CN115089716A - Bmp4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用 - Google Patents

Bmp4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明公开BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，通过抑制BMP4的表达水平，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。本发明首次发现BMP4参与糖尿病心肌病的新作用，结果显示，BMP4在糖尿病模型动物中表达增加，增加的BMP4蛋白可诱导心肌细胞损伤和肥大，揭示其有可能为糖尿病心肌病的治疗靶点，并且经实验发现，BMPs受体抑制剂可逆转高糖诱导的心肌细胞损伤、肥大，以及抑制db/db小鼠的心肌损伤和肥厚，表明抑制BMP4表达的药物可用于对糖尿病心肌病疾病的治疗，为糖尿病心肌病治疗提供新的药物靶点。

Description

BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
背景技术
糖尿病心肌病是糖尿病患者罹患的一种特异性心肌疾病，是高血糖、氧化应激及代谢异常等多种原因导致的心肌细胞肥大、死亡和纤维化等心脏结构改变及心肌微血管病变，出现舒张及收缩功能损害，最终引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等。研究表明，糖尿病心肌病的死亡率是非糖尿病心脏疾病患者死亡率的2～3倍，有50％以上的糖尿病患者死于糖尿病心肌病。糖尿病心肌病的发病机制尚不十分清楚，而流行病学研究表明，糖尿病的发病率近年来逐渐增高，截至2040年，全球成年糖尿病患者将达到6.42亿。因此，深入研究糖尿病心肌病的发病机理、积极探索预防和治疗糖尿病心肌病的药物具有十分重要的意义。
骨成型蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4，BMP4)是骨成型蛋白(Bonemorphogenetic protein，BMPs)家族中的一员，是一种分泌蛋白，是多功能的生长因子，在骨、软骨、心血管系统等胚胎组织器官发育及成熟的组织器官中发挥重要生物学功能；它也是一种炎症因子，参与调控高血压、心肌肥厚、动脉粥样硬化及肺动脉高压等多种疾病。近年来，有研究表明BMP4参与糖尿病肾病、动脉粥样硬化等糖尿病血管并发症的发生。生理情况下，BMP4为β细胞分泌胰岛素所必需，尚可通过促进葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)作用改善糖耐量；肥胖时BMP4仍能提高全身胰岛素敏感性，增强脂肪细胞、骨骼肌和肝脏中的胰岛素信号转导，减少肝脏葡萄糖的生成。然而糖尿病时BMP4损伤血管的功能也已被证实。临床研究表明，BMP4血浆水平在糖耐量异常及T2D患者中明显升高；db/db小鼠(糖尿病模型小鼠)BMP4血浆及主动脉组织表达水平均明显增高，并介导NOX1依赖的eNOS解耦、内皮功能障碍等；BMP4参与糖尿病肾病的发生，肾小球系膜细胞和足细胞分泌的BMP4直接导致足细胞损伤，并与尿白蛋白排泄有关。然而BMP4与糖尿病的主要死亡原因糖尿病心肌病的相关性研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过抑制BMP4的表达水平，缓解糖尿病诱导的心肌细胞损伤、肥大和凋亡，从而发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
进一步地，通过抑制BMP4的表达水平，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
进一步地，通过抑制BMP4的表达水平，缓解糖尿病诱导的心肌细胞损伤和肥大，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
本发明还提供一种BMP4抑制剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
进一步地，利用所述BMP4抑制剂下调BMP4表达水平，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
本发明还提供一种用于治疗糖尿病心肌病的药物，包含BMP4抑制剂。
进一步地，所述BMP4抑制剂包括DMH1。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次发现BMP4参与糖尿病心肌病的新作用，实验结果显示，BMP4在糖尿病模型动物中表达增加，增加的BMP4蛋白可诱导心肌细胞损伤和肥大，揭示其有可能作为糖尿病心肌病的治疗靶点，进一步采用BMPs受体抑制剂DMH1作用于高糖诱导的心肌细胞及db/db糖尿病心肌病模型鼠，结果显示，BMPs受体抑制剂可逆转高糖诱导的心肌细胞损伤、肥大，以及抑制db/db小鼠的心肌损伤和肥厚，由此可见，抑制BMP4表达的药物可用于对糖尿病心肌病疾病的治疗，为糖尿病心肌病的预防或治疗提供新的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为db/m小鼠和db/db小鼠心脏组织病理变化HE染色结果；
图2为BMP4在db/db小鼠心脏组织中表达情况；
图3为高糖及BMP4诱导心肌细胞表达BMP4的情况；
图4为高糖环境下BMP4抑制心肌细胞活力的统计图；
图5为高糖环境下BMP4诱导心肌细胞中凋亡蛋白的表达情况；
图6为高糖环境下BMP4诱导心肌细胞面积增加的免疫荧光染色图及统计图；
图7为BMPs受体抑制剂DMH1逆转高糖诱导的细胞活力下降；
图8为BMPs受体抑制剂DMH1抑制高糖诱导的BMP4与细胞凋亡蛋白的表达情况。
图9为BMPs受体抑制剂DMH1抑制高糖诱导的心肌细胞面积增加的免疫荧光染色图及统计图；
图10为BMPs受体抑制剂DMH1改善db/db小鼠心脏组织病理变化HE染色图；
图11为BMPs受体抑制剂DMH1抑制db/db小鼠心脏BMP4蛋白表达及改善db/db小鼠心肌细胞凋亡作用；
图12为BMPs受体抑制剂DMH1抑制db/db小鼠心肌肥厚标志性基因mRNA表达结果；左图：ANP；右图：BNP。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用的材料、仪器及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。
实施例1糖尿病心肌病模型动物的心脏组织BMP4蛋白表达水平
1.1试验过程
1.1.1动物分组及组织收集
3周龄雄性db/db小鼠与其同周龄同性别对照组db/m小鼠(购买于常州卡文斯实验动物有限公司，每组10只)置于(22±2)℃、55％±10％湿度、12h明暗循环条件下普通饲料喂养饲养至8周龄后，腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉后，开胸取心脏组织，用预冷的PBS清洗心脏表面残血，剪取一部分心肌组织固定在4％的多聚甲醛固定液中，另一部分置于液氮中速冻后转置-80℃超低温冰箱保存，分别用于后续HE染色和Western Blotting等实验。对实验动物的所有操作均符合齐齐哈尔医学院伦理委员会要求，(齐)伦审[2021]143号，下同。
1.1.2石蜡切片HE染色
1.1.2.1石蜡切片脱蜡至水
依次将切片放入二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→二甲苯Ⅲ5min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→95％酒精5min→95％酒精5min→90％酒精5min→80％酒精5min→蒸馏水洗。
1.1.2.2苏木素染细胞核
切片入Harris苏木素染1-5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
1.1.2.3伊红染细胞质
切片入伊红染液中染色1-3min。
1.1.2.4脱水封片
将切片依次放入95％酒精Ⅰ3min→95％酒精Ⅱ3min→无水乙醇Ⅰ3min→无水乙醇Ⅱ3min，二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
1.1.2.5显微镜镜检，图像采集分析
1.1.2蛋白提取与浓度测定
从-80℃超低温冰箱中取出心脏组织，用眼科剪迅速剪取约5mm×5mm大小的组织块，放入1.5ml EP管中，加入约0.5ml蛋白裂解液(RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂＝100：1)，用组织匀浆器迅速研磨组织至其完全消失。冰浴静置裂解10min后40HZ超声3次，每次持续5s间隔3min。待超声完毕后13500rpm 4℃离心15min，将上清转移至另一EP管中，-80℃超低温冰箱保存。配置BSA标准品溶液(2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/μL)和BCA工作液(A液：B液＝50:1)。先后将200ul BCA工作液、1ul BSA标准品溶液和1ul组织蛋白溶液加入96孔板中，每个标准品或组织蛋白均设置复孔，轻轻震动96孔板混匀液体，放入37℃温箱中孵育20min。孵育结束后用酶标仪检测562nm处吸光度值，利用Excel软件制作标准曲线，根据后者计算各组蛋白浓度。整个提取过程在冰浴上迅速完成，所用试剂均经过预冷处理以防止蛋白降解。
1.1.3Western Blotting方法检测蛋白量
配制12.5％的丙烯酰胺凝胶。分别将上述提取的总蛋白(每组50μg)与5×Loadingbuffer按照4:1体积比充分混合，100℃水浴锅煮沸变性5min。于电泳槽上样泳道中加入等质量和等体积的各蛋白样品，并在空余泳道中加入预染蛋白marker标示。以70mV电压电泳30min使样品充分压缩后，将电压调整至110mV继续电泳约90min，使各分子量蛋白充分分离，停止电泳。将电泳好的SDS-PAGE，剪裁好的PVDF膜和滤纸放入预冷的转膜液中平衡10min，之后按负极→海绵→滤纸→胶→膜→滤纸→海绵→正极的顺序安放“转印三明治”，之后在预冷的转膜液中以300mA的电流转印60-90min分钟。去离子轻轻漂洗转印完毕的PVDF膜5min，将膜放入5％脱脂奶中室温摇床封闭2h，然后用PBS洗膜3次。根据目的蛋白分子量区间，分割PVDF膜，并分别加入不同目的蛋白一抗中(Anti-BMP4抗体：PBS＝1：200；Anti-GAPDH抗体：PBS＝1：1000)，4℃孵育过夜。孵育完毕后使用PBST清洗3次，每次5min。按1:10000的比例室温孵育荧光二抗60min，用PBST清洗4次，每次5min，整个过程需要避光。最后应用Odyssey红外荧光扫描成像系统对PVDF膜上蛋白进行成像及结果分析。
1.2实验结果
1.2.1心脏组织HE染色
有研究表明db/db小鼠(糖尿病模型鼠)5周龄开始出现糖尿病心肌病病理改变，我们以8周龄雄性db/db小鼠作为研究对象，利用HE染色法检测8周龄db/db小鼠以及对照组db/m小鼠的心脏组织病理变化情况。如图1所示，db/m小鼠心肌细胞排列整齐，未见肿胀，心肌纤维完整，染色均匀；与db/m小鼠相比，在db/db小鼠心肌出现区域性坏死，间质水肿，有炎性细胞和大量红细胞浸润，心肌纤维排列紊乱、肿胀、断裂，染色不均。说明8周龄db/db小鼠出现明显的糖尿病心肌病病理变化，可作为糖尿病心肌病动物模型。
1.2.2Western Blotting法检测db/db小鼠心脏组织BMP4蛋白
Western Blotting法分别检测8周龄雄性db/db小鼠以及对照组db/m小鼠的心脏组织中BMP4蛋白表达，结果显示：db/db小鼠中BMP4蛋白表达量均明显增加，与db/m对照组比较p<0.01(见图2，注：**p<0.01，与db/m比较，n＝4)。说明BMP4在糖尿病心肌病中表达升高，提示其可能参与糖尿病心肌病的发生。
实施例2高糖诱导心肌细胞表达BMP4蛋白的体外实验验证
2.1实验过程
2.1.1心肌细胞原代培养
取1～3d龄的C57BL/6小鼠乳鼠(齐齐哈尔医学院动物实验中心提供)，雌雄兼用。75％乙醇乳鼠体表消毒后，胸口朝上固定四肢，在超净台内无菌条件下快速断头开胸取出心脏，将心脏放入装有预冷的DMEM培养基的平皿内洗净残血，修剪掉心脏包膜后，反复冲冼心脏，并剪切至1mm3大小，将组织块转移到15mL离心管内，弃上清。向离心管内加入组织块体积2倍量的0.25％胰蛋白酶震荡消化(37℃)，弃掉第一次消化液，加入新的消化液反复消化，将每次消化所得细胞悬液移入含10％胎牛血清的DMEM培养液的EP管中，于4℃冰箱中保存。此步骤重复数次直至组织块完全消化完毕。合并所有细胞悬液，过200目不锈钢网过滤，收集滤液，以2500rpm离心3min，弃上清，将细胞沉淀重悬于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，均匀接种于25cm培养瓶中。37℃正常培养90min，待成纤维细胞贴壁后，用吸管吸取细胞悬液轻轻吹打培养瓶底面，将心肌细胞收集完全后，加入青链霉素混合液(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)、0.1mol/L的BrdU(抑制非心肌细胞的增殖)。将细胞悬液(心肌细胞)混匀后，平均体积，转分别移至新瓶中，在37℃5％CO2培养箱中正常培养，48h后更换新鲜的培养液继续培养至次日，进行实验。
2.1.2分组与造模
将上述原代培养的C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞(Neonatal mousecardiomyocytes，NMCM)随机分为正常浓度葡萄糖组(Normal glucose，NG)、高浓度葡萄糖组(High glucose，HG)及HG+BMP4组。心肌细胞分别在含正常浓度葡萄糖(5.5mM)、高浓度葡萄糖(33mM，为糖尿病心肌病体外细胞模型常用方法)和含HG+BMP4的DMEM培养基(含10％胎牛血清)中进行培养(下同)，HG+BMP4组BMP4浓度为50ng/mL，培养48h。培养结束后弃掉培养基，并用PBS冲洗细胞3次(排除培养基中的BMP4对结果的影响)，用移液器将培养瓶中残余的PBS液体吸净排除，加入RIPA裂解液(50μL～100μL)后用细胞刮刀边裂解边收集细胞，将细胞裂解液移至1.5mL EP管中，分别进行超声裂解、提取蛋白、蛋白浓度检测、WesternBlotting法检测心肌细胞BMP4蛋白表达情况，方法同1.1.3。
2.2实验结果
HG组及HG+BMP4组心肌细胞BMP4蛋白表达较NG组均明显增高；HG+BMP4组较HG组心肌细胞BMP4蛋白表达进一步增加。说明，HG可诱导心肌细胞BMP4蛋白表达，且在HG环境下，BMP4诱导心肌细胞表达BMP4蛋白，即BMP4诱导自身表达(见图3，注：NG：正常浓度葡萄糖组；HG：高浓度葡萄糖组；HG+BMP4：BMP4处理组；**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。提示糖尿病时血糖增高可引起BMP4表达增加；同时，如果BMP4在糖尿病心肌病发病中发挥作用，则该作用存在正反馈调节。
实施例3 BMP4在高糖环境下对心肌细胞的影响
3.1 BMP4在高糖环境下诱导心肌细胞损伤
3.1.1实验过程
3.1.1.1 MTT法检测心肌细胞活力
C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞原代培养(方法同2.1.1)。以5000个/孔的密度均匀接种心肌细胞于96孔板中，培养48h后更换培养基,次日，将心肌细胞随机分为NG组、HG组及HG+BMP4组，并给与相应的处理，葡萄糖浓度及BMP4浓度同2.1.2，培养基每隔24h更换一次，共培养48h。培养结束后，更换含为0.5mg·mL-1的MTT的无血清培养基于37℃、5％CO2条件下避光继续培养4h。培养结束后弃掉培养基、PBS漂洗一次,每孔加入DMSO 150μL,室温避光孵育15min,待结晶充分溶解后,用酶标仪读取各孔在570nm波长下的光吸收值。细胞活力计算公式为：处理组OD/对照组OD×100％。
3.1.1.2 Western Blotting方法检测凋亡蛋白量
原代培养C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞(方法同2.1.1)，随机分组、葡萄糖及BMP4浓度、细胞培养时间同2.1.2。培养结束后收集细胞、超声裂解、提取蛋白、蛋白浓度检测、Western Blotting法检测心肌细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达情况，Anti-Cleaved-Caspase-3抗体1：1000；Anti-GAPDH抗体1：1000)，方法同1.1.3。
3.1.2实验结果
MTT法结果显示，在HG(33mM)环境下，BMP4明显抑制心肌细胞活力，与HG组比较均p<0.01(见图4，注：NG：正常浓度葡萄糖组；HG：高浓度葡萄糖组；HG+BMP4：BMP4处理组；**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。Western Blotting检测结果显示，在HG(33mM)环境下，BMP4诱导凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达，与HG组比较均p<0.01(见图5，注：NG：正常浓度葡萄糖组；HG：高浓度葡萄糖组；HG+BMP4：BMP4处理组；*p<0.05，**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。提示在高糖环境下，BMP4可诱导心肌细胞损伤。
3.2 BMP4在HG环境下诱导心肌细胞肥大
3.2.1实验过程
原代C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞(方法同2.1.1)接种于铺有盖玻片的六孔板中进行培养，随机分组、葡萄糖及BMP4浓度、细胞培养时间同2.1.2。培养结束后弃去六孔板中的培养基，PBS缓冲液洗涤5次。随后用每孔中加入1ml左右4％多聚甲醛，室温固定15min。之后PBS洗5次，室温下使用含1％BSA，0.4％TritonX-100的PBS缓冲液穿透。1h后PBS洗5次，每孔中加入1ml山羊血清于37℃封闭30min。再次用PBS洗5次，向细胞中加入一抗(Anti-α-actinin,1:200)4℃孵育过夜。次日，PBS洗5次后，加入二抗(Dylight 594，1:200),并于37℃避光孵育1h，PBS洗5次，向细胞中加入DAPI(1:50)，最后PBS洗5次，洗去未结合染料。荧光显微镜下随机挑选视野拍照保存，并采用Image-Pro Plus Version(5.0.1)软件勾画出心肌细胞表面积，同时使用任意单位读取细胞相对面积，进而评估心肌细胞肥大程度。
3.2.2实验结果
细胞骨架蛋白α-actinin免疫荧光法染色检测心肌细胞面积结果发现BMP4使原代培养的NMCM细胞面积进一步增加，与HG组比较p<0.01(见图6，注：NG：正常浓度葡萄糖组；HG：高浓度葡萄糖组；HG+BMP4：BMP4处理组；**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。说明在HG情况下，BMP4具有诱导心肌细胞肥大的特性。
实施例4BMPs受体抑制剂DMH1对高糖诱导的心肌细胞的影响
4.1 DMH1逆转HG诱导的心肌细胞损伤
4.1.1实验过程
4.1.1.1 MTT法检测心肌细胞活力
原代培养C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞(方法同2.1.1)，以5000个/孔的密度均匀接种心肌细胞于96孔板中，培养48h后更换培养基,次日，将心肌细胞随机分为NG组、HG组、HG+DMH1组及NG+DMH1组，DMH1的给药浓度为10μM，葡萄糖浓度、细胞培养时间及MTT实验步骤、方法同3.1.1.1，根据测得光吸收值计算各组细胞活力。
4.1.1.2 Western Blotting方法检测凋亡蛋白量
原代心肌细胞培养(方法同2.1.1)，心肌细胞随机分为NG组、HG组、HG+DMH1组及NG+DMH1组，DMH1的给药浓度为10μM，葡萄糖浓度、细胞培养时间、Western Blotting方法同3.1.1.2，检测各组心肌细胞BMP4表达、凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达情况。
4.1.2实验结果
MTT法结果显示，DMH1可显著逆转HG(33mM)引起的心肌细胞活力降低，与HG组比较均p<0.01，在NG环境下DMH1对心肌细胞活力无明显影响(见图7，注：NG：正常浓度葡萄糖；HG：高浓度葡萄糖；DMH1：DMH1处理组；**p<0.01，与NG比较；#p<0.05，与HG组比较)。
Western Blotting法检测心肌细胞BMP4表达和凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达结果显示，DMH1可显著抑制HG诱导的BMP4与凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达，与HG组比较均p<0.01,在NG环境下DMH1对心肌细胞BMP4与Cleaved-Caspase-3表达无明显影响(见图8，注：NG：正常浓度葡萄糖；HG：高浓度葡萄糖；DMH1：DMH1处理组；*p<0.05，**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。说明BMP4抑制剂DMH1可逆转HG诱导的心肌细胞损伤，对高糖诱导的心肌细胞损伤具有明显的治疗效果。
4.2 DMH1逆转HG诱导的心肌细胞肥大
4.2.1实验过程
原代心肌细胞培养(方法同2.1.1)，心肌细胞随机分为NG组、HG组、HG+DMH1组及NG+DMH1组，给药浓度、培养时间同4.1.1.1，细胞骨架蛋白α-actinin免疫荧光法染色及面积计算方法同3.2.1，检测不同组别心肌细胞面积差异。
4.2.2实验结果
细胞骨架蛋白α-actinin免疫荧光法染色检测心肌细胞面积结果发现DMH1显著抑制HG诱导的NMCM细胞面积增加，与HG组比较p<0.01，在NG环境下DMH1对心肌细胞面积无显著影响(见图9，注：NG：正常浓度葡萄糖；HG：高浓度葡萄糖；DMH1：DMH1处理组；**p<0.01，与NG比较；##p<0.01，与HG组比较)。说明BMP4抑制剂DMH1具有逆转HG诱导心肌细胞肥大的特性。
实施例5BMP4抑制剂DMH1对db/db小鼠心脏组织相关蛋白、mRNA表达的影响
5.1实验过程
5.1.1动物分组、取材、HE染色及Western Blotting实验
3周龄雄性db/db小鼠与其同周龄同性别对照组db/m小鼠(购买于常州卡文斯实验动物有限公司)置于(22±2)℃、55％±10％湿度、12h明暗循环条件下适应性饲养一周后，随机选择db/m小鼠10只作为对照组，20只db/db小鼠随机分为db/db及db/db+DMH1组。db/db+DMH1组每日腹腔注射2mg/kg的DMH1，其余两组腹腔注射等量的12.5％的2-羟丙基-Β-环糊精(根据参考文献确定为DMH1的溶剂)，连续给药4w。治疗结束后麻醉后收集心脏组织等(方法同1.1.1)，并进行HE染色、Western Blotting实验(方法同1.1.3)。
5.1.2 Real-Time PCR检测mRNA表达
5.1.2.1 TRIzol法提取细胞/组织总RNA
从液氮中迅速取出组织置于EP管中，加入1ml TRIzol反复研磨直至组织块消失。按每1ml TRIzol加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒后室温静置3min。之后13500rpm离心15min，小心吸取上层水相500ul转移到新的EP管中，并向管内加入500ul的异丙醇，反复混匀数次后室温放置10min。13500rpm离心10min后可见RNA呈羽毛状附着于管底。倒掉上清，加入75％用DEPC水配制的乙醇溶液洗涤沉淀。10600rpm离心5min后，将RNA放空气中干燥。待RNA干燥后加入DEPC水溶解RNA，置于冰上备用。
5.1.2.2 RT-PCR
NANO drop 8000测RNA样品浓度及纯度，取0.5ugRNA并按ABI逆转录试剂盒操作说明将RNA样品与dNTP、逆转录酶、buffer及随机引物混合，置于逆转录仪中。PCR反应条件为：25℃/10min，37℃/2h，85℃/5min，在温度降至4℃后，停止运行。
5.1.2.3 Real-Time PCR
取1ul扩增好的cDNA样品用于Real-Time PCR检测靶基因mRNA的表达。实验步骤参照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒操作说明。PCR反应条件为：95℃变性10min后，95℃/15s,60℃/30s，72℃/30s；反应共40个循环。相对mRNA表达以2-△△Ct表示，其中△△Ct＝(Ct目的-Ct内参)实验组-(Ct目的-Ct内参)对照组。待测靶基因及内参引物序列见表1。
表1.Real-time PCR引物序列
Figure BDA0003741453710000161
5.1实验结果
5.1.1心脏组织HE染色
如图10所示，db/m小鼠心肌细胞排列整齐，未见肿胀，心肌纤维完整，染色均匀；与db/m小鼠相比，在db/db小鼠心肌出现区域性坏死，间质水肿，有炎性细胞和大量红细胞浸润，心肌纤维排列紊乱、肿胀、断裂，染色不均。DMH1组心肌细胞排列相对整齐，心肌纤维较为完整，水肿较轻，间质轻度水肿，炎性细胞浸润较模型组明显减少。
5.1.2 BMP4蛋白表达和凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达
Western Blotting法结果显示，db/db组小鼠心脏组织BMP4蛋白与凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达与db/m组比较均明显增加，p<0.01，说明db/db组小鼠心脏发生凋亡，损伤；db/db+DMH1组小鼠心脏组织BMP4蛋白与凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达与db/db组比较均明显降低，p<0.01(见图11，注：*p<0.05，**p<0.01，与db/m组比较；##p<0.01，与db/db组比较)，说明DMH1可显著抑制db/db小鼠心脏组织BMP4与凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达，提示BMP4抑制剂DMH1对糖尿病心肌细胞损伤具有明显的改善作用。
5.1.2 DMH1对心肌肥厚基因mRNA表达的影响
Real-time PCR结果显示，db/db组小鼠心脏组织肥厚标志性基因ANP、BNP基因mRNA表达与db/m组比较均明显增加，p<0.01，说明db/db组小鼠发生心肌肥厚；db/db+DMH1组心脏组织ANP、BNP基因mRNA表达与db/db组比较均明显降低，p<0.01(见图12，注：**p<0.01，与db/m组比较；##p<0.01，与db/db组比较)，说明DMH1可显著抑制db/db小鼠心肌肥厚的发生，提示BMP4抑制剂DMH1对糖尿病心肌病心肌肥厚有显著改善作用。
结合实施例1-5可知，BMP4在糖尿病模型动物中表达增加，增加的BMP4蛋白可诱导心肌细胞损伤和肥大，BMPs受体抑制剂DMH1可逆转HG诱导的心肌细胞损伤与心肌肥大以及db/db小鼠心脏损伤与肥厚，说明BMP4参与糖尿病心肌病发病的发生，是糖尿病心肌发生的重要机制，抑制BMP4表达可缓解糖尿病心肌病，揭示其可作为预防或治疗糖尿病心肌病的药物靶点。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.BMP4作为作用靶点在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制BMP4的表达水平，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过抑制BMP4的表达水平，缓解糖尿病诱导的心肌细胞损伤和肥大，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
4.一种BMP4抑制剂在制备治疗糖尿病心肌病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用所述BMP4抑制剂下调BMP4表达水平，发挥治疗糖尿病心肌病的作用。
6.一种用于治疗糖尿病心肌病的药物，其特征在于，包含BMP4抑制剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述BMP4抑制剂包括DMH1。
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