CN115087749A - 用于通过分析循环肿瘤dna进行分子疾病评定的方法和系统 - Google Patents

用于通过分析循环肿瘤dna进行分子疾病评定的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本公开提供了评定受试者的肿瘤状态(例如，进展、消退、复发等)的方法。在一方面，一种用于评定受试者的肿瘤状态(例如，进展、消退、复发等)的方法可以包括：基于受试者在不同时间点的cfDNA分子的第一WGS数据和第二WGS数据，确定(i)第一多个CNA和第二多个CNA以及(ii)第一多个片段长度和第二多个片段长度；处理所述第一多个CNA和所述第二多个CNA以确定CNA谱变化；比较所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度以确定片段长度谱变化；至少部分地基于所述CNA谱变化和所述片段长度谱变化，确定所述受试者在第一时间点或第二时间点的第一肿瘤分数或第二肿瘤分数；以及至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。

Description

用于通过分析循环肿瘤DNA进行分子疾病评定的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月24日提交的美国临时专利申请第62/953,368号和2020年3月23日提交的第62/993,564号的优先权益，这些临时申请的内容通过引用方式并入本文。
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以下提交的以ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：197102004840SEQLIST.TXT，记录日期：2020年12月18日，大小：34KB)。
背景技术
肿瘤进展通常可以指在患有癌症的受试者(例如，患者)中，具有严重性进展的肿瘤的情况(例如，肿瘤负荷、肿瘤大小、癌症阶段)。例如，患者的肿瘤进展可能表明患者的肿瘤对癌症的治疗方案没有应答。另一方面，患者的肿瘤未进展可能表明患者的肿瘤对癌症的治疗方案有应答。此外，患者的肿瘤进展或肿瘤未进展状态可以指示受试者对癌症治疗的预后。
发明内容
提供了用于通过分析受试者的体液样品(例如，血液样品)来评定受试者(诸如患有癌症的患者)的肿瘤状态(例如，进展、消退、复发等)的方法和系统。可以通过分析来自受试者样品的肿瘤DNA(例如，来自细胞游离DNA)来评定和/或监测肿瘤进展或肿瘤未进展。受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展状态可以指示患有癌症的受试者的诊断、预后或治疗选择。
在一个方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；处理第一WGS数据以确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；处理第二WGS数据以确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；处理第一多个CNA与第二多个CNA以确定CNA谱变化；处理第一多个片段长度与第二多个片段长度以确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在一个方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定，(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据确定，(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一个方面，本公开提供一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定，(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据确定，(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)；以及，基于检测到的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗(例如，手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂)来治疗受试者的癌症。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态包括肿瘤进展，并且该方法包括向患者施用第二治疗，其中在施用之前，患者已经使用针对癌症的第一治疗进行治疗(并且第一和第二治疗是不同的)。
在一些实施例中，第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。在一些实施例中，获得第一WGS数据包括对第一多个cfDNA分子进行测序以产生第一多个测序读数，或其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行测序以产生第二多个测序读数。在一些实施例中，测序是通过纳米孔测序、链终止(Sanger)测序、合成测序(例如，Illumina或Solexa测序)、单分子实时测序、大规模平行测序技术、Polony测序、454焦磷酸测序、联合探针锚定聚合、连接测序(SOLiD测序)或GenapSys测序。在一些实施例中，测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)、全基因组酶促甲基测序、全外显子组测序、全表观基因组测序、甲基化阵列、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Tet辅助亚硫酸氢盐测序(TAB-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、沉降或甲基化DNA免疫沉淀测序或胞嘧啶5-羟甲基化测序(例如，经由Bluestar)。
在一些实施例中，测序在不超过约40X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约30X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约25X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约20X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约12X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约10X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约8X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约6X的深度进行。在一些实施例中，测序在不超过约5X、不超过约4X、不超过约3X、不超过约2X或不超过约1X的深度进行。
在一些实施例中，该方法进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。在一些实施例中，该方法进一步包括针对多个基因组区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，富集包括扩增第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，扩增包括选择性扩增。在一些实施例中，扩增包括通用性扩增。在一些实施例中，富集包括选择性分离至少一部分的第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，选择性地分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分包括使用多个探针，多个探针中的每一个与多个基因组区域的基因组区域的至少一部分具有序列互补性。在一些实施例中，该部分至少包括肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，该部分至少包括多个肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个具有拷贝数改变的基因座(例如，CNA基因座，诸如MET、EGFR和BRCA2，以及染色体1和8中的整臂CNA)。使用癌症基因组图谱(TCGA)和癌症体细胞突变目录(COSMIC)等数据库可以找到此类CNA基因座。
在一些实施例中，确定第一多个CNA包括确定在第一多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度，并且其中确定第二多个CNA包括确定在第二多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度。在一些实施例中，该方法进一步包括针对GC含量和/或可映射性偏差校正第一多个CNA或第二多个CNA。在一些实施例中，校正包括使用统计建模分析。在一些实施例中，校正包括使用LOESS回归或贝叶斯模型。在一些实施例中，多个基因组区域包括参考基因组的具有预定大小的非重叠基因组区域。在一些实施例中，预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
在一些实施例中，多个基因组区域包括至少约1,000个不同的基因组区域。在一些实施例中，多个基因组区域包括至少约2,000个不同的基因组区域。在一些实施例中，多个基因组区域包括至少约3,000个不同的基因组区域、至少约4,000个不同的基因组区域、至少约5,000个不同的基因组区域、至少约6,000个不同的基因组区域、至少约7,000个不同的基因组区域、至少约8,000个不同的基因组区域、至少约9,000个不同的基因组区域、至少约10,000个不同的基因组区域、至少约15,000个不同的基因组区域、至少约20,000个不同的基因组区域、至少约25,000个不同的基因组区域、至少约30,000个不同的基因组区域、至少约35,000个不同的基因组区域、至少约40,000个不同的基因组区域、至少约45,000个不同的基因组区域、至少约50,000个不同的基因组区域、至少约100,000个不同的基因组区域、至少约150,000个不同的基因组区域、至少约200,000个不同的基因组区域、至少约250,000个不同的基因组区域、至少约300,000个不同的基因组区域、至少约400,000个不同的基因组区域或至少约500,000个不同的基因组区域。
在一些实施例中，确定CNA谱变化包括处理具有多个参考CNA值的第一多个CNA和第二多个CNA，其中多个参考CNA值从另外的cfDNA分子获得，该另外的cfDNA分子从另外的受试者的另外的体液样品获得或衍生。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名未患有癌症的受试者(例如，未受癌症影响的受试者或未诊断出癌症的受试者)。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名不具有肿瘤进展的受试者。在一些实施例中，使用在第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的受试者的另外的体液样品获得多个参考CNA值。
在一些实施例中，该方法进一步包括过滤掉满足预定标准的第一多个CNA和第二多个CNA的子集。在一些实施例中，当给定CNA值和对应的参考CNA值之间的差值包括不超过约1个标准偏差的差值时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。在一些实施例中，该方法进一步包括当给定CNA值和对应的参考CNA值之间的差值包括不超过约2个标准偏差的差值时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。在一些实施例中，该方法进一步包括当给定CNA值和对应的参考CNA值之间的差值包括不超过约3个标准偏差的差值时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。在一些实施例中，该方法进一步包括基于给定CNA值与对应的局部平均片段长度或局部平均甲基化之间的Spearman秩相关性过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。在一些实施例中，该方法进一步包括当Spearman秩相关系数(Spearman's rho)小于-0.1时(例如，指示局部平均片段长度与局部肿瘤拷贝数不存在显著负相关)时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。这也可以通过Pearson相关性或某种其他相关性统计来确定，以确定CAN与片段长度或甲基化之间是否存在负相关。
在一些实施例中，该方法进一步包括基于文库或基因组位置将第一多个片段长度或第二多个片段长度归一化。在一些实施例中，该方法进一步包括肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)，肿瘤状态包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时受试者的肿瘤进展。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时检测受试者的主要分子学应答(MMR)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.50、至少约0.55，至少约0.60、至少约0.65、至少约0.70、至少约0.75、至少约0.80、至少约0.85、至少约0.90、至少约0.91、至少约0.92、至少约0.93或至少约0.94的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.95、至少约0.96、至少约0.97或至少约0.98的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.99的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。在一些实施例中，该方法进一步包括，基于受试者的经确定的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)，施用治疗有效剂量的治疗以治疗受试者的癌症。在一些实施例中，该治疗包括用手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂治疗。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。在一些实施例中，第一和第二WGS数据通过测序装置或计算机处理器(例如，包括用于基于本公开的方法执行指令的一个或多个程序)获得。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的计算机系统，该计算机系统包括：数据库，其被配置成存储(i)第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前，和(ii)第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；和可操作地耦合至数据库的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器单独或共同地编程为：处理第一WGS数据以确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；处理第二WGS数据以确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；处理第一多个CNA与第二多个CNA以确定CNA谱变化；处理第一多个片段长度与第二多个片段长度以确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；并且至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的计算机系统，该计算机系统包括：数据库，其被配置成存储(i)第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前，和(ii)第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；和可操作地耦合至数据库的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器单独或共同地编程为：基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；并且至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
在另一方面，本公开提供一种包括机器可执行指令的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，执行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；处理第一WGS数据以确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；处理第二WGS数据以确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；处理第一多个CNA与第二多个CNA以确定CNA谱变化；处理第一多个片段长度与第二多个片段长度以确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种包括机器可执行指令的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，执行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定，(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据确定，(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前；处理第一MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；处理第二MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；处理跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数图谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。在一些实施例中，可以在第二时间点之后的另外的时间点采集并分析，以检测在后续时间发生的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数图谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。在一些实施例中，可以在第二时间点之后的另外的时间点采集并分析，以检测在后续时间发生的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数图谱；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态；以及，基于检测到的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗(例如，手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂)来治疗受试者的癌症。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态包括肿瘤进展，并且该方法包括向患者施用第二治疗，其中在施用之前，患者已经使用针对癌症的第一治疗进行治疗(并且第一和第二治疗是不同的)。
在一些实施例中，第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。在一些实施例中，获得第一MS数据包括对第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。在一些实施例中，甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。在一些实施例中，甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。在一些实施例中，甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫共沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
在一些实施例中，甲基化测序在不超过约40X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约30X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约25X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约20X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约12X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约10X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约8X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约6X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约5X、不超过约4X、不超过约3X、不超过约2X或不超过约1X的深度进行。
在一些实施例中，该方法进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组(例如，同时与参考基因组的C-to-T转换版本)比对，从而产生多个经比对的测序读数。在一些实施例中，该方法进一步包括富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的基因组的区域。在一些实施例中，富集包括扩增第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，扩增包括选择性扩增。在一些实施例中，扩增包括通用性扩增。在一些实施例中，富集包括选择性分离至少一部分的第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，选择性分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分包括使用多个探针，多个探针中的每一个与基因组的区域的至少一部分具有序列互补性。在一些实施例中，该部分至少包括肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，该部分至少包括多个肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(TCGA)或癌症体细胞突变目录(COSMIC)的基因座。
在一些实施例中，基因组的区域包括以下一个或多个：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。在一些实施例中，基因组的区域包括基因组的多个非重叠区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域具有预定大小。在一些实施例中，预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。在一些实施例中，基因组的区域包括一个或多个MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因，例如人MAGE基因。在一些实施例中，基因组的区域包括对应于一个或多个MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因，例如人MAGE基因的一个或多个启动子。
在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约1,000个不同区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约2,000个不同区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约3,000个不同区域、至少约4,000个不同区域、至少约5,000个不同区域、至少约6,000个不同区域、至少约7,000个不同区域，至少约8,000个不同区域，至少约9,000个不同区域、至少约10,000个不同区域、至少约15,000个不同区域、至少约20,000个不同区域、至少约25,000个不同区域、至少约30,000个不同区域、至少至少约35,000个不同区域、至少约40,000个不同区域、至少约45,000个不同区域、至少约50,000个不同区域、至少约100,000个不同区域、至少约150,000个不同区域、至少约200,000个不同区域、至少约250,000个不同区域、至少约300,000个不同区域、至少约400,000个不同区域或至少约500,000个不同区域。
在一些实施例中，确定第一肿瘤分数或第二肿瘤分数包括用一个或多个参考甲基化分数谱处理甲基化分数谱，其中该一个或多个参考甲基化分数谱从另外的cfDNA分子获得，该另外的cfDNA分子从另外的受试者的另外的体液样品获得或衍生。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名患有癌症的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名未患有癌症的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名具有肿瘤进展的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名不具有肿瘤进展的受试者。在一些实施例中，使用在第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的受试者的另外的体液样品获得一个或多个参考甲基化分数谱。
在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时检测受试者的包括肿瘤进展的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时检测受试者的主要分子学应答(MMR)。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数统计学上显著大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时检测受试者的肿瘤进展。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数统计学上显著小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时检测受试者的主要分子学应答(MMR)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.50、至少约0.55，至少约0.60、至少约0.65、至少约0.70、至少约0.75、至少约0.80、至少约0.85、至少约0.90、至少约0.91、至少约0.92、至少约0.93或至少约0.94的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.95、至少约0.96、至少约0.97或至少约0.98的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.99的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。在一些实施例中，该方法进一步包括，基于受试者的经确定的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗受试者的癌症。在一些实施例中，第二治疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂。在一些实施例中，第一和第二多个cfDNA分子来自受试者的免疫细胞。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。在一些实施例中，第一和第二MS数据通过测序装置或计算机处理器(例如，包括用于基于本公开的方法执行指令的一个或多个程序)获得。
在根据本文描述的任何实施例的一些实施例中，受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的计算机系统，该计算机系统包括：数据库，其被配置成存储(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前，和(ii)跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在向受试者施用治疗法之后；和可操作地耦合至数据库的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器单独或共同地编程为：处理第一MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；处理第二MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；处理跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应的甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；并且至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的计算机系统，该计算机系统包括：数据库，其被配置成存储(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前，和(ii)跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；和可操作地耦合至数据库的一个或多个计算机处理器，其中一个或多个计算机处理器单独或共同地编程为：基于第一MS数据，确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；基于第二MS数据，确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行对比以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应的甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；并且至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
在另一方面，本公开提供一种包括机器可执行指令的非暂时性计算机可读介质，该指令在由一个或多个计算机处理器执行时，执行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前；处理第一MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；处理第二MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；处理跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数图谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种包括机器可执行指令的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，执行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数图谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数检测受试者的肿瘤状态。
在一些实施例中，检测到的肿瘤进展至少部分地基于各自甲基化分数谱的一种或多种统计建模分析。在一些实施例中，一种或多种统计建模分析包括线性回归、简单回归、二元回归、贝叶斯线性回归、贝叶斯模型、多项式回归、高斯过程回归、高斯模型、逻辑回归或非线性回归。在一些实施例中，一种或多种统计建模分析将检测到的肿瘤进展与衍生自具有已知肿瘤分数的样品的MS数据、衍生自纯肿瘤样品的MS数据或衍生自健康样品的MS数据进行比较。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用被配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一MS数据，确定基因组的一个或多个基因座(例如，基因组区域中的一个或多个CpG岛或非CpG甲基化基因座)中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二MS数据，确定基因组的一个或多个基因座(例如，基因组区域中的一个或多个CpG岛或非CpG甲基化基因座)中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱和跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。在一些实施例中，可以在第二时间点之后的另外的时间点采集并分析，以检测在后续时间发生的肿瘤进展。
在另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一MS数据，确定基因组的一个或多个基因座(例如，基因组区域中的一个或多个CpG岛或非CpG甲基化基因座)中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二MS数据，确定基因组的一个或多个基因座(例如，基因组区域中的一个或多个CpG岛或非CpG甲基化基因座)中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱和跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；至少部分地基于相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态；以及，基于检测到的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗(例如，手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂)来治疗受试者的癌症。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态包括肿瘤进展，并且该方法包括向患者施用第二治疗，其中在施用之前，患者已经使用针对癌症的第一治疗进行治疗(并且第一和第二治疗是不同的)。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第一MS数据，确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第一MS数据，确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱和跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态；以及，基于检测到的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗(例如，手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂)来治疗受试者的癌症。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态包括肿瘤进展，并且该方法包括向患者施用第二治疗，其中在施用之前，患者已经使用针对癌症的第一治疗进行治疗(并且第一和第二治疗是不同的)。
在另一方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第一MS数据，确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第二MS数据，确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱和跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
在另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者癌症的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；基于第一WGS数据确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第一MS数据，确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二个时间点是在对受试者施用治疗法之后；基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；基于第二MS数据，确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；基于第一多个片段长度与第二多个片段长度确定片段长度谱变化；将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱和跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态；以及，基于检测到的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗(例如，手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂)来治疗受试者的癌症。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态包括肿瘤进展，并且该方法包括向患者施用第二治疗，其中在施用之前，患者已经使用针对癌症的第一治疗进行治疗(并且第一和第二治疗是不同的)。
在一些实施例中，第一和第二甲基化谱包括5-羟甲基胞嘧啶状态、5-甲基胞嘧啶状态、基于富集的甲基化评定、中值甲基化水平、模式甲基化水平、最大甲基化水平或最小甲基化水平。在一些实施例中，第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。在一些实施例中，获得第一MS数据包括对第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。在一些实施例中，甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。在一些实施例中，甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。在一些实施例中，甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫共沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
在一些实施例中，甲基化测序在不超过约40X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约30X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约25X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约20X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约12X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约10X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约8X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约6X的深度进行。在一些实施例中，甲基化测序在不超过约5X、不超过约4X、不超过约3X、不超过约2X或不超过约1X的深度进行。
在一些实施例中，该方法进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组(例如，同时与参考基因组的C-to-T转换版本)比对，从而产生多个经比对的测序读数。在一些实施例中，该方法进一步包括富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的基因组的区域。在一些实施例中，富集包括扩增第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，扩增包括选择性扩增。在一些实施例中，扩增包括通用性扩增。在一些实施例中，富集包括选择性分离至少一部分的第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。在一些实施例中，选择性分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分包括使用多个探针，多个探针中的每一个与基因组的区域的至少一部分具有序列互补性。在一些实施例中，该部分至少包括肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，该部分至少包括多个肿瘤标志物基因座。在一些实施例中，多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(TCGA)或癌症体细胞突变目录(COSMIC)的基因座。
在一些实施例中，基因组的基因座或区域包括以下一个或多个：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。在一些实施例中，基因组的区域包括基因组的多个非重叠区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域具有预定大小。在一些实施例中，预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约1,000个不同区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约2,000个不同区域。在一些实施例中，基因组的多个非重叠区域包括至少约3,000个不同区域、至少约4,000个不同区域、至少约5,000个不同区域、至少约6,000个不同区域、至少约7,000个不同区域，至少约8,000个不同区域，至少约9,000个不同区域、至少约10,000个不同区域、至少约15,000个不同区域、至少约20,000个不同区域、至少约25,000个不同区域、至少约30,000个不同区域、至少至少约35,000个不同区域、至少约40,000个不同区域、至少约45,000个不同区域、至少约50,000个不同区域、至少约100,000个不同区域、至少约150,000个不同区域、至少约200,000个不同区域、至少约250,000个不同区域、至少约300,000个不同区域、至少约400,000个不同区域或至少约500,000个不同区域。
在一些实施例中，确定第一肿瘤分数或第二肿瘤分数包括用一个或多个参考甲基化分数谱处理甲基化分数谱，其中该一个或多个参考甲基化分数谱从另外的cfDNA分子获得，该另外的cfDNA分子从另外的受试者的另外的体液样品获得或衍生。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名患有癌症的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名未患有癌症的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名具有肿瘤进展的受试者。在一些实施例中，另外的受试者包括一名或多名不具有肿瘤进展的受试者。在一些实施例中，使用在第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的受试者的另外的体液样品获得一个或多个参考甲基化分数谱。
在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时检测受试者的包括肿瘤进展的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时检测受试者的主要分子学应答(MMR)。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数统计学上显著大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时检测受试者的包括肿瘤进展的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数统计学上显著小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时检测受试者的主要分子学应答(MMR)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的灵敏度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的特异度来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阳性预测值(PPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％或至少约94％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约95％、至少约96％、至少约97％或至少约98％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约99％的阴性预测值(NPV)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.50、至少约0.55，至少约0.60、至少约0.65、至少约0.70、至少约0.75、至少约0.80、至少约0.85、至少约0.90、至少约0.91、至少约0.92、至少约0.93或至少约0.94的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.95、至少约0.96、至少约0.97或至少约0.98的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。在一些实施例中，该方法进一步包括以至少约0.99的曲线下面积(AUC)来检测受试者的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)。
在一些实施例中，该方法进一步包括在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。在一些实施例中，该方法进一步包括，基于受试者的经确定的肿瘤状态(例如，肿瘤进展、未进展、消退或复发)，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗受试者的癌症。在一些实施例中，第二治疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂。在一些实施例中，第一和第二多个cfDNA分子来自受试者的免疫细胞。在一些实施例中，检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。在一些实施例中，第一和第二MS数据通过测序装置或计算机处理器(例如，包括用于基于本公开的方法执行指令的一个或多个程序)获得。
在根据本文描述的任何实施例的一些实施例中，受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
本公开的另一方面提供一种包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文别处的任何方法。
本公开的另一方面提供了一种包括一个或多个计算机处理器和与其耦合的计算机存储器的系统。计算机存储器包括机器可执行代码，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文别处的任何方法。
通过以下具体实施方式，本公开的另外的方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施例。如将认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施例，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些均不脱离本公开。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用方式并入本文，所达到的程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体地和单独地指出以引用方式并入。在以引用方式并入本文的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开相矛盾的范围内，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下具体实施方式并结合附图(本文也称为图(Figure/FIG.))，可以更好地理解本发明的特征和优点，具体实施方式阐述了其中利用本发明原理的说明性实施例，在附图中：
图1示出了根据一些实施例的使用偏差变化(CID)评分评定受试者的肿瘤进展的示例性方法。
图2示出了被编程或以其他方式配置成实现本文提供的方法的计算机系统。
图3A-3B显示了根据一些实施例的临床环境的概览。图3A显示了比较放射影像学应答评定和cfDNA评定分子应答的潜在用途的图表。图3B显示了研究中患者的成像和采血时间。
图4A-4E显示了根据一些实施例对ctDNA进行连续评定以确定分子进展。图4A显示了针对患者LS030178检测到的CNA的全基因组图。T0基线抽血在治疗开始前13天开始采集，而T1基线抽血在治疗开始后21天进行采集。图4B显示了与CNA相比，归一化片段长度表现出相反的模式。图4C显示了，总体而言，每个基因组位置的归一化片段长度与推断出的拷贝数之间存在很强的负相关(Spearman’s rho＝-0.57，P<1E-10)。图4D显示了患者LS030178在后续时间点T1和T2的TFR增加，可在指示疾病进展的成像之前检测到。图4E显示了对治疗有应答的患者LS030093在T1和T2表现出TFR显著降低，这与表现出部分缓解的后续成像一致。
图5A-5C显示了根据一些实施例，在第一或第二治疗周期后预测进展的ctDNA评定。图5A显示了在第一次FUI时(由RECIST 1.1评定的SLD)的成像结果与分子进展的ctDNA评定的比较，通过任一治疗后样品的TFR的可信增加来表明(灵敏度＝54％，特异度＝100％，PPV＝100％，NPV＝85％)。脚注病例表现出明显的临床进展。图5B显示了进展者和未进展者在T1(左)和T2(右)的TFR，与PD或非PD的放射影像学或临床评定相比，显示了每个时间点的预测性能。图5C显示了，对于具有分子进展的患者，分子进展的检测早于通过标准治疗成像检测进展的日期的中位数为40天(-21至103天的范围)。
图6A-6I显示了根据一些实施例，治疗过程早期的分子应答评定与良好PFS相关。图6A显示了整个群组(n＝92)的中位PFS为211天。图6B显示了在T1或T2从cfDNA检测到分子进展的患者(n＝14，中位PFS＝62天)与没有分子进展的患者(n＝78，中位PFS＝263天；HR＝12.6[95％CI：5.8至27.3]；对数秩P<1E-10)相比有明显更差的PFS。图6C-6D显示了针对加或不加化学疗法的免疫疗法的患者(n＝34；对数秩P＝2E-12)(图6C)、加或不加靶向疗法的化学疗法的患者(n＝42；对数秩P＝7E-6)(图6D)的基于治疗方式的子集分析。图6E-6F显示了针对肺癌患者(n＝40；对数秩P＝8E-8)(图6E)和乳腺癌患者(n＝25；对数秩P＝3E-4)(图6F)的基于治疗方式的子集分析。图6G显示了在考虑基于分子进展的预测后，出现MMR的患者的PFS显著延长(Cox P＝0.011)。图6H-6I显示了在第一次FUI时(n＝65)通过放射学确定的疾病稳定或部分缓解的患者的子集分析，按缓解状态分层(对数秩P＝0.4)(图6H)或MMR(对数秩P＝0.02)(图6I)。
图7A-7B显示了根据一些实施例，甲基化可以向CNA提供正交信号用于响应监测。这些图显示了患者LS030083(图7A)和LS030078(图7B)在基线(黑线)和T1或T2(橙线)的全基因组1兆碱基箱中平均甲基化水平的分布。
图8显示了根据一些实施例的针对健康个体的纵向WGS数据。该图包括显示在初始抽血(顶部)和34天后(底部)未检测到参与者LB-S00129的CNA的全基因组图，如图4A中。
图9显示了根据一些实施例的跨测序方案的肿瘤分数比的比较。该图显示了使用WGS和WGBS处理的来自13名参与者的20个治疗后样品的结果。来自PD患者的两个样品在第一次FUI时有不一致的分子进展分类，TFR的测量值接近判读边界。
图10显示了根据一些实施例的样品时间和灵敏度。该图显示了来自在第一次FUI时的来自26名PD参与者的42个样品的分子进展和血液样品时间(两样品Kolmogorov-Smirnov检验，P＝0.15)。
图11显示了根据一些实施例的其他癌症的分子应答评定和PFS。该图显示了非肺癌非乳腺癌(n＝27；对数秩P＝5E-6)，绘制在图6E-6F中。
图12A-12B显示了根据一些实施例的在第一次FUI时非PD患者的MMR和PFS。这些图显示了来自所有患者具有放射影像学部分缓解(n＝30)(图12A)或疾病稳定(n＝35)(图12B)的结果。
图13A-13B显示根据一些实施例的患者群组中这三个患者类别(MP、MMR和既不是MP也不是MMR)中的每一个的Kaplan-Meier无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)图的实例.这些图显示生存期曲线彼此高度分离。此外，分子进展的预测以高特异度预测放射影像学进展。
图14A-14C显示了根据一些实施例在三个MAGE基因(MAGEA1、MAGEA3和MAGEA4)处观察到的甲基化强烈平均降低的实例。
图15A和15B显示了在治疗过程中量化来自患者的多个样品中特异性拷贝数畸变(CNA)的强度变化不太容易出现由基于CNA分别量化单独样品中的肿瘤分数而引起的某些错误模式。
具体实施方式
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”通常是指包括一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子。核酸可包括一个或多个选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的核苷酸。核苷酸通常包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和一个或多个磷酸基团，单独或组合。
核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖为脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞嘧啶三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，包括可检测标签，诸如发光标签或标志物(例如荧光团)。核苷酸可以包括能够掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。此类亚基可以是A、C、G、T或U，或具有特异性的一种或多种互补A、C、G、T或U或与嘌呤(即A或G或其变体)或嘧啶(即C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。核酸可以是单链的或双链的。核酸分子可以是线性的、弯曲的或环状的或其任何组合。
如本文所用，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”通常是指可以具有各种长度的多核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(RNA)或其类似物。核酸分子可具有至少约5个碱基、10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、60个碱基、70个碱基、80个碱基、90个碱基、100个碱基、110个碱基、120个碱基、130个碱基、140个碱基、150个碱基、160个碱基、170个碱基、180个碱基、190个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb或50kb的长度或者它可以具有任意两个上述值之间的任意数量的碱基。寡核苷酸通常由四个核苷酸碱基：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T))的特异性序列组成。因此，术语“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”至少部分地旨在作为多核苷酸分子的字母表示。可替代地，这些术语可以应用于多核苷酸分子本身。该字母表示可以输入到具有中央处理单元的计算机中的数据库中和/或用于生物信息学应用，诸如功能基因组学和同源性搜索。寡核苷酸可以包括一种或多种非标准核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰核苷酸。
如本文所用，术语“样品”通常是指生物学样品。生物学样品的实例包括核酸分子、氨基酸、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪或病毒。在一个实例中，生物学样品是包括一种或多种核酸分子的核酸样品。核酸分子可以是细胞游离或细胞游离核酸分子，诸如细胞游离DNA(cfDNA)或细胞游离RNA(cfRNA)。核酸分子可衍生自多种来源，包括人类、哺乳动物、非人类哺乳动物、猿、猴、黑猩猩、爬行动物、两栖动物或鸟类来源。进一步地，样品可以从多种含有细胞游离序列的动物体液中提取，包括但不限于体液样品，诸如血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水、淋巴液等。细胞游离多核苷酸(例如，cfDNA)可以是胎儿来源的(经由液体取自怀孕受试者)，或者可以衍生自受试者本身的组织。
如本文所用，术语“受试者”通常是指具有正在经历处理或分析的生物学样品的个体。受试者可以是动物或植物。受试者可以是哺乳动物，诸如人、狗、猫、马、猪或啮齿动物。受试者可以是患者，例如患有或疑似患有疾病，诸如一种或多种癌症(例如脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、尿路癌)、一种或多种传染病、一种或多种遗传疾病、或一种或多种肿瘤或它们的任意组合。对于患有或疑似患有一种或多种肿瘤的受试者，肿瘤可以是一种或多种类型。
如本文所用，术语“全血”通常是指尚未分离为子组分(例如，通过离心)的血液样品。血液样品的全血可以包含cfDNA和/或种系DNA。可以从血液样品中提取全血DNA(可以包含cfDNA和/或种系DNA)。全血DNA测序读数(可以包含cfDNA测序读数和/或种系DNA测序读数)可以从全血DNA中提取。
在来自受试者的细胞游离DNA序列数据中评定肿瘤进展
当取自受试者的样品的很大一部分(例如，>80％)来自或衍生于肿瘤细胞时，肿瘤进展的评定可以相对简单易行。然而，在从受试者的衍生自血液样品的血浆中制备细胞游离DNA(cfDNA)中，从cfDNA中检测肿瘤DNA并评定肿瘤进展可能是一个不敏感且嘈杂的过程。由于来自非肿瘤DNA(例如，非肿瘤衍生的种系细胞的种系DNA)的压倒性信号，从这种不敏感和/或嘈杂的信号中检测肿瘤DNA和评定肿瘤进展可能具有挑战性。本公开提供用于根据从受试者(例如，患有癌症的患者)的样品获得或衍生的cfDNA分子的细胞游离DNA(cfDNA)序列数据(例如，cfDNA测序读数)评定肿瘤进展的方法和系统。一旦从来自受试者的样品的分析中接收到cfDNA序列数据，就可以使用一种或多种生物信息学处理来评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展。在一些实施例中，从cfDNA中检测免疫细胞DNA，其可任选地用于评定肿瘤进展。
在一个方面，本公开提供一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤进展的方法，该方法包括：获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前；处理第一WGS数据以确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点在对受试者施用治疗法之后；处理第二WGS数据以确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；处理第一多个CNA与第二多个CNA以确定CNA谱变化；处理第一多个片段长度与第二多个片段长度以确定片段长度谱变化；至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
图1示出了根据一些实施例的在受试者中评定肿瘤进展的示例性方法。在操作102中，获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据。第一多个cfDNA分子可以在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生。第一时间点可以在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之前。在操作104中，处理第一WGS数据以确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度。在操作106中，获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据。第二多个cfDNA分子可以在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生。第二时间点可以在对受试者施用配置成治疗癌症的治疗法之后。在操作108中，处理第二WGS数据以确定(i)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度。在操作110中，处理第一多个CNA与第二多个CNA(例如，比较)以确定CNA谱变化。在操作112中，处理第一多个片段长度与第二多个片段长度(例如，比较)以确定片段长度谱变化。在操作114中，至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化，确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数和/或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数。在操作116中，至少部分地基于第一肿瘤分数和/或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，该方法包括识别一个或多个文库(例如，其中可以确定肿瘤分数，诸如通过使用CNA模式，或基于文库来自对照样品的事实)。对于每个文库，可以使用如本文描述的甲基化测序从基因组的一个或多个区域(例如，一个、一些或所有CpG岛、启动子等)计算甲基化状态(例如，平均甲基化分数)。统计建模(例如，线性回归或本公开的另一技术)可用于针对甲基化模式调整已知肿瘤分数，例如，使用留一参与者交叉验证。不希望受理论束缚，认为这些方法允许基于甲基化模式预测样品的肿瘤分数，例如，即使当CNA不可检测时。在一些实施例中，该方法进一步包括在两个或更多个时间点上比较上述分析。
例如，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的测序方法从cfDNA产生测序读数。测序方法可以是第一代测序方法，诸如Maxam-Gilbert或Sanger测序，或高通量测序(例如，下一代测序或NGS)方法。高通量测序方法可以同时(或基本上同时)测序至少10,000、100,000、100万、1000万、1亿、10亿或更多个多核苷酸分子。测序方法可以包括但不限于：焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、连接测序、杂交测序、数字基因表达
Figure BDA0003767760730000361
大规模平行测序，例如，
Figure BDA0003767760730000362
克隆单分子阵列
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使用
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Ion
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或
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平台进行测序。在一些实施例中，测序是通过纳米孔测序、链终止(Sanger)测序、合成测序(例如，Illumina或Solexa测序)、单分子实时测序、大规模平行测序技术、Polony测序、454焦磷酸测序、联合探针锚定聚合、连接测序(SOLiD测序)或GenapSys测序。在一些实施例中，测序包括基于杂交捕获的测序(基于杂交捕获的NGS)，例如，使用基于衔接子连接的文库。参见例如，Frampton,G.M.et al.(2013)Nat.Biotech.31:1023-1031。
在一些实施例中，测序方法包括亚硫酸氢盐测序。亚硫酸氢盐测序通常包括在测序前用亚硫酸氢盐处理DNA，这会将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶而不转化5-甲基胞嘧啶，从而允许检测DNA甲基化状态(尽管需要另外的方法来区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，如下所述)。在亚硫酸氢盐处理后可以使用多种标准测序方法，包括对甲基化检测具有特异性或非特异性的方法。测序方法可以包括但不限于焦磷酸测序、直接测序(例如，使用PCR)、高分辨率熔解分析、甲基化敏感的单链构象分析、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸、碱基特异性切割/MALDI-TOF，通过微阵列和甲基化特异性PCR进行序列分析。
在一些实施例中，测序方法包括氧化亚硫酸氢盐测序。氧化亚硫酸氢盐测序可用于通过将5-羟甲基胞嘧啶化学氧化为5-甲酰基胞嘧啶来区分5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶，5-甲酰基胞嘧啶可经由亚硫酸氢盐处理转化为尿嘧啶。
在一些实施例中，测序方法包括基于TET的甲基化测序，诸如TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)或TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS或TAB-Seq)。TAB-Seq允许通过使用10-11易位(TET)双加氧酶来分解5-羟甲基胞嘧啶。在示例性方法中，β-葡糖基转移酶(βGT)用于将5-羟甲基胞嘧啶转化为β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(其阻断TET的进一步修饰和亚硫酸氢盐的氧化)，并且TET酶用于将5-羟甲基胞嘧啶氧化为5-羧基胞嘧啶，对经由亚硫酸氢盐的尿嘧啶转化敏感。参见例如，Yu,M.et al.(2012)Cell 149:1368-1380。对于TAPS，TET酶用于将5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶氧化为5-羧基胞嘧啶，然后吡啶硼烷将5-羧基胞嘧啶还原转化为二氢尿嘧啶(DHU)，可经由PCR读取为胸腺嘧啶。参见例如，Liu,Y.et al.(2019)Nat.Biotechnol.37:424-429。
在一些实施例中，测序方法包括氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)。在该方法中，可以使用高钌酸钾将5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰基胞嘧啶，而不影响5-甲基胞嘧啶。然后亚硫酸氢盐处理可以将5-甲酰基胞嘧啶转化为尿嘧啶。
在一些实施例中，测序方法包括APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)。在该方法中，载脂蛋白B mRNA编辑酶亚基3A(APOBEC3A)用于将胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脱氨基并将其测序为胸腺嘧啶，而β-葡萄糖基转移酶(βGT)用于将5-羟甲基胞嘧啶转化为β-葡糖基-5-羟甲基胞嘧啶(阻断APOBEC的脱氨作用)。
在一些实施例中，测序方法包括甲基化DNA免疫沉淀测序，诸如甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)或羟甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)测序。在这些技术中，5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶的特异性抗体用于通过免疫沉淀从总DNA中分离甲基化DNA，然后进行纯化和测序。
在一些实施例中，测序方法包括甲基化阵列。在这种方法中，微阵列技术可用于查询多个基因组基因座处的甲基化状态。例如，可以对DNA进行亚硫酸氢盐处理，并且可以设计寡核苷酸探针来检测相同基因座的未甲基化(通过检测尿嘧啶)或甲基化(通过检测胞嘧啶)形式。检测哪个探针与序列杂交可鉴定该序列是否甲基化。
在一些实施例中，测序方法包括简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)。在这种方法中，DNA用甲基化不敏感的限制性内切酶(例如，MspI)消化，并在修复黏性末端和A加尾后将序列衔接子添加到片段上。然后可以用二硫化物处理DNA，通过PCR扩增并测序。参见例如，Meissner,A.et al.(2005)Nucleic Acids Res.33:5868-5877。
在一些实施例中，测序方法包括胞嘧啶5-羟甲基化测序，例如hMe-Seal。在该方法中，β-葡糖基转移酶(βGT)用于将含有叠氮基团的葡萄糖部分转移到5-羟甲基胞嘧啶上，可以用生物素对5-羟甲基胞嘧啶进行化学修饰，以实现DNA片段的检测、亲和力富集和测序。参见例如，Song,C.X.et al.(2011)Nat.Biotechnol.29:68-72.
在一些实施例中，测序包括全基因组测序(WGS)。测序可以在足够的深度进行以评定具有预期表现的受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展(例如，精度、灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)或接收者操作特征(ROC)的曲线下面积(AUC))。在一些实施例中，测序以“低深度”(low-pass)方式进行，例如，在不超过约12X、不超过约11X、不超过约10X、不超过约9X、不超过约8X、不超过约7X、不超过约6X、不超过约5X、不超过约4X、不超过约3.5X、不超过约3X、不超过约2.5X、不超过约2X、不超过约1.5X或不超过约1X的深度。
在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展可以包括将cfDNA测序读数与参考基因组比对。参考基因组可以包括基因组(例如，人类基因组)的至少一部分。参考基因组可以包括整个基因组(例如，整个人类基因组)。参考基因组可以包括具有应用了某些碱基转换的整个基因组(例如，具有非甲基化胞嘧啶转换为胸腺嘧啶的整个人类基因组)，如可以用于甲基化数据比对。参考基因组可以包括数据库，该数据库包括对应于基因组的编码和/或非编码基因组区域的多个基因组区域。数据库可以包括对应于基因组的癌症相关(或肿瘤相关)编码和/或非编码基因组区域的多个基因组区域，诸如癌症驱动突变(例如，单核苷酸变异(SNV)、拷贝数改变(CNA)、插入或缺失(indel)和其他重排、融合基因以及基因组区域(诸如单核苷酸和/或二核苷酸))。可以使用Burrows-Wheeler算法(BWA)、samamba算法、samtools算法或任何其他合适的比对算法来进行比对。
在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展可以包括为多个基因组区域中的每一个生成cfDNA测序读数的定量测度。可以生成cfDNA测序读数的定量测度，诸如与给定基因组区域比对的DNA测序读数的计数。可以将具有与给定基因组区域的部分或全部测序读数比对的cfDNA测序读数计入该基因组区域的定量测度。
在一些实施例中，基因组区域可以包括肿瘤标志物。特异性和非特异性基因组区域的模式可以指示肿瘤进展或肿瘤未进展状态。这些基因组区域模式随时间的变化可以指示肿瘤进展或肿瘤未进展状态的变化。
在一些实施例中，cfDNA可以通过在多个基因组区域的每一个进行多个cfDNA分子的结合测量来测定。在一些实施例中，进行结合测量包括使用对多个cfDNA分子中的多个基因组区域的至少一部分具有选择性的探针测定多个cfDNA分子。在一些实施例中，探针是与多个基因组区域的核酸序列具有序列互补性的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子是引物或富集序列。在一些实施例中，测定包括使用阵列杂交或聚合酶链式反应(PCR)或核酸测序。
在一些实施例中，该方法进一步包括针对多个基因组区域的至少一部分富集多个cfDNA分子。在一些实施例中，富集包括扩增多个cfDNA分子。例如，可以通过选择性扩增(例如，通过使用包括与多个基因组区域的核酸序列具有序列互补性的核酸分子的一组引物或探针)来扩增多个cfDNA分子。可替代地或组合地，可以通过通用性扩增(例如，通过使用通用性引物)来扩增多个cfDNA分子。在一些实施例中，富集包括选择性地分离多个cfDNA分子的至少一部分(例如，富集多个cfDNA分子的一部分，较短cfDNA分子)。
在一些实施例中，本公开的方法包括获得一种或多种定量测度，例如，片段长度、核苷酸数量等等。在一些实施例中，定量测度是统计测度。合适的统计测量是本领域已知的。例如，在一些实施例中，偏差的统计测量包括相对于一组参考样品或一组参考值(例如一组基线值)的z分数。
在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展的方法包括处理多个计数以获得多个cfDNA分子的片段长度的定量测度(例如，统计测度)。在一些实施例中，多个cfDNA分子的片段长度的定量测度包括多个cfDNA分子中的每一个的核苷酸数量。参考样品可获自一名或多名具有肿瘤进展的受试者和/或获自不具有肿瘤进展的受试者(例如，具有肿瘤未进展的受试者或未受影响的患者)。参考样品可以获自一名或多名患有癌症类型的受试者或获自不患有癌症类型的受试者(例如，脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌、尿路癌)。参考样品可获自患有晚期癌症或未患有晚期癌症(例如，早期癌症或无癌症)的一名或多名受试者。
在一些实施例中，cfDNA测序读数可以被归一化或校正。例如，可以对cfDNA测序读数进行去重复、归一化和/或校正，以说明测序和文库制备中的已知偏差和/或测序和文库制备中的已知偏差。在一些实施例中，可以过滤掉定量测度(例如，统计测度)的子集，例如，基于此类定量测度(例如，跨不同时间点)的变化是否与在那些未受影响的受试者(例如，cfDNA分子的背景谱)中观察到的变化显著不同。例如，当定量测度的z分数的绝对值小于(或不超过)预定数时，可以过滤掉定量测度。预定数可以是约0.1、约0.2、约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5或大于约5。
在一些实施例中，多个基因组区域包括单核苷酸和/或二核苷酸。多个基因组区域可包括至少约10个不同的基因组区域、至少约50个不同的基因组区域、至少约100个不同的基因组区域、至少约500个不同的基因组区域、至少约1000个不同的基因组区域、至少大约5000个不同的基因组区域，至少大约10000个不同的基因组区域，至少大约50000个不同的基因组区域，至少大约100000个不同的基因组区域，至少大约500000个不同的基因组区域，至少大约100万个不同的基因组区域区、至少约200万个不同的基因组区、至少约300万个不同的基因组区、至少约400万个不同的基因组区、至少约500万个不同的基因组区、至少约1000万个不同的基因组区、至少约1500万个不同的基因组区域、至少约2000万个不同的基因组区域、至少约2500万个不同的基因组区域离子、至少约3000万个不同的基因组区域或超过3000万个不同的基因组区域。
在一些实施例中，基因组的区域包括一种或多种MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因，例如，人MAGE基因。在一些实施例中，基因组的区域包括对应于一个或多个MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因，例如人MAGE基因的一个或多个启动子。MAGE基因(例如，人MAGE基因)是本领域已知的；参见例如，Chomez,P.et al.(2001)Cancer Res.61:5544-5551和Weon,J.L.和Potts,P.R.(2015)Curr.Opin.Cell Biol.37:1-8.示例性MAGE基因(例如人MAGE基因)包括但不限于MAGE-A基因(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A2B、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11和MAGE-A12)、MAGE-B基因(例如，MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-B6B、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B17和MAGE-B18)、MAGE-C基因(例如，MAGE-C1、MAGE-C2和MAGE-C3)和II型MAGE基因(例如，MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D3、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-G1、MAGE-H1、MAGE-L2、NDN和NDNL2)。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的灵敏度检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的特异度检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，以至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95、至少约0.96、至少约0.97、至少约0.98或至少约0.99的接收者操作特征(ROC)的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤进展。
在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展的方法进一步包括在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的灵敏度检测受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的特异度检测受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，以至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，以至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95、至少约0.96、至少约0.97、至少约0.98或至少约0.99的接收者操作特征(ROC)的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤未进展。
在一些实施例中，受试者已诊断出患有癌症。例如，癌症可以是一种或多种类型，包括但不限于：脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
在一些实施例中，该方法进一步包括，基于受试者的经确定的肿瘤进展，施用治疗有效量的治疗以治疗受试者的肿瘤。在一些实施例中，该治疗包括用手术、化学疗法、治疗剂、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂治疗。
可以评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展以确定癌症的诊断、癌症的预后、癌症的复发或受试者的肿瘤进展或消退的指示。此外，可以基于肿瘤进展或肿瘤未进展的评定或监测(例如，两个或更多个时间点之间的肿瘤进展或肿瘤未进展状态的差异)来分配一个或多个临床结果。此类临床结果可包括诊断受试者患有包括一种或多种类型的肿瘤的癌症、诊断受试者患有包括一种或多种类型和阶段的肿瘤的癌症、预测患有癌症的受试者(例如，指示受试者的临床治疗过程(例如，手术、化学疗法、治疗剂、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂或其他治疗))，指示另一种临床作用过程(例如，不治疗、持续监测(诸如在规定的时间间隔基础上)、停止当前治疗、切换到另一种治疗)或指示受试者的预期存活时间。
在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展的方法进一步包括处理第一多个CNA和第二多个CNA以确定CNA谱变化。在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展的方法进一步包括处理第一多个片段长度和第二多个片段长度以确定片段长度谱变化。在一些实施例中，评定受试者的肿瘤进展的方法进一步包括至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数。在一些实施例中，评定对受试者的肿瘤进展的方法进一步包括至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数检测受试者的肿瘤进展。例如，可以基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数是否满足预定标准(例如，至少是预定阈值、是大于预定阈值、在大多数是预定阈值或是小于预定阈值)。可以通过对从一名或多名参考受试者获得或衍生的参考样品的肿瘤进展或肿瘤未进展进行评定来生成预定阈值(例如，已知患有某种肿瘤类型的患者、已知患有某些阶段的某些肿瘤类型的患者或未表现出患有任何癌症的健康受试者)，并基于从参考受试者获得或衍生的参考样品的肿瘤进展或肿瘤未进展确定合适的预定阈值。
可以基于期望的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)或评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展状态的精度来调整预定阈值。例如，如果需要评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展状态的高灵敏度，则可以将预定阈值调整为较低。可替代地，如果需要高特异度评定受试者的肿瘤进展或肿瘤未进展状态，则可以将预定阈值调整为较高。可以调整预定阈值以便在评定从包括一种或多种类型的肿瘤的一个或多个参考受试者获得或衍生的癌症时实现假阳性(FP)和假阴性(FN)之间的期望平衡。
在一些实施例中，评定肿瘤进展或肿瘤未进展的方法进一步包括在第二个较晚时间点重复评定。可以选择第二时间点用于肿瘤进展或肿瘤未进展评定相对于第一时间点的适当比较。第二时间点的实例可以对应于手术切除后的时间、治疗施用期间或治疗施用后的时间以治疗受试者的癌症以监测治疗效果或治疗后受试者中无法检测到癌症后的时间以监测受试者的残留疾病或癌症复发。
在一些实施例中，本公开的方法包括确定在两个或更多个不同时间点的状态差异(例如，肿瘤进展或肿瘤未进展状态)。可以使用时间点之间的状态差异(例如，比较在较早点的状态与在较晚或当前点的状态)，例如，以指示肿瘤的进展、消退、复发或稳定状态。在一些实施例中，可以绘制状态随时间的差异，例如，以表示肿瘤的进展、消退、复发或稳定状态。例如，在一些实施例中，评定肿瘤进展或肿瘤未进展状态的方法进一步包括确定第一肿瘤进展/肿瘤未进展状态和第二肿瘤进展/肿瘤未进展状态之间的差异。在一些实施例中，该差异指示受试者的肿瘤的进展或消退。可替代地或组合地，该方法可以进一步包括通过计算机处理器生成作为第一和第二时间点函数的第一肿瘤进展/肿瘤未进展状态和第二肿瘤进展/肿瘤未进展状态的图。在一些实施例中，该图指示受试者的肿瘤的进展或消退。例如，计算机处理器可以生成在y轴上两个或更多个肿瘤进展/肿瘤未进展状态，在x轴上两个或更多个肿瘤进展或肿瘤未进展状态对应的数据收集的时间对应的时间的图。
肿瘤状态随时间的差异，如上文描述在第一肿瘤进展/未进展状态和第二肿瘤进展/未进展状态之间确定或绘制的此类差异可以指示受试者的肿瘤的进展、消退、复发或稳定状态。例如，如果较晚的肿瘤进展/未进展状态(例如，第二状态)大于早期的肿瘤进展/未进展状态(例如，第一状态)，则这种差异可以表明，例如，肿瘤进展，对受试者的肿瘤的治疗无效、肿瘤对正在进行的治疗的耐药性、肿瘤转移到受试者的其他部位或受试者的残留疾病或癌症复发。如果较晚的肿瘤进展/未进展状态(例如，第二状态)小于早期的肿瘤进展/未进展状态(例如，第一状态)，则这种差异可以表明，例如，肿瘤消退、手术切除受试者的肿瘤的效果、治疗受试者的肿瘤的效果或受试者中没有残留疾病或癌症复发。
在评定和/或监测肿瘤进展或肿瘤未进展状态之后，可以基于肿瘤进展或肿瘤未进展的评定或监测(例如，两个或更多个时间点之间的肿瘤进展或肿瘤未进展状态的差异)来分配一个或多个临床结果。此类临床结果可包括诊断受试者患有包括一种或多种类型的肿瘤的癌症、诊断受试者患有包括一种或多种类型和阶段的肿瘤的癌症、预测患有癌症的受试者(例如，指示受试者的临床治疗过程(例如，手术、化学疗法、治疗剂、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂或其他治疗))，或者确定受试者体内的肿瘤cDNA的来源，指示另一种临床作用过程(例如，不治疗、持续监测(诸如在规定的时间间隔基础上)、停止当前治疗、切换到另一种治疗)或指示受试者的预期存活时间。
治疗
本公开的某些方面涉及治疗，例如用一种或多种治疗剂。例如，在一些实施例中，治疗可以包括用手术、化学疗法、治疗剂、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化疗剂、抗体或检查点抑制剂治疗。本文提供了治疗的示例性和非限制性描述。
例如，可以使用细胞毒性剂或细胞抑制剂进行治疗。示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷类、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷化剂、嵌入剂、能够干扰信号转导通路的药剂和促进细胞凋亡和辐射的药剂。在其他实施例中，该方法可以与免疫调节剂，例如，IL-1、2、4、6或12，或干扰素α或γ或免疫细胞生长因子诸如GM-CSF组合使用。
在一些实施例中，该治疗可以是免疫治疗或免疫调节治疗，例如，基于化合物、抗体或细胞的免疫疗法。免疫疗法的实例包括但不限于检查点抑制剂、癌症疫苗、基于细胞的疗法、基于T细胞受体(TCR)的疗法、辅助免疫疗法、细胞因子免疫疗法或溶瘤病毒疗法。在一些实施例中，癌症免疫疗法包括小分子、核酸、多肽、碳水化合物、毒素、基于细胞或结合剂的治疗剂。下文更详细地描述了癌症免疫疗法的实例，但并非旨在进行限制。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括以下一种或多种：检查点抑制剂、癌症疫苗、基于细胞的疗法、基于T细胞受体(TCR)的疗法、辅助免疫疗法、细胞因子免疫疗法或溶瘤病毒疗法。在一些实施例中，癌症免疫疗法包括小分子、核酸、多肽、碳水化合物、毒素、基于细胞或结合剂的治疗剂。下文更详细地描述了癌症免疫疗法的实例，但并非旨在进行限制。在一些实施例中，癌症免疫疗法活化免疫系统的一个或多个方面以攻击表达本公开的新抗原的细胞(例如，肿瘤细胞)。本公开的癌症免疫疗法被考虑用作单一疗法，或以包括任何组合或数量的两种或更多种的组合方法使用，这取决于医学判断。任何癌症免疫疗法(任选地作为单一疗法或与本文描述的另一种癌症免疫疗法或其他治疗剂组合)可用于本文描述的任何方法中。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括癌症疫苗。已经测试了一系列癌症疫苗，它们采用不同的方法来促进对肿瘤的免疫应答(参见例如，Emens L A,Expert Opin EmergDrugs 13(2):295-308(2008)和US20190367613)。已经设计了一些方法来增强B细胞、T细胞或专职抗原呈递细胞对肿瘤的应答。癌症疫苗的示例性类型包括但不限于基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗、病毒转导的疫苗、基于肽的疫苗、树突细胞疫苗、溶瘤病毒、全肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗等。在一些实施例中，癌症疫苗可以是预防性或治疗性的。在一些实施例中，癌症疫苗被配制成基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于细胞的疫苗。例如，疫苗组合物可以包含在阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.etal,J.Clin.Invest.95:341,1995)，裸cDNA或肽，例如封装在聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中(参见，例如，Eldridge,et al,Molec.Immunol.28:287-294,1991:Alonsoet al,Vaccine 12:299-306,1994；Jones et al,Vaccine 13:675-681,1995)；包含在免疫刺激复合物(ISCOM)中的肽组合物(例如，Takahashi et al,Nature 344:873-875,1990；Huet al,Clin.Exp.Immunol.113:235-243,1998)；或多抗原肽系统(MAP)(参见例如，Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988；Tam,J.P.,J.Immunol.Methods196:17-32,1996)。在一些实施例中，将癌症疫苗被配制成基于肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中核酸编码多肽。在一些实施例中，癌症疫苗被配制成基于抗体的疫苗。在一些实施例中，癌症疫苗被配制成基于细胞的疫苗。在一些实施例中，癌症疫苗是肽癌症疫苗，在一些实施例中，其是个性化肽疫苗。在一些实施例中，癌症疫苗是多价长肽、多肽、肽混合物、杂合肽或肽脉冲树突细胞疫苗(参见，例如，Yamada et al,CancerSci,104:14-21),2013)。在一些实施例中，此类癌症疫苗增强抗肿瘤应答。
在一些实施例中，癌症疫苗选自sipuleucel-T(
Figure BDA0003767760730000471
Dendreon/ValeantPharmaceuticals)，其已被批准用于治疗无症状或轻微症状的转移性去势抵抗性(激素难治性)前列腺癌；和talimogene laherparepvec(
Figure BDA0003767760730000482
BioVex/Amgen，以前称为T-VEC)，一种转基因溶瘤病毒疗法，被批准用于治疗黑色素瘤中不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶。在一些实施例中，癌症疫苗选自溶瘤病毒疗法，诸如pexastimogene devacirepvec(PexaVec/JX-594,SillaJen/formerly Jennerex Biotherapeutics)，一种胸苷激酶-(TK-)缺陷型牛痘病毒，经工程化以表达GM-CSF，用于肝细胞癌(NCT02562755)和黑色素瘤(NCT00429312)；pelareorep(
Figure BDA0003767760730000481
Oncolytics Biotech)，一种呼吸道肠道孤儿病毒(呼肠孤病毒)的变体，在许多癌症中，包括结直肠癌(NCT01622543)、前列腺癌(NCT01619813)、头颈部鳞状细胞癌(NCT01166542)、胰腺癌(NCT00998322)和非小细胞肺癌(NSCLC)(NCT 00861627)，它不会在未被RAS活化的细胞中复制；enadenotucirev(NG-348,PsiOxus,以前称为ColoAdl)，一种腺病毒，在卵巢癌(NCT02028117)、转移性或晚期上皮肿瘤，诸如结直肠癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌和唾液腺癌(NCT02636036)中，经工程化以表达全长CD80和特异于T细胞受体CD3蛋白的抗体片段；ONCOS-102(Targovax/以前的Oncos)，一种在黑色素瘤(NCT03003676)和腹膜疾病、结直肠癌或卵巢癌(NCT02963831)中，经工程化以表达GM-CSF的腺病毒；GL-ONC1(GLV-1h68/GLV-1h153,Genelux GmbH)，经工程化以表达β-半乳糖苷酶(β-gal)/β-葡萄糖醛酸酶或β-gal/人钠碘转运体(hNIS)，在腹膜转移瘤(NCT01443260)、输卵管癌、卵巢癌(NCT 02759588)中分别研究；或CG0070(Cold Genesys)，一种在膀胱癌中经工程化以表达GM-CSF的腺病毒(NCT02365818)；抗gp100；STINGVAX；GVAX；DCVaxL和DNX-2401。在一些实施例中，癌症疫苗选自JX-929(SillaJen/原JennerexBiotherapeutics)，一种经工程化以表达胞嘧啶脱氨酶的TK和牛痘生长因子缺陷型牛痘病毒，其能够将前药5-氟胞嘧啶转化为细胞毒性药物5-氟尿嘧啶；TGO1和TG02(Targovax/原Oncos)，靶向难治RAS突变的基于肽的免疫疗法药剂；和TILT-123(TILTBiotherapeutics)，一种设计好的工程化腺病毒：Ad5/3-E2F-delta24-hTNFα-IRES-hIL20；和VSV-GP(ViraTherapeutics)，一种经工程化以表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白(GP)的水疱性口炎病毒(VSV)，其可进一步工程化以表达旨在提高抗原特异性CD8+T细胞应答的抗原。在一些实施例中，癌症疫苗包括基于载体的肿瘤抗原疫苗。基于载体的肿瘤抗原疫苗可用作提供稳定的抗原供应以刺激抗肿瘤免疫应答的一种方式。在一些实施例中，将编码肿瘤抗原的载体注射到患者体内(可能带有促炎剂或其他引诱剂诸如GM-CSF)，由细胞在体内吸收以制造特异性抗原，然后该特异性抗原引发预期的免疫应答。在一些实施例中，载体可用于一次递送大于一种肿瘤抗原，以增强免疫应答。此外，重组病毒、细菌或酵母载体应该会触发其自身的免疫应答，这也可能增强整体免疫应答。
在一些实施例中，癌症疫苗包括基于DNA的疫苗。在一些实施例中，基于DNA的疫苗可用于刺激抗肿瘤应答。直接注射编码抗原蛋白的DNA引发保护性免疫应答的能力已在许多实验系统中得到证实。通过直接注射编码抗原蛋白的DNA接种疫苗以引发保护性免疫应答，通常会产生细胞介导和体液应答。此外，已经报道了小鼠对编码各种抗原的DNA的重复性免疫应答基本上持续了动物的一生(参见例如，Yankauckas et al.(1993)DNA CellBiol.,12:771-776)。在一些实施例中，将包含编码与基因表达所需的调节元件可操作地连接的蛋白质的序列的质粒(或其他载体)DNA施用于个体(例如人类患者、非人类哺乳动物等)。在一些实施例中，个体的细胞吸收施用的DNA并表达编码序列。在一些实施例中，如此产生的抗原成为免疫应答所针对的靶标。
在一些实施例中，癌症疫苗包括基于RNA的疫苗。在一些实施例中，基于RNA的疫苗可用于刺激抗肿瘤应答。在一些实施例中，基于RNA的疫苗包括自我复制的RNA分子。在一些实施例中，自我复制的RNA分子可以是α病毒衍生的RNA复制子。自我复制的RNA(或“SAM”)分子在本领域中是众所周知的并且可以通过使用衍生自例如α病毒的复制元件和用编码目标蛋白质的核苷酸序列取代结构病毒蛋白质来产生。自我复制的RNA分子通常是可在递送至细胞后直接翻译的+链分子，这种翻译提供了RNA依赖性RNA聚合酶，然后从递送的RNA产生反义转录本和有义转录本。因此，递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子RNA以及共线的亚基因组转录本可自身翻译以提供编码多肽(即包括HPV抗原)的原位表达，或可转录以提供与递送的RNA具有相同意义的进一步转录本，这些转录本被翻译以提供抗原的原位表达。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括基于细胞的疗法。在一些实施例中，癌症免疫疗法包括基于T细胞的疗法。在一些实施例中，癌症免疫疗法包括过继疗法，例如基于T细胞的过继疗法。在一些实施例中，T细胞对于受体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，T细胞为CD8+T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD4+T细胞。过继免疫疗法是指一种治疗癌症或传染病的治疗方法，其中将免疫细胞施用于宿主，目的是使细胞直接或间接介导对肿瘤细胞的特异性免疫(即产生针对肿瘤细胞的免疫应答)。在一些实施例中，免疫应答导致肿瘤和/或转移性细胞生长和/或增殖的抑制，并且在相关实施例中导致肿瘤细胞死亡和/或再吸收。免疫细胞可以衍生自不同的生物体/宿主(外源性免疫细胞)或可以是从受试者生物体获得的细胞(自体免疫细胞)。在一些实施例中，免疫细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、不变NK细胞或NKT细胞)可以是经基因工程化以表达抗原受体，诸如工程化TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。例如，宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)被修饰以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在一些实施例中，NK细胞经工程化以表达TCR。NK细胞可以进一步经工程化以表达CAR。多个CAR和/或TCR，诸如不同的抗原，可以添加到单个细胞类型，诸如T细胞或NK细胞。在一些实施例中，细胞包括经由基因工程引入的编码一种或多种抗原受体的一种或多种核酸/表达构建体/载体，以及此类核酸的基因工程产物。在一些实施例中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或获自该细胞的样品中，诸如一种获自另一生物体或细胞的核酸，例如，其通常不存在于经工程化的细胞中和/或这种细胞来源的生物体中。在一些实施例中，核酸不是天然存在的，诸如自然界中不存在的核酸(例如嵌合的)。在一些实施例中，免疫细胞群可以从需要治疗或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的受试者获得。因此，细胞对于需要治疗的受试者来说是自体的。在一些实施例中，免疫细胞群可以从供体获得，诸如组织相容性匹配的供体。在一些实施例中，免疫细胞群可以从受试者或供体中存在的免疫细胞的外周血、脐带血、骨髓、脾脏或任何其他器官/组织中收获。在一些实施例中，免疫细胞可以从受试者和/或供体库中分离，诸如从合并的脐带血中分离。在一些实施例中，当免疫细胞群从不同于受试者的供体获得时，供体可以是同种异体的，只要获得的细胞是受试者相容的，因为它们可以被引入受试者。在一些实施例中，同种异体供体细胞可以是或可以不是人-白细胞-抗原(HLA)-相容的。在一些实施例中，为了使受试者相容，可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
在一些实施例中，基于细胞的疗法包括基于T细胞的疗法。在过去的二十年中，已经描述了几种用于衍生、活化和扩增功能性抗肿瘤效应细胞的基本方法。这些包括：自体细胞，诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被T细胞配体和活化抗体的磁珠，或通过捕获靶细胞膜分离的细胞体外活化T细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和非肿瘤特异性自体或同种异体细胞经基因重编程或“重定向”以表达肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子，显示抗体样肿瘤识别能力，称为“T体”。在一些实施例中，T细胞衍生于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。在一些方面，细胞为人类细胞。在一些实施例中，细胞是原代细胞，诸如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些细胞。在一些实施例中，细胞包括一种或多种T细胞亚群或其他细胞类型，诸如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞及其亚群，诸如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体的类型、存在于特异性器官或隔室中、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度定义的那些。在一些实施例中，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些实施例中，诸如对于现成的技术，细胞是多能的(pluripotent和/或multipotent)，诸如干细胞，诸如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施例中，该方法包括从受试者分离细胞，如本文描述，制备、加工、培养和/或工程化它们，以及在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者。在一些实施例中，T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)的亚型和亚群是初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、黏膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。在一些实施例中，一种或多种T细胞群富集或耗尽对特异性标志物(诸如表面标志物)呈阳性或对特异性标志物呈阴性的细胞。在一些实施例中，此类标志物是那些在某些T细胞群(诸如，非记忆细胞)上不存在或以相对低水平表达但在某些其他T细胞群(诸如，记忆细胞)存在或以相对低水平表达的。在一些实施例中，通过阴性选择在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞)或其他白细胞(诸如CD 14)上表达的标志物，将T细胞从PBMC样品中分离出来。在一些实施例中，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群可以通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达程度相对较高的标志物的阳性或阴性选择而进一步分类为亚群。在一些实施例中，CD8+T细胞进一步富集或耗尽初始、中央记忆、效应记忆和/或中央记忆干细胞，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在一些实施例中，T细胞为自体细胞。在该方法中，从患者身上获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。单细胞悬液可以在任何合适的方式中获得，例如，机械方式(例如，使用gentleMACSTM Dissociator，Miltenyi Biotec，Auburn，Calif.解聚肿瘤)或酶促方式(例如，胶原酶或DNA酶)。将肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白细胞介素2(IL-2)中培养。将细胞培养至汇合(例如，约2x 106个淋巴细胞)，例如从约5至约21天，诸如从约10至约14天。
在一些实施例中，可以合并培养的T细胞并快速扩增。快速扩增提供抗原特异性T细胞数量的增加，例如，至少约50倍(例如50、60、70、80、90或100倍或更多)持续约10至约14天。在一些实施例中，可以通过本领域已知的多种方法中的任一种来完成扩增。例如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素2(IL-2)或白细胞介素15(IL-15)(IL-2特别考虑过)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可包括约30ng/mlOKT3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从
Figure BDA0003767760730000521
Raritan,N.J.获得)。在一些实施例中，可以通过用癌症的一种或多种抗原(包括其抗原部分，诸如表位或细胞)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞，其可以在T细胞生长因子，诸如300IU/ml IL-2或IL-15(IL-2正在考虑中)存在下，可任选地从载体，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽表达。通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激，体外诱导的T细胞迅速扩增。在一些实施例中，T细胞可以用例如照射过的自体淋巴细胞或用照射过的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施例中，可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子。在一些实施例中，合适的T细胞生长因子包括例如，白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如，Sambrooket al,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel et al,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。在一些实施例中，修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，诸如IL-12的序列，在本领域中很容易获得，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作的连接促进高水平表达。在一些实施例中，自体T细胞可经工程化以表达针对靶TAA的确定的T细胞受体(TCR)，野生型TCR或突变/工程化的TCR对抗原肽/MHC分子复合物具有更高的亲和力。在一些实施例中，自体T细胞可经工程化以表达一种CAR，例如，如下文描述。
在一些实施例中，基于T细胞的疗法包括基于嵌合抗原受体(CAR)-T的疗法。这种方法涉及工程化一种CAR，该CAR与目标抗原特异性结合，并包括一个或多个用于T细胞活化的细胞内信号结构域。然后CAR在工程化T细胞(CAR-T)的表面上表达并施用于患者，导致针对表达抗原的癌细胞的T细胞特异性免疫应答。在一些实施例中，该CAR特异性结合本发明的新抗原。
在一些实施例中，基于T细胞的疗法包括T细胞表达重组T细胞受体(TCR)。该方法涉及识别与目标抗原特异性结合的TCR，然后将其用于替换施用于患者的工程化T细胞表面上的内源性或天然TCR，导致针对表达抗原的癌细胞的T细胞特异性免疫应答。在一些实施例中，重组TCR特异性结合本公开的新抗原。
在一些实施例中，基于T细胞的疗法包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。例如，TIL可以从本公开的肿瘤或癌症中分离，然后在体外分离和扩增。这些TIL中的一些或全部可以特异性识别本公开的新抗原。在一些实施例中，TIL在分离后在体外暴露于本公开的一种或多种新抗原。然后将TIL施用于患者(任选与一种或多种细胞因子或其他免疫刺激物质组合)。
在一些实施例中，基于细胞的疗法包括基于自然杀伤(NK)细胞的疗法。自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞的一个亚群，对多种肿瘤细胞、病毒感染的细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞具有自发的细胞毒性。NK细胞是对转化和病毒感染细胞的早期先天免疫应答的关键效应物。NK细胞约占人外周血中的淋巴细胞的10％。当淋巴细胞在白细胞介素2(IL-2)存在下培养时，会产生强烈的细胞毒性反应。NK细胞是称为大颗粒淋巴细胞的效应细胞，因为它们的尺寸较大并且在其细胞质中存在特征性的嗜天青颗粒。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可以通过特异性表面标志物来检测，诸如人类中的CD 16、CD56和CD8。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白B细胞受体。在一些实施例中，NK细胞通过本领域中众所周知的方法衍生自人外周血单核细胞(PBMC)、未刺激的白细胞分离产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、骨髓或脐带血。在一些实施例中，脐带CB用于衍生NK细胞。在一些实施例中，通过先前描述的离体扩增NK细胞的方法分离和扩增NK细胞(Spanholtz et al,2011；Shah et al,2013)。在一些实施例中，CB单核细胞通过聚蔗糖密度梯度离心分离并在具有IL-2和人工抗原呈递细胞(aAPC)的生物反应器中培养。7天后，细胞培养物耗尽任何表达CD3的细胞并额外再培养7天。细胞再次被CD3耗尽并表征以确定CD56+/CD3细胞或NK细胞的百分比。在一些实施例中，脐带CB用于通过分离CD34+细胞和通过在含有SCF、IL-7、IL-15和IL-2的培养基中培养分化成CD56+/CD3细胞来衍生NK细胞。
在一些实施例中，基于细胞的疗法包括基于树突细胞的疗法，例如树突细胞疫苗。在一些实施例中，DC疫苗包括能够诱导特异性T细胞免疫的抗原呈递细胞，其从患者或供体中收获。在一些实施例中，然后可以将DC疫苗在体外暴露于肽抗原，从而在患者体内产生T细胞。在一些实施例中，然后将携带抗原的树突细胞注射回患者体内。在一些实施例中，如果需要，可以多次重复免疫接种。用于收获、扩增和施用树突细胞的方法是本领域已知的；参见例如，WO2019178081。树突细胞疫苗(诸如Sipuleucel-T，也称为APC8015和
Figure BDA0003767760730000541
)是涉及施用充当APC以向患者的免疫系统呈递一种或多种癌症特异性抗原(例如本公开的新抗原)的树突细胞的疫苗。在一些实施例中，该疫苗包括已经暴露于本公开的一种或多种新抗原的树突细胞。在一些实施例中，该疫苗包括呈递本公开的一种或多种新抗原的树突细胞，例如，经由I类MHC。在一些实施例中，树突细胞对于受体是自体的或同种异体的。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括基于TCR的疗法。在一些实施例中，癌症免疫疗法包括施用特异性结合本公开的新抗原的一种或多种TCR或基于TCR的生物制剂。例如，基于TCR的治疗法可以包括特异性结合本公开的新抗原的TCR或其细胞外部分(例如，如经由I类MHC存在于细胞表面上)以及结合免疫细胞的部分(例如，T细胞)，诸如特异性结合T细胞表面蛋白或受体的抗体或抗体片段(例如，抗CD3抗体或抗体片段)。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括辅助免疫疗法。辅助免疫疗法包括使用一种或多种活化先天免疫系统成分的药剂，例如靶向TLR7通路的
Figure BDA0003767760730000551
(咪喹莫特)。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括细胞因子免疫疗法。细胞因子免疫疗法包括使用一种或多种活化免疫系统成分的细胞因子。实例包括但不限于阿地白介素(
Figure BDA0003767760730000552
白细胞介素2)、干扰素α-2a
Figure BDA0003767760730000553
干扰素α-2b
Figure BDA0003767760730000554
和聚乙二醇干扰素α-2b
Figure BDA0003767760730000555
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括溶瘤病毒疗法。溶瘤病毒疗法使用转基因病毒在癌细胞中复制并杀死癌细胞，导致释放刺激免疫应答的抗原(例如，本公开的新抗原)。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的具有复制能力的溶瘤病毒包括任何天然存在的(例如来自“野生来源”)或经修饰的具有复制能力的溶瘤病毒。在一些实施例中，溶瘤病毒除了表达肿瘤抗原外，还可以被修饰以增加病毒对癌细胞的选择性。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒包括但不限于作为肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、短尾噬菌体科、复层噬菌体科、覆盖噬菌体科、芽生噬菌体科、脂毛噬菌体科、微小纺锤形噬菌体科、痘病毒科、虹彩病毒科、藻类脱氧核糖核酸病毒科、杆状病毒科、疱疹病毒科、腺病毒科、乳多泡病毒科、聚脱氧核糖核酸病毒科、丝状病毒科、微病毒科、双生病毒科、环状病毒科、细小病毒科、嗜肝脱氧核糖核酸病毒科、逆转录病毒科、囊状病毒科、呼肠孤病毒科、双核糖核酸病毒科、副粘病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、光滑病毒科、小核糖核酸病毒科、伴生病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、罗达病毒科、四病毒科、番茄丛矮病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和杆菌状核糖核酸病毒科家族的成员的溶瘤病毒。在一些实施例中，具有复制能力的溶瘤病毒包括腺病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、新城疫病毒(NDV)、多瘤病毒、牛痘病毒(VacV)、单纯疱疹病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒和细小病毒。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的复制性溶瘤牛痘病毒可以经工程化为缺少一种或多种功能基因，以增加病毒的癌症选择性。在一些实施例中，溶瘤牛痘病毒经工程化以缺乏胸苷激酶(TK)活性。在一些实施例中，溶瘤牛痘病毒可经工程化以缺乏牛痘病毒生长因子(VGF)。在一些实施例中，溶瘤牛痘病毒可经工程化以缺乏VFG和TK活性。在一些实施例中，溶瘤牛痘病毒可经工程化以缺乏一种或多种涉及逃避宿主干扰素(IFN)应答的基因，诸如E3L、K3L、B18R或B8R。在一些实施例中，复制性溶瘤牛痘病毒是Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株并且缺乏功能性TK基因。在一些实施例中，溶瘤牛痘病毒是缺乏功能性B18R和/或B8R基因的Western Reserve、Copenhagen、Lister或Wyeth株。在一些实施例中，表达组合的肿瘤抗原的复制性溶瘤牛痘病毒可以局部或全身施用于受试者，例如经由肿瘤内、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、颅内、皮下或鼻内施用。
在一些实施例中，癌症免疫疗法包括检查点抑制剂。如本领域已知的，检查点抑制剂靶向至少一种免疫检查点蛋白以改变免疫应答的调节，例如下调或抑制免疫应答。免疫检查点蛋白包括例如CTLA4、PD-L1、PD-1、PD-L2、VISTA、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、2B4、ICOS、HVEM、CEACAM、LAIR1、CD80、CD86、CD276、VTCN1、I类MHC、II类MHC、GALS、腺嘌呤、TGFR、CSF1R、MICA/B、精氨酸酶、CD160、gp49B、PIR-B、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3、BTLA、SIRPalpha(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、LAG-3、BTLA、IDO、OX40和A2aR。在一些实施例中，涉及调节免疫检查点的分子包括但不限于：PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1,CD274)、PD-L2(B7-CD,CD273)、CTLA-4(CD152)、HVEM、BTLA(CD272)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、LAG-3(CD223)、TIM-3(HAVCR2)、CEACAM、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、GAL9、VISTA(PD-1H)、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRbeta、A2AR、GITR(CD357)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD276(B7-H3)、VTCNI(B7-H4)、I类MHC、II类MHC、GALS、腺嘌呤、TGFR、B7-H1、OX40(CD134)、CD94(KLRD1)、CD137(4-1BB)、CD137L(4-1BBL)、CD40、IDO、CSF1R、CD40L、CD47、CD70(CD27L)、CD226、HHLA2、ICOS(CD278)、ICOSL(CD275)、LIGHT(TNFSF14,CD258)、NKG2a、NKG2d、OX40L(CD134L)、PVR(NECL5,CD155)、SIRPa、MICA/B和/或精氨酸酶。在一些实施例中，检查点抑制剂降低负调节免疫细胞功能的检查点蛋白的活性，例如，以增强T细胞活化和/或抗癌免疫应答；在其他实施例中，检查点抑制剂增加正调节免疫细胞功能的检查点蛋白的活性，例如，以增强T细胞活化和/或抗癌免疫应答。在一些实施例中，检查点抑制剂为抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂为抗体。检查点抑制剂的实例包括但不限于PD-L1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体，例如阿特珠单抗(MPDL3280A))，一种针对共抑制分子的拮抗剂(例如，CTLA4拮抗剂(例如，抗CTLA4抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或LAG-3拮抗剂(例如，抗LAG-3抗体))或其任意组合。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂包括药物，诸如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，诸如人抗体(例如，国际专利公开W02015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；均以引用方式并入本文)。在一些实施例中，可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。
在一些实施例中，该检查点抑制剂为PD-L1轴结合拮抗剂，例如PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂或PD-L2结合拮抗剂。PD-1(程序性死亡1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1”、“PDCD1”、“CD279”和“SLEB2”。示例性人PD-1显示在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116中。PD-L1(程序性死亡配体1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7-H”和“PDL1”。示例性人PD-L1显示在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中。PD-L2(程序性死亡配体2)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体2”、“PDCD1 LG2”、“CD273”、“B7-DC”、“Btdc”和“PDL2”。示例性人PD-L2显示在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51中。在一些情况下，PD-1、PD-L1和PD-L2为人PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一情况下，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配体结合的分子。在具体方面，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一情况下，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配体配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是小分子、核酸、多肽(例如抗体)、碳水化合物、脂质、金属或毒素。
在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)，例如，如下文所述。在一些情况下，抗PD-1抗体选自由MDX-1 106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810 MGA-012、JNJ-63723283、BI754091和BGB-108所组成的组。MDX-1 106也称为MDX-1 106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗，为WO2006/121 168中描述的抗PD-1抗体。MK-3475也称为派姆单抗或Lambrolizumab，为WO 2009/1 14335中描述的抗PD-1抗体。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。AMP-224也称为B7-DCIg，为WO 2010/027827和WO 2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗(Bristol-Myers Squibb/Ono)，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0003767760730000581
是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ IDNO:1)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:2)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:1的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:2的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:1的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:2的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗(Pembrolizumab)(CAS登记号：1374853-91-4)。派姆单抗(Merck)，也称为MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、
Figure BDA0003767760730000591
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:3)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
EIVLTQSPAT LSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:3的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:4的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:3的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:4的轻链可变结构域。
抗PD-1抗体的另一实例包括但不仅限于MEDI-0680(AMP-514；AstraZeneca)、PDR001(CAS Registry No.1859072-53-9；Novartis)、REGN2810(
Figure BDA0003767760730000601
或cemiplimab-rwlc；Regeneron)、BGB-108(BeiGene)、BGB-A317(BeiGene)、BI 754091、JS-001(Shanghai Junshi)、STI-A1110(Sorrento)、INCSHR-1210(Incyte)、PF-06801591(Pfizer)、TSR-042(也称为ANB011；Tesaro/AnaptysBio)、AM0001(ARMO Biosciences)、ENUM 244C8(Enumeral Biomedical Holdings)、ENUM 388D4(Enumeral BiomedicalHoldings)。在一些实施例中，该PD-1轴结合拮抗剂包括tislelizumab(BGB-A317)、BGB-108、STI-A1110、AM0001、BI754091、sintilimab(IBI308)、cetrelimab(JNJ-63723283)、toripalimab(JS-001)、camrelizumab(SHR-1210,INCSHR-1210,HR-301210)、MEDI-0680(AMP-514)、MGA-012(INCMGA 0012)、纳武单抗(BMS-936558,MDX1106,ONO-4538)、spartalizumab(PDR00l)、派姆单抗(MK-3475,SCH900475)、PF-06801591、cemiplimab(REGN-2810,REGEN2810)、dostarlimab(TSR-042,ANB011)、FITC-YT-16(PD-1结合肽)、APL-501或CBT-501或genolimzumab(GB-226)、AB-122、AK105、AMG 404、BCD-100、F520、HLX10、HX008、JTX-4014、LZM009、Sym021、PSB205、AMP-224(融合蛋白靶向PD-1)、CX-188(PD-1probody)、AGEN-2034、GLS-010、budigalimab(ABBV-181)、AK-103、BAT-1306、CS-1003、AM-0001、TILT-123、BH-2922、BH-2941、BH-2950、ENUM-244C8、ENUM-388D4、HAB-21、H EISCOI11-003、IKT-202、MCLA-134、MT-17000、PEGMP-7、PRS-332、RXI-762、STI-1110、VXM-10、XmAb-23104、AK-112、HLX-20、SSI-361、AT-16201、SNA-01、AB122、PD1-PIK、PF-06936308、RG-7769、CAB PD-1Abs、AK-123、MEDI-3387、MEDI-5771、4H1128Z-E27、REMD-288、SG-001、BY-24.3、CB-201、IBI-319、ONCR-177、Max-1、CS-4100、JBI-426、CCC-0701、CCX-4503或其衍生物。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是肽或小分子化合物。在一些实施例中，PD-1结合拮抗剂是AUNP-12(PierreFabre/Aurigene)。在一些实施例中，PD-1轴结合拮抗剂包括Guzik等人，Molecules(2019)May 30；24(11)中描述的小分子PD-1轴结合拮抗剂。用于本文提供的方法的其他PD-l抑制剂是本领域已知的，诸如美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中描述的。
在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-1的小分子。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1的小分子。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1和VISTA或PD-L1和TIM3的小分子。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂是CA-170(也称为AUPM-170)。在本文的任何情况下，分离的抗PD-L1抗体可以结合人PD-L1，例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示的人PD-L1或其变体。在一些实施例中，PD-L1结合拮抗剂是小分子、核酸、多肽(例如抗体)、碳水化合物、脂质、金属或毒素。
在一些情况下，例如，如下所述，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1与PD-1之间和/或PD-L1与B7-1之间的结合。在一些情况下，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体是选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些情况下，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体是人抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体选自由YW243.55.S70、MPDL3280A(阿特珠单抗)、MDX-1 105和MEDI4736(德瓦鲁单抗)和MSB0010718C(阿维鲁单抗)所组成的组。抗体YW243.55.S70为WO 2010/077634中描述的抗PD-L1。MDX-1 105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体。MEDI4736(德瓦鲁单抗)是WO201 1/066389和US2013/034559中描述的抗PD-L1单克隆抗体。可用于本发明的方法中的抗PD-L1抗体的实例及其制备方法描述于PCT专利申请WO 2010/077634、WO 2007/005874、WO 2011/066389、美国专利号8,217,149和US2013/034559中。在一些实施例中，该PD-L1轴结合拮抗剂包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗(imfinzi)、BGB-A333、SHR-1316(HTI-1088)、CK-301、BMS-936559、envafolimab(KN035、ASC22)、CS1001、MDX-1105(BMS-936559)、LY3300054、STI-A1014、FAZ053、CX-072、INCB086550、GNS-1480、CA-170、CK-301、M-7824、HTI-1088(HTI-131、SHR-1316)、MSB-2311、AK-106、AVA-004、BBI-801、CA-327、CBA-0710、CBT-502、FPT-155、IKT-201、IKT-703、10-103、JS-003、KD-033、KY-1003、MCLA-145、MT-5050、SNA-02、BCD-135、APL-502(CBT-402或TQB2450)、IMC-001、KD-045、INBRX-105、KN-046、IMC-2102、IMC-2101、KD-005、IMM-2502、89Zr-CX-072、89Zr-DFO-6E11、KY-1055、MEDI-1109、MT-5594、SL-279252、DSP-106、Gensci-047、REMD-290、N-809、PRS-344、FS-222、GEN-1046、BH-29xx、FS-118或其衍生物。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其序列分别为GFTFSDSWIH(SEQ IDNO:5)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:6)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)，并且
(b)轻链可变区包含HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3，其序列分别为RASQDVSTAVA(SEQ IDNO:8)、SASFLYS(SEQ ID NO:9)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:10)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是MPDL3280A，也称为阿特珠单抗和
Figure BDA0003767760730000631
(CAS登记号：1422185-06-5)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:12)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:13)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:14)。
在一些情况下，提供了分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中轻链序列与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些情况下，提供了包含重链和轻链序列的分离的抗PD-L1抗体，其中重链序列与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一些情况下，提供了分离的抗PD-L1抗体，其包含重链和轻链序列，其中轻链序列与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且重链序列与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在更进一步特定方面，抗体进一步包括人或鼠恒定区。在更进一步方面，人恒定区选自由lgG1、lgG2、lgG2、lgG3和lgG4组成的组。在更进一步特定方面，人恒定区为lgG1。在更进一步方面，鼠恒定区选自由lgG1、lgG2A、lgG2B和lgG3组成的组。在更进一步方面，鼠恒定区为lgG2A。在更进一步特定方面，抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化。在更进一步的情况下，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。
在一些情况下，分离的抗PD-L1抗体是无糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸，是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，该羟基氨基酸最通常为丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以除去上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地从抗体上除去糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基取代为另一个氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守取代)来进行变异。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是阿维鲁单抗(avelumab)(CAS登记号：1537032-82-8)。阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C，是人单克隆IgG1抗PDL1抗体(Merck KGaA，Pfizer)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID NO:15)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ IDNO:16)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:15的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:16的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:15的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:16的轻链可变结构域。
在一些实施例中，抗PDL1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)(CAS登记号：1428935-60-7)。德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736，是WO2011/066389和US2013/034559中描述的Fc优化的人单克隆IgG1κ抗PDL1抗体(MedImmune，AstraZeneca)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID NO:17)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:17的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:18的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗PDL1抗体包含来自SEQ ID NO:17的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:18的轻链可变结构域。
抗PD-L1抗体的其他实例包括但不限于MDX-1105(BMS-936559；Bristol MyersSquibb)、LY3300054(Eli Lilly)、STI-A1014(Sorrento)、KN035(Suzhou Alphamab),FAZ053(Novartis)或CX-072(CytomX Therapeutics)。
在一些实施例中，PD-L1轴结合拮抗剂包括小分子PD-L1轴结合拮抗剂GS-4224。在一些实施例中，PD-L1轴结合拮抗剂包括PCT/US2019/017721中描述的小分子PD-L1轴结合拮抗剂。
在一些实施例中，检查点抑制剂是CT-011，也称为hBAT、hBAT-1或pidilizumab，WO2009/101611中描述的抗体。
在一些实施例中，检查点抑制剂为CTLA4的拮抗剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是CTLA4的小分子拮抗剂。在一些实施例中，检查点抑制剂为抗CTLA4抗体。CTLA4是免疫检查点分子CD28-B7免疫球蛋白超家族的一部分，可负向调节T细胞活化，尤其是CD28依赖性T细胞应答。CTLA4与CD28竞争结合常见的配体，诸如CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，并以比CD28更高的亲和力与这些配体结合。阻断CTLA4活性(例如，使用抗CTLA4抗体)被认为可增强CD28介导的共刺激(导致T细胞活化/启动增加)、影响T细胞发育和/或消耗Tregs(诸如肿瘤内Tregs)。在一些实施例中，CTLA4拮抗剂为小分子、核酸、多肽(例如抗体)、碳水化合物、脂质、金属或毒素。
在一些实施例中，抗CTLA4抗体是伊匹木单抗(
Figure BDA0003767760730000681
CAS登记号：477202-00-9)。伊匹木单抗，也称为BMS-734016、MDX-010和MDX-101，是WO2001/14424中描述的全人单克隆IgG1 kappa抗CTLA4抗体(Bristol-Myers Squibb)。在一些实施例中，抗CTLA4抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链序列与以下重链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)，并且
(b)轻链序列与以下轻链序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)。
在一些实施例中，抗CTLA4抗体包含来自SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的六个HVR序列(例如，来自SEQ ID NO:19的三个重链HVR和来自SEQ ID NO:20的三个轻链HVR)。在一些实施例中，抗CTLA4抗体包含来自SEQ ID NO:19的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:20的轻链可变结构域。
抗CTLA4抗体的其他实例包括但不限于APL-509、AGEN1884和CS1002。在一些实施例中，CTLA-4抑制剂包括伊匹木单抗(IBI310、BMS-734016、MDX010、MDX-CTLA4、MEDI4736)、曲美木单抗(CP-675、CP-675,206)、APL-509、AGEN1884和CS1002、AGEN1181、阿巴西普(Orencia,BMS-188667,RG2077)、BCD-145、ONC-392、ADU-1604、REGN4659、ADG116、KN044、KN046或其衍生物。
在一些实施例中，免疫检查点抑制剂包括LAG-3抑制剂(例如，抗体、抗体缀合物或其抗原结合片段)。在一些实施例中，LAG-3抑制剂包括小分子、核酸、多肽(例如抗体)、碳水化合物、脂质、金属或毒素。在一些实施例中，LAG-3抑制剂包括小分子。在一些实施例中，LAG-3抑制剂包括LAG-3结合剂。在一些实施例中，LAG-3抑制剂包括抗体、抗体缀合物或其抗原结合片段。在一些实施例中，LAG-3抑制剂包括艾泰莫德(eftilagimod)α(IMP321、IMP-321、EDDP-202、EOC-202)、瑞拉利单抗(relatlimab)(BMS-986016)、GSK2831781(IMP-731)、LAG525(IΜΡ701)、TSR-033、EVIP321(可溶性LAG-3蛋白)、BI 754111、IMP761、REGN3767、MK-4280、MGD-013、XmAb22841、INCAGN-2385、ENUM-006、AVA-017、AM-0003、iOnctura抗-LAG-3抗体、Arcus Biosciences LAG-3抗体、Sym022、其衍生物或与前述任意一种竞争的抗体。
在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是单价的和/或单特异性的。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂是多价的和/或多特异性的。
在一些实施例中，免疫疗法包括免疫调节分子或细胞因子。需要免疫调节谱来触发有效的免疫应答并平衡受试者的免疫。在一些实施例中，免疫调节分子包含在本文详述的任何治疗中。合适的免疫调节细胞因子的实例包括但不限于干扰素(例如，IFNα、IFNβ和IFNγ)、白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12和IL-20)、肿瘤坏死因子(例如TNFα和TNFβ)、促红细胞生成素(EPO)、FLT-3配体、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、Rantes、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及其功能片段。在一些实施例中，与趋化因子受体即CXC、CC、C或CX3C趋化因子受体结合的任何免疫调节趋化因子可用于本发明的上下文中。趋化因子的实例包括但不限于MIP-3α(Lax)、MIP-3β、Hcc-1、MPIF-1、MPIF-2、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、GCP-2Groα、Gro-β、Nap-2、Ena-78、Ip-10、MIG、I-Tac、SDF-1和BCA-1(Blc)以及其功能片段。
本文所述方法(例如癌症免疫疗法)中利用的组合物可以通过任何合适的方法施用，包括例如静脉内、肌肉内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、腹膜、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、玻璃体内(例如，玻璃体内注射)施用，通过滴眼液、吸入、注射、植入、输注、连续输注、局部灌注直接沐浴靶细胞、导管、灌洗施用，以乳脂液或脂质组合物形式施用。本文描述的方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。在一些情况下，检查点抑制剂通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本文描述的癌症免疫疗法(例如，抗体、结合多肽和/或小分子)(任何另外的治疗剂)可以按照与良好医学实践一致的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。治疗剂不是必须的，而是任选地将其与目前用于预防或治疗所讨论疾患的一种或多种药剂同时配制和/或施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的检查点抑制剂的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。例如，作为一般提议，施用给人的免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体或抗LAG-3抗体的治疗有效量，无论是通过一次或多次施用，将在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些情况下，所用的抗体以例如约0.01mg/kg至约45mg/kg、约0.01mg/kg至约40mg/kg、约0.01mg/kg至约35mg/kg、约0.01mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约25mg/kg、约0.01mg/kg至约20mg/kg、约0.01mg/kg至约15mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg或约0.01mg/kg至约1mg/kg来每日、每周、每两周、每三周或每月施用。在一些情况下，抗体以15mg/kg施用。然而，其他剂量方案可能有用。在一种情况下，将本文描述的抗PD-L1抗体在21天周期的第1天(每三周，q3w)以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg或约1800mg的剂量施用于人。在一些情况下，抗PD-L1抗体MPDL3280A每三周(q3w)以1200mg静脉内施用。该剂量可以以单剂量或多剂量(例如，2或3个剂量)诸如输注的形式施用。与单次治疗相比，可减少组合治疗中抗体的剂量。疗法的进展可以通过常规技术容易地监测。
在一些实施例中，该方法进一步涉及向患者施用有效量的另外的治疗剂。在一些实施例中，另外的抗癌疗法包括手术、放射疗法、化学疗法、抗血管生成疗法、抗DNA修复疗法和抗炎疗法中的一种或多种。在一些情况下，该另外的治疗剂选自由以下项组成的组：抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、放射疗法、细胞毒性剂以及它们的组合。在一些情况下，癌症免疫疗法可以与化学疗法或化疗剂联合施用。在一些实施例中，化学疗法或化学治疗剂是基于铂的药剂(包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂和沙铂)。在一些情况下，癌症免疫疗法可以与放射治疗剂联合施用。在一些情况下，癌症免疫疗法可以与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些情况下，癌症免疫疗法可以与另一种免疫疗法或免疫治疗剂例如单克隆抗体联合施用。在一些情况下，另外的治疗剂为针对共刺激分子的激动剂。在一些情况下，另外的治疗剂为针对共抑制分子的拮抗剂。在一些情况下，癌症免疫疗法作为单一疗法施用。
化疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似KW-2189和CB1-TM1)；五加苷素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、氯苯哌嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，特别是加利车霉素γll和加利车霉素ωll；达尼霉素，包括达尼霉素A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐；艾司米星；以及新抑癌菌素发色团和相关的发色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-叠氮-5-氧代-L-正亮氨酸，阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉合-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、伊索比星、伊达比星、马塞罗霉素；丝裂霉素，诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、甲基丝裂霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、喋罗呤、三甲蝶呤；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟啶、依诺他宾、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素类药物，诸如米托坦、曲洛斯坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；亚胺醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；裂裥菌素；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(尤其是T-2毒素、维拉库林A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺万隆；替尼泊苷；依达曲塞；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-l l)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、甲基苄肼、普利霉素、吉西他滨、长春瑞滨、法尼基蛋白转移酶抑制剂、转铂和上述任何物质的药用盐、酸或衍生物。
可以与本公开组合的化疗药物的一些(非限制性)实例是卡铂(Paraplatin)、顺铂(Platinol,Platinol-AQ)、环磷酰胺(Cytoxan,Neosar)、多西他赛(Taxotere)、多柔比星(Adriamycin)、厄洛替尼(Tarceva)、依托泊苷(VePesid)、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(Gemzar)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec)、伊立替康(Camptosar)、甲氨蝶呤(Folex、Mexate、Amethopterin)、紫杉醇(Taxol、Abraxane)、索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、拓扑替康(Hycamtin)、长春新碱(Oncovin,Vincasar PFS)和长春花碱(Velban)。补充癌症治疗的另一大组潜在目标包括激酶抑制剂，因为癌细胞的生长和存活与激酶活性的失调密切相关。为了恢复正常激酶活性并因此减少肿瘤生长，使用了多种抑制剂。靶向激酶组包括受体酪氨酸激酶例如BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-a、PDGFR-β、cKit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK，细胞质酪氨酸激酶例如c-SRC、c-YES、Abl、JAK-2，丝氨酸/苏氨酸激酶例如ATM、Aurora A&B、CDKs、mTOR、PKCi、PLKs、b-Raf、S6K、STK1 1/LKB1和脂质激酶例如PI3K、SKI。小分子激酶抑制剂为例如PHA-739358、尼洛替尼、达沙替尼和PD166326、NSC 74341 1、拉帕替尼(GW-572016)、卡那替尼(CI-1033)、塞马替尼(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、Sutent(SU1 1248)、索拉非尼(BAY 43-9006)和来氟米特(SU101)。有关更多信息，请参见例如，Zhang et al.2009:Targetingcancer with small molecule kinase inhibitors.Nature Reviews Cancer 9,28-39”。小分子靶向治疗药物通常是癌细胞内突变、过表达或其他关键蛋白质上的酶结构域的抑制剂。突出且非限制性的实例是酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Gleevec/Glivec)和吉非替尼(Iressa)。
在一些实施例中，另外的抗癌疗法包括抗血管生成疗法。血管生成抑制剂可防止肿瘤生存所需的血管广泛生长(血管生成)。例如，肿瘤细胞为满足其不断增加的营养和氧气需求而促进的血管生成可以通过靶向不同的分子来阻断。可与本发明组合的血管生成介导分子或血管生成抑制剂的非限制性实例是可溶性VEGF(VEGF同种型VEGF121和VEGF165，受体VEGFR1、VEGFR2和共受体Neuropilin-1和Neuropilin-2)1和NRP-1、血管生成素2、TSP-1和TSP-2、血管抑素及相关分子、内皮细胞抑制素、血管生成抑素、钙网蛋白、血小板因子-4、TIMP和CDAI、甲基-1和甲基-2、IFNα、IFN-β和IFN-γ、CXCL10、IL-4、IL-12和IL-18、凝血酶原(三环结构域-2)、抗凝血酶III片段、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白、血管能抑素、多育曲菌素相关蛋白、休眠蛋白和药物，例如贝伐单抗、伊曲康唑、羧胺三唑、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、苏拉明、SU5416、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、血管抑制类固醇+肝素、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、2-甲氧基雌二醇、替可加兰、四硫代钼酸盐、沙利度胺、血小板反应蛋白、催乳素νβ3抑制剂、利诺胺和他喹莫德。在一些实施例中，已知的治疗候选物包括天然存在的血管生成抑制剂，包括但不限于血管抑制素、内皮细胞抑制素和血小板因子-4。在另一个实施例中，治疗候选物包括但不限于内皮细胞生长的特异性抑制剂，诸如TNP-470、沙利度胺和白细胞介素-12。其它抗血管生成剂包括中和血管生成分子的那些，诸如包括但不限于成纤维细胞生长因子的抗体或血管内皮生长因子的抗体或血小板衍生生长因子的抗体或EGF VEGF或PDGF的受体的抗体或其它类型的抑制剂。在一些实施例中，抗血管生成剂包括但不限于苏拉明及其类似物和替可加兰。在其他实施例中，抗血管生成剂包括但不限于中和血管生成因子受体的药剂或干扰血管基底膜和细胞外基质的药剂，包括但不限于金属蛋白酶抑制剂和血管抑制类固醇。另一组抗血管生成化合物包括但不限于抗粘附分子，诸如针对整联蛋白αvβ3的抗体。其它抗血管生成化合物或组合物包括但不限于激酶抑制剂、沙利度胺、伊曲康唑、羧胺三唑、CM101、IFN-α、IL-12、SU5416、血小板反应蛋白、软骨源性血管生成抑制因子、2-甲氧基雌二醇、四硫代钼酸盐、血小板反应蛋白、催乳素和利诺胺。在一个特定的实施例中，抗血管生成化合物是针对VEGF的抗体，诸如
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/贝伐单抗(Genentech)。
在一些实施例中，另外的抗癌疗法包括抗DNA修复疗法。在一些实施例中，DNA损伤修复和应答抑制剂选自PARP抑制剂、RAD51抑制剂或选自CHCK1、ATM或ATR的DNA损伤应答激酶抑制剂。在一些实施例中，另外的抗癌疗法包括辐射增敏剂。示例性辐射增敏剂包括缺氧辐射增敏剂，诸如米索硝唑、甲硝唑和藏红花酸二钠盐，一种有助于增加氧气扩散到缺氧肿瘤组织中的化合物。辐射增敏剂也可以是干扰碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、包括同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的重组修复和直接修复机制的DNA损伤应答抑制剂。SSB修复机制包括BER、NER或MMR途径，而DSB修复机制包括HR和NHEJ途径。辐射导致DNA断裂，如果不加以修复，就会致命。使用完整的DNA链作为模板，通过BER、NER和MMR机制的组合修复单链断裂。SSB修复的主要途径是利用称为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的相关酶家族的BER。因此，辐射增敏剂可以包括DNA损伤应答抑制剂，诸如聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)抑制剂。在一些实施例中，另外的抗癌疗法是DNA修复和应答途径抑制剂、PARP抑制剂(例如，Talazoparib、Rucaparib、Olaparib)、RAD51抑制剂(RI-1)或DNA损伤应答激酶抑制剂诸如CHCK1(AZD7762)、ATM(KU-55933、KU-60019、NU7026、VE-821)和ATR(NU7026)。
在一些实施例中，另外的抗癌疗法包括抗炎剂。在一些实施例中，抗炎剂是阻断、抑制或降低炎症或来自炎症信号通路的信号的药剂。在一些实施例中，抗炎剂抑制或降低以下任意一种或多种的活性：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、干扰素(IFN)例如IFNα、IFNβ、IFNγ、IFN-γ诱导因子(IGIF)、转化生长因子-β(TGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、肿瘤坏死因子TNF-α、TNF-β、TNF-RI、TNF-RII、CD23、CD30、CD40L、EGF、G-CSF、GDNF、PDGF-BB、RANTES/CCL5、IKK、NF-κB、TLR2、TLR3、TLR4、TL5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和/或其任何同源受体。在一些实施例中，抗炎剂是IL-1或IL-1受体拮抗剂，诸如a阿那白滞素
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利纳西普或卡纳单抗。在一些实施例中，抗炎剂是IL-6或IL-6受体拮抗剂，例如抗IL-6抗体或抗IL-6受体抗体，诸如托珠单抗
Figure BDA0003767760730000761
奥洛组单抗、克拉扎珠单抗、沙利姆单抗、西鲁库单抗、司妥昔单抗或ALX-0061。在一些实施例中，抗炎剂是TNF-α拮抗剂，例如抗TNFα抗体，诸如英夫利昔单抗
Figure BDA0003767760730000762
戈利木单抗
Figure BDA0003767760730000763
阿达木单抗
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聚乙二醇结合赛妥珠单抗
Figure BDA0003767760730000765
或依那西普。
在一些实施例中，抗炎剂是皮质类固醇。示例性皮质类固醇包括但不限于可的松(氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、
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HYDROCORT
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磷酸氢化可酮
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Figure BDA0003767760730000769
)、地卡特隆(地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、
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Figure BDA00037677607300007611
)、甲基强的松龙(6-甲基强的松龙、醋酸甲基强的松龙、甲基强的松龙琥珀酸钠、
Figure BDA00037677607300007612
Figure BDA00037677607300007613
)、强的松龙(
Figure BDA00037677607300007614
Figure BDA00037677607300007615
)和泼尼松(
Figure BDA00037677607300007616
Figure BDA00037677607300007617
)和双膦酸盐(例如，帕米膦酸盐
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和唑来膦酸
Figure BDA00037677607300007619
)。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，癌症免疫疗法的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一种情况下，癌症免疫疗法的施用和另外的治疗剂的施用在彼此相距约一个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、二天、三天、四天、五天或六天之内进行。
不希望受理论束缚，认为通过促进共刺激分子或抑制共抑制分子来增强T细胞刺激可促进肿瘤细胞死亡，从而治疗或延缓癌症的进展。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对共刺激分子的激动剂联合施用。在一些情况下，共刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些情况下，针对共刺激分子的激动剂是与CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127结合的激动剂抗体。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对共抑制分子的拮抗剂联合施用。在一些情况下，共抑制分子可包括CTLA-4(也称为CD1 52)、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精氨酸酶。在一些情况下，针对共抑制分子的拮抗剂是与CTLA-4、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精氨酸酶结合的拮抗剂抗体。
在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与针对CTLA-4的拮抗剂(也称为CD152)例如封闭抗体联合施用。在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与伊匹木单抗(也称为MDX-010、MDX-101或
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)联合施用。在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与曲美木单抗(tremelimumab)(也称为替西木单抗(ticilimumab)或CP-675,206)联合施用。在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与针对B7-H3的拮抗剂(也称为CD276)例如封闭抗体联合施用。在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与MGA271联合施用。在一些情况下，PD-L1轴结合拮抗剂可以与针对TGF-β的拮抗剂例如美替木单抗(也称为CAT-192)、夫苏木单抗(也称为GC1008)或LY2157299联合施用。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与包括过继转移表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，细胞毒性T细胞或CTL)的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与包括过继转移包括显性阴性TGFβ受体例如显性阴性TGFβII型受体的T细胞的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与包括HERCREEM方案的治疗联合施用(参见，例如，ClinicalTrials.gov标识符NCT00889954)。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对CD137(也称为TNFRSF9、4-1BB或ILA)的激动剂例如活化抗体联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对CD40的激动剂例如活化抗体联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与CP-870893联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对OX40(也称为CD134)的激动剂例如活化抗体联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗OX40抗体(例如，AgonOX)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对CD27的激动剂例如活化抗体联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与CDX-1127联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些情况下，IDO拮抗剂为1-甲基-D-色氨酸(也称为1-D-MT)。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗体-药物缀合物联合施用。在一些情况下，抗体药物缀合物包含mertansine或单甲基奥瑞他汀E(MMAE)。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗NaPi2b抗体-MMAE缀合物(也称为DNIB0600A或RG7599)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与曲妥珠单抗美坦新偶联物(也称为T-DM1、ado-trastuzumab emtansine或
Figure BDA0003767760730000781
Genentech)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与DMUC5754A联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗体-药物缀合物联合施用，该抗体-药物缀合物靶向内皮素B受体(EDNBR)，例如，针对EDNBR与MMAE缀合物的抗体。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗血管生成剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对VEGF的抗体例如VEGF-A联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与贝伐单抗(也称为
Figure BDA0003767760730000782
Genentech)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与针对血管生成素2(也称为Ang2)的抗体联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与MEDI3617联合施用。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗肿瘤剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CSF-1R(也称为M-CSFR或CD1 15)的药剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与抗-CSF-1R(也称为IMC-CS4)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与干扰素例如干扰素α或干扰素γ联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与Roferon-A(也称为重组干扰素α-2a)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与GM-CSF(也称为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、rhu GM-CSF、沙格司亭或
Figure BDA0003767760730000791
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-2(也称为阿地白介素或
Figure BDA0003767760730000792
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-12联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CD20的抗体联合施用。在一些情况下，靶向CD20的抗体为奥滨尤妥珠单抗(也称为GA101或
Figure BDA0003767760730000793
)或利妥昔单抗。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向GITR的抗体联合施用。在一些情况下，靶向GITR的抗体为TRX518。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与癌症疫苗联合施用。在一些情况下，癌症疫苗为肽癌症疫苗，其在一些情况下为个性化肽疫苗。在一些情况下，肽癌症疫苗为多价长肽、多肽、肽混合物、杂合肽或肽负载树突细胞疫苗(参见例如，Yamada et al.,Cancer Sci.104:14-21,2013)。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与佐剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与包括TLR激动剂例如Poly-ICLC(也称为
Figure BDA0003767760730000801
)、LPS、MPL或CpG ODN的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与肿瘤坏死因子(TNF)α联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-1联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与HMGB1联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-10拮抗剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-4拮抗剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与IL-13拮抗剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与HVEM拮抗剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与ICOS激动剂联合施用，例如，通过施用ICOS-L或针对ICOS的激动性抗体。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CX3CL1的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CXCL9的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CXCL10的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向CCL5的治疗联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与LFA-1或ICAM1激动剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与选择素激动剂联合施用。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与靶向疗法联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与B-Raf抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与威罗非尼(也称为
Figure BDA0003767760730000811
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与达拉菲尼(也称为
Figure BDA0003767760730000812
)联合施用。在某些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与厄洛替尼(也称为
Figure BDA0003767760730000813
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与MEK例如MEK1(也称为MAP2K1)或MEK2(也称为MAP2K2)的抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与考比替尼(也称为GDC-0973或XL-518)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与曲美替尼(也称为
Figure BDA0003767760730000814
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与K-Ras抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与c-Met抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与奥纳妥珠单抗(也称为MetMAb)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与Alk抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与AF802(也称为CH5424802或阿来替尼)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与BKM120联合施用。
在某些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与艾代拉里斯(idelalisib)(也称为GS-1101或CAL-101)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与哌立福辛(也称为KRX-0401)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与Akt抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与MK2206联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与GSK690693联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与GDC-0941联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与mTOR抑制剂联合施用。在某些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与西罗莫司(也称为雷帕霉素)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与替西罗莫司(也称为CCI-779或
Figure BDA0003767760730000821
)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与依维莫司(也称为RAD001)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与地磷莫司(也称为AP-23573、MK-8669或地福莫司)联用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与OSI-027联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与AZD8055联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与INK128联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与双重PI3K/mTOR抑制剂联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与XL765联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与GDC-0980联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与BEZ235(也称为NVP-BEZ235)联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与BGT226联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与GSK2126458联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与PF-04691502联合施用。在一些情况下，免疫检查点抑制剂，例如PD-L1轴结合拮抗剂和/或CTLA4拮抗剂，可以与PF-05212384(也称为PKI-587)联合施用。
虽然PD-L1轴结合拮抗剂和CTLA4拮抗剂在上文被称为示例性癌症免疫疗法，但这并非旨在限制；本公开的任何癌症免疫疗法可以与本文描述的或本领域中已知的任何其他治疗联合施用(取决于医学判断)。
计算机系统
本公开提供了经编程以实现本公开的方法的计算机系统。图2示出了计算机系统201，其被编程或以其他方式配置成例如，处理WGS数据以确定cfDNA分子的拷贝数畸变(CNA)和片段长度，处理CNA以确定CNA谱变化，处理片段长度以确定cfDNA分子的片段长度谱变化，处理MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，处理跨CpG岛的平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱，确定受试者在某个时间点的肿瘤分数，并检测受试者的肿瘤进展。计算机系统201可以调节本公开的诸如分析、计算和生成的各个方面，例如，处理WGS数据以确定cfDNA分子的拷贝数畸变(CNA)和片段长度，处理CNA以确定CNA谱变化，处理片段长度以确定cfDNA分子的片段长度谱变化，处理MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，处理跨CpG岛的平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱，确定受试者在某个时间点的肿瘤分数，并检测受试者的肿瘤进展。计算机系统201可以是用户的电子装置或相对于电子装置位于远程的计算机系统。该电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统201包括中央处理单元(CPU，在此也称为“处理器”和“计算机处理器”)205，其可以是单核或多核处理器，也可以是多个并行处理的处理器。计算机系统201还包括存储器或存储器位置210(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元215(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统和外围装置225，诸如高速缓冲、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器通信的通信接口220(例如，网络适配器)。存储器210、存储单元215、接口220和外围装置225通过通信总线(实线)与CPU 205通信，以形成母板。存储单元215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统201可以借助通信接口220可操作地耦合至计算机网络(“网络”)230。网络230可以是与互联网通信的互联网或因特网和/或外联网。在一些情况下，网络230是电信和/或数据网络。在一些实施例中，网络230可以包括局域网(“LAN”)，包括但不限于以太网、令牌环网等；广域网；无线广域网(“WWAN”)；虚拟网，诸如虚拟专用网(“VPN”)；互联网；内联网；外联网；无线网，包括但不限于在任何IEEE 802.11协议组、本领域已知的BluetoothTM协议和/或任何其他无线协议下运行的网络；和/或这些和/或其他网络的任何组合。网络230可以包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可以实现分布式计算，诸如云计算。例如，一个或多个计算机服务器可以使网络230上的云计算(“云”)能够执行本公开的诸如分析、计算和生成的各个方面，例如，处理WGS数据以确定cfDNA分子的拷贝数畸变(CNA)和片段长度，处理CNA以确定CNA谱变化，处理片段长度以确定cfDNA分子的片段长度谱变化，处理MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，处理跨CpG岛的平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱，确定受试者在某个时间点的肿瘤分数，并检测受试者的肿瘤进展。此类云计算可以由云计算平台提供，诸如例如
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Web Services(AWS),
Figure BDA0003767760730000842
Azure,
Figure BDA0003767760730000843
Cloud Platform和
Figure BDA0003767760730000844
cloud。在某些情况下，网络230借助计算机系统201可以实现对等网络，这可以使耦合至计算机系统201的装置能够充当客户端或服务器。
CPU 205可以执行存储在存储器210上的机器可读指令序列，其可以体现在程序或软件中。指令由CPU 205执行，其可以随后对CPU 205进行编程或以其他方式配置以实现本公开的方法。CPU 205执行的操作的实例可以包括获取、解码、执行和写回。
CPU 205可以是电路的一部分，诸如集成电路。系统201的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在某些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)、微处理器、内核或存储芯片。应当理解，CPU可以是任何类型的电子电路。
存储单元215可以存储文件，诸如驱动程序、库和已保存的程序。存储单元215可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统201可以包括在计算机系统201外部的一个或多个另外的数据存储单元，诸如位于通过内联网或互联网与计算机系统201通信的远程服务器上。
计算机系统201可以通过网络230与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统201可以与用户(例如，医生、护士、看护人、患者或受试者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如便携式PC)、平板电脑或平板PC(例如
Figure BDA0003767760730000855
iPad、
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Galaxy Tab)、电话、智能手机(例如
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iPhone、支持
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的装置、
Figure BDA0003767760730000854
)或个人数字助理。用户可以通过网络230访问计算机系统201。
如本文描述的方法可以通过存储在诸如计算机系统201的电子存储位置，例如存储器210或电子存储单元215上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用过程中，代码可以由处理器205执行。在一些情况下，可以从存储单元215检索代码并将其存储在存储器210上以供处理器205随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元215，并且将机器可执行指令存储在存储器210上。
代码可以被预编译和配置成与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时编译。可以用编程语言来提供代码，可选择该编程语言以使代码能够以预编译或编译后的方式执行。
本文提供的系统和方法的方面，诸如计算机系统201，可以体现在编程中。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，通常以机器(或处理器)可执行代码和/或在一种机器可读介质类型上承载或体现的相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，它们可以提供非暂时性存储以随时进行软件编程。软件的全部或部分有时可以通过互联网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以实现将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如通过本地装置之间的物理接口、通过有线和光地线网络以及通过各种空中链路使用。承载这种波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时的、有形的“存储”介质，诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可以采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机等中的任何存储装置，诸如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的电线。载波传输介质可以采用电或电磁信号，或声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸磁带、任何其他带有孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒式磁带、传输数据或指令的载波、传输此类载波的电缆或链路或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可能涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。
计算机系统201可以包括电子显示器235或与之通信，电子显示器235包括用户界面(UI)240，用于提供例如经确定的CNA和cfDNA分子的片段长度、经确定的CNA谱变化、经确定的片段长度谱变化、经确定的肿瘤分数，检测到的受试者的肿瘤进展或未进展，检测到的肿瘤状态(例如，进展或未进展)，随时间推移的肿瘤进展/肿瘤未进展状态(例如，以数字方式或作图提供)，经确定的甲基化状态或对其进行更改等。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)。GUI可以包括但不限于用于在移动装置上执行的基于网络的用户界面或基于应用的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在中央处理单元205执行时通过软件来实现。例如，该算法可以处理WGS数据以确定cfDNA分子的拷贝数畸变(CNA)和片段长度，处理CNA以确定CNA谱变化，通过量化来自患者在治疗过程中的多个样品中的特异性CNA信号强度变化的差异，处理片段长度以确定片段长度谱变化(显示出不太容易出现由基于CNA分别量化单独样品中的肿瘤分数而引起的某些错误模式，参见图15A和15B)，处理MS数据以确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，处理跨CpG岛的平均甲基化分数谱以确定甲基化分数谱，确定受试者在基于正交数据训练的时间点的肿瘤分数，并检测受试者的肿瘤进展。
虽然这被描述为一种统计建模技术，但上述过程也可以通过修改各种众所周知的机器学习技术来执行。
枚举实施例
以下枚举实施例代表本发明的一些方面。
1.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于第一多个片段长度和第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
2.如实施例1的方法，其中第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
3.如实施例1的方法，其中获得第一WGS数据包括对第一多个cfDNA分子进行测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行测序以产生第二多个测序读数。
4.如实施例3的方法，其中测序在不超过约25X的深度进行。
5.如实施例3的方法，其中测序在不超过约10X的深度进行。
6.如实施例3的方法，其中测序在不超过约8X的深度进行。
7.如实施例3的方法，其中测序在不超过约6X的深度进行。
8.如实施例3的方法，其进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
9.如实施例1的方法，其进一步包括针对多个基因组区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
10.如实施例9的方法，其中富集包括扩增第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
11.如实施例10的方法，其中扩增包括选择性扩增。
12.如实施例10的方法，其中扩增包括通用性扩增。
13.如实施例9的方法，其中富集包括选择性地分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分。
14.实施例13的方法，其中选择性地分离第一或第二多个cfDNA分子的至少一部分包括使用多个探针，多个探针中的每一个与多个基因组区域的基因组区域的至少一部分具有序列互补性。
15.如实施例13的方法，其中至少一部分包含肿瘤标志物基因座。
16.如实施例15的方法，其中至少一部分包含多个肿瘤标志物基因座。
17.如实施例16的方法，其中多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(TCGA)或癌症体细胞突变目录的基因座(COSMIC)。
18.如实施例3的方法，其中确定第一多个CNA包括确定在第一多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度，并且其中确定第二多个CNA包括确定在第二多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度。
19.如实施例18的方法，其进一步包括针对GC含量和/或可映射性偏差来校正第一多个CNA或第二多个CNA。
20.如实施例19的方法，其中校正包括使用统计建模分析。
21.如实施例20的方法，其中统计建模分析包括LOESS回归或贝叶斯模型。
22.如实施例18的方法，其中多个基因组区域包括参考基因组的具有预定大小的非重叠基因组区域。
23.如实施例22的方法，其中预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
24.如实施例18的方法，其中多个基因组区域包括至少约1,000个不同的基因组区域。
25.如实施例24的方法，其中多个基因组区域包括至少约2,000个不同的基因组区域。
26.如实施例1的方法，其中确定CNA谱变化包括将第一多个CNA和第二多个CNA与多个参考CNA值进行比较，其中多个参考CNA值从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
27.如实施例26的方法，其中另外的受试者包括一个或多个未患有癌症的受试者。
28.如实施例26的方法，其中另外的受试者包括一个或多个不具有肿瘤进展的受试者。
29.如实施例26的方法，其中多个参考CNA值是使用受试者的在第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的另外的体液样品而获得。
30.如实施例1的方法，其进一步包括过滤掉满足预定标准的第一多个CNA和第二多个CNA的子集。
31.如实施例30的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约1个标准偏差的差时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。
32.如实施例31的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约2个标准偏差的差时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。
33.如实施例31的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约3个标准偏差的差时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。
34.如实施例30的方法，其进一步包括：基于给定CNA值与对应的局部平均片段长度之间的Spearman秩相关性过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。
35.如实施例34的方法，其进一步包括：当Spearman秩相关系数(Spearman's rho)小于-0.1时，过滤掉第一多个CNA或第二多个CNA值的给定CNA值。
36.如实施例1的方法，其进一步包括：基于文库或基因组位置将第一多个片段长度或第二多个片段长度归一化。
37.如实施例1的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时，检测到肿瘤状态包括受试者的肿瘤进展。
38.如实施例1的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时，检测到受试者的主要分子学应答(MMR)。
39.如实施例1至38中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
40.如实施例39的方法，其进一步包括：以至少约70％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
41.如实施例40的方法，其进一步包括：以至少约90％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
42.如实施例1至41中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
43.如实施例42的方法，其进一步包括：以至少约70％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
44.如实施例43的方法，其进一步包括：以至少约90％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
45.如实施例44的方法，其进一步包括：以至少约98％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
46.如实施例1至45中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
47.如实施例46的方法，其进一步包括：以至少约70％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
48.如实施例47的方法，其进一步包括：以至少约90％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
49.如实施例1至48中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
50.如实施例49的方法，其进一步包括：以至少约70％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
51.如实施例50的方法，其进一步包括：以至少约90％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
52.如实施例1至51中任一项的方法，其进一步包括：以至少约0.60的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤状态。
53.如实施例52的方法，其进一步包括：以至少约0.75的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤状态。
54.如实施例53的方法，其进一步包括：以至少约0.90的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤状态。
55.如实施例1至54中任一项的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。
56.如实施例1至55中任一项的方法，其进一步包括：基于受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗以治疗受试者的癌症。
57.如实施例56的方法，其中治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
58.如实施例1至57中任一项的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
59.如实施例1至58中任一项的方法，其中第一WGS数据和第二WGS数据是通过焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、连接测序、杂交测序、大规模平行测序、链终止测序、单分子实时测序、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)、组合探针锚定合成或基于杂交捕获的测序而获得。
60.如实施例1至59中任一项的方法，其中第一WGS数据和第二WGS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
61.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；和(ii)第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至数据库，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于第一多个片段长度和第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
62.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，方法包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于第一多个片段长度和第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于CNA谱变化和片段长度谱变化来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
63.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱与跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
64.如实施例63的方法，其中第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
65.如实施例63的方法，其中获得第一MS数据包括对第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
66.如实施例65的方法，其中甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。
67.如实施例65的方法，其中甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。
68.如实施例65的方法，其中甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
69.如实施例65的方法，其中甲基化测序在不超过约25X的深度进行。
70.如实施例65的方法，其中甲基化测序在不超过约10X的深度进行。
71.如实施例65的方法，其中甲基化测序在不超过约8X的深度进行。
72.如实施例65的方法，其中甲基化测序在不超过约6X的深度进行。
73.如实施例65的方法，其进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
74.如实施例65的方法，其进一步包括针对基因组的区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
75.如实施例74的方法，其中富集包括扩增第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
76.如实施例75的方法，其中扩增包括选择性扩增。
77.如实施例75的方法，其中扩增包括通用性扩增。
78.如实施例74的方法，其中富集包括选择性地分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分。
79.如实施例78的方法，其中选择性地分离第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子的至少一部分包括使用多个探针，该多个探针中的每一个与基因组的区域的至少一部分具有序列互补性。
80.如实施例78的方法，其中至少一部分包含肿瘤标志物基因座。
81.如实施例80的方法，其中至少一部分包含多个肿瘤标志物基因座。
82.如实施例81的方法，其中多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(TCGA)或癌症体细胞突变目录的基因座(COSMIC)。
83.如实施例63的方法，其中基因组的区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
84.如实施例63的方法，其中基因组的区域包括基因组的多个非重叠区域。
85.如实施例84的方法，其中基因组的多个非重叠区域具有预定大小。
86.如实施例85的方法，其中预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
87.如实施例84的方法，其中基因组的多个非重叠区域包括至少约1,000个不同区域。
88.如实施例87的方法，其中基因组的多个非重叠区域包括至少约2,000个不同区域。
89.如实施例63的方法，其中确定第一肿瘤分数或第二肿瘤分数包括将甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
90.如实施例89的方法，其中另外的受试者包括一个或多个患有癌症的受试者。
91.如实施例89的方法，其中另外的受试者包括一个或多个未患有癌症的受试者。
92.如实施例89的方法，其中另外的受试者包括一个或多个具有肿瘤进展的受试者。
93.如实施例89的方法，其中另外的受试者包括一个或多个不具有肿瘤进展的受试者。
94.如实施例89的方法，其中一个或多个参考甲基化分数谱是使用受试者的在第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的另外的体液样品而获得。
95.如实施例63的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时，检测到肿瘤状态包括受试者的肿瘤进展。
96.如实施例63的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时，检测到受试者的主要分子学应答(MMR)。
97.如实施例63至96中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
98.如实施例97的方法，其进一步包括：以至少约70％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
99.如实施例98的方法，其进一步包括：以至少约90％的灵敏度检测受试者的肿瘤状态。
100.如实施例63至99中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
101.如实施例100的方法，其进一步包括：以至少约70％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
102.如实施例101的方法，其进一步包括：以至少约90％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
103.如实施例102的方法，其进一步包括：以至少约98％的特异度检测受试者的肿瘤状态。
104.如实施例63至103中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
105.如实施例104的方法，其进一步包括：以至少约70％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
106.如实施例105的方法，其进一步包括：以至少约90％的阳性预测值(PPV)检测受试者的肿瘤状态。
107.如实施例63至106中任一项的方法，其进一步包括：以至少约50％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
108.如实施例107的方法，其进一步包括：以至少约70％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
109.如实施例108的方法，其进一步包括：以至少约90％的阴性预测值(NPV)检测受试者的肿瘤状态。
110.如实施例63至109中任一项的方法，其进一步包括：以至少约0.60的曲线下面积(AUC)检测受试者的状态进展。
111.如实施例110的方法，其进一步包括：以至少约0.75的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤状态。
112.如实施例111的方法，其进一步包括：以至少约0.90的曲线下面积(AUC)检测受试者的肿瘤状态。
113.如实施例63至112中任一项的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。
114.如实施例63至113中任一项的方法，其进一步包括：基于受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗受试者的癌症。
115.如实施例114的方法，其中第二治疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
116.如实施例63至115中任一项的方法，其中第一多个cfDNA分子和第二多个cfDNA分子来自受试者的免疫细胞。
117.如实施例63至116中任一项的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
118.如实施例63至117中任一项的方法，其中第一MS数据和第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
119.如实施例1至60和63至118中任一项的方法，其中受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
120.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；和(ii)跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至数据库，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱与跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
121.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，方法包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱与跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
122.如实施例120的计算机系统或如实施例121的非暂时性计算机可读介质，其中检测到的肿瘤进展至少部分地基于对相应甲基化分数谱的一种或多种统计建模分析。
123.如实施例122的系统或介质，其中一种或多种统计建模分析包括线性回归、简单回归、二元回归、贝叶斯线性回归、贝叶斯建模、多项式回归、高斯过程回归、高斯建模、逻辑回归或非线性回归。
124.如实施例122或如实施例123的系统或介质，其中一种或多种统计建模分析将检测到的肿瘤进展与得自具有已知肿瘤分数的样品的MS数据、得自纯肿瘤样品的MS数据或得自健康样品的MS数据进行比较。
125.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一MS数据确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二MS数据确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱与跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
126.如实施例125的方法，其中第一甲基化谱和第二甲基化谱包括5-羟甲基胞嘧啶状态、5-甲基胞嘧啶状态、基于富集的甲基化评定、中值甲基化水平、众数甲基化水平、最大甲基化水平或最小甲基化水平。
127.如实施例125或如实施例126的方法，其中第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
128.如实施例125的方法，其中获得第一MS数据包括对第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
129.如实施例128的方法，其中甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。
130.如实施例128的方法，其中甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。
131.如实施例128的方法，其中甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
132.如实施例128的方法，其进一步包括将第一多个测序读数或第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
133.如实施例128的方法，其进一步包括针对基因组的区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
134.如实施例128的方法，其中基因组的区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
135.如实施例128的方法，其中基因组的区域包括基因组的多个非重叠区域。
136.如实施例128的方法，其中确定第一肿瘤分数或第二肿瘤分数包括将甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
137.如实施例128的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4或大于5时，检测到肿瘤状态包括受试者的肿瘤进展。
138.如实施例128的方法，其进一步包括：当第一肿瘤分数或第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4或小于0.5时，检测到受试者的主要分子学应答(MMR)。
139.如实施例128至138中任一项的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定受试者的肿瘤未进展。
140.如实施例128至139中任一项的方法，其进一步包括：基于受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗受试者的癌症。
141.如实施例128至140中任一项的方法，其中第一多个cfDNA分子和第二多个cfDNA分子来自受试者的免疫细胞。
142.如实施例128至141中任一项的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
143.如实施例128至142中任一项的方法，其中第一MS数据和第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
144.如实施例128至143中任一项的方法，其中受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
145.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；和(ii)跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至数据库，其中一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨一个或多个CpG岛的第一甲基化谱与跨一个或多个CpG岛的第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
146.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，该机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，方法包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱与跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
147.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；
基于第一MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；
基于第二MS数据确定基因组的区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于第一多个片段长度和第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
将跨一个或多个CpG岛的第一平均甲基化分数谱与跨一个或多个CpG岛的第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
148.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的第一体液样品获得或衍生，其中第一时间点是在向受试者施用经配置用于治疗癌症的治疗法之前；
基于第一WGS数据，确定(i)第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中第一多个cfDNA分子是在第一时间点从受试者的体液样品获得或衍生；
基于第一MS数据确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的第二体液样品获得或衍生，其中第二时间点是在向受试者施用治疗法之后；
基于第二WGS数据，确定(iii)第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中第二多个cfDNA分子是在第二时间点从受试者的体液样品获得或衍生；
基于第二MS数据确定基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将第一多个CNA与第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于第一多个片段长度和第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
将跨一个或多个基因座的第一甲基化谱与跨一个或多个基因座的第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于CNA谱变化、片段长度谱变化和相应甲基化分数谱来确定受试者在第一时间点的第一肿瘤分数或受试者在第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于第一肿瘤分数或第二肿瘤分数来检测受试者的肿瘤状态。
149.如实施例148的方法，其中第一甲基化谱和第二甲基化谱包括5-羟甲基胞嘧啶状态、5-甲基胞嘧啶状态、基于富集的甲基化评定、中值甲基化水平、众数甲基化水平、最大甲基化水平或最小甲基化水平。
150.如实施例147至149中任一项的方法，其中第一WGS数据和第一MS数据是从同一样品获得的。
151.如实施例147至149中任一项的方法，其中第一WGS数据和第一MS数据是从不同样品获得的。
152.如实施例147至151中任一项的方法，其中第二WGS数据和第二MS数据是从同一样品获得的。
153.如实施例147至151中任一项的方法，其中第二WGS数据和第二MS数据是从不同样品获得的。
154.如实施例147至153中任一项的方法，其中第一体液样品或第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
155.如实施例147至154中任一项的方法，其中获得第一WGS数据包括对第一多个cfDNA分子进行测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行测序以产生第二多个测序读数。
156.如实施例147至155中任一项的方法，其进一步包括针对多个基因组区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
157.实施例155或实施例156的方法，其中确定第一多个CNA包括确定在第一多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度，并且其中确定第二多个CNA包括确定在第二多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度。
158.如实施例147至157中任一项的方法，其中确定CNA谱变化包括将第一多个CNA和第二多个CNA与多个参考CNA值进行比较，其中多个参考CNA值从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
159.如实施例147至158中任一项的方法，其中第一WGS数据和第二WGS数据是通过焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、连接测序、杂交测序、大规模平行测序、链终止测序、单分子实时测序、聚合酶克隆测序(Polony sequencing)、组合探针锚定合成或基于杂交捕获的测序而获得。
160.如实施例147至159中任一项的方法，其中获得第一MS数据包括对第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得第二WGS数据包括对第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
161.如实施例147至160中任一项的方法，其进一步包括针对基因组的区域富集第一多个cfDNA分子或第二多个cfDNA分子。
162.如实施例147至161中任一项的方法，其中基因组的区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
163.如实施例147至162中任一项的方法，其中确定第一肿瘤分数或第二肿瘤分数包括将甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
164.如实施例147至163中任一项的方法，其进一步包括：基于受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗以治疗受试者的癌症。
165.如实施例164的方法，其中治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
166.如实施例147至165中任一项的方法，其中第一多个cfDNA分子和第二多个cfDNA分子来自受试者的免疫细胞。
167.如实施例147至166中任一项的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
168.如实施例147至167中任一项的方法，其中第一MS数据和第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
169.如实施例147至168中任一项的方法，其中受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
170.如实施例63至119、125至144和147至169中任一项的方法，其中基因组的区域包括一种或多种MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因，例如人MAGE基因。
171.如实施例63至119、125至144和147至169中任一项的方法，其中基因组的区域包括对应于一种或多种MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因的一种或多种启动子，例如人MAGE基因。
实例
实例1：通过晚期实体瘤中的全基因组循环肿瘤DNA在早期检测分子疾病进展
晚期实体瘤患者的治疗应答评定可能很复杂，并且其他评定方法可能需要更精确的早期疾病评定。当前的指南可能依赖于成像，这可能会施加一些限制，诸如在确定治疗效果之前需要很长时间。使用本公开的方法和系统，全基因组(WG)循环肿瘤DNA(ctDNA)的连续变化被用于在治疗过程的早期检测疾病进展。
入组了一组97名晚期癌症患者，并在开始新治疗之前和之后从每位患者采集了血液样品。制备血浆细胞游离DNA文库用于WG或WG亚硫酸氢盐测序。量化ctDNA分数的纵向变化，以二元方式来确定分子进展或应答(例如，“进展”或“未进展”)。研究终点与第一次随访成像(FUI)和无进展生存期(PFS)的分层一致。
结果表明，与其他没有早期分子进展的患者(n＝78；中位数＝263天，风险比(HR)＝12.6[95％置信区间(CI)为5.8至27.3]，对数秩P<1E-10，从分析中排除5)相比，具有早期分子进展的患者(n＝14；中位数＝62天)有更短的无进展生存期(PFS)。所有具有分子进展的病例均经FUI证实，分子进展早于FUI的中位数为40天。在治疗中位数为24天时，以54％的灵敏度和100％的特异度在患者中确定了临床进展。
基于ctDNA数据确定的分子进展，在随访成像前约6周成功检测到癌症患者的疾病进展，这些治疗的病例具有高特异性。这种方法可以使早期疗程改变为潜在有效的治疗，从而避免与无效治疗周期相关的副作用和成本。
本公开的方法和系统可以具有显著的过渡相关性。早期评定晚期实体瘤治疗应答的工具可能需要改进。使用本公开的方法和系统，进行WG ctDNA的基线和早期系列评定以在标准治疗临床和放射影像学评定之前预测治疗应答。结果表明，基于血液的预测方法在成像前大约6周可靠地确定了分子进展，在多种不同的肿瘤类型和治疗类型中具有非常高的特异度和阳性预测值。与未进展患者相比，有分子进展患者的无进展生存期(PFS)显著缩短。此外，肿瘤分数比的大量降低与显著的持久益处相关。总的来说，这些结果表明血液中与癌症相关的变化先于临床或影像学变化，并且可以在治疗过程的早期告知临床管理的变化，以改善长期患者结果并限制成本。
目前评估癌症患者晚期实体瘤治疗应答的标准治疗可基于患者的身体检查、患者报告的症状和患者的定期放射影像学肿瘤评定。然而，这些方法可能存在局限性，因为疾病的细微变化通常是无症状的，并且与频繁成像相关的成本、不确定性和患者焦虑相当大。在临床试验中，缓解标准是标准化的(例如，RECIST、irRECIST)，通过将治疗开始前的基线扫描与定期随访成像(FUI)与预先指定的应答标准进行比较来指导评估。这些标准会受到随时间推移测量的可靠性、疾病部位测量的难度(例如，骨或胸腔积液)的限制以及区分伪进展(例如，进展的假阳性病例)和真实进展(例如，真阳性病例)的挑战。因此，鉴于新的治疗方式的出现以及如何最好地管理临床治疗、最大限度地减少对患者的毒性和控制成本等问题，改进的监测治疗应答的方法可能是有利的。在这里，评估了一种使用WG ctDNA动态变化的基于血液的方法，用于早期评定治疗应答。
液体活检测定可以分析循环细胞游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)、核糖核酸(RNA)、蛋白质、外泌体、微生物组或代谢物。ctDNA可能起源于经历凋亡、坏死或涉及核酸分泌以促进远处转移和基因表达的潜在活性机制的癌细胞。ctDNA的量可与肿瘤负荷和/或更晚期疾病相关，也可受肿瘤类型、起源、转移部位和治疗的影响。ctDNA和非肿瘤cfDNA之间可有几个区别特征。具体而言，与cfDNA相比，ctDNA可包含以下一项或多项：肿瘤特异性体细胞点突变、结构变异、较短片段长度、有偏差的片段开始和结束位置以及表观遗传模式的变化。拷贝数畸变(CNA)，可包括基因组的部分的缺失、重复或更高拷贝扩增，可以是我们在晚期疾病患者中的整个基因组不同部位观察到的常见结构变异形式。此外，可以通过低深度下一代测序(NGS)在来自患者的cfDNA中检测到CNA，在晚期疾病患者中检测到CNA的比率更高。然而，晚期癌症患者中的CNA随时间的变化可能仍在研究中。
最近，人们对评估ctDNA在晚期实体瘤中的潜在临床应用产生了显著的兴趣。例如，可以证明ctDNA基因组改变和突变等位基因频率的预后值作为肿瘤负荷的替代物。在辅助疗法中，手术后残留的ctDNA(例如，指示微小残留疾病)可与跨多种不同肿瘤类型的疾病复发有关。在晚期疾病中，经过充分验证的临床用途可以来鉴定具有已知药物靶标的驱动突变。此外，可以在血液中鉴定耐药性突变，指导临床管理。ctDNA在肿瘤应答评定中的潜在作用可以在黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤类型中进行评估；然而，常规评定的临床效用可能尚未确定。
在这里，在一个前瞻性入组的晚期泛癌症群组中，与常规临床和放射影像学评定疾病相比，全基因组cfDNA分析被作为治疗过程早期疾病进展的分子标志物或指标进行。与分析特定基因相比，这种方法利用了基因组中的CNA和片段化模式，这是一种在多种不同肿瘤类型中具有广泛潜在临床应用的技术。此外，对于患者子集，亚硫酸氢盐转化作为测定的一部分进行，这提供了对全基因组甲基化变化的了解。据推测，血液中癌症相关信号的早期变化将预测第一次FUI时的应答状态，并且信号动态变化的幅度将提供各种实体肿瘤类型和治疗的长期预后信息。
受试者和患者的研究样品如下获得。这里的研究样品代表了当前积累的纵向观察研究的子集。从2017年5月到2018年12月，参与者(18岁以上)从美国的五个肿瘤中心(TMPN-Cancer Care,Redondo Beach,CA；Scripps-California Cancer Associates,San Diego,CA；Sharp Memorial Hospital,San Diego,CA；Summit Cancer Centers,Post Falls,ID；Robert H.Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University,Chicago,IL)前瞻性入组并一直持续到2019年6月(如表1所示)。纳入标准包括以下内容：诊断为非血液学和手术不可切除的晚期肿瘤(III期或更高)；开始一种医生选择的新系统治疗方案；存在通过影像学可测量或可评估的疾病。要被纳入该群组，参与者需要从至少两个时间点采集静脉血样品：一个在基线(时间＝T0，治疗开始之前)以及另一个在第2周期(时间＝T1)和/或第3周期之前(时间＝T2，如图3A所示)。这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到了西北大学、夏普纪念医院和西方机构审查委员会的批准。在参与研究之前，从每位患者那里获得了知情同意书。
Figure BDA0003767760730001121
*60名参与者有两个治疗后时间点
表1：参与者特征。血样分布和随访时间与研究中的治疗时间相关，2017年5月至2019年6月
图3A-3B显示了根据一些实施例的临床环境的概览。图3A显示了比较放射影像学应答评定和cfDNA评定分子应答的潜在用途的图表。图3B显示了研究中患者的成像和采血时间。
响应状态的评估如下进行。参与者在基线和再次在第一次随访时接受放射学评定，根据标准治疗常规临床评定确定。该研究的主要终点是放射影像学进展的证据(例如，由实体瘤应答评估标准(RECIST)1.1版确定)或临床应答评定。影像学可测量疾病由主治医师设施和独立放射科医师解释，他们对分子应答的评定不知情。当由于无法评估或缺少影像学研究而无法确定RECIST结果时，使用临床应答评估。临床应答被定义为治疗改变前医生的结果评定，分为临床进行性疾病(Pd)、应答性疾病(非Pd)、疾病稳定(非PD)或评定太早。
PFS定义为从开始治疗到首次记录PD或因任何原因导致死亡的时间，以先发生者为准。已知最后存活的和未进展的患者在最后一次接触之日被审查。如果患者不再参与研究并且其状态未知(不可评定的病例)，则将其视为失随访。
样品制备如下进行。在每个时间点，在Streck细胞游离DNA采血管(BCT)中收集10mL全血。通过以1600x g离心15分钟分离血浆，然后自收集时7天内以2500x g离心10分钟。使用Qiagen QIAmp MinElute ccfDNA试剂盒从血浆中提取cfDNA并储存在-80℃直至文库制备。对于每位患者，使用用于全基因组测序(WGS)的KAPA HyperPrep文库制备试剂盒(n＝54名患者)或Nugen Ovation Ultralow Methyl-Seq全基因组亚硫酸氢盐测序试剂盒(WGBS)(n＝43名患者)制备文库。进入文库制备的平均输入cfDNA为20纳克(ng)。文库在Illumina HiSeq X平台上进行测序，平均深度为20X(范围为6X至29X)。
生物信息学方法如下进行。测量肿瘤分数比(TFR)以使用CNA评定ctDNA的变化和cfDNA片段长度的局部变化，两者均从测序数据评定。使用基于BWA、sambamba和samtools的自定义生物信息学渠道将读数与人类基因组(GRCh37)对齐。然后对读数进行重复数据删除，并使用deepTools软件包纠正GC偏差。使用基于ichorCNA和自定义算法的渠道检测CNA。通过对文库中片段长度分布的中位数和多个未受影响文库的基因组位置进行归一化来计算归一化片段长度。使用取自当前或先前未诊断出任何恶性肿瘤的44名个体的健康正常样品为每个测序方案建立CNA和片段长度的背景信号(如表S1所示)。为了最大限度地提高CNA的灵敏度，同时防止假阳性检测，局部平均片段长度和拷贝数之间的Spearman秩相关性被用作取消CNA判读集的资格。
Figure BDA0003767760730001141
表S1：来自健康参与者群组的纵向样品，包括使用WGS和WGBS处理的44名健康参与者
通过直接比较患者时间点之间CNA衍生的TF估计值来评定ctDNA随时间的变化可能并不总是可靠的，因为读数深度水平对应于哪些结构事件可能存在歧义。例如，在存在不明确的中性水平的高度突变的肿瘤中，两个区域可能被称为中性区和重复区，或杂合缺失和中性区。为了规避这一挑战，将在多个时间点检测到的CNA与线性模型进行纵向比较以量化TFR。为了确定可靠的判读，将测量的变化与模拟背景模型进行比较，并要求超过3的Z分数阈值。来自44名健康参与者的样品(表S1)没有纵向的比较显示TFR的显著变化。例如，图8显示了根据一些实施例的针对健康个体的纵向WGS数据。该图包括显示在初始抽血(顶部)和34天后(底部)未检测到参与者LB-S00129的CNA的全基因组图，如图4A中。在任一时间点显示肿瘤分数可信增加(例如，如TFR大于1所示)的病例被归类为分子进展。主要分子应答(MMR)定义为TFR<0.1。
如下进行统计分析。为计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，真阳性定义为检测显示分子进展的病例，在第一次FUI时也被临床或RECIST 1.1评估为PD；真阴性是在第一次随访时测定和临床评估都没有判读PD的病例。假阳性和假阴性被定义为分子应答评定与第一次FUI不一致的病例，分别具有临床或放射影像学进展或缺乏临床或放射影像学进展。这些灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值指标的置信区间是使用威尔逊评分区间法计算的。
使用Kaplan-Meier方法生成生存曲线，并使用对数秩检验评定分子进展者和未进展者之间PFS的差异。Cox比例风险模型用于评定不同变化幅度对PFS的影响。使用R生存包2.41-3版本进行生存统计分析，使用python scipy包1.1.0版本确定其他统计分析。
患者特征如下获得。共有97名符合研究纳入标准并具有适当长期随访数据的晚期癌症患者，获得了样品并对其进行了测序以进行分析。五名参与者的基线血样测序失败，因此他们被排除在外。其余92名具有NGS和临床结果数据的患者被纳入该分析。中位年龄为70岁，55％为女性(如表1所示)。约一半的参与者(52％)接受了一线治疗，25％的参与者接受了二线治疗。大多数患者患有肺癌(44％)或乳腺癌(27％)，其余为胃肠道癌(15％)、泌尿生殖道癌(6.5％)、黑色素瘤(6.5％)和肉瘤(1％)。在研究期间，所有参与者的46％接受了化学疗法(加或不加抗体疗法)，37％接受了加或不加化学疗法的免疫疗法(n＝34，表1，表S2)。第一次FUI发生在治疗开始后71天(中位值)(图3B，范围为26至208天)。三名参与者进行了不可评估的影像学研究，并在第12周被评定为临床非PD；两名参与者在治疗改变之前没有进行影像学研究，并在第9周和第19周由主治医师评定为临床PD。整个群组的中位随访时间为140天(范围为35至645天)。
Figure BDA0003767760730001151
Figure BDA0003767760730001161
Figure BDA0003767760730001171
表S2：研究治疗列表，包括按药物名称和药物类别的参与者摘要
在开始治疗之前收集所有患者的基线血液样品(图3B，中位数＝治疗开始后0天，最小值＝治疗开始前19天)。收集每位患者的一个或两个治疗后样品，在第二个治疗周期之前在治疗开始后的中位数21天(n＝86，范围为9至40天)收集样品T1，并在到第三个治疗周期之前的中位数42天(n＝66，范围为37至84天)收集样品T2。收集了60名患者的两种治疗后样品。
图4A-4E显示了根据一些实施例对ctDNA进行连续评定以确定分子进展。图4A显示了针对患者LS030178检测到的CNA的全基因组图。T0基线抽血在治疗开始前13天开始采集，而T1基线抽血在治疗开始后21天进行采集。图4B显示了与CNA相比，归一化片段长度表现出相反的模式。图4C显示了，总体而言，每个基因组位置的归一化片段长度与推断出的拷贝数之间存在很强的负相关(Spearman’s rho＝-0.57，P<1E-10)。图4D显示了患者LS030178在后续时间点T1和T2的TFR增加，可在指示疾病进展的成像之前检测到。图4E显示了对治疗有应答的患者LS030093在T1和T2表现出TFR显著降低，这与表现出部分缓解的后续成像一致。
连续ctDNA测量显示治疗早期的快速变化。使用WG分析评定肿瘤分数的变化，以量化基线和治疗后样品之间的TFR。治疗开始后早期观察到TFR的显著变化(图4A-4D)。患者LS030178展示了在第一个治疗周期后T1时间TFR快速增加至2.4的例子，表明从基线显著增加，随后在T2时间甚至增加更大(图4A-4D)。该患者有体细胞1号染色体长臂(1q)增益，这可能是乳腺癌中最常见的臂水平畸变之一。此外，CNA的强模式由片段化模式证实(图4B-4C)。相反，患者LS030093在时间T1显示TFR的降低，然后在时间T2较大降低(图4E)。
一个样品子集同时具有WGS和WGBS，这些用于测试TFR是否可以在测序方案中等效地量化。图9显示了根据一些实施例的跨测序方案的肿瘤分数比的比较。该图显示了使用WGS和WGBS处理的来自13名参与者的20个治疗后样品的结果。来自PD患者的两个样品在第一次FUI时有不一致的分子进展分类，TFR的测量值接近判读边界。TFR值在WGS和WGBS之间高度一致，从而能够分析包括使用两种方案分析的样品的整个群组。
图5A-5C显示了根据一些实施例，在第一或第二治疗周期后预测进展的ctDNA评定。图5A显示了在第一次FUI时(由RECIST 1.1评定的SLD)的成像结果与分子进展的ctDNA评定的比较，通过任一治疗后样品的TFR的可信增加来表明(灵敏度＝54％，特异度＝100％，PPV＝100％，NPV＝85％)。脚注病例表现出明显的临床进展。图5B显示了进展者和未进展者在T1(左)和T2(右)的TFR，与PD或非PD的放射影像学或临床评定相比，显示了每个时间点的预测性能。图5C显示了，对于具有分子进展的患者，分子进展的检测早于通过标准治疗成像检测进展的日期的中位数为40天(-21至103天的范围)。
在早期时间点跟踪肿瘤分数的变化预测了第一次随访应答评定的进展。在第一次FUI和临床评估中，92名患者中有26名患有临床PD，66名患者患有非PD。为了评估ctDNA测定的预测值，我们将所有患者的第一次FUI时的分子进展分类与临床评定进行了比较(图5A)。在T1或T2出现有进展的所有14名患者都患有PD，同样，在66名非PD患者中，无一有分子进展。包括时间点T1和T2在内的测定灵敏度为54％并且特异度为100％。T1时灵敏度为42％，T2时灵敏度为61％(图5B)。灵敏度和抽血时间之间没有统计学上显著关系。图10显示了根据一些实施例的样品时间和灵敏度。该图显示了来自在第一次FUI时的来自26名PD参与者的42个样品的分子进展和血液样品时间(两样品Kolmogorov-Smirnov检验，P＝0.15)。在判读为分子进展的病例中，首次鉴定的时间点先于通过成像检测进展40天(中位数)(图5C)。
在第一次FUI时的12名PD患者中，影像学和分子学进展评定之间存在差异，3名患者未检测到可靠的CNA，2名患者肿瘤分数无显著变化，7名患者肿瘤分数降低。对于肿瘤分数降低的不一致病例，代表了多种癌症类型(3乳腺癌、2肺癌、1肾癌、1肉瘤)、治疗(4化学疗法、1免疫疗法、1内分泌疗法、1单独靶向疗法)和治疗线(3一线、2二线、1三线和1五线)。此外，WGS和WGBS之间的预测性能没有主要差异(表S3)。
Figure BDA0003767760730001191
表S3：通过测序方案在第一次FUI时的分子进展和评定
图6A-6I显示了根据一些实施例，治疗过程早期的分子应答评定与良好PFS相关。图6A显示了整个群组(n＝92)的中位PFS为211天。图6B显示了在T1或T2从cfDNA检测到分子进展的患者(n＝14，中位PFS＝62天)与没有分子进展的患者(n＝78，中位PFS＝263天；HR＝12.6[95％CI：5.8至27.3]；对数秩P<1E-10)相比有明显更差的PFS。图6C-6D显示了针对加或不加化学疗法的免疫疗法的患者(n＝34；对数秩P＝2E-12)(图6C)、加或不加靶向疗法的化学疗法的患者(n＝42；对数秩P＝7E-6)(图6D)的基于治疗方式的子集分析。图6E-6F显示了针对肺癌患者(n＝40；对数秩P＝8E-8)(图6E)和乳腺癌患者(n＝25；对数秩P＝3E-4)(图6F)的基于治疗方式的子集分析。图6G显示了在考虑基于分子进展的预测后，出现MMR的患者的PFS显著延长(Cox P＝0.011)。图6H-6I显示了在第一次FUI时(n＝65)通过放射学确定的疾病稳定或部分缓解的患者的子集分析，按缓解状态分层(对数秩P＝0.4)(图6H)或MMR(对数秩P＝0.02)(图6I)。
治疗早期通过cfDNA评定的分子应答模式与PFS相关。全群组患者的中位PFS为211天(图6A)。与没有分子进展的患者(n＝78)的中位PFS为263天相比，在T1或T2(n＝14)有分子进展的患者PFS较短，其中HR＝12.6(95％CI为5.8至27.3；对数秩P＝7E-16)且中位PFS为63天(图6B)。
基于肿瘤起源和治疗类型在患者子集中探索了该测定的预测性能。在接受免疫治疗的34名患者中，有分子进展患者(中位PFS＝57天)的PFS显著短于未发现分子进展的患者(中位随访167天后未达到中位PFS，对数秩P＝2E-12)，与整个群组一致(图6C)。该结果与化学疗法子集的相似，有分子进展患者的中位PFS为56天，未进展患者为212天(图6D；n＝42；对数秩P＝7E-6)。
对于两个最大子集，肺癌(图6E；对数秩P＝8E-8)和乳腺癌(图6F；对数秩P＝3E-4)，有分子进展患者的PFS也显著缩短。对于混合癌症类型(胃肠道、泌尿生殖系统、黑色素瘤和肉瘤)的其余子集也是如此(对数秩P＝5E-6)。图11显示了根据一些实施例的其他癌症的分子应答评定和PFS。该图显示了非肺癌非乳腺癌(n＝27；对数秩P＝5E-6)，绘制在图6E-6F中。第一次FUI时的进展预测在这些子集中也具有可比性(表S4)。总之，这些数据表明该测定在多种不同的癌症类型和治疗方式中是有效的。
Figure BDA0003767760730001201
表S4：癌症和治疗类型子集的第一次FUI时的分子进展和评定
此外，结果表明，治疗过程早期的大量减少与PFS的改善有关。在测定未显示分子进展的78名患者中，27名患者在任一治疗后时间点都有MMR。值得注意的是，在T1发现MMR的所有病例中，如果该时间点可用(n＝12)，则在T2也观察到这一发现。在7例中，T1时TFR与基线相比没有降低10倍，但在T2时降低了10倍，例如患者LS030093(图4E)。与没有MMR且没有分子进展的患者(n＝51；中位PFS为211天)相比，有MMR的患者的PFS更长(图6G，未达到中位PFS)。在考虑了基于分子进展的预测后，MMR可显著预测PFS(分层Cox：分子进展P＝4E-9，MMR P＝0.011)，指示早期定量ctDNA动力学在预测长期治疗效果方面的价值。
接下来，评定了MMR与放射影像学应答监测相结合的预测值。对于第一次FUI时未显示放射影像学进展的患者(n＝65)，基于RECIST 1.1的部分缓解与首次FUI时疾病稳定的PFS预后价值有限(图6H；对数秩P＝0.4；HR＝0.67[95％CI为0.28至1.60])。然而，在同一子集中，有MMR患者的PFS显著延长(图6I；对数秩P＝0.02；HR＝0.28[95％CI为0.09至0.84])，这在第一次FUI时调整放射影像学评定后也很显著(分层Cox：部分缓解P＝0.36，MMR P＝0.016)。图12A-12B显示了根据一些实施例的在第一次FUI时非PD患者的MMR和PFS。这些图显示了来自所有患者具有放射影像学部分缓解(n＝30)(图12A)或疾病稳定(n＝35)(图12B)的结果。
甲基化水平的纵向变化可以补充肿瘤分数的变化。完全低甲基化可能是肿瘤基因组的一个标志，cfDNA中完全甲基化水平的增加可能与未进展有关，因为它可能表明ctDNA的比例降低。重要的是，可以在ctDNA中检测到在肿瘤中观察到的表观遗传模式，包括整体的完全低甲基化。为了评定甲基化变化在鉴定对治疗的早期应答方面的潜力，回顾性检查了两个示例患者的全基因组甲基化水平从基线到治疗后的变化(图7A-7B)—一个在第一次FUI时具有非PD判读(LS030083)，一个在第一次FUI(LS030078)时具有PD判读。与第一次FUI时的临床评定一致，对于LS030083观察到甲基化水平明显增长(图7A)，而在LS030078中观察到下降(图7B)。对于患者LS030078，基于CNA和局部碎片变化(TFR＝2.01)观察到明显的分子进展，而在LS030083中未检测到CNA。
图7A-7B显示了根据一些实施例，甲基化可以向CNA提供正交信号用于响应监测。这些图显示了患者LS030083(图7A)和LS030078(图7B)在基线(黑线)和T1或T2(橙线)的全基因组1兆碱基箱中平均甲基化水平的分布。
患有晚期恶性肿瘤的患者可能需要仔细的治疗监测，以评定治疗效果、提高生活质量并限制药物毒性。然而，目前使用临床和放射影像学评定进行疾病监测的方法可能需要几个月的时间才能有信心地确定治疗应答。在这里，评定了改善的全基因组cfDNA分子学应答测定的效用，其分析了在基线和治疗初始周期期间的纵向ctDNA测量，以预测对疗法的应答。此技术以100％的特异度和阳性预测值(PPV)预测疾病进展，表明此测定能够在比目前标准治疗方法提前6周(中位数)以高置信度和可靠性预测疾病进展。此发现表明，在治疗过程中早期进展的晚期肿瘤在靶病灶的大小、轮廓或密度发生可见变化(可通过目前的成像方案和判读检测到)很早之前就能在血液中反映为可观察到的信号。
这些结果指示几个其他主要发现。首先，基于血液的全基因组ctDNA分子测定似乎通过考虑肿瘤特异性点突变和融合的靶向评定来跨各种肿瘤和治疗类型对疾病进展做出一致地预测。具体地，患者数量最多的两个群组(肺癌和乳腺癌)的子集分析证明了统计学上的重要发现，这些发现也在非肺癌和非乳腺癌患者中共同观察到。在不同的治疗(包括接受化学疗法或免疫疗法的患者)中出现了相似的预测值。
这些发现表明，本公开的方法和系统代表了针对某些患者群组(例如，那些只接受免疫疗法的患者)的改善的基于CNA的方法。其次，结果证明与那些TFR没有变化或减少幅度较小的患者相比，出现MMR的患者具有更长的PFS，表明对疗法的初始应答程度存在定量值。在获得的数据中，与部分缓解与疾病稳定的RECIST 1.1分类相比，PFS与通过测定所测量的应答程度更密切相关，表明在第一次FUI时，部分缓解与疾病疾病的放射影像学评定在一些情况下可具有有限的长期预后值。识别MMR的另外的预后值支持整合连续cfDNA样品的成像和分析的可能性，以提供疾病控制的持续时间延长的早期指示。
用连续cfDNA测量进行分子学应答监测对于评定疾病控制和疾病进展具有潜在的临床益处。例如，如果观察到MMR，对于目前治疗方案有效性的及早确定可以用于限制临床成像的频率。相比之下，基于血液的分子学进展的早期预测可以指导肿瘤学家中止无效治疗，从而减少可避免的副作用和财务毒性。通过加速临床决策环，患者可以有机会改用可替代的、潜在有效的疗法。这种评定算法可以增加可参与多线疗法(包括临床试验)的具有足够体能状态评分的患者数量。此外，基于血液的测定为患者提供了便利，因为在每一个疗法周期期间都会常规地收集血液样品。
虽然该测定的特异度非常高，这是在晚期疾病的情况下临床效用的关键性能度量，但灵敏度，特别是在最早的时间点，可以通过包括其他特征(诸如癌症相关的表观遗传信号)提高。例如，在患者LS030083中，从基线到治疗后，全基因组甲基化水平明显增加，与在第一次FUI时的非PD判读一致，仍然未检测到CNA(图7A)。因此，可以将这些基于甲基化的信号与片段长度和拷贝数信息一起引入测定中，以提高对具有低肿瘤分数的样品的测定灵敏度。然而，即使有另外的的正交信号，也可能存在源于以下肿瘤的残差假阴性率：不生成足够ctDNA的肿瘤(例如，非脱落性肿瘤)；在最早的治疗周期中尚未进展的肿瘤；和/或通过ctDNA分析和成像的得到的分子学进展不一致的肿瘤。进一步地，扩增的患者群组可以用于证实测定的肿瘤和治疗不可知论性质。进一步地，可以执行预测工具的前瞻性验证。可以检查一个独立的验证群组，以评定利用自适应临床试验设计进行的治疗变更如何通过使用基于血液的分子学应答评定更快地切换到不同的治疗组来限制成本并改善长期患者结果。
总之，结果证明与标准治疗临床评定相比，采用低深度测序分析全基因组ctDNA的连续监测方法产生了具有高特异度和PPV的临床预测。此外，跨多种肿瘤和治疗类型的发现是一致的，并且ctDNA减少的程度与长期临床结果相关。这种非侵入性工具可以更准确地使晚期癌症患者更早地与潜在有效的疗法匹配，从而限制与无效治疗相关联的副作用和成本。
实例2：使用cfDNA甲基化和片段长度来跟踪治疗应答
使用本公开的方法和系统，基于分析cfDNA的片段来开发模型以了解患者对癌症治疗的应答。
通常，肿瘤源性cfDNA(ctDNA)的片段比来自非癌组织的cfDNA短。ctDNA还具有较低的的总体甲基化水平。因此，开发模型以使用该信息来证实拷贝数畸变(CNA)的判读。
评定甲基化模式与CNA判读一致的程度以及片段长度模式与CNA判读一致的方式。在实践中，这是针对来自受试者(例如，患者)的每个文库，通过定量所有基因组箱(例如，基因组中每500千碱基区域)中的平均甲基化和/或片段长度与该区域中拷贝数之间的相关性来完成的。
在具有正确判读的CNA的真正癌症患者中，预期的观察结果是肿瘤的拷贝数与平均甲基化分数和平均片段长度两者之间的反相关。这是因为在具有拷贝数增益的区域(例如，与所有非肿瘤细胞中的2个拷贝相比，肿瘤中的拷贝数为3或更大)，血液中cfDNA的较大部分是肿瘤源性的。相比之下，在肿瘤仅有一个拷贝的基因组区域中，预期会有更大的片段长度和更高的甲基化水平，因为cfDNA的较小部分源自肿瘤细胞。
如由Spearman's rho(或可替代地，相关性的另一种统计检验，诸如Pearson's R)测量的这些相关系数是评定针对样品的特定CNA判读集是否是真正肿瘤源性的，而非由于测序数据中的噪声产生的独立方法。这允许改善CNA判读的特异度，从而减少假阳性，并最终成为一种对患者对治疗的应答或无应答进行纵向监测的更有效的方法。
因此，使用本公开的方法和系统，充分利用针对cfDNA的片段长度和/或甲基化数据来改善CNA判读的特异度。
实例3：基于cfDNA的组合的全基因组和甲基化信号监测肿瘤进展
使用本公开的方法和系统，肿瘤进展是基于从cfDNA样品的全基因组测序和甲基化感知测序(methyl-seq)获得的两个信号的组合来进行的。例如，可以通过以下方法基于酶促甲基测序分析来计算针对肿瘤进展的综合评分。
首先，确定基于CNA的肿瘤分数比(TFR)。这可以通过分析在基线时间点来自患者的第一cfDNA样品和在后续随访时间点来自患者的第二cfDNA样品，并接着对来自随访时间点的读取深度库与来自患者的基线时间点的读取深度库进行比较来完成。
接着，如实例4所述，基于甲基化分析确定第二癌症相关信号。接下来，将全基因组和甲基化信号组合成对第一随访时间点与基线时间点之间的肿瘤分数的倍数变化的组合预测。可以使用多种方法组合全基因组和甲基化信号，该方法包括使用逻辑回归、使用经对数转换的值的加权平均(例如，相当于几何平均数)或考虑特定患者资料中每个测量的估计统计精度的加权平均。
为了便于使用，可以对组合比率进行归一化、缩放或转换为方便刻度尺上的组合分数，诸如0至200的刻度尺。例如，这可以通过使用以下变换：分数＝最大_分数/(1+1/比率)来执行。100分是基线分数，分数越高指示结果越差(例如，肿瘤进展越快和分子应答越弱)，以及分数越低指示结果越好(例如，肿瘤进展越慢或没有，以及分子应答越强)。基于该评分评定，患者被分配到三个类别中的一个：分子进展、主要分子应答(MMR)和未进展或无主要分子应答。
分子进展(MP)定义为肿瘤分数在统计学上显著增加，而MMR可以定义为肿瘤分数从基线时间点到随访时间点显著(例如，至少10倍)降低。
图13A至13B示出了患者群组中针对这三个患者类别(MP、MMR和既非MP又非MMR)中的每一个的Kaplan-Meier无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)图表的示例。这些图显示生存期曲线彼此高度分离。此外，分子进展的预测以高特异度预测放射影像学进展。
实例4：基于cfDNA的甲基化信号监测肿瘤进展
使用本公开的方法和系统，多种不同的方法可以用于从cfDNA样品的甲基化谱中提取癌症相关信号，并基于癌症相关信号监测肿瘤进展。例如，此类方法可以包括测量来自CpG岛、岛岸、PMD、启动子、基因体、重复元件、已知癌症基因和单个CpG位点中的甲基化分数的信号。特别是，已证明通过CNA判读的正交方法对一组具有已知肿瘤分数的样品使用具有强正则化的线性回归来训练甲基化肿瘤分数模型(或其他类型的模型)，将来自cfDNA的CNA数据纳入此类肿瘤进展方法能够以增强的灵敏度(与使用全基因组数据相比)有利地改善对肿瘤进展的监测。
甲基化信号提取可以包括识别所有文库，在这些文库中，可以从CNA模式确信地确定来自癌症患者的给定cfDNA样品的肿瘤分数，或确定样品是来自未受影响的对照受试者的事实。
接着，对于每个此类文库，从甲基化测序数据中确定基因组中所有CpG岛(或者可替代地，另一类区域，诸如岛岸或启动子)中的平均甲基化分数。甲基化测序数据可以通过例如cfDNA样品的全基因组亚硫酸氢盐测序或酶促甲基测序生成。
接下来，使用合适的交叉验证方法(例如，留一参与者交叉验证)，通过针对甲基化模式对已知肿瘤分数进行正则化来执行回归或建模(例如，线性回归、简单回归、二元回归、贝叶斯线性回归、多项式回归、高斯过程回归、逻辑回归、非线性回归等)。根据这些结果，使用本公开的方法和系统，基于甲基化模式可以生成对cfDNA样品的肿瘤分数的预测。
即使在CNA信号低或无法检测到的情况下，甲基化信号方法也可以得到对cfDNA中的甲基化分数的估计。然后将甲基化信号用于组合模型中以进行评分(例如，如实例3所述)，和/或在时间点之间进行比较(例如，基线时间点和一个或多个后续随访时间点)。
其他方法可以用于从cfDNA样品中提取癌症相关的甲基化信号。例如，可以使用主成分分析来计算权重(例如，可以观察到第一最重要的主成分与癌症高度相关，或者可能是取决于数据中存在哪些其他变化的子序列主成分)。作为另一示例，可以在应用主成分分析之前基于片段长度过滤测序读数，从而丰富肿瘤源性读数。作为另一示例，可以在甲基化单倍型块中确定甲基化单倍型负荷(MHL)，并且可以计算反向MHL(类似于MHL，但针对未经甲基化的块)。这些方法中的任何一种或组合可以用于从测序或methyl-seq数据生成癌症相关的甲基化信号。这些方法中的任何一种或组合可以用作本文所述的肿瘤分数建模的输入。
实例5：使用cfDNA预测肿瘤基因表达以预测治疗应答
甲基化可以在调节基因表达中发挥重要作用。通常，可以观察到基因启动子区域中的甲基化会抑制基因表达。例如，癌症中的异常甲基化的一个方面是正常高水平的致癌基因启动子甲基化的丧失，这可能导致致癌基因的过度表达，从而导致更严重的癌变状态。特别是，MAGE(黑色素瘤相关抗原)基因家族是许多癌症类型中该异常甲基化的原型。因此，诸如在正在开发候选药物以靶向过度表达的致癌基因中的一个的情况下，通过液体活检分析受试者的cfDNA的甲基化状态来针对此类基因过度表达进行测试的能力可能是有利的。
使用本公开的方法和系统，通过对受试者的生物学样品的液体活检进行分析来测量目的基因的整体肿瘤和健康组织的平均总甲基化水平。在MAGE基因的情况下，已知甲基化水平在除睾丸之外的所有正常成人组织中为组成型地高水平。因此，当在MAGE启动子处观察到甲基化减弱时，这可能指示受试者的肿瘤。图14A至14C示出了在三个MAGE基因(MAGEA1、MAGEA3和MAGEA4)处观察到的甲基化的强烈地平均降低的示例。如图14A至14C所示，在多个患者中的三个不同的MAGE基因处观察到甲基化强烈地平均降低，这超过了全基因组的低甲基化水平。该结果指示，对于血液中具有足够的循环肿瘤DNA(ctDNA)(例如，肿瘤来源的cfDNA)的患者，在正常组织中存在一组经甲基化抑制的基因。对于该组基因，使用本公开的方法和系统可以分析和测量肿瘤中的低甲基化和表达。
总体而言，肿瘤细胞可以表现出经种系表达的基因(诸如MAGE的启动子)的异常低甲基化，这会导致这些基因的过度表达，从而导致癌症患者的不良后果、结果和预后。使用本公开的方法和系统，检测到这些基因的低甲基化，这允许通过液体活检靶向这些基因(例如，而不需要肿瘤组织活检或其他侵入性测定)的靶向疗法的个性化选择。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在中央处理单元205执行时通过软件来实现。通过定量整个治疗过程中来自患者的多个样品中特定CNA信号的强度变化，该算法可以例如，处理WGS数据以确定cfDNA分子的拷贝数畸变(CNA)和片段长度；处理CNA以确定CNA谱变化；处理片段长度以确定片段长度谱变化。如图15A和15B所示，此类方法不太容易出现某些错误模式，这些错误模式是由基于CNA的单独样品中的单独定量肿瘤分数引起的。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施例，但是对于本领域技术人员来说，这些实施例仅作为示例提供是显而易见的。本发明并不旨在受说明书内提供的具体示例所限制。尽管已参考前述说明书描述了本发明，但本文中实施例的描述和说明并不意味着以限制性意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变更、变化和取代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明的实施例的各种替代方案。因此预期本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 莱森特生物公司(Lexent Bio, Inc.)
<120> 用于通过分析循环肿瘤 DNA 进行分子疾病评定的方法和系统
<130> 19710-20048.40
<140> 尚未分配
<141> 同时附上
<150> US 62/993,564
<151> 2020-03-23
<150> US 62/953,368
<151> 2019-12-24
<160> 20
<170> 用于 Windows 的 FastSEQ，4.0 版
<210> 1
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 4
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 13
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 16
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 17
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 18
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (169)

1.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一WGS数据，确定(i)所述第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)所述第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二WGS数据，确定(iii)所述第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)所述第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将所述第一多个CNA与所述第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于所述CNA谱变化和所述片段长度谱变化来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一体液样品或所述第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述第一WGS数据包括对所述第一多个cfDNA分子进行测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得所述第二WGS数据包括对所述第二多个cfDNA分子进行测序以产生第二多个测序读数。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述测序在不超过约25X的深度进行。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述测序在不超过约10X的深度进行。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述测序在不超过约8X的深度进行。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述测序在不超过约6X的深度进行。
8.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括将所述第一多个测序读数或所述第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对多个基因组区域富集所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述富集包括扩增所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述扩增包括选择性扩增。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述扩增包括通用性扩增。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述富集包括选择性地分离所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子的至少一部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中选择性地分离所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子的所述至少一部分包括使用多个探针，所述多个探针中的每一个与所述多个基因组区域中的基因组区域的至少一部分具有序列互补性。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一部分包含肿瘤标志物基因座。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述至少一部分包含多个肿瘤标志物基因座。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)或癌症体细胞突变目录(Catalogueof Somatic Mutations incancer，COSMIC)的基因座。
18.根据权利要求3所述的方法，其中确定所述第一多个CNA包括确定在所述第一多个测序读数的多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度，并且其中确定所述第二多个CNA包括确定在所述第二多个测序读数的所述多个基因组区域中的每一个处的CNA的定量测度。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括针对GC含量和/或可映射性偏差来校正所述第一多个CNA或所述第二多个CNA。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述校正包括使用统计建模分析。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述统计建模分析包括LOESS回归或贝叶斯模型。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述多个基因组区域包括参考基因组的具有预定大小的非重叠基因组区域。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述多个基因组区域包括至少约1,000个不同的基因组区域。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述多个基因组区域包括至少约2,000个不同的基因组区域。
26.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述CNA谱变化包括将所述第一多个CNA和所述第二多个CNA与多个参考CNA值进行比较，其中所述多个参考CNA值从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个未患有癌症的受试者。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个不具有肿瘤进展的受试者。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述多个参考CNA值是使用所述受试者的在所述第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的另外的体液样品而获得。
30.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括过滤掉满足预定标准的所述第一多个CNA和所述第二多个CNA的子集。
31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约1个标准偏差的差时，过滤掉所述第一多个CNA或所述第二多个CNA值的所述给定CNA值。
32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约2个标准偏差的差时，过滤掉所述第一多个CNA或所述第二多个CNA值的所述给定CNA值。
33.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括：当给定CNA值与对应的参考CNA值之间的差包括不大于约3个标准偏差的差时，过滤掉所述第一多个CNA或所述第二多个CNA值的所述给定CNA值。
34.根据权利要求30所述的方法，其进一步包括：基于给定CNA值与对应的局部平均片段长度之间的Spearman秩相关性过滤掉所述第一多个CNA或所述第二多个CNA值的所述给定CNA值。
35.根据权利要求34所述的方法，其进一步包括：当Spearman秩相关系数(Spearman'srho)小于-0.1时，过滤掉所述第一多个CNA或所述第二多个CNA值的所述给定CNA值。
36.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：基于文库或基因组位置将所述第一多个片段长度或所述第二多个片段长度归一化。
37.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4、或大于5时，检测到所述肿瘤状态包括所述受试者的肿瘤进展。
38.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4、或小于0.5时，检测到所述受试者的主要分子学应答(MMR)。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
43.根据权利要求42所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
44.根据权利要求43所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
45.根据权利要求44所述的方法，其进一步包括：以至少约98％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
48.根据权利要求47所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
51.根据权利要求50所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约0.60的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
53.根据权利要求52所述的方法，其进一步包括：以至少约0.75的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
54.根据权利要求53所述的方法，其进一步包括：以至少约0.90的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定所述受试者的肿瘤未进展。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其进一步包括：基于所述受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗以治疗所述受试者的所述癌症。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中所述第一WGS数据和所述第二WGS数据是通过焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、连接测序、杂交测序、大规模平行测序、链终止测序、单分子实时测序、聚合酶克隆测序(Polonysequencing)、组合探针锚定合成或基于杂交捕获的测序而获得。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述第一WGS数据和所述第二WGS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
61.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；和(ii)第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至所述数据库，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于所述第一WGS数据，确定(i)所述第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)所述第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
基于所述第二WGS数据，确定(iii)所述第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)所述第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将所述第一多个CNA与所述第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于所述CNA谱变化和所述片段长度谱变化来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
62.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，所述机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一WGS数据，确定(i)所述第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)所述第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二WGS数据，确定(iii)所述第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)所述第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
将所述第一多个CNA与所述第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
至少部分地基于所述CNA谱变化和所述片段长度谱变化来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
63.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一平均甲基化分数谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述第一体液样品或所述第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
65.根据权利要求63所述的方法，其中获得所述第一MS数据包括对所述第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得所述第二WGS数据包括对所述第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序在不超过约25X的深度进行。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序在不超过约10X的深度进行。
71.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序在不超过约8X的深度进行。
72.根据权利要求65所述的方法，其中所述甲基化测序在不超过约6X的深度进行。
73.根据权利要求65所述的方法，其进一步包括将所述第一多个测序读数或所述第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
74.根据权利要求65所述的方法，其进一步包括针对所述基因组的所述区域富集所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述富集包括扩增所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述扩增包括选择性扩增。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述扩增包括通用性扩增。
78.根据权利要求74所述的方法，其中所述富集包括选择性地分离所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子的至少一部分。
79.根据权利要求78所述的方法，其中选择性地分离所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子的所述至少一部分包括使用多个探针，所述多个探针中的每一个与所述基因组的所述区域的至少一部分具有序列互补性。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述至少一部分包含肿瘤标志物基因座。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述至少一部分包含多个肿瘤标志物基因座。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述多个肿瘤标志物基因座包括一个或多个选自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)或癌症体细胞突变目录(Catalogueof Somatic Mutations incancer，COSMIC)的基因座。
83.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因组的所述区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
84.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因组的所述区域包括所述基因组的多个非重叠区域。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述基因组的所述多个非重叠区域具有预定大小。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述预定大小为约50千碱基(kb)、约100kb、约200kb、约500kb、约1兆碱基(Mb)、约2Mb、约5Mb或约10Mb。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述基因组的所述多个非重叠区域包括至少约1,000个不同区域。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述基因组的所述多个非重叠区域包括至少约2,000个不同区域。
89.根据权利要求63所述的方法，其中确定所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数包括将所述甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中所述一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个患有癌症的受试者。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个未患有癌症的受试者。
92.根据权利要求89所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个具有肿瘤进展的受试者。
93.根据权利要求89所述的方法，其中所述另外的受试者包括一个或多个不具有肿瘤进展的受试者。
94.根据权利要求89所述的方法，其中所述一个或多个参考甲基化分数谱是使用所述受试者的在所述第一时间点之后的一个或多个后续时间点获得的另外的体液样品而获得。
95.根据权利要求63所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4、或大于5时，检测到所述肿瘤状态包括所述受试者的肿瘤进展。
96.根据权利要求63所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4、或小于0.5时，检测到所述受试者的主要分子学应答(MMR)。
97.根据权利要求63至96中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
98.根据权利要求97所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
99.根据权利要求98所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的灵敏度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
100.根据权利要求63至99中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
101.根据权利要求100所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
102.根据权利要求101所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
103.根据权利要求102所述的方法，其进一步包括：以至少约98％的特异度检测所述受试者的所述肿瘤状态。
104.根据权利要求63至103中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
105.根据权利要求104所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
106.根据权利要求105所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的阳性预测值(PPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
107.根据权利要求63至106中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约50％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
108.根据权利要求107所述的方法，其进一步包括：以至少约70％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
109.根据权利要求108所述的方法，其进一步包括：以至少约90％的阴性预测值(NPV)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
110.根据权利要求63至109中任一项所述的方法，其进一步包括：以至少约0.60的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的状态进展。
111.根据权利要求110所述的方法，其进一步包括：以至少约0.75的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
112.根据权利要求111所述的方法，其进一步包括：以至少约0.90的曲线下面积(AUC)检测所述受试者的所述肿瘤状态。
113.根据权利要求63至112中任一项所述的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定所述受试者的肿瘤未进展。
114.根据权利要求63至113中任一项所述的方法，其进一步包括：基于所述受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗所述受试者的所述癌症。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述第二治疗法包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
116.根据权利要求63至115中任一项所述的方法，其中所述第一多个cfDNA分子和所述第二多个cfDNA分子来自所述受试者的免疫细胞。
117.根据权利要求63至116中任一项所述的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
118.根据权利要求63至117中任一项所述的方法，其中所述第一MS数据和所述第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
119.根据权利要求1至60和63至118中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
120.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；和(ii)跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至所述数据库，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一平均甲基化分数谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
121.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，所述机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一平均甲基化分数谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于相应甲基化分数谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
122.根据权利要求120所述的计算机系统或根据权利要求121所述的非暂时性计算机可读介质，其中检测到的肿瘤进展至少部分地基于对所述相应甲基化分数谱的一种或多种统计建模分析。
123.根据权利要求122所述的系统或介质，其中所述一种或多种统计建模分析包括线性回归、简单回归、二元回归、贝叶斯线性回归、贝叶斯建模、多项式回归、高斯过程回归、高斯建模、逻辑回归或非线性回归。
124.根据权利要求122或权利要求123所述的系统或介质，其中所述一种或多种统计建模分析将所述检测到的肿瘤进展与得自具有已知肿瘤分数的样品的MS数据、得自纯肿瘤样品的MS数据或得自健康样品的MS数据进行比较。
125.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨所述一个或多个基因座的所述第一甲基化谱与跨所述一个或多个基因座的所述第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述第一甲基化谱和所述第二甲基化谱包括5-羟甲基胞嘧啶状态、5-甲基胞嘧啶状态、基于富集的甲基化评定、中值甲基化水平、众数甲基化水平、最大甲基化水平或最小甲基化水平。
127.根据权利要求125或权利要求126所述的方法，其中所述第一体液样品或所述第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
128.根据权利要求125所述的方法，其中获得所述第一MS数据包括对所述第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得所述第二WGS数据包括对所述第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述甲基化测序包括全基因组亚硫酸氢盐测序。
130.根据权利要求128所述的方法，其中所述甲基化测序包括全基因组酶促甲基测序。
131.根据权利要求128所述的方法，其中所述甲基化测序包括氧化亚硫酸氢盐测序、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、TET辅助亚硫酸氢盐测序(TABS)、氧化亚硫酸氢盐测序(oxBS-Seq)、APOBEC偶联表观遗传测序(ACE-seq)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序、羟甲基化DNA免疫沉淀(hMeDIP)测序、甲基化阵列分析、简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS-Seq)或胞嘧啶5-羟甲基化测序。
132.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括将所述第一多个测序读数或所述第二多个测序读数与参考基因组比对，从而产生多个经比对的测序读数。
133.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括针对所述基因组的所述区域富集所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
134.根据权利要求128所述的方法，其中所述基因组的所述区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
135.根据权利要求128所述的方法，其中所述基因组的所述区域包括所述基因组的多个非重叠区域。
136.根据权利要求128所述的方法，其中确定所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数包括将所述甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中所述一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
137.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数大于1、大于1.1、大于1.2、大于1.3、大于1.4、大于1.5、大于1.6、大于1.7、大于1.8、大于1.9、大于2、大于3、大于4、或大于5时，检测到所述肿瘤状态包括所述受试者的肿瘤进展。
138.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括：当所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数小于0.01、小于0.05、小于0.1、小于0.2、小于0.3、小于0.4、或小于0.5时，检测到所述受试者的主要分子学应答(MMR)。
139.根据权利要求128至138中任一项所述的方法，其进一步包括：在未检测到肿瘤进展时确定所述受试者的肿瘤未进展。
140.根据权利要求128至139中任一项所述的方法，其进一步包括：基于所述受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的第二治疗法以治疗所述受试者的所述癌症。
141.根据权利要求128至140中任一项所述的方法，其中所述第一多个cfDNA分子和所述第二多个cfDNA分子来自所述受试者的免疫细胞。
142.根据权利要求128至141中任一项所述的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
143.根据权利要求128至142中任一项所述的方法，其中所述第一MS数据和所述第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
144.根据权利要求128至143中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
145.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的计算机系统，其包括：
数据库，其被配置成存储：(i)跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；和(ii)跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；和
一个或多个计算机处理器，其可操作地耦合至所述数据库，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一甲基化谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
146.一种非暂时性计算机可读介质，其包含机器可执行指令，所述机器可执行指令在由一个或多个计算机处理器执行时，进行用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，所述方法包括：
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一平均甲基化分数谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二平均甲基化分数谱进行比较；
至少部分地基于相应甲基化谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
147.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一WGS数据，确定(i)所述第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)所述第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在所述第一时间点从所述受试者的体液样品获得或衍生；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第一平均甲基化分数谱；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二WGS数据，确定(iii)所述第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)所述第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在所述第二时间点从所述受试者的体液样品获得或衍生；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的所述区域中一个或多个CpG岛中的每一个的平均甲基化分数，从而获得第二平均甲基化分数谱；
将所述第一多个CNA与所述第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
将跨所述一个或多个CpG岛的所述第一平均甲基化分数谱与跨所述一个或多个CpG岛的所述第二平均甲基化分数谱进行比较以确定甲基化分数谱；
至少部分地基于所述CNA谱变化、所述片段长度谱变化和所述相应甲基化分数谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
148.一种用于评定患有癌症的受试者的肿瘤状态的方法，其包括：
获得第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一全基因组测序(WGS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在第一时间点
从所述受试者的第一体液样品获得或衍生，其中所述第一时间点是在向所述受试者施用经配置用于治疗所述癌症的治疗法之前；
基于所述第一WGS数据，确定(i)所述第一多个cfDNA分子中的第一多个拷贝数畸变(CNA)和(ii)所述第一多个cfDNA分子的第一多个片段长度；
获得跨基因组的区域的第一多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第一甲基化测序(MS)数据，其中所述第一多个cfDNA分子是在所述第一时间点从所述受试者的体液样品获得或衍生；
基于所述第一MS数据确定所述基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第一甲基化谱；
获得第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二全基因组测序(WGS)数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在第二时间点从所述受试者的第二体液样品获得或衍生，其中所述第二时间点是在向所述受试者施用所述治疗法之后；
基于所述第二WGS数据，确定(iii)所述第二多个cfDNA分子中的第二多个拷贝数畸变(CNA)和(iv)所述第二多个cfDNA分子的第二多个片段长度；
获得跨所述基因组的所述区域的第二多个细胞游离DNA(cfDNA)分子的第二MS数据，其中所述第二多个cfDNA分子是在所述第二时间点从所述受试者的体液样品获得或衍生；
基于所述第二MS数据确定所述基因组的一个或多个基因座中的每一个的甲基化谱，从而获得第二甲基化谱；
将所述第一多个CNA与所述第二多个CNA进行比较以确定CNA谱变化；
基于所述第一多个片段长度和所述第二多个片段长度确定片段长度谱变化；
将跨所述一个或多个基因座的所述第一甲基化谱与跨所述一个或多个基因座的所述第二甲基化谱进行比较；
至少部分地基于所述CNA谱变化、所述片段长度谱变化和所述相应甲基化分数谱来确定所述受试者在所述第一时间点的第一肿瘤分数或所述受试者在所述第二时间点的第二肿瘤分数；以及
至少部分地基于所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数来检测所述受试者的肿瘤状态。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述第一甲基化谱和所述第二甲基化谱包括5-羟甲基胞嘧啶状态、5-甲基胞嘧啶状态、基于富集的甲基化评定、中值甲基化水平、众数甲基化水平、最大甲基化水平或最小甲基化水平。
150.根据权利要求147至149中任一项所述的方法，其中所述第一WGS数据和所述第一MS数据是从同一样品获得的。
151.根据权利要求147至149中任一项所述的方法，其中所述第一WGS数据和所述第一MS数据是从不同样品获得的。
152.根据权利要求147至151中任一项所述的方法，其中所述第二WGS数据和所述第二MS数据是从同一样品获得的。
153.根据权利要求147至151中任一项所述的方法，其中所述第二WGS数据和所述第二MS数据是从不同样品获得的。
154.根据权利要求147至153中任一项所述的方法，其中所述第一体液样品或所述第二体液样品选自由以下项组成的组：血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脊髓液、脑脊液(CSF)、胸膜液、腹膜液、羊水和淋巴液。
155.根据权利要求147至154中任一项所述的方法，其中获得所述第一WGS数据包括对所述第一多个cfDNA分子进行测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得所述第二WGS数据包括对所述第二多个cfDNA分子进行测序以产生第二多个测序读数。
156.根据权利要求147至155中任一项所述的方法，其进一步包括针对多个基因组区域富集所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
157.根据权利要求155或权利要求156所述的方法，其中确定所述第一多个CNA包括确定在所述第一多个测序读数的多个基因组区域的每一个处的CNA的定量测度，并且其中确定所述第二多个CNA包括确定在所述第二多个测序读数的所述多个基因组区域的每一个处的CNA的定量测度。
158.根据权利要求147至157中任一项所述的方法，其中确定所述CNA谱变化包括将所述第一多个CNA和所述第二多个CNA与多个参考CNA值进行比较，其中所述多个参考CNA值从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
159.根据权利要求147至158中任一项所述的方法，其中所述第一WGS数据和所述第二WGS数据是通过焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、半导体测序、连接测序、杂交测序、大规模平行测序、链终止测序、单分子实时测序、聚合酶克隆测序、组合探针锚定合成或基于杂交捕获的测序而获得。
160.根据权利要求147至159中任一项所述的方法，其中获得所述第一MS数据包括对所述第一多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第一多个测序读数，或者其中获得所述第二WGS数据包括对所述第二多个cfDNA分子进行甲基化测序以产生第二多个测序读数。
161.根据权利要求147至160中任一项所述的方法，其进一步包括针对所述基因组的所述区域富集所述第一多个cfDNA分子或所述第二多个cfDNA分子。
162.根据权利要求147至161中任一项所述的方法，其中所述基因组的所述区域包括以下项中的一者或多者：CpG岛、CpG岸、患者特异性部分甲基化结构域、常见部分甲基化结构域、启动子、基因体、均匀间隔的全基因组箱和转座元件。
163.根据权利要求147至162中任一项所述的方法，其中确定所述第一肿瘤分数或所述第二肿瘤分数包括将所述甲基化分数谱与一个或多个参考甲基化分数谱进行比较，其中所述一个或多个参考甲基化分数谱从获自或衍生自另外的受试者的另外的体液样品的另外的cfDNA分子获得。
164.根据权利要求147至163中任一项所述的方法，其进一步包括：基于所述受试者的经确定的肿瘤状态，施用治疗有效剂量的治疗以治疗所述受试者的所述癌症。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述治疗包括手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、细胞疗法、抗激素剂、抗代谢物化学治疗剂、激酶抑制剂、甲基转移酶抑制剂、肽、基因疗法、疫苗、基于铂的化学治疗剂、抗体或检查点抑制剂。
166.根据权利要求147至165中任一项所述的方法，其中所述第一多个cfDNA分子和所述第二多个cfDNA分子来自所述受试者的免疫细胞。
167.根据权利要求147至166中任一项所述的方法，其中检测到的肿瘤状态指示肿瘤进展、未进展、消退或复发。
168.根据权利要求147至167中任一项所述的方法，其中所述第一MS数据和所述第二MS数据是通过测序装置或计算机处理器而获得。
169.根据权利要求147至168中任一项所述的方法，其中所述受试者患有脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肾癌、肝胆道癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或尿路癌。
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