CN115087393A - 用于校准和质量控制的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开的特征在于校准流体，所述校准流体包括多个珠粒，诸如纤维素珠粒、硅石珠粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)珠粒、三聚氰胺珠粒、交联琼脂糖珠粒、聚乙酸乙烯酯(PVA)珠粒和/或聚苯乙烯珠粒，其中所述珠粒的尺寸和颜色设置成表示至少一种类型的血细胞；和载送流体，所述载送流体可包括：聚合物或聚合基质，例如水溶性树脂，例如丙烯酸或聚氨酯水溶性树脂，或淀粉或纤维素，血清，和/或一种或多种糖。本公开的特征还在于使用所述校准流体来校准自动化样品制备系统，诸如自动化血液分析仪系统，例如基于图像的血液分析仪系统的方法。

Description

用于校准和质量控制的组合物和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2019年12月19日提交的美国临时专利申请第62/950,796号的权益，该临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于使用各种流体样品(诸如血液和其他生物流体)并且使用组织样品的样品处理系统的校准，以及用于质量控制并且用于监测样品处理系统性能的材料。
背景技术
多年来，实验室技术人员已经通过首先将样品施加至基片(例如显微镜载玻片)，然后例如在显微镜下观察所制备的基片来检查多种生物学样品(例如，即，血液)。由于各个技术人员的技能和经验差异以及施加步骤的日常变化，手动施加程序的质量会有所不同。进一步，在基片上手动制备生物学样品相对较慢，因为它通常涉及多个劳动密集型步骤。
存在许多自动化细胞样品分析系统，诸如流式细胞仪和基于阻抗的细胞计数系统，该系统可以相当有效地分析大量生物学样品，例如血液样品。此外，例如，如美国专利号9,217,695；10,094,764；和10,764,538中所公开的用于生物学样品的基于图像的自动化细胞计数器(例如
Figure BDA0003699595990000011
m511集成血液分析仪(Roche Diagnostics))是可用的。此类基于图像的计数器用于分析血液样品，以及用于对各种细胞类型进行计数以确定细胞浓度和活力，和/或用于对某些亚型的细胞进行计数。此类系统可以在细胞通过检测器时对该细胞进行成像，同时在液体悬浮液中流动。其他系统在成像之前将细胞放置在基片上。在这两种情况下，可以用吸收染料或其他染色剂(例如荧光试剂)对细胞进行染色，以允许细胞组分可视化。然而，所有这些自动化系统均需要在初始设置时进行校准，以用于线性测试，并且在常规基础上使用对照品或标准品以确保细胞分析的结果准确。
当前用于血液学分析(例如全血细胞计数(CBC))的校准和质量控制流体是使用来自多个未经验证的含血物种的生物材料生产的，并且具有高度的批次间变异性。例如，已经在白细胞(WBC)计数和区分以及血小板(PLT)尺寸参数中发现变异性，并且需要更稳定和可靠的校准和质量控制流体。
发明内容
与上述背景技术相反，本公开的实施方案提供了优于现有技术的某些非显而易见的优点和进步。特别地，发明人已经认识到需要改善用于校准和质量控制的组合物和方法。
本公开至少部分地基于以下发现：包括某些尺寸的珠粒(例如纤维素、硅石和/或聚苯乙烯和其他类型的珠粒)，任选地包括纯化和稳定的血细胞(例如红细胞(RBC))的校准流体可用于校准基于图像的自动化血液分析仪系统，该系统使用玻璃或塑料基片(例如载玻片)以用于生物学样品分析，因为这些流体中的珠粒可以附接或粘附至玻璃或塑料基片，并且在一些实施例中该珠粒可以由血液分析仪系统染色，并且在所有实施例中该珠粒可以由血液分析仪系统成像，所有这些操作均以与包括一个或多个生物细胞的生物学样品相同的方式进行。珠粒的计数、尺寸设置和染色剂吸收能力允许评估此类血液分析仪系统的打印过程、固定过程(例如，使用甲醇)、染色过程和成像过程。
在第一方面，本公开提供了包括多个珠粒的校准流体，其中珠粒的尺寸和颜色设置成表示至少一种类型的血细胞；和载送流体。在这些校准流体中，该多个珠粒可以包括第一组珠粒，该第一组珠粒的尺寸和颜色设置成表示白细胞(WBC)。例如，表示WBC的该多个珠粒包括多个橙色硅石珠粒，用以表示嗜中性粒细胞；多个蓝色聚苯乙烯珠粒，用以表示淋巴细胞；多个绿色聚苯乙烯珠粒，用以表示单核细胞；多个红色聚苯乙烯珠粒，用以表示嗜酸性粒细胞；和多个黑色聚苯乙烯珠粒，用以表示嗜碱性粒细胞。
在一些实施例中，校准流体进一步包括经稳定的红细胞(RBC)或经稳定的血小板(PLT)，或者经稳定的RBC和PLT两者。
在其他实施例中，校准流体中的该多个珠粒进一步包括不同于第一组珠粒的第二组珠粒，该第二组珠粒的尺寸和颜色设置成表示红细胞(RBC)。在又一些实施例中，校准流体可以进一步包括不同于第一组珠粒和第二组珠粒的第三组珠粒，该第三组珠粒的尺寸和颜色设置成表示血小板(PLT)。
在各种实施例中，载送流体可以是或包括水溶性聚合基质，诸如丙烯酸或聚氨酯树脂。
在不同的实施例中，校准流体中的珠粒可以是或包括以下项中的一者或多者：纤维素珠粒、硅石(二氧化硅)珠粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)/水凝胶包被的珠粒、三聚氰胺(三聚氰胺甲醛树脂)珠粒、SepharoseTM(交联琼脂糖)珠粒、聚乙酸乙烯酯(PVA)珠粒和聚苯乙烯珠粒。
在一些实施例中，珠粒是官能化的。例如，珠粒被以下基团中的一个或多个基团官能化：巯基基团、羟基基团、羧基基团、二硫基团、聚乙烯醇基团、胺基团(伯铵和仲铵)、马来酰亚胺基团、叔铵基团、季铵基团、环氧基团、羧基磺酸根基团和十八烷基(C18)基团。
在实施例中，珠粒具有约1微米至约10微米的直径，以及约1.0至约3.0克/cm3的密度。
如果在各种实施例中，则载送流体包括水溶性聚合物或水溶性聚合基质，例如丙烯酸或聚氨酯树脂。在其他实施例中，水溶性聚合物包括淀粉，例如羟乙基淀粉或纤维素，例如甲基纤维素。在又一些实施例中，载送流体可以包括或还包括血清和/或脑脊液。
在一些实施例中，载送流体包括一种或多种糖，诸如作为单分子或二聚体、呈任何组合的葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、核糖和/或鼠李糖。
在另一方面，本公开提供了校准自动化样品制备系统，诸如自动化血液分析仪，例如基于图像的血液分析仪的方法。这些方法包括如本文所述的校准流体；将一定体积的校准流体添加到基片上以产生校准样品；用第一染色剂对校准样品进行染色；从校准样品冲洗掉第一染色剂；对校准样品进行成像；从校准样品的图像确定自动化样品制备系统的校准状态；以及基于校准状态根据需要调整自动化样品制备系统的至少一个方面。
在这些方法中，确定自动化样品制备系统的校准状态可以包括：从校准样品的一个或多个图像计算至少一个校准参数的值；以及由处理器将该至少一个校准参数的值与该至少一个校准参数的已知参考范围进行比较。
在一些实施例中，该方法进一步包括：确定该至少一个校准参数的值在已知参考范围之外；以及通知用户调整自动化样品制备系统的与该至少一个校准参数相关的至少一个方面。在一些实施例中，该方法进一步包括：确定用户已调整了自动化样品制备系统的至少一个方面；确定该至少一个校准参数的值现在是在已知参考范围内；以及通知用户自动化样品制备系统被正确校准。
在一些实施例中，该方法进一步包括：在将该体积的校准流体分配到基片上之后，用基片移动器将基片传输到染色站。在相同或其他实施例中，该方法可以进一步包括用第二染色剂对校准样品进行染色，其中珠粒被配置为吸收第二染色剂。例如，染色剂选自由以下项组成的组：曙红Y、天青B和亚甲蓝。
在一些实施例中，该多个珠粒中的第一组珠粒的尺寸和颜色设置成表示白细胞(WBC)，和/或该方法可以进一步包括使用该多个珠粒中的不同于第一组珠粒的第二组珠粒，该第二组珠粒的尺寸和颜色设置成表示红细胞(RBC)。
在某些实施例中，如本文所述的方法可进一步包括以下项中的一者或多者：(a)检测含有珠粒的打印的样品的一侧是否比另一侧更厚，并且基于打印的样品的参考厚度，确定系统的打印针是否超出公差；(b)计算珠粒的尺寸，并且基于样品中的珠粒的已知尺寸，确定从图像中获取的珠粒的测量值是否在参考尺寸范围的公差内；以及(c)通过在成像站处施加特定波长的光来确定经染色的珠粒的感知颜色，并且基于样品中的珠粒的参考颜色，确定针对成像站处的特定波长的光源是否在公差内。
在一些实施例中，校准流体包括一种或多种血液组分，例如血清或脑脊液。
新的校准流体(例如包括珠粒，例如纤维素、硅石、PMMA/水凝胶包被的珠粒、三聚氰胺珠粒、SepharoseTM(交联琼脂糖)珠粒、PVA珠粒或聚苯乙烯珠粒)以及任选地纯化和稳定的血细胞，以及本文所述的方法提供了许多优点和益处。例如，校准组合物中的珠粒高度稳定，并且可以以与血液或组织样品中的生物细胞相同的方式进行打印、固定、染色和成像。此外，珠粒通常是柔性的，这允许它们以类似于生物细胞的方式移动穿过自动化血液分析仪系统的打印针。将珠粒与校准流体中的特定载液组合以提供有利的粘附特性，以允许当打印时，珠粒粘附至载玻片(或其他基片)，该载液为例如丙烯酸和/或聚氨酯水溶性聚合基质(例如树脂)或其他聚合物(例如淀粉(例如羟乙基淀粉)或纤维素(例如甲基纤维素)和/或糖(例如，作为单分子或二聚体、呈任何组合的葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、核糖和/或鼠李糖)或血清)。
此外，在某些实施例中，校准流体中的珠粒可以在自动化血液分析仪系统的染色过程期间吸收一种或多种不同的染色剂。这与标准塑料珠粒不同，该标准塑料珠粒通常是预先染色的，因此不允许分析自动化血液分析仪系统的染色组件的功能。然而，某些预先染色的珠粒也可以有利地用于新的校准流体中。新的珠粒和方法还允许基于每个样品进行质量控制，并且与其他质量控制方法和系统相比成本相对较低。
校准流体也可以被引入生物学样品中，并且流体中的珠粒可以因为其尺寸、形状和颜色的一致性而在自动化血液分析仪系统中成像期间与生物学样品中的细胞或其他生物材料区分开来。因为可以容易地识别珠粒，所以自动化血液分析仪系统可以基于珠粒的图像来测量珠粒，并且使用测量结果以校准分析仪系统的各个方面。也可以将珠粒掺入质量控制材料中，该质量控制材料可以由自动化血液分析仪系统进行处理以用于监测此类系统的性能。此外，珠粒的图像可用于通知可能需要在自动化血液分析仪系统可处理样品之前解决的用户系统中的缺陷(例如，未施加染色剂、光源(例如LED)在其可接受的波长范围的外部或外侧，或点样针被堵塞)。
此外，校准流体可用于有效且轻松地校准自动化血液分析仪系统和其他细胞分析系统，因为校准流体可以以与任何其他生物或其他样品相同的方式流过系统。校准流体被设计为具有较长的保质期，并且这些流体中的珠粒的尺寸和形状被设置成一致的，并且可以具有独特的颜色和染色特征。珠粒可以以相关浓度流过系统，以测试系统在分析样品时的功能，该样品含有自动化血液分析仪系统被批准检测的浓度范围内的多个颗粒。正如任何其他生物学样品一样，校准流体可以流过自动化血液分析仪系统。
进一步，可以将流体中的珠粒引入具有低浓度细胞的生物学样品(例如，具有少量细胞的样品，例如脑脊液)中，以有助于将成像组件聚焦在以其他方式难以聚焦的样品上。流体中的珠粒不会干扰生物学样品中的细胞成像，并且不会在自动化血液分析仪系统的打印、固定、染色和成像过程期间分解。
在本文中不使用诸如“优选地”、“普通地”和“通常地”的术语来限制要求保护的主题的范围或暗示某些特征对于本文公开的实施例的结构或功能是关键的、必需的或甚至重要的。相反，这些术语仅旨在突出在本公开的特定实施方案中可以使用或可以不使用的替代或附加特征。
术语“基本上”和“约”在本文可用来表示固有的不确定性程度，其可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示。这些术语在本文还被用来表示定量表示可不同于所陈述的参考的程度，而不会导致所讨论的主题的基本功能发生变化。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本公开的实施例的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不旨在限制。
本公开的实施例的这些及其他特征和优点将从以下详细描述并且从权利要求中显而易见地看出。应注意，权利要求的范围由其中的引用而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论来限定。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可以最佳地理解以下对本公开的实施例的详细描述，在附图中，相同的结构用相同的参考编号表示，并且在附图中：
图1为根据本公开的一个实施例的在自动化血液分析仪系统上拍摄的经打印和经染色的纤维素珠粒的图像。
图2为根据本公开的一个实施例的自动化样本处理系统的示意图。
图3为图2的自动化样本处理系统的染色组件的示意图。
图4为连接至图3的染色组件的泵送和控制系统的示意图。
图5为流程图，该流程图示出了用于在自动化样本处理系统中处理样本的一系列步骤的示例。
图6为显微镜载玻片上的绿色、黄色、红色、黑色预先染色的10微米硅石珠粒的显微镜图像的表示。
图7为用以下项衍生化的硅石珠粒的显微镜图像的表示：NH2(氨基，橙色)、C18(蜡，浅蓝色)和用COOH(酸，深蓝色)。
图8为聚苯乙烯珠粒和用NH2衍生化的硅石珠粒(橙色)的显微镜图像的表示
图9为校准流体的统一打印的显微镜图像的表示，该校准流体包括7微米硅石-NH2珠粒、10微米聚苯乙烯珠粒、丙烯酸水溶性聚合树脂、RBC、葡萄糖和亚5微米未衍生化硅石珠粒。
技术人员应当理解，图中的元件是为了简单和清晰起见而展示的，其并不一定按比例绘制。例如，图中一些元件的尺寸可以相对于其他元件放大，以帮助增进对本公开的实施方案的理解。
具体实施方式
本文公开了用于使用校准流体来校准和评估自动化生物学样品处理系统(例如自动化血液分析仪系统)的功能的方法和系统。自动化样品处理方法和系统提供了优于手动和其他自动化处理方法的优点，与手动处理或由其他系统处理的样品相比，该优点包括在使用最小试剂体积的同时增强处理速度，并且同时产生统一的样品制备，该统一的样品制备显著减少与染色剂、固定剂和其他试剂的应用相关联的可变性。
必须校准自动化生物学样品处理系统以产生统一且可重复的结果。如本文所公开的，包括珠粒(例如纤维素、硅石、PMMA/水凝胶包被的珠粒、三聚氰胺珠粒、SepharoseTM(交联琼脂糖)珠粒、PVA珠粒和/或聚苯乙烯珠粒)以及任选地保存的血细胞的校准流体或质量控制流体可以以与正常生物学样品相同的方式或基本相同的方式流过自动化样品处理系统。珠粒可以由自动化样品处理系统进行打印、固定、染色、成像和测量，并且结果可以用于校准和/或监测自动化样品处理系统的一个或多个部分/部件的性能。
一般方法
用不同样品流体制备的校准和质量控制流体
校准流体用于调整基于图像的分析仪系统的特定部件的操作(例如，打印、染色或成像)，以便对齐系统以产生在制备校准流体时预先确定的系统测量结果的精确已知值。可以在安装新系统时执行校准，并且可以在使用系统期间或当主要系统部件发生变化时周期性地(例如每6个月)执行校准。通常每天使用质量控制流体以监测系统在例行使用期间的性能。此类质量控制流体通常涵盖一系列细胞计数，以确保系统在其常规的动态范围内执行。
珠粒(诸如纤维素、硅石、PMMA/水凝胶包被的珠粒、三聚氰胺珠粒、SepharoseTM(交联琼脂糖)珠粒、PVA珠粒和/或聚苯乙烯珠粒)可以添加至任何数量的生物流体(包括血液、脑脊液、滑膜液和血清)以产生校准或质量控制流体，以用于监测自动化血液分析仪系统的性能。也可以将珠粒掺入非生物流体中(包括缓冲液)，以产生校准流体和质量控制流体。取决于校准的流体或目的，可以包括不同浓度的珠粒。例如，可以将较低浓度的纤维素和/或其他珠粒掺入模拟脑脊液的样品中，其中对较小的RBC和较大的WBC进行计数，因为脑脊液中通常存在低浓度的细胞(例如，五个至1000个RBC和/或WBC)。
可能包括纤维素和/或其他珠粒以产生校准或质量控制流体的生物学样品包括例如含有红细胞、白细胞和血小板的血液样品。此外，包括红细胞和/或白细胞和/或血小板的其他生物学样品(诸如骨髓悬浮液、尿液、阴道/宫颈细胞悬浮液、上皮组织悬浮液、肿瘤悬浮液、精液、痰液和唾液)也可以应用于基片。可以应用于基片并且可以包含目标细胞的其他流体包括但不限于脑脊液(CSF)、浆液(包括胸膜液)、腹膜液(例如，由于诸如腹水的情况)、心包液、滑膜液和连续非卧床腹膜透析(CAPD)液。不含有细胞但也可应用于基片的流体包括但不限于血浆(例如，血浆，例如40％；和糖，例如葡萄糖，例如20％)、羟乙基淀粉6％(VoluvenTM)、甲基纤维素和血清。可以使用的其他糖包括作为单分子或二聚体、呈任何组合的果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、核糖和/或鼠李糖。
校准流体或控制流体还可以包括水溶性悬浮液(诸如丙烯酸和/或聚氨酯聚合树脂)或其他聚合物、蛋白质和/或糖，以确保在由自动化样品处理系统(例如基于图像的血液分析仪系统)进行处理期间，珠粒将粘附至载玻片或基片。当使用树脂时，最终校准流体中树脂的浓度应足以在介于过程中的应用于基片与染色步骤之前两者之间的时间固化。这在自动化过程的所有步骤期间提供了校准流体中的珠粒与基片的牢固粘附。丙烯酸或聚氨酯聚合基质(例如树脂)在水基中的典型浓度的范围为约0.2重量％至约5重量％。
通过添加聚合物(例如淀粉，例如羟乙基淀粉和纤维素淀粉，例如甲基纤维素淀粉)以及某些生物墨水，可以进一步增加珠粒在载玻片上的保留，该生物墨水可以为因其生物相容性组分和有利的流变特性而选择的任何天然或合成聚合物。这些特征暂时或永久地支持活细胞，以促进它们在成熟期间的粘附、增殖和分化。在其他实施例中，聚合物可包括聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、糖原、支链淀粉、明胶、明胶琥珀酸盐、琼脂糖、海藻酸盐、胶原和壳聚糖。此外，羟乙基淀粉为VenofundinTM(一种用于急诊医学的胶体血浆容量扩充剂，也可用于本校准和控制流体)的主要成分。
在其他实施例中，载玻片可以用多聚-L-赖氨酸预处理(例如预先包被)或进行血浆处理以增加珠粒与载玻片的附接。载玻片也可以在打印过程期间进行包被。
所使用的水溶性聚合树脂为水溶性丙烯酸基或聚氨酯基溶液。一个主要特征为聚合树脂(为水溶性的)可以由经校准的仪器上的水基清洁剂来进行清洁，并且水溶性聚合树脂不会对添加至混合物的任何细胞组分产生不利影响。水溶性聚合树脂的另一个特征为它们在空气中快速固化，从而将细胞和珠粒贴在载玻片或基片上，这抑制了后续染色操作中珠粒的去除。
稀释剂和其他成分也可以根据需要添加至校准流体，以实现所需的一致性和浓度，这可能是有效的样品制备、染色、成像和分析所必需的。例如，可以添加糖(例如葡萄糖)(例如，在2％至5％或更多，高达10％、15％或20％的范围内的葡萄糖)以有助于打印统一性和稳定性并且进一步增强与基片的粘附性。可以使用的其他糖包括作为单分子或二聚体、呈任何组合的果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、核糖和/或鼠李糖。
通常，珠粒应具有以下特性。在尺寸方面，珠粒可以呈血液样品中不同细胞的尺寸(例如1微米至10微米、例如3微米至10微米、例如4微米至6微米或3微米至8微米)，例如以模拟血细胞(例如红细胞)的尺寸。该尺寸向典型物镜(例如20x物镜)提供了良好的染色分数，并且在一些情况下，较大的颗粒可能会在染色期间被洗掉，特别是大于10微米的颗粒。珠粒可以具有轻微的孔隙率(例如，15nm或更大的孔)或表面粗糙度，以支持更好的染色剂吸收并且减少在染色和洗涤步骤期间所洗掉的珠粒数量。珠粒的密度应为约1克/cm3，即水的密度。增加的密度(高于1.5克/cm3)会产生局部较高的壁剪切应力，这可以从表面撕下颗粒，从而增加染色和清洗期间的冲刷。密度低于0.9克/cm3的珠粒将不会形成悬浮液，而是将漂浮在用作储存基质的水溶液的顶部。此外，单分散珠粒更易于使用，并且更易于由自动化系统对染色分数评估进行量化。
珠粒官能化
各种类型的珠粒可以以多种方式衍生化或官能化(例如包被)以增强珠粒的能力和功能，例如，以更好地与某些染色剂和染料结合、改变珠粒的正电荷或负电荷、改变酸或碱的强度，和/或改变它们的孔隙率。官能化的性质可以影响颜色吸收动力学、颜色释放动力学和/或颜色强度。例如，不同的带正电或带负电的表面改性允许颜色差异，因为某些染料和染色剂(诸如曙红和亚甲蓝)具有不同的电荷和不同的染色强度。此外，当混合不同的官能化珠粒时，所有类型的珠粒均应以经定义的稳定pH在溶液中保持相同的ζ电位，以帮助避免聚合和结块。
不同的官能团包括例如巯基、羟基、羧基、二硫化物、聚乙烯醇、胺(伯铵和仲铵)、马来酰亚胺基、叔铵、季铵、环氧基、羧基磺酸根和十八烷基(C18)基团。然而，可用的官能化取决于珠粒材料。珠粒/官能团组合可以包括例如PMMA、聚苯乙烯、三聚氰胺或具有羧基基团的硅石珠粒、PMMA、硅石或具有胺基团的三聚氰胺、具有羧基磺酸根基团的聚苯乙烯珠粒。在其他示例中，PMMA珠粒可以用巯基、羟基、羧基、二硫化物、聚乙烯醇、胺(伯铵和仲铵)、马来酰亚胺基和/或羧基磺酸根基团进行衍生化或官能化。在一些其他示例中，聚苯乙烯珠粒可以用羧基或羧基磺酸根基团进行官能化，并且硅石珠粒可以用羧基或胺基团进行官能化。三聚氰胺珠粒可以用例如羧基或羧基磺酸根以及伯铵、仲铵、叔铵或季铵基团进行官能化。琼脂糖凝胶珠粒可以用例如叔铵或季铵基团进行官能化。
纤维素珠粒特性
可以获得具有不同尺寸(例如直径为1微米至50微米)和密度(例如在约0.1至20g/cm3，例如约1.0至10g/cm3或2.5至5g/cm3，例如1.0、1.02、1.05、1.1、1.13、1.15、1.17或1.2g/cm3的范围内)的纤维素珠粒。放大后的纤维素珠粒样品的示例的图像在图1中示出。例如，用于包含在校准流体中的纤维素珠粒可以具有大约1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、20微米、25微米、20微米、25微米、40微米、45微米或50微米的直径。然而，较小尺寸(例如小于8微米)的纤维素珠粒可能更难处理一些。可选择纤维素珠粒以反映特定目标细胞类型的尺寸，例如红细胞(RBC)(3微米至8微米)、白细胞(WBC)(6微米至15微米)、循环肿瘤细胞(CTC)(8微米至15微米)或血小板(大约2微米)。纤维素珠粒的ζ电位在pH 7.4(IEP pH 2.8)下为约-30mV。
目标细胞的类型可能取决于所研究的样品的类型而改变。例如，如果样品为脑脊液样品并且正在执行成像以研究脑脊液中血细胞存在或不存在，则可以选择珠粒尺寸以平行于红细胞和/或白细胞的尺寸。纤维素珠粒的尺寸可能会由自动化血液分析仪系统的打印针直径限制，因为在样品制备期间，珠粒通过针来进行打印。
纤维素珠粒通常以干粉(例如，由Kobo Products,Inc.,South Plainfield,N.J.,USA制造)形式购买，该干粉通常具有较长的保质期。珠粒的形状通常为统一的，这允许在校准和质量控制方案期间的成像中可以将珠粒与细胞内容物区分开来。纤维素珠粒为亲水的，并且当它们被润湿时，它们包含在用于自动化血液分析仪系统的校准或质量控制液体中这一情况的有利特性就会呈现出来。
纤维素珠粒和本文所述的珠粒中的任何珠粒可以与多种流体(包括血液、血浆(例如，血浆40％和葡萄糖20％)、血清、脑脊液、
Figure BDA0003699595990000121
羟乙基淀粉6％(VoluvenTM)、甲基纤维素、聚合基质(例如树脂和蒸馏水))混合，以形成用于处理的校准流体和质量控制流体。
纤维素珠粒的亲水特性允许珠粒吸收来自自动化血液分析期间执行的染色步骤中的染色剂。染色步骤中使用的染色剂可以包括例如曙红Y、天青B、亚甲蓝、苏木精、巴氏染色剂(PAP)、荧光染色剂或超活体染色剂，以及它们的不同组合。在对包括纤维素珠粒的样品进行成像期间，可以评估染色剂的着色和覆盖率。在一些情况下，可以使用具有尺寸网格的基片，以提供用于确定基片上的细胞和/或珠粒覆盖率的引导。在成像期间，也可以检查自动化血液分析仪系统的聚焦参数。
例如，图1为在自动化血液分析仪系统上拍摄的经打印和经染色的纤维素珠粒100的图像。珠粒的亲水性质允许染色剂被吸收并且稍后成像。对于血液学中使用的Romanovsky染色剂，可以依次应用固定剂、红色和蓝色染料以及冲洗液。仅使用蓝色染料的约10秒的标准染色时间用于生产图1中示出的样品。使用红色染料以及固定剂与红色或蓝色染料的组合可以发现类似的染色强度。然而，水基冲洗液通常将降低染色强度。
硅石珠粒特性
硅石珠粒很容易获得，可由自动化生物学样品处理系统染色，可以具有1微米至15微米的尺寸范围，也可以具有多种化学涂层。这些涂层将改变由不同系统对珠粒进行的染色。硅石珠粒密度可以为约1至5g/cm3，例如2至3g/cm3，例如2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.55、2.6、2.65、2.7、2.75、2.8、2.9、或3.0g/cm3。
未经包被或自然状态下的硅石珠粒可以由Romanowsky染色剂染色为浅蓝色。这是由于Romanowsky染色中染料上的电荷所致。经过包被(衍生化)以产生-NH3表面的硅石珠粒在珠上粒产生高正电荷，这会吸引Romanowsky染色剂中带负电荷的染料(曙红Y)，从而导致-NH3包被的珠粒染色为红色。
包被有–COOH的硅石珠粒在珠粒上产生负电荷，这吸引Romanowsky染色剂中带正电荷的染料(天青B、亚甲蓝)，从而导致珠粒染色为深蓝色。
硅石珠粒的电荷修饰和化学修饰允许由其他染色剂(例如苏木精、巴氏(PAP)染色剂、荧光染色剂或超活体染色剂，以及它们的不同组合)进行染色。
数十年来，硅石珠粒和衍生化硅石珠粒已经在许多行业中使用，因此很容易获得。最值得注意的是，它们可以从供应珠粒的公司处购得，该珠粒具有各种尺寸和涂层以用于高效液相色谱(HPLC)。
聚苯乙烯珠粒特性
聚苯乙烯珠粒通常并不由自动化生物学样品处理系统染色，但它们可以具有高度定义的尺寸范围，并且可以具有多种预先染色的颜色。可以获得具有不同尺寸(例如直径为1微米至50微米)和密度(例如在约0.1至1.05g/cm3，例如约0.9至1.0g/cm3，例如0.95、1.0、1.01、1.02、1.05g/m3的范围内)的聚苯乙烯珠粒。当NH2官能化时，聚苯乙烯珠粒的ζ电位可以为例如5mV至30mV，或者当SO3官能化时，可以为约-30mV。
预先染色的颜色可以用于验证光学成像系统中使用的光谱波长和其他测量特征和/或用于校准，例如用于校准打印过程(例如，无需清洗或其他步骤)。此类预先染色的聚苯乙烯珠粒可从各个制造商处购得，以用于验证基于流的系统的测量特性。
PMMA/水凝胶包被的珠粒特性
可以获得具有不同尺寸(例如直径为1微米至50微米)和密度(例如在约0.1至1.18g/cm3，例如约0.5至1.18g/cm3或1至2g/cm3，例如1.0、1.02、1.05、1.1、1.15、1.18或1.2g/m3的范围内)的PMMA珠粒。例如，用于包含在校准流体中的PMMA珠粒可以具有大约1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、20微米、25微米、20微米、25微米、40微米、45微米或50微米的直径。可选择PMMA珠粒以反映特定目标细胞类型的尺寸，例如红细胞(RBC)(3微米至8微米)、白细胞(WBC)(6微米至15微米)、循环肿瘤细胞(CTC)(8微米至15微米)或血小板(大约2微米)。当NH2官能化时，PMMA珠粒的ζ电位在pH 7.4(IEP pH 6.67)下可以为例如-10mV。
目标细胞的类型可能取决于所研究的样品的类型而改变。例如，如果样品为脑脊液样品并且正在执行成像以研究脑脊液中血细胞存在或不存在，则可以选择珠粒尺寸以平行于红细胞和/或白细胞的尺寸。PMMA珠粒的尺寸可能会由自动化血液分析仪系统的打印针直径限制，因为在样品制备期间，珠粒通过针来进行打印。
PMMA珠粒可按不同规格生产，例如，单分散在10％w/v水溶液中。如果需要，PMMA珠粒应进行水凝胶包被以实现表面官能化。
三聚氰胺珠粒特性
可以获得具有不同尺寸(例如直径为1微米至50微米)和密度(例如在约0.1至1.57g/cm3，例如约0.9至1.57g/cm3或1.0至1.5g/cm3，例如1.0、1.02、1.05、1.1、1.15、1.2、1.3、1.4、1.5或1.57g/m3的范围内)的三聚氰胺珠粒。例如，用于包含在校准流体中的三聚氰胺珠粒可以具有大约1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、20微米、25微米、20微米、25微米、40微米、45微米或50微米的直径。可选择三聚氰胺珠粒以反映特定目标细胞类型的尺寸，例如红细胞(RBC)(3微米至8微米)、白细胞(WBC)(6微米至15微米)、循环肿瘤细胞(CTC)(8微米至15微米)或血小板(大约2微米)。
目标细胞的类型可能取决于所研究的样品的类型而改变。例如，如果样品为脑脊液样品并且正在执行成像以研究脑脊液中血细胞存在或不存在，则可以选择珠粒尺寸以平行于红细胞和/或白细胞的尺寸。三聚氰胺珠粒的尺寸可能会由自动化血液分析仪系统的打印针直径限制，因为在样品制备期间，珠粒通过针来进行打印。
三聚氰胺珠粒可按不同规格生产，例如，单分散在10％w/v水溶液中。
SepharoseTM(交联琼脂糖)珠粒特性
可以获得琼脂糖凝胶珠粒，该琼脂糖凝胶珠粒具有不同尺寸，但通常为非统一的，并且可以以8.5微米或更大的平均直径来进行生产，并且可以具有宽范围的密度。例如，用于包含在校准流体中的琼脂糖凝胶珠粒可以具有大约8.5微米、24微米、25微米、30微米、35微米、40微米、45微米或50微米的直径。可以选择琼脂糖凝胶珠粒以反映特定目标细胞类型的尺寸。琼脂糖凝胶珠粒还具有直径为约70nm的孔。
琼脂糖凝胶珠粒的尺寸可能会由自动化血液分析仪系统的打印针直径限制，因为在样品制备期间，珠粒通过针来进行打印。
琼脂糖凝胶珠粒可按不同规格生产，例如分散在乙醇中的悬浮液中以避免结块。
聚乙酸乙烯酯(PVA)珠粒特性
可以获得具有不同尺寸(例如直径为1微米至50微米)和密度(例如在约0.1至1.19g/cm3，例如约0.9至1.19g/cm3，例如0.95、0.98、0.99、1.0或1.1g/cm3的范围内)的PVA珠粒。例如，用于包含在校准流体中的PVA珠粒可以具有大约1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、20微米、25微米、20微米、25微米、40微米、45微米或50微米的直径。可选择PVA珠粒以反映特定目标细胞类型的尺寸，例如红细胞(RBC)(3微米至8微米)、白细胞(WBC)(6微米至15微米)、循环肿瘤细胞(CTC)(8微米至15微米)或血小板(大约2微米)。
目标细胞的类型可能取决于所研究的样品的类型而改变。例如，如果样品为脑脊液样品并且正在执行成像以研究脑脊液中血细胞存在或不存在，则可以选择珠粒尺寸以平行于红细胞和/或白细胞的尺寸。PVA珠粒的尺寸可能会由自动化血液分析仪系统的打印针直径限制，因为在样品制备期间，珠粒通过针来进行打印。
PVA珠粒可按不同规格生产，例如，单分散在10％w/v水溶液中。
校准和质量控制流体
鉴于本公开，可以产生含有珠粒的校准流体管，然后可以由基于图像的血液分析仪，例如cobas m 511集成血液分析仪(Roche Diagnostics,Inc.)对该珠粒进行采样、打印、染色和成像。鉴于当前可用的选项调色板，可以用作替代物的珠粒类型至少包括以下项：
硅石10微米橙色(由基于图像的血液分析仪染色为橙色)-嗜中性粒细胞的替代物
聚苯乙烯10微米蓝色-淋巴细胞的替代物
聚苯乙烯10微米绿色-单核细胞的替代物
聚苯乙烯10微米红色-嗜酸性粒细胞的替代物
聚苯乙烯10微米黑色-嗜碱性粒细胞的替代物
纤维素5微米(由基于图像的血液分析仪来进行染色)–RBC和HGB(血红蛋白)/MCH(平均细胞血红蛋白)测量结果的替代物
硅石亚5微米(由基于图像的血液分析仪染色为紫色)-血小板的替代物。
除了珠粒之外，经纯化的、经稳定的RBC可用作RBC和HGB/MCH测量结果的替代物。
原则上，这意味着这些校准流体可用于：
(1)通过对溶液中的珠粒数量进行计数并且评估打印统一性，来验证基于图像的血液分析仪的样品打印(或涂片)性能；
(2)通过测量可染色珠粒(例如硅石或纤维素珠粒)的染色剂吸收量来验证基于图像的血液分析仪的染色性能；
(3)通过检测任何冲洗来验证清洗效率和清洗条件；
(4)通过对不同的珠粒类型进行计数并且相应地对类型进行分选，来验证基于图像的血液分析仪的性能；并且
(5)如果HGB和其他RBC参数在基于图像的血液分析仪上可用，则可以在溶液中使用珠粒或经稳定的RBC以用于验证这些参数。
基于图像的自动化血液分析仪系统
用于制备应用于基片的样品的后续处理步骤可以包括将样品暴露于一种或多种流体，以用于对样品进行固定、染色和冲洗。流体输送步骤(诸如流体递送、搅拌和流体抽真空)和其他制备步骤(例如干燥)也可能涉及样品制备。
通常，例如，如美国专利号9,217,695、10,094,764和10,764,538中所公开的基于图像的自动化血液分析仪系统(例如
Figure BDA0003699595990000171
m 511集成血液分析仪(Roche Diagnostics))使用最少的流体量来提供快速、高效且统一的样品处理。使用此类系统的方法通常包括一个或多个固定、染色和冲洗阶段，该阶段包括在固定、染色和冲洗阶段中的一者或多者期间或之后的一个或多个搅拌阶段。该系统可以作为独立装置或作为用于制备和检查生物学样品的更大系统中的部件来加以实现。
罗氏的cobas m 511集成血液分析仪(图中示出了该集成血液分析仪的一个示例)包括打印、染色和成像站，以执行上述阶段。图2示出了自动化血液分析仪系统1，其接收基片2并且移动基片2穿过多个站(例如站121、122、123、124和125)。自动化血液分析仪系统1包括用于在站之间(例如，从站121至站122、至站123、至站124和至站125)传输基片2的基片移动器120。基片移动器120可以包括用于固定基片2的夹持器127，以及使移动器120能够确定基片2是否安装在移动器120中的配准电路或软件。
图2示出了具有第一标记读取站121、点样站122、染色站123、成像站124和第二标记读取站125的系统。第一标记读取站121被配置为从基片2读取信息，诸如用于识别特定基片2的条形码和/或“指纹”信息。第二标记读取站125以类似的方式运行，并且该第二标记读取站读取的信息用于验证在成像站124处成像的样品3与经处理的基片相同。
打印站
在点样站(也称为打印站)122处，例如由空心针(未示出)将流体沉积至基片2上。基片可以是或可以包括显微镜载玻片、盖玻片或适用于在样品处理期间固定样品和在样品处理之后进行显微镜检查的其他透明材料。基片可以由一种或多种材料形成，该一种或多种材料对于至少在电磁波谱的可见部分内的辐射可能透明或可能不透明。此类材料的示例包括但不限于各种玻璃、石英、熔融石英和多种聚合物，以上各项中的其中一些可以为透明的。图3的实施例示出了玻璃显微镜载玻片、包括生物学样品3的基片2。沉积的流体变成样品3，然后在自动化血液分析仪系统的后续站处对该样品进行染色和成像。空心针的直径大于珠粒的直径，并且定位在至少与珠粒直径一样高的高度处。
染色站
参考图3，染色站123可以包括支撑件110A和110B，以将染色站123固定至系统或实验室工作站内的位置。染色站123还包括一个或多个基片臂10A和10B，每个基片臂均在它们的基部连接至致动器30A和30B。基片臂10A和10B的相对端包括基片夹持器20A和20B，以用于在样品处理期间接收并且固定基片。每个基片夹持器20A和20B均在染色站123完成样品处理步骤(如下所述)时接收并且固定基片2。使用抽吸端口，基片夹持器20A、20B可以在样品处理期间将基片2保固定至基片臂10A、10B。抽吸管23通过抽吸端口21A和21B以及22A和22B(应注意，端口21A和22A位于图3中的基片2后面，并且以虚线示出)向基片夹持器20A和20B提供抽吸。图3所示的实施例为双基片系统，能够在基片臂10A和10B中的每一者上固定并且处理基片。其他实施例可以提供依次或同时处理单个基片或者三个或更多个基片。
在如图3所示的染色站123被配置为接受并且处理两个基片上的样品的同时，在以下讨论和附图中，可以仅参考染色站123中的一组部件(例如，基片夹持器20A、致动器30A和基片臂10A)。然而，应当理解，所公开的与一组部件有关的相同步骤、特征和属性也可以应用于染色站1中的另一组部件(例如，基片夹持器20B、致动器30B和基片臂10B)。因此，虽然为了清晰和简洁起见，本文的讨论仅聚焦于一组部件，但应当理解，用于样品检查的机器或装置(例如染色站123)可以包括两组或超过两组的部件，每组均具有一些或所有本文讨论的特征。
将流体穿过分别附接至块80A和80B的平台60A和60B而递送至基片2上的样品3。平台60A可以包括偏移件70A至70D以提供介于平台60A的表面与基片2之间的分离，并且防止基片2接触平台60A。平台60B可以包括对应的一组偏移件71A至71D。偏移件可以包括在平台60A和/或60B的表面与基片2之间提供分离的支座、销、钉、杆、珠粒、壁或其他结构。平台60A和60B具有长边缘9和短边缘7。分隔件100定位在平台60A与60B之间，基本平行于平台60A和60B的长边缘9。废液管50A和50B可以延伸穿过阀90A和90B，并且废液管51A和51B(如图4所示)可以延伸穿过阀90C和90D。废液管50A至51A和50B至51B可以将固定剂、染色剂或冲洗液运送至废液容器230和231(如图4所示)。阀90A至90D可以通过包含在阀内或阀外的致动器被机械地、电动地、液压地或气动地致动。
染色站123可以包括或连接至控制系统5，如图4所示，该图提供了染色站123的另一个透视图。取决于样品3的性质，可以执行多个不同的处理阶段作为整个处理序列的一部分，以制备样品用于检查。下面讨论此类阶段的示例。然而，应当理解，可以使用本文公开的系统来执行多种不同的处理阶段以及阶段的组合，包括本文未作为示例具体讨论的阶段。在某些实施例中，控制系统5可以利用一个或多个传感器105A和105B来检测基片臂10A和/或10B的位置，以检测指示器臂101A和101B。传感器105A和105B可以为利用例如红外光的近距离传感器(例如光电传感器)或各种其他技术(激光、运动检测器、感应传感器、电容传感器、电阻(即接触)传感器或开关)以检测存在或不存在基片臂10A和/或10B。例如，传感器105A或105B可以具有检测场，并且该传感器可以确定基片臂(例如，臂10A和/或10B)或基片夹持器(例如，夹持器20A和/或20B)是否在检测场内。控制系统5可以从传感器接收信息以确定基片臂10A和/或10B的位置。在某些实施例中，控制系统5可以使用附接至系统1的干燥器4来干燥样品3。例如，干燥器4可以引导气流跨过样品3。
参考图4，一个或多个流体管52A至55A可以连接至平台60A内的端口和相应的固定剂或染色剂储存器210A至213A。流体管还可以包括与泵200A至203A和/或阀的连接件，该阀能够将固定剂或染色剂从储存器引导穿过管和位于平台上的端口，并且引导至基片和样品上。作为示例，泵200A可以将固定剂或染色剂从储存器210A引导穿过管54A，穿过块80A，从端口44A出来，引导至平台60A上，引导至平台60A与基片2之间的间隙92中，并且引导至含有样品3的基片2上。在将特定量的固定剂或染色剂应用于基片2之后，真空装置或其他抽吸源220和/或221可以将残留的固定剂从基片2穿过废液管50A至51A和50B至51B抽真空至废液容器230和/或231中。第二组流体管52B至55B可以连接至平台60A内的端口和相应的固定剂或染色剂储存器210B至213B。流体管还可以包括与泵200B至203B和/或阀的连接件，该阀能够将固定剂或染色剂从储存器引导穿过管和位于平台上的端口，并且引导至基片和样品上。
控制系统5可以包括一台或多台计算机，每台计算机均含有中央处理单元，该中央处理单元能够执行存储在计算机可读介质(诸如硬盘驱动器、光盘驱动器或存储器)上的软件指令。此外，控制系统5可以包括用于执行软件指令的电路。控制系统5可以包括用于接收用户命令以控制系统1的操作的用户界面。存储在控制系统5(即计算机)上或提供给该控制系统的软件可以包括在样品处理期间控制系统1的部件(诸如流体泵和真空装置)的操作的程序。例如，软件可以包括用于指导系统1将各种固定剂、染色剂和冲洗液应用于基片上的样品并且在样品处理期间执行若干搅拌步骤的指令。
成像站
成像站124可以包括例如显微镜。在一些实施例中，可以在染色站123处执行样品成像以用于获得样品图像，该染色站可以包括部件(诸如一个或多个辐射源和一个或多个检测器)和各种其他光学部件。在此类实施例中，系统1可以不包括单独的成像站124，而成像站的所有功能在系统的其他站处(例如，在染色站123处)执行。
自动化血液分析仪系统的校准
通常，自动化血液分析仪系统必须在系统的初始设置时并且在维护检查(该维护检查应在系统的生命周期内定期进行)期间进行校准，以确保正常运行。在初始设置和维护检查中，必须评估系统在整个操作参数范围内的功能。例如，自动化血液分析仪系统必须能够对具有0至500万个血小板和0至800万个红细胞以及0至40万个WBC的范围的样品进行操作。然而，在自动化血液分析仪系统的操作范围的上限和下限处具有生物血小板和红细胞计数的保存的生物学样品可能难以获得。然而，目前描述的包括纤维素、硅石和/或聚苯乙烯珠粒的校准流体提供了理想的解决方案，因为它们可以根据需要进行制备以具有每种珠粒尺寸的精确、特定浓度。
如图5所述，在校准程序400期间，包含珠粒的校准流体以与实际生物学样品相同的方式流过自动化血液分析仪系统，并且自动化血液分析仪系统的参数可以基于校准流体的观察而改变。在第一步骤402中，将校准流体打印至基片上。在将固定剂溶液施加至打印在基片上的样品的任选步骤之后，然后将校准流体的打印的样品用第一染色剂进行染色(步骤404)。从样品中冲洗第一染色剂(步骤406)。任选地，可以与第一染色剂同时或依次将第二染色剂施加至样品。任选地，然后从样品中冲洗第二染色剂。然后对样品进行成像(步骤408)。
基于图像的观察或测量结果，评估一个或多个校准参数(步骤410)以查看这些参数是否在一组经定义的限度内。如果校准参数不在校准参数的预测限度内，则对自动化血液分析仪系统的至少一个部件进行调整414。进行调整后，校准流体的另一个样品流过系统，并且以相同方式分析校准参数。
可以进行评估的校准参数的示例包括样品混合、成像器焦距和景深、LED光强度和波长、打印样品体积、打印针距、相对速度和与基片的相对角度，以及染色施用器功能。通过在制备校准流体时将系统测量结果(例如，细胞类型的计数、细胞类型的区分)与在独立校准的系统上产生的那些系统测量结果进行比较来评估校准。对于打印站，可以研究距离基片的打印针距和打印针的清洁度。如果校准期间拍摄的样品图像中的纤维素、硅石和/或聚苯乙烯珠粒的轮廓出现破损，则可以调整打印针以避免在珠粒(或细胞)流过针头或者在它们从针流出至基片上时损坏它们。具有破损的珠粒的图像可能表明打印针部分阻塞或走形，并且可能需要清洁和/或更换。此外，如果在校准期间拍摄的图像中没有出现珠粒，则打印针可能被完全阻塞，并且可能需要清洁和/或更换。
在另一个示例中，成像处理系统可以对校准期间拍摄的图像中的珠粒的数量进行计数。可以将所计数的珠粒的数量与应用了适量的校准流体的图像中出现的预期珠粒数量进行比较。例如，如果校准流体的珠粒浓度为1000个珠粒/微升，并且图像处理系统对900个珠粒进行计数，则预期将有0.9微升的校准流体施加至基片。如果要施加至基片的所需样品体积为1微升，则可能需要调整打印体积。
对于染色站，新方法能够测试将染色剂施加于样品的均匀性。例如，如果在基片的一部分上吸收一种特定染料或多种染料的珠粒(例如，纤维素、衍生化硅石或可以由系统染色的其他珠粒)似乎比在基片的另一部分上的珠粒染色更重，则可能需要调整染色施用器。
在另一个示例中，如果在校准期间拍摄的图像中珠粒似乎未染色，则染色设备可能有堵塞或泄漏。如果在自动化血液分析仪系统上校准的特定方案需要将多种染色剂施加至基片，则可以评估两种染色剂的施加和均匀性。成像站可以测量穿过含有染料的基片的光的吸光度或透射率。
由于吸光度和透射率值与在样品制备过程期间染料沉积在基片上的体积以及染料所占的面积有关，因此可以评估此类值以确定仪器是否在载玻片上精确地沉积了所需的样品量。例如，染料的光谱质量可以控制在所打印的血液样品和/或含有给定厚度的珠粒的样品的图像中捕获的颜色。因此，可以基于一张或多张所获取的图像来估计在给定面积上均匀打印和染色的样品的厚度。根据打印的样品的估计厚度和面积，可以计算分配在基片上的染料量。因此，具有已知光谱特征的染料可以用于估计和/或校准分配器沉积在给定表面上的样品量。同样，根据本公开的另一个实施例，珠粒(即纤维素珠粒、硅石珠粒或聚苯乙烯珠粒)可以用于检测含有珠粒的打印的样品的一侧是否比另一侧厚，这可以表明，例如，打印针已弯曲或以其他方式超出分析仪的公差。
基于校准期间拍摄的图像的清晰度或模糊度，可以调整成像系统的焦点以将样品置于最清晰的视野中。在另一个示例中，成像系统可用于捕获包括珠粒的校准样品的图像，并且图像处理系统可以用于计算珠粒的尺寸(例如，通过直径测量结果)。由于样品中的珠粒具有已知尺寸，所以可以调整成像系统或图像处理系统，使得从图像中获取的珠粒的测量结果在已知尺寸的允许范围内。在另一个示例中，如果珠粒用特定染色剂(例如荧光染色剂)染色(该染色剂通过在成像站处应用特定波长的光而被吸收或激发)并且珠粒似乎不吸收或发出荧光，则在成像站处的特定波长的光源可能无法正常工作。
在运行如上所讨论的校准方案后对自动化血液分析仪系统进行调整之后，可以启动另一个校准方案。在随后的校准方案中，用户可以检查在第一校准方案后所做的调整是否正确完成，以及可以在自动化血液分析仪系统上分析样品之前是否需要完成任何附加调整。
实例
应当理解，本公开的上述实施例中的一个或多个实施例可以进行组合，只要实施例不互相排斥即可。为了更容易地理解本公开的实施例，参考以下实例，该实例旨在说明本发明而非限制其范围。
实例1–纤维素珠粒
使用在血清中混合的纤维素珠粒的初始测试证明，这些珠粒可以由cobas m 511集成血液分析仪染色并且成像(图1)。整个自动化染色方案的应用示出，在染色过程之后，只有一部分应用于基片的珠粒保留下来。然后执行使用丙烯酸水溶性物质的后续实验(实例2)。
实例2–丙烯酸水溶性聚合树脂中的纤维素珠粒
为了使珠粒更好地粘附至载玻片(基片)，添加丙烯酸水溶性树脂作为校准流体的组分。将珠粒悬浮在树脂中，放置在cobas m 511集成血液分析仪上，并且正常处理。结果示出，由于载玻片上沉积了薄层树脂，因此树脂将在染色步骤之前固化，并且导致珠粒粘附至玻璃表面。
将尺寸为10微米并且浓度为大致0.2％的纤维素珠粒与树脂基质混合。丙烯酸水溶性聚合树脂以约0.25重量％的浓度加以使用。
尝试了两种类型的水溶性聚合树脂–丙烯酸和聚氨酯。在5％至50％浓度(最终)范围内测试了该丙烯酸和聚氨酯，以开发出约1％至10％的最有用范围。
聚氨酯树脂由cobas m 511集成血液分析仪染色过程染色为浅蓝色，而丙烯酸树脂为透明的。
如图1所示，这些结果表明需要水溶性丙烯酸(或其他)聚合树脂基质，以允许系统在样品之间使用DigiMAC3洗涤剂正确地清洁自身。
实例3–硅石珠粒
还测试了硅石珠粒。这些珠粒可以用多种染料预先染色。例如，可以获得预先染色的硅石珠粒，类似于聚苯乙烯珠粒。这些可以用作聚苯乙烯珠粒的替代品。此类硅石珠粒通过暴露于溶解在有机溶剂中的染料来进行预先染色，然后将硅石珠粒悬浮在水性缓冲液中，从而将染料捕集在硅石珠粒内。
特别地，7微米硅石珠粒以大约0.1％的浓度使用，10微米硅石珠粒以大约0.05％的浓度使用，并且亚5微米硅石珠粒以大约0.1％的浓度使用。丙烯酸水溶性聚合树脂以约5％的浓度加以使用。葡萄糖以约4％的浓度加以使用。最初测试的浓度范围为0至0.5％的所有珠粒、0至50％的水溶性聚合树脂、0至10％的葡萄糖以及0至500万个RBC/微升。
尝试了两种类型的水溶性聚合树脂–丙烯酸和聚氨酯。在5％至50％浓度(最终)范围内测试了该丙烯酸和聚氨酯，以开发出约1％至10％的最有用范围。聚氨酯树脂由cobasm 511集成血液分析仪染色过程染色为浅蓝色，而丙烯酸树脂保持透明。
图6为显微镜载玻片上的绿色、黄色、红色、黑色预先染色的10微米硅石珠粒的显微镜图像的表示。
实例4–衍生化硅石珠粒
用-NH2(氨基)、-COOH(酸)和C18(蜡)进行化学衍生化的硅石珠粒购自SiliCycleInc.(Quebec,Canada)。这些珠粒通过在水溶性丙烯酸聚合树脂(5％浓度)中制备悬浮液来进行测试，并且使用DigiMAC3TM染色剂包在cobas m 511集成血液分析仪上进行处理。珠粒的浓度为0至5％。
图7为用以下项衍生化的硅石珠粒的显微镜图像的表示：-NH2(氨基，橙色)、C18(蜡，浅蓝色)和用-COOH(酸，深蓝色)。
实例5–聚苯乙烯珠粒
将预先染色的聚苯乙烯珠粒悬浮在水溶性丙烯酸聚合树脂中，并且在cobas m511集成血液分析仪上进行处理。这些珠粒具有统一的尺寸，并且在分析仪上进行染色后保持其颜色。红色、蓝色、黑色和绿色珠粒由于其可用性而被使用，并且它们的颜色很容易通过人工显微镜检查来进行区分。
特别地，以大约0.1％的浓度使用7微米硅石珠粒。以大约0.05％的浓度使用10微米预先染色的聚苯乙烯珠粒。丙烯酸水溶性聚合树脂以约5％的浓度加以使用。最初测试的浓度范围为0至0.5％的所有珠粒，0至50％的水溶性聚合树脂。尝试了两种类型的水溶性聚合树脂–丙烯酸和聚氨酯。在5％至50％浓度(最终)范围内测试了该丙烯酸和聚氨酯，以开发出约1％至10％的最有用范围。
聚氨酯树脂由cobas m 511集成血液分析仪染色过程染色为浅蓝色，而丙烯酸树脂为透明的。
图8为聚苯乙烯珠粒(红色、蓝色、黑色和绿色)和用NH2衍生化的硅石珠粒(橙色)的显微镜图像的表示
实例6–作为校准流体中的组分的RBC
将RBC(10至500万个/微升)添加至珠粒悬浮液，但最初RBC破坏了统一的样品打印。将葡萄糖添加至校准流体，并且发现这可以制备更统一的制剂。所使用的范围为1％至5％的葡萄糖。葡萄糖还有助于保持珠粒附接至载玻片，然而仍然需要丙烯酸和/或聚氨酯水溶性聚合树脂基质。
特别地，7微米硅石珠粒以大约0.1％的浓度使用，10微米硅石珠粒以大约0.05％的浓度使用，并且亚5微米硅石珠粒以大约0.1％的浓度使用。丙烯酸水溶性聚合树脂以约5％的浓度加以使用。葡萄糖以约4％的浓度加以使用。RBC以约300万个细胞/微升的浓度进行添加。
最初测试的浓度范围为0至0.5％的所有珠粒、0至5％的水溶性聚合树脂、0至10％的葡萄糖以及0至500万个RBC/微升。
实例7–亚5微米珠粒
通过过滤来分选未衍生化硅石珠粒，用以获得直径低于5微米的珠粒以用作PLT替代物。这些珠粒由cobas m 511集成血液分析仪染色为紫色。
实例8–校准流体测试
最终校准流体包括：
7微米硅石-NH2珠粒(0.1％)
10微米聚苯乙烯珠粒(0.05％)
丙烯酸水溶性聚合树脂(5％)
RBC(300万个细胞/ml)
葡萄糖(4％)
亚5微米未衍生化硅石珠粒(0.1％)
如上述实例所述，在cobas m 511集成血液分析仪中测试的浓度范围为0至0.5％的珠粒、0至50％的水溶性丙烯酸聚合树脂、0至10％的葡萄糖以及0至500万个RBC/微升。
结果示出，可以获得相当统一的打印品，该打印品可以在分析仪上进行处理，然后这样将给出RBC参数数据，并且将小珠粒中的一些小珠粒分类为血小板。这些结果是使用未经修改的已发行软件获得的。图9为校准流体的统一打印的显微镜图像的表示，该校准流体包括7微米硅石-NH2珠粒、10微米聚苯乙烯珠粒、水溶性丙烯酸聚合树脂、RBC、葡萄糖和亚5微米未衍生化硅石珠粒，如上所述。
该载玻片的cobas m 511集成血液分析仪结果为：
WBC 0.21
RBC 0.68
HGB 2
HCT 6.6
MCV 97.8
MCH 30.3
MCHC 31
RDW 15.1
RDWSD 53.2
PLT 5
来自观察站的库示出，由cobas m 511集成血液分析仪染色的亚5微米珠粒被识别为血小板。
其他实施例
已经描述了本公开的多个实施例。然而，应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文所述的实施例进行各种修改和变化。因此，其他实施例在以下权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种校准流体，所述校准流体包含：
多个珠粒，其中所述珠粒的尺寸和颜色设置成表示至少一种类型的血细胞；和
载送流体。
2.根据权利要求1所述的校准流体，其中所述多个珠粒选自由以下项组成的组：纤维素珠粒、硅石(二氧化硅)珠粒、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)/水凝胶包被的珠粒、三聚氰胺(三聚氰胺甲醛树脂)珠粒、交联琼脂糖珠粒、聚乙酸乙烯酯(PVA)珠粒和聚苯乙烯珠粒。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的校准流体，其中所述珠粒是官能化的。
4.根据权利要求3所述的校准流体，其中所述珠粒被以下基团中的一个或多个基团官能化：巯基基团、羟基基团、羧基基团、二硫基团、聚乙烯醇基团、胺基团(伯铵和仲铵)、马来酰亚胺基团、叔铵基团、季铵基团、环氧基团、羧基磺酸根基团和十八烷基(C18)基团。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的校准流体，其中所述珠粒具有约1微米至约10微米的直径，以及约1.0至约3.0克/cm3的密度。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的校准流体，其中所述载送流体包括水溶性聚合物或水溶性聚合基质。
7.根据权利要求6所述的校准流体，其中所述水溶性聚合基质包括丙烯酸或聚氨酯树脂。
8.根据权利要求6所述的校准流体，其中所述水溶性聚合物包括羟乙基淀粉或纤维素，例如甲基纤维素。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的校准流体，其中所述载送流体包括血清。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的校准流体，其中所述载送流体包括一种或多种糖。
11.根据权利要求10所述的校准流体，其中所述一种或多种糖包括作为单分子或二聚体、呈任何组合的葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、核糖和/或鼠李糖)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的校准流体，其中所述多个珠粒包括第一组珠粒，所述第一组珠粒的尺寸和颜色设置成表示白细胞(WBC)。
13.根据权利要求12所述的校准流体，其中表示WBC的所述第一组珠粒包括
多个橙色硅石珠粒，用以表示嗜中性粒细胞；
多个蓝色聚苯乙烯珠粒，用以表示淋巴细胞；
多个绿色聚苯乙烯珠粒，用以表示单核细胞；
多个红色聚苯乙烯珠粒，用以表示嗜酸性粒细胞；和
多个黑色聚苯乙烯珠粒，用以表示嗜碱性粒细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的校准流体，所述校准流体进一步包括经稳定的红细胞(RBC)或经稳定的血小板(PLT)，或者经稳定的RBC和PLT两者。
15.根据权利要求12或权利要求13所述的校准流体，其中所述多个珠粒进一步包括不同于所述第一组珠粒的第二组珠粒，所述第二组珠粒的尺寸和颜色设置成表示红细胞(RBC)。
16.根据权利要求15所述的校准流体，其中所述多个珠粒进一步包括不同于所述第一组珠粒和所述第二组珠粒的第三组珠粒，所述第三组珠粒的尺寸和颜色设置成表示血小板(PLT)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的校准流体，其中所述校准流体包括一种或多种血液组分。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的校准流体，其中所述校准流体包括血清。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的校准流体，其中所述校准流体包括脑脊液。
20.一种校准自动化样品制备系统的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求1至19中任一项所述的校准流体；
将一定体积的所述校准流体添加到基片上以产生校准样品；
用第一染色剂对所述校准样品进行染色；
从所述校准样品冲洗掉所述第一染色剂；
对所述校准样品进行成像；
从所述校准样品的图像确定所述自动化样品制备系统的校准状态；以及
基于所述校准状态根据需要调整所述自动化样品制备系统的至少一个方面。
21.根据权利要求20所述的方法，其中确定所述自动化样品制备系统的校准状态包括
从所述校准样品的一个或多个图像计算至少一个校准参数的值；以及
由处理器将所述至少一个校准参数的所述值与所述至少一个校准参数的已知参考范围进行比较。
22.根据权利要求21所述的方法，所述方法进一步包括：
确定所述至少一个校准参数的所述值在所述已知参考范围之外；以及
通知用户调整所述自动化样品制备系统的与所述至少一个校准参数相关的至少一个方面。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法进一步包括
确定用户已调整了所述自动化样品制备系统的至少一个方面；
确定所述至少一个校准参数的所述值现在是在所述已知参考范围内；以及
通知所述用户所述自动化样品制备系统被正确校准。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在将所述体积的校准流体分配到所述基片上之后，用基片移动器将所述基片传输到染色站。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法进一步包括用第二染色剂对所述校准样品进行染色，其中所述珠粒被配置为吸收所述第二染色剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一染色剂和所述第二染色剂选自由以下项组成的组：曙红Y、天青B和亚甲蓝。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述多个珠粒中的第一组珠粒的尺寸和颜色设置成表示白细胞(WBC)。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法进一步包括使用所述多个珠粒中的不同于所述第一组珠粒的第二组珠粒，所述第二组珠粒的尺寸和颜色设置成表示红细胞(RBC)。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括以下项中的一者或多者：
(a)检测含有所述珠粒的打印的样品的一侧是否比另一侧更厚，并且基于所述打印的样品的参考厚度，确定所述系统的打印针是否超出公差；
(b)计算所述珠粒的尺寸，并且基于所述样品中的所述珠粒的已知尺寸，确定从所述图像中获取的所述珠粒的测量值是否在参考尺寸范围的公差内；以及
(c)通过在成像站处施加特定波长的光来确定经染色的珠粒的感知颜色，并且基于所述样品中的所述珠粒的参考颜色，确定针对所述成像站处的所述特定波长的光源是否在公差内。
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