NO:1(GNYDAAKRGPGGAW)的SAA2基因产物的抗体。
22.氨基酸序列GNYDAAKRGPGGAW(SEQ ID NO:1)的分离的肽。
23.一种偶联物,其包含权利要求22所述的分离的肽和异源部分。
24.一种核酸分子,其编码权利要求22所述的分离的肽。
25.一种产生针对权利要求22所述的肽的抗体的方法,包括用所述肽免疫并分离得到的抗体。
26.一种检测有需要的受试者存在或不存在全身性炎症的方法,包括:
a.确定所述受试者的尿液样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的水平的相应值进行比较,从而获得与所述参比对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
27.权利要求26所述的方法,其中所述参比对照样品对应于健康对照受试者,并且与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。
28.权利要求26所述的方法,其中所述参比对照样品对应于健康对照受试者,并且以所述基因产物的水平与它们在所述对照样品中的水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有全身性炎症。
29.权利要求26所述的方法,其还包括确定所述受试者中全身性炎症的水平。
30.权利要求26或29所述的方法,其中所述炎症选自轻度、中度和重度。
31.权利要求29所述的方法,其中所述受试者的尿液样品是在第一时间点从所述受试者获得的第一尿液样品,并且所述参比对照样品是在先于从所述受试者获得所述第一尿液样品的时间的时间点从同一受试者获得的第二尿液样品,并且其中所述方法用于监测所述受试者的炎症状态的变化。
32.权利要求31所述的方法,其中以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的加重,并且以所述至少三种基因产物的水平与它们在先前时间点的相应水平相比显著降低为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者中全身性炎症的改善。
33.权利要求32所述的方法,其还包括调整为所述受试者提供的治疗,其中所述受试者中全身性炎症的加重指示了应该调整所述治疗。
34.权利要求30所述的方法,其还包括在所述确定的全身性炎症水平的基础上为所述受试者确定治疗。
35.权利要求34所述的方法,其还包括为所述受试者提供所述治疗。
36.权利要求33或35所述的方法,其中所述治疗选自抗生素药物、抗炎药物、免疫抑制剂和皮质类固醇。
37.权利要求26-36中的任一项所述的方法,其包括确定所述样品中选自表6和10-14中的任一者中列出的基因产物的至少五种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少五种基因产物的尿液蛋白质组学签名。
38.权利要求26-36中的任一项所述的方法,其中所述至少三种基因产物选自表6中列出的基因产物。
39.权利要求38所述的方法,其包括确定所述样品中表6中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
40.权利要求26-36中的任一项所述的方法,其中所述至少三种基因产物选自表10-14中的任一者中列出的基因产物。
41.权利要求40所述的方法,其包括确定所述样品中表10、表11、表12、表13或表14中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
42.权利要求26所述的方法,其中以SAA1、SAA2和GUCA2B基因产物的水平显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
43.一种检测存在或不存在重度全身性炎症的方法,包括:
a.确定受试者的尿液样品中选自表4、5和9中的任一者中列出的基因产物的至少三种基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在健康对照受试者中的尿液水平的相应值进行比较,从而获得与所述健康对照受试者的尿液蛋白质组学签名相比的所述受试者的尿液蛋白质组学签名。
44.权利要求43所述的方法,其中与所述健康对照的尿液蛋白质组学签名显著不同的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
45.权利要求43所述的方法,其中以所述基因产物的水平与它们的对照水平相比显著提高为特征的尿液蛋白质组学签名指示了所述受试者患有重度全身性炎症。
46.权利要求43所述的方法,其中所述炎症伴有血液CRP水平>100mg/L,并且所述基因产物选自表5或9中列出的基因产物。
47.权利要求46所述的方法,其包括确定所述样品中表9中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
48.权利要求45所述的方法,其包括确定所述样品中表5中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
49.权利要求43所述的方法,其中所述炎症伴有血液CRP水平>120mg/L,并且所述基因产物选自表4中列出的基因产物。
50.权利要求49所述的方法,其包括确定所述样品中表4中列出的所有基因产物的水平,从而获得所述受试者关于所述基因产物的尿液蛋白质组学签名。
51.一种分析尿液样品的方法,所述方法包括:
a.确定所述样品中选自表1的至少三种基因产物的水平,从而获得所述样品关于所述至少三种基因产物的尿液蛋白质组学签名,和
b.将每种基因产物的水平与对应于它在参比对照尿液样品中的尿液水平的相应值进行比较,从而获得与所述对照样品的尿液蛋白质组学签名相比的所述样品的尿液蛋白质组学签名。
52.根据权利要求26-51中的任一项所述的方法,其中步骤b.使用学习和模式识别算法来进行。
53.根据权利要求26-51中的任一项所述的方法,其中所述受试者是人类。
54.根据权利要求26-51中的任一项所述的方法,其中所述受试者是成年人类。
55.根据权利要求26-51中的任一项所述的方法,其中确定所述基因产物的水平用过免疫测定法来进行。
56.权利要求55所述的方法,其中所述免疫测定法选自试纸条、ELISA、抗体阵列、抗体芯片、侧流测试和多重珠免疫测定法。
57.根据权利要求26-51中的任一项所述的方法,其中所述受试者患有感染或患有选自自身免疫性疾病、风湿病、慢性炎性疾病和癌症的病症。
58.权利要求26-51中的任一项所述的方法,其还包括为被检测为患有所述炎症的所述受试者提供疾病预后和/或相应的治疗。
59.权利要求26或43中的任一项所述的方法,其中所述受试者已接受免疫刺激性治疗,并且所述方法用于评估细胞因子释放综合征(CRS)的存在或发病风险。
60.权利要求26或43中的任一项所述的方法,其中所述受试者已接受免疫抑制性治疗,并且所述方法用于确定治疗效果。
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